JPS61177986A - ピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
ピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法Info
- Publication number
- JPS61177986A JPS61177986A JP60017940A JP1794085A JPS61177986A JP S61177986 A JPS61177986 A JP S61177986A JP 60017940 A JP60017940 A JP 60017940A JP 1794085 A JP1794085 A JP 1794085A JP S61177986 A JPS61177986 A JP S61177986A
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- JP
- Japan
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- pyranose oxidase
- culture
- pyranose
- oxidase
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- Pending
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はピラノース・オキシダーゼの製造法に関する。
従来の技術
ポリポラス属微生物を用いる方法(Methods i
nBnzymol vol XLl、 p、170.
1975) 、コリオラス属。
nBnzymol vol XLl、 p、170.
1975) 、コリオラス属。
ダエダレオプシス属、プロイロタス属またはグロエオフ
ィルム属微生物を用いる方法(特開昭58−43785
号公報)が知られている。
ィルム属微生物を用いる方法(特開昭58−43785
号公報)が知られている。
発明の目的
従来知られている微生物以外でピラノース・オキシダー
ゼを製造する微生物を見い出した。
ゼを製造する微生物を見い出した。
問題点を解決するための手段
本発明方法によると、イルペックス属、オウリキュラリ
ア属、コプリナス属またはトラメテス属に属し、ピラノ
ース・オキシダーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に
培養することにより、培養物中に収率よくピラノース・
オキシダーゼを帰ることができる。
ア属、コプリナス属またはトラメテス属に属し、ピラノ
ース・オキシダーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に
培養することにより、培養物中に収率よくピラノース・
オキシダーゼを帰ることができる。
本発明に使用される微生物は、イルペックス属。
オウリキニラリア属、コプリナス属またはトラメテス属
に属し、ピラノース・オキシダーゼを生産する能力を有
するものであればいずれの菌株でもよい。好適な菌株の
例としては、イルペックス・ラフテラx (Irpex
Iacteus)ATCC20123゜オウリキニラ
リア・ポリトリ力(Auriculariapolyt
richa) Z −229(微工研菌寄第7119号
)、コプリナス・ミカセウス(Coprinus m1
caceus)ATCC20122,)ラメテス・シン
ナバリナx (Trametes cinnabari
nus) I F 06139等があげられる。これら
の微生物の菌学的性質は、伊藤誠哉著「日本菌類誌J
(1955)養賢堂に記載されている。
に属し、ピラノース・オキシダーゼを生産する能力を有
するものであればいずれの菌株でもよい。好適な菌株の
例としては、イルペックス・ラフテラx (Irpex
Iacteus)ATCC20123゜オウリキニラ
リア・ポリトリ力(Auriculariapolyt
richa) Z −229(微工研菌寄第7119号
)、コプリナス・ミカセウス(Coprinus m1
caceus)ATCC20122,)ラメテス・シン
ナバリナx (Trametes cinnabari
nus) I F 06139等があげられる。これら
の微生物の菌学的性質は、伊藤誠哉著「日本菌類誌J
(1955)養賢堂に記載されている。
本発明に使用される栄養培地は炭素源、窒素源。
無機物その他使用菌株の必要とする微量栄養素を程よく
含有するものであれば合成培地、天然培地のいずれも使
用可能である。
含有するものであれば合成培地、天然培地のいずれも使
用可能である。
炭素源としては、グルコース、シニクロース。
デキストリン、でんぷん、グリセリン、糖蜜などの炭水
化物などが用いられる。
化物などが用いられる。
窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム
