JPH04126078A - 新規なα―Ｌ―フコシダーゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、バチルス属に属する細菌により生産されるα
−Ｌ−フコシダーゼおよびその製造法に関する。

（従来の技術） 糖タンパク質や糖脂質などの複合糖質の糖鎖の非還元末
端あるいは枝別れ部分には、α−Ｌ−フコシル基が頻繁
に見出され、近年、これの代謝と細胞のガン化に深い関
係があることが示唆されている。例えば、ＣＡ１９−９
などラクトシリーズ系の腫瘍マーカーの殆どはＬ−フコ
シル基を含んでいる。また、細胞のガン化に伴い血中の
し一フコース量が増加することが種々のガン患者で観察
されている。α−Ｌ−フコシダーゼはこのようなα−Ｌ
−フコシル結合を分解する酵素であり、複合糖質の糖鎖
の構造解析や構造と機能との関連を研究する上でフコー
スを特異的にはずす修飾試薬として重要な意味を持って
いる。α−Ｌ−フコシダーゼは細菌からカビ、植物、軟
体動物、哺乳類にいたるまて広く分布している。サザエ
やボウシュウポラ（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　７５．５
０９．　（１９７４戸などの動物由来の酵素は広いアグ
リコン特異性を持っており、ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ
−フコシドのような合成基質およびブタ顎下腺ムチンや
２Ｉ−フコシルラクトースなどに存在するα−１→２フ
コシル結合、オロソムコイド（α１−酸性糖タンパク質
）などに存在するα−１→３フコシル結合、ヒト母乳由
来のラクト−Ｎ−フコペンタオース■などに存在するα
−１→４フコシル結合あるいはウシイムノグロブリンＧ
などに存在するα−１→６フコシル結合を分解する。し
かしながら、これらは材料の安定供給の面で工業生産に
は不利である。

一方、バチルス属（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　７４．１
１４１．　（１９７３））　、アスペルギルス属（Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２４５゜２９９、　　（１９
７０）　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、
Ｃｏｍｍｕｎ、。

１３６．５６３．　（１９８６））などの微生物由来の
酵素およびアーモンド（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　
２５７．８２０５．　（１９８２））の酵素は厳密なア
グリコン特異性を持っており、ｐ−ニトロフェニルα−
Ｌ−フコシドのような合成基質には作用せず、上記結合
のうちの一種類のみを分解する。

（発明が解決しようとする課題） これら各種のフコシダーゼの中で、α−１→６フコシル
結合に作用する酵素は動物由来のものを除くと、アスペ
ルギルス属の微生物由来の酵素が知られているのみであ
る。しかしながら、アスペルギルス属由来の酵素は、天
然高分子のα−１→６フコース残基には作用するが、低
分子基質には作用しない。従って、低分子基質のα−１
→６フコシル結合に作用する微生物由来のフコシダーゼ
の開発が望まれていた。

（課題を解決するための手段） 本発明者らはかかる課題を解決するためにα−１→６フ
コシル結合に作用するα−Ｌ−フコシダーゼ生産能を存
する微生物を広く自然界より検索した。その結果、本発
明者らにより、広いアグリコン特異性を有し、糖タンパ
ク質及び糖脂質のどちらにも作用しうるα−Ｌ−フコシ
ダーゼを生産する細菌として見いだされたバチルス・サ
ーキュランスＭ２８株（特願平１−１８６３２２）がα
−ｔ→６フコシル結合に作用するα−Ｌ−フコシダーゼ
を培養液中に生産することを見いだし、本発明を完成し
た。

本発明において用いられる菌株は、以下のような菌学的
性質を有する。

（形態的所見） （１）　　細胞の形態、大きさ：桿菌０．５　Ｘ　４−
６μｍ（２）多形性：なし く３）　　運動性：あり （４）胞　子：あり　　　　　１．ＯＸ２．５μｍ（５
）胞子の部位：準端 （６）　　ダラム染色性：陽性 （生育状態） （１）　　肉汁寒天平板培養 集落の形状は円形であり、 面隆起は扁平状である。又、 白色〜白黄色である。