、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、グルタミン
酸などのアミノ酸など無機あるいは有機の窒素化合物、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーン
・スチープ・リカーなどの窒素含を天然物が使用できる
。
、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、グルタミン
酸などのアミノ酸など無機あるいは有機の窒素化合物、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーン
・スチープ・リカーなどの窒素含を天然物が使用できる
。
無機物としては、リン酸−カリウム、リン酸二カリウム
、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用できる。
、硫酸マグネシウム、塩化第二鉄などが使用できる。
培養は、通常通気攪拌培養で行う。培養温度は20〜3
5℃、培地のpHは3、O〜8,0の範囲にあることが
望ましく、培養期間は3〜7日で完了する。
5℃、培地のpHは3、O〜8,0の範囲にあることが
望ましく、培養期間は3〜7日で完了する。
上記の方法で培養することにより、培養物中、主に菌体
中にピラノース・オキシダーゼが生成蓄積する。
中にピラノース・オキシダーゼが生成蓄積する。
培養物中からのピラノース・オキシダーゼの採取は例え
ば次のように行う。
ば次のように行う。
培養終了後、培養液を濾過して菌体を得、ついでこの菌
体を適当な手段で破砕し、破砕液から遠心分離等によっ
てよ清液を得る。上清液を通常酵素精製に用いられる方
法、たとえば、塩析、有機溶媒沈殿、透析、イオン交換
カラムクロマト、ゲル濾過、凍結乾燥などの方法で処理
する。以上のようにして精製ピラノース・オキシダーゼ
を採取することができる。本発明におけるピラノース・
オキシダーゼの活性は次の方法で測定する。
体を適当な手段で破砕し、破砕液から遠心分離等によっ
てよ清液を得る。上清液を通常酵素精製に用いられる方
法、たとえば、塩析、有機溶媒沈殿、透析、イオン交換
カラムクロマト、ゲル濾過、凍結乾燥などの方法で処理
する。以上のようにして精製ピラノース・オキシダーゼ
を採取することができる。本発明におけるピラノース・
オキシダーゼの活性は次の方法で測定する。
0、1 M )リス−塩酸緩衝液(pH7,0) 1.
Oa+1゜発色液〔4−アミノアンチピリン、フェノー
ルを各# 10 m mol/1含むO,l M )リ
スー塩酸at衡液(pH7,0)にパーオキシダーゼを
該溶液100a11当り2. OOO単位含有させたも
の:l O,2ffil、 IMグルコース溶液Q、1
ml、ピラノース・オキシダーゼ溶液Q、1ml、Q、
l mM FADO,1ml、水1.5ffllより
成る全量3.01111の酵素含有液を37℃で反応し
、500nmの吸光度の増加を記録計で自動的に記録し
た。この条件下で生成するキノンイミン色素の分子吸光
係数を5.3X10”とし、37℃、p H7,0にお
いて1分間に1 、IJIIIOI (7)過酸化水素
を生成する酵素量を1単位とすると、ピラノース・オキ
シダーゼの単位は として表示される。
Oa+1゜発色液〔4−アミノアンチピリン、フェノー
ルを各# 10 m mol/1含むO,l M )リ
スー塩酸at衡液(pH7,0)にパーオキシダーゼを
該溶液100a11当り2. OOO単位含有させたも
の:l O,2ffil、 IMグルコース溶液Q、1
ml、ピラノース・オキシダーゼ溶液Q、1ml、Q、
l mM FADO,1ml、水1.5ffllより
成る全量3.01111の酵素含有液を37℃で反応し
、500nmの吸光度の増加を記録計で自動的に記録し
た。この条件下で生成するキノンイミン色素の分子吸光
係数を5.3X10”とし、37℃、p H7,0にお
いて1分間に1 、IJIIIOI (7)過酸化水素
を生成する酵素量を1単位とすると、ピラノース・オキ
シダーゼの単位は として表示される。
ΔAsoo :単位時間(1分間)当りの500nmの
吸光度増加量 次に、実施例1により得られたピラノース・オキシダー
ゼの性質を示す。
吸光度増加量 次に、実施例1により得られたピラノース・オキシダー
ゼの性質を示す。
(1)安定pH範囲
酵素標品を第1図に示した種々のpHを有するクエン酸
緩衝液、トリス緩衝液、はう酸緩衝液に100 mul
o、 7mlとなるよウニ溶解シ、これらの溶液を50
℃に30分間保持した。冷却後中和し、残存活性を測定
した。第1図から本酵素の安定pH範囲は5.0〜7.
4であることがわかる。
緩衝液、トリス緩衝液、はう酸緩衝液に100 mul
o、 7mlとなるよウニ溶解シ、これらの溶液を50
℃に30分間保持した。冷却後中和し、残存活性を測定
した。第1図から本酵素の安定pH範囲は5.0〜7.