（２）肉汁液体培養 生育し混濁する。

（３）ゼラチン穿刺培養 液化せず。

（生理学的性質） （１）硝酸塩の還元 （２）硫化水素の生成 （３）インドールの生成 （４）デンプンの分解 （５）カゼインの分解 （６）　　クエン酸の利用 （７）ウレアーゼ （８）カタラーゼ ・陰性 陰性 陰性 陽性 陰性 陰性 陰性 陽性 周縁は金縁で、表 集落の色調は、乳 （９）オキシダーゼ　：陰性 α０）ＭＲテス　ト　・陰性 αυ　ＶＰテス　ト　：陰性 ａり生育温度：１ｏ〜４４°Ｃ 至適温度　３０〜３５°Ｃ αＪ　酸素に対する態度：好気性 ａ４　　糖類からの酸およびガスの生成（＋：生成、−
：生成せず） 酸 Ｄ−グルコース　　　　　　十 〇−アラビノース　　　　　＋ Ｄ−キシロース　　　　　　＋ Ｄ−マンニトール　　　　　＋ イノシトール　　　　　　　＋ ソルビトール　　　　　　　＋ シ　　ョ　　糖　　　　　　　　　　　　十メソビオー
ス　　　　　　　＋ トレハロース　　　　　　　　＋ α５　　ＶＰ培地（ｐＨ６，０）　におけるｐＨｐＨ５
，４８（６日） ガス αＱ　食塩含有培地における生育 ５％　生育する ７％　生育しない 以上の性質から、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏ
ｆ　Ｄｅｔｅｒｍ−ｒｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌｏｇｙ、第８版を参照し、この菌株をバチルスに属す
る菌株と同定し、バチルススピイシイズ　Ｍ　−２８（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　Ｍ−２８）と命名した。本
菌株は、微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１０７８
８号として寄託されている。

本菌株はその後の検討によりバチルス　サーキュランス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）であること
が明らかとなった。

次に、本菌株により生産されるα−Ｌ−フコシダーゼの
酵素学的および理化学的性質について記述する。

■）酵素の作用 本発明の酵素はオリゴ糖や合成基質中のα−り一フコシ
ド結合を特異的に加水分解し、Ｌ−フコースを遊離する
。

２）基質特異性 本酵素の種々のα−Ｌ−フコシド含存基質に対する作用
を第１表に示した。

本酵素はｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコシドのような
合成基質及び２′−フコシルラクトース、３−フコシル
ラクトースなどのオリゴ糖に作用する。また、オリゴ糖
鎖中のα−１→６フコシル結合を分解し、Ｌ−フコース
を遊離する。一方、天然高分子基質中のα−１→２、α
−１→３、α−１→４およびα−１→６フコシル結合に
は作用しない。

なお、第１表中の相対活性は、２′−フコシルラクトー
スに対する活性を１００として表示した。

（以下余白） ３）力価の測定法 酵素活性の測定はｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコシド
を基質として、ｐＨ７，０のリン酸カリウム緩衝液中、
３７℃で反応を行い、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９，８）を加
えて反応を停止させた後、遊離のｐ−ニトロフェノール
の量を４００ｎｍの吸光度を測定することにより行った
。酵素の単位は１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノ
ールを遊離する酵素量を１ユニツトとした。その他の基
質については、ｐＨ７，０のリン酸カリウム緩衝液中、
３７°Ｃで２０〜４０分間反応を行い、沸騰浴中３分間
加熱して反応を停止した後、遠心し、その上溝中の遊離
Ｌ−フコース量をブタ肝由来のし一フコースデヒドロゲ
ナーゼを用いて測定することにより行った。

４）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは第１図に示すとおり、ｐＨ６，０〜７．０で
ある。安定ｐＨ範囲は３７°Ｃ１３時間の処理条件の場
合、第２図に示すとおりｐＨ６，０〜８．５であった。

なお、第１図および第２図において使用した緩衝液をク
エン酸−ＨＣｌ：○○、クエン酸：０−０、リン酸カリ
ウム・−・、トリス−ＨＣｌ：△−△、グリシン−Ｎａ
ＯＨ：■−■で示した。

５）至適温度および安定温度 反応の至適温度は４５°Ｃであった（第３図）。

安定温度範囲はｐＨ７，０，１０ｍＭリン酸緩衝液中に
各温度で１０分間保温して残存活性を測定した。その結
果、本発明の酵素は４０″Ｃまて安定であり、５０°Ｃ
で約５０％の残存活性を示した（第４図）。

６）Ｋｍ値 ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコシド、２′フコシルラ
クトースまたは６−０−α−Ｌ−フコピラノシルーＮ−
アセチルグルコサミンに対するｈ値は、それぞれ４．３
ｘｌＣｒ’Ｍ、１．３ｘｌＯ−”Ｍおよび１．８ＸＩＧ
１Ｍである。