4であることがわかる。
(2)最適pH
酵素標品を第2図に示した種々のpHを有するトリス緩
衝液に250 mu/3.7mlとなるように溶解し酸
素吸収測定用セル(給水科学研究新製BIOXYGRA
PH) 1.:入れ、1Mグルコース50μlを添加し
て酸素吸収量を測定した。第2図から本酵素の最適pH
は6.2付近にあることがわかる。
衝液に250 mu/3.7mlとなるように溶解し酸
素吸収測定用セル(給水科学研究新製BIOXYGRA
PH) 1.:入れ、1Mグルコース50μlを添加し
て酸素吸収量を測定した。第2図から本酵素の最適pH
は6.2付近にあることがわかる。
(3)最適温度
活性測定法と同じ組成を有する反応液で100muのピ
ラノース・オキシダーゼを使用し、第3図に示した各温
度で5分間反応した。第3図より本酵素の最適温度は5
0℃にあることがわかる。
ラノース・オキシダーゼを使用し、第3図に示した各温
度で5分間反応した。第3図より本酵素の最適温度は5
0℃にあることがわかる。
(4)耐熱性
0、2 M )リス緩衝液pH6,00,6+++1に
本酵素を100mU10.7+nlとなるように溶解し
、第4図に示した各温度で30分間熱処理後、残存活性
を測定した。第4図より本酵素は60℃、30分間処理
後も90%の残存活性を有することがわかる。
本酵素を100mU10.7+nlとなるように溶解し
、第4図に示した各温度で30分間熱処理後、残存活性
を測定した。第4図より本酵素は60℃、30分間処理
後も90%の残存活性を有することがわかる。
(5)基質特異性
活性測定法と同じ組成を有する反応液で、ピラノース・
オキシダーゼ2.5単位、反応の基質として第1表に示
した各種の糖溶液(100mM)Q、1ml使用した。
オキシダーゼ2.5単位、反応の基質として第1表に示
した各種の糖溶液(100mM)Q、1ml使用した。
活性は相対活性であられした。
第1表より本酵素はグルコースに対する特異性が高く、
他にソルボース、キシロースに作用した。
他にソルボース、キシロースに作用した。
第 1 表
基 質 相対活性(%)
グルコース 100
マ ン ノ − ス
0.9ガラクトース 0.9 ソルボース 3.4 フラクトース 0 キ シ ロ − ス
2.6マルトース 0 トレハロース O ラ り ト − ス
0マンニトール 0 グルコサミン 0 グルコン酸 O 従来のポリポラス属の微生物から得られたピラノース・
オキシダーゼに比べてソルボース、キシロースに対する
基質特異性が極めて弱い(B。
0.9ガラクトース 0.9 ソルボース 3.4 フラクトース 0 キ シ ロ − ス
2.6マルトース 0 トレハロース O ラ り ト − ス
0マンニトール 0 グルコサミン 0 グルコン酸 O 従来のポリポラス属の微生物から得られたピラノース・
オキシダーゼに比べてソルボース、キシロースに対する
基質特異性が極めて弱い(B。
B、 A、 167501〜510 (1968)の表
1参照)。
1参照)。
以下に、本発明の実施例を示す。
実施例1゜
グルコース0.5g/dl、酵母エキス0.4g/di
。
。
麦芽エキスIg/j!、塩化第二鉄1■/dl(1)8
6.0)より成る種培養培地3Qmlを30 Qml容
フラスコに入れ、120℃で15分間殺菌する。この培
地にイルペックス・ラフテラス ATCC20123を
1白金耳接種し、30℃で5日間振盪培養する。得られ
る種培養液(第一種培策液)39mlを21培養フラス
コに入れた前記と同じ組成を有する種培養培地300m
lに接種し、30℃で4日間振盪培養する。得られる種
培養液(第二種培養液)1.2j!を30j2ジャーフ
ァーメンタ−に入れた種培養培地と同じ組成の発酵培地
181に接種し、30℃、250rprn、通気量1β
/l /minで2日間本培養を行う。
6.0)より成る種培養培地3Qmlを30 Qml容
フラスコに入れ、120℃で15分間殺菌する。この培
地にイルペックス・ラフテラス ATCC20123を
1白金耳接種し、30℃で5日間振盪培養する。得られ
る種培養液(第一種培策液)39mlを21培養フラス
コに入れた前記と同じ組成を有する種培養培地300m
lに接種し、30℃で4日間振盪培養する。得られる種
培養液(第二種培養液)1.2j!を30j2ジャーフ
ァーメンタ−に入れた種培養培地と同じ組成の発酵培地
181に接種し、30℃、250rprn、通気量1β
/l /minで2日間本培養を行う。
培養物中のピラノース・オキシダーゼは発酵液1ml当
り320mUである。
り320mUである。
培養液からのピラノース・オキシダーゼの採取は次のご
とく行う。培養物を吸引洲過して湿菌体約1kgを得る
。この菌体を50mM)リス−塩酸緩衝液(pH7,0