７）精製方法 本発明の酵素の精製は、既知の精製法が単独もしくは併
用して利用され得る。例えば、培養液を濾過または遠心
分離にかけ菌体を除去し、次いて塩析法、各種クロマト
グラフ法等を適宜に組み合わせて行うことができる。精
製法の一例を次に示す。

（Ｃ工程） 培養終了後、遠心分離により菌体および不溶物を除き、
培養濾液を得る。この濾液を硫安（８０％飽和）で塩析
を行なう。得られた沈殿を０．２Ｍの塩化ナトリウムを
含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、同
緩衝液で一夜透析し、透析内液を同緩衝液で予め平衡化
したＤＥＡＥ−トヨバール６５０Ｍカラムに通し、吸着
した酵素を０．２５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリ
ン酸緩衝液で溶出する。

（ｂ工程） 活性画分を集め、限外濾過膜を用いて濃縮した後、１０
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で−夜透析し、透析内
液を同緩衝液で予め平衡化したハイトロキシルアパタイ
トカラムに通し、吸着した酵素をリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）１０〜６０ｍＭのリニアーグラジェント法で溶出
する。

（Ｃ工程） 活性画分を集めて濃縮した後、１０％（ｗ／Ｖ）硫安を
含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７゜０）に対して一夜
透析し、透析内液を同緩衝液で予め平衡化したブチルト
ヨパール６５０Ｍカラムに通し、１０〜７％（Ｗ／Ｖ）
硫安のステップワイズグラジェント法で溶出する。

（Ｃ工程） 溶出された活性画分を集めて濃縮し、予め１０ｍＭ’Ｊ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＴＳＫ−ゲルＨ
Ｗ６５Ｆカラムを用いてゲル濾過を行う。得られる活性
画分を、予め１０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
平衡化したフコースーセルロファインカラムに通し、吸
着した酵素を０．３５Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝液
で溶出し、α−Ｌ−フコシダーゼの精製標品を得る。

８）分子量 本発明の酵素の分子量は、ＴＳＫ−ゲルＨＷ６５Ｆを用
いるゲル濾過法により約２５０．０００と測定された。

９）ポリアクリルアミド電気泳動 精製された酵素は、ポリアクリルアミド電気泳動におい
て単一のバンドを示した。

１０）阻害剤等の影響 本酵素に対する種々の添加物質の影響について検討した
ところ銅（１ｍＭ）　、水銀（１ｍＭ）、バラクロルメ
ルクリ安息香酸（０，５ｍＭ）により著しく阻害された
が、その他の金属イオン（１ｍＭ）やＳＨ試薬（１ｍＭ
）および糖（１０ｍＭ）によりほとんど影響を受けなか
った。

次に本発明をより具体的に説明する。

本発明に使用する微生物は、バチルス属に属し、上記性
質を有するα−Ｌ−フコシダーゼを生産する能力を持つ
ものであればいかなるものでも良い。

それらのうち好ましい菌株は、本発明者らにより竜野市
の土壌から分離されたバチルス　サーキュランスＭ２８
株があげられる。

本面を用いてα−Ｌ−フコシダーゼを生産するには、通
常の微生物の培養に用いられるものであれば特に限定さ
れない。

炭素源としては例えば、グルコース、フコース、アラビ
ノース、シュークロース、可溶性デンプン、デキストリ
ン、糖蜜、ヒト母乳、ブタ胃ムチンなどの糖質、窒素源
としては、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、カザミノ
酸、コーンスチープリカ、各種アンモニウム塩、各種硝
酸塩、尿素等が用いられる。培養は、培地を通常の方法
で滅菌し、本発明の菌株を接種し、２５〜３５°Ｃ５ｐ
Ｈ６゜０〜７．０で２〜５日間振どうまたは通気撹拌に
より好気的に行う。

培養終了後、培養液から、α−Ｌ−フコシダーゼを採取
、精製するには前記のような既知の方法を組合わせて行
うことができる。本酵素は培養液中に生産されるので、
遠心分離等により菌体を除いた培養上澄液を硫安分画後
、イオン交換、ゲル濾過、吸着等のクロマトグラフィー
を行い精製することができる。

（実施例） 以下、実施例により詳しく説明するが、本発明がこれに
限定されるものではない。

実施例１ グルコース０．５％、ペプトン０．５％、酵母エキス０
．５％、塩化ナトリウム０．５％（ｐＨ６，５）を含む
培地を５００ｍ１容振とうフラスコに１００ｍ１分注し
、滅菌した後、バチルスサーキュランスＭ２８を接種し
３０°Ｃで振どう培養し種培養とした。ついで種培養と
同組成の培地８ＬをＩＯＬ容ジャーファーメンタ−に入
れ、１２０°Ｃ１３０分間殺菌した。冷却後、上記の種
培養液を接種し、３０°Ｃで４日間、毎分３．５Ｌの通
気量と毎分３５０回転の撹拌速度の条件で培養した。培
養終了後、遠心分離により菌体および不溶物を除き、培
養濾液を得た。この濾液を０〜４°Ｃに保ちながら硫安
を添加し、８０％飽和の沈殿を採取した。得られた沈殿
を０．２Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）に溶解し、同緩衝液で一夜透析した。

この透析内液を同緩衝液で予め平衡化したＤＥＡＥ−ト
ヨバール６５０Ｍカラム（６，０Ｘ２７ａｎ）に通し、
吸着した酵素を０．２５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液で溶出した。活性画分を集め、限外濾過
膜を用いて濃縮した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）で−夜透析した。この透析内液を同緩衝液で予め
平衡化したハイトロキシルアパタイトカラム（２，６Ｘ
１５ａｎ）に通し、吸着した酵素をリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）１０−６０ｍＭのリニアーグラジェント法で溶
出した。活性画分を集めて濃縮した後、１０％（Ｗ／Ｖ
）硫安を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に対
して一夜透析した。透析内液を同緩衝液で予め平衡化し
たブチルトヨパール６５０Ｍカラム（１，０Ｘ１５ａｏ
）に通し、１Ｏ−７％（Ｗ／Ｖ）硫安のステップワイズ
グラジェント法で溶出した。溶出された活性画分を集め
て濃縮し、予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
平衡化したＴＳＫ−ゲルＨＷ６５Ｆカラム（１，０Ｘ６
１ａｏ）を用いてゲル濾過を行った。得られた活性画分
を、予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化
したフコースーセルロファイン力ラム（０，８Ｘ４ｃｍ
）に通し、吸着した酵素を０．３５Ｍ塩化ナトリウムを
含む同緩衝液で溶出し、α−Ｌ−フコシダーゼの精製標
品１５０μｇ（比活性１９３ｕｎｉｔｓ　／　ｍ　ｇ、
収率５％）を得た。

（発明の効果） 以上、説明したように本発明のα−Ｌ−フコシダーゼは
オリゴ糖など低分子基質のα−１→６フコシル結合を加
水分解する特異性を有しているため、糖鎖の構造解析や
機能の研究に極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の至適ｐＨを示す図である。 第２図は本酵素の安定ｐＨを示す図である。 第３図は本酵素の至適温度を示す図である。 第４図は本酵素の安定温度を示す図である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の酵素学的性質を有するα−Ｌ−フコシダーゼ ［１］作用 オリゴ糖や合成基質中のα−Ｌ−フコシド結合を特異的
   に加水分解し、Ｌ−フコースを遊離する。 ［２］基質特異性 ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコシドのような合成基質
   及び２′−フコシルラクトース、３−フコシルラクトー
   スなどのオリゴ糖に作用する。一方、天然高分子基質中
   のα−１→２、α−１→３、α−１→４およびα−１→
   ６フコシル結合には作用しない。 ［３］至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 至適ｐＨはｐＨ６．０〜７．０であり、安定ｐＨ範囲は
   ３７℃、３時間の保持条件においてｐＨ６．０〜８．５
   である。 ［４］反応至適温度および安定温度範囲反応の至適温度
   は４５℃であり、ｐＨ７．０で１０分間処理した時、４
   ０℃まで安定であり、６０℃以上で失活する。 ［５］分子量 ゲル濾過法により測定した分子量は約２５０，０００で
   ある。 ［６］阻害剤等の影響 銅、水銀、パラクロルメルクリ安息香酸により著しく阻
   害されるが、その他の金属イオンやＳＨ試薬および糖に
   よりほとんど影響を受けない。
2. （２）請求項（１）記載のα−Ｌ−フコシダーゼ生産能
   を有するバチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
   ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）。
3. （３）請求項（１）記載のα−Ｌ−フコシダーゼ生産能
   を有するバチルス属に属する菌株微工研菌寄第１０７８
   ８号。
4. （４）バチルス属に属し、菌体外にα−Ｌ−フコシダー
   ゼを生産する能力を有する微生物を培養し、培養物より
   α−Ｌ−フコシダーゼを採取することを特徴とするα−
   Ｌ−フコシダーゼの製造方法。
5. （５）請求項第（４）記載の微生物が請求項（２）又は
   （３）記載のものである請求項（４）記載の製造法。