)(以下用いる緩衝液はすべてこの(1@液である。)
1.1に懸濁した後、ホモジナイザーで菌体を細断する
。遠心分離して得た上清1.81にアルカリを添加して
p H7,0に調整した後、緩衝液で平衡化したHPA
−75(三菱化成)の11カラムに流し緩衝液で洗浄す
る。次に0.1 M硫安を含む緩衝液で洗浄し、0.2
5 M硫安を含む緩衝液で酵素の溶出を行う。活性画分
を合わせ、硫安80%飽和とし遠心分離によって沈殿物
を得る。沈殿を30m1の緩衝液に溶解し、セファロー
ス4日のIZカラムにかけ、緩衝液で溶出する。活性画
分を合わせ、硫安80%飽和沈殿を遠心分離によって集
める。これを30m1の緩衝液に溶解し、セファデック
スG−100の500m1カラムにかけ、緩衝液で溶出
する。活性画分を凍結乾燥し、ピラノース・オキシダー
ゼの粉末1.6gを得る。菌体抽出液からの精製収率は
43%、比活性9.60/@g蛋白である。
とく行う。培養物を吸引洲過して湿菌体約1kgを得る
。この菌体を50mM)リス−塩酸緩衝液(pH7,0
)(以下用いる緩衝液はすべてこの(1@液である。)
1.1に懸濁した後、ホモジナイザーで菌体を細断する
。遠心分離して得た上清1.81にアルカリを添加して
p H7,0に調整した後、緩衝液で平衡化したHPA
−75(三菱化成)の11カラムに流し緩衝液で洗浄す
る。次に0.1 M硫安を含む緩衝液で洗浄し、0.2
5 M硫安を含む緩衝液で酵素の溶出を行う。活性画分
を合わせ、硫安80%飽和とし遠心分離によって沈殿物
を得る。沈殿を30m1の緩衝液に溶解し、セファロー
ス4日のIZカラムにかけ、緩衝液で溶出する。活性画
分を合わせ、硫安80%飽和沈殿を遠心分離によって集
める。これを30m1の緩衝液に溶解し、セファデック
スG−100の500m1カラムにかけ、緩衝液で溶出
する。活性画分を凍結乾燥し、ピラノース・オキシダー
ゼの粉末1.6gを得る。菌体抽出液からの精製収率は
43%、比活性9.60/@g蛋白である。
実施例2゜
実施例1において、第2表に示す菌株を用いる以外は、
実施例1と同様に培養する。培養物中のピラノース・オ
キシダーゼは第2表のとおりである。
実施例1と同様に培養する。培養物中のピラノース・オ
キシダーゼは第2表のとおりである。
第 2 表
発明の効果
本発明方法により、収率よくピラノース・オキシダーゼ
を得ることができる。
を得ることができる。
第1図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と安定p
H範囲との関係を示す。 第2図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と最適p
)Iとの関係を示す。 第3図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と最適温
度との関係を示す。 第4図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と耐熱性
との関係を示す。
H範囲との関係を示す。 第2図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と最適p
)Iとの関係を示す。 第3図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と最適温
度との関係を示す。 第4図はピラノース・オキシダーゼの相対活性と耐熱性
との関係を示す。
Claims (1)
- イルペックス属、オウリキュラリア属、コプリナス属ま
たはトラメテス属に属し、ピラノース・オキシダーゼ生
産能を有する微生物を栄養培地に培養し、培養物中にピ
ラノース・オキシダーゼを生成蓄積させ、これを採取す
ることを特徴とするピラノース・オキシダーゼの製造法
。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60017940A JPS61177986A (ja) | 1985-02-01 | 1985-02-01 | ピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP60017940A JPS61177986A (ja) | 1985-02-01 | 1985-02-01 | ピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS61177986A true JPS61177986A (ja) | 1986-08-09 |
Family
ID=11957773
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP60017940A Pending JPS61177986A (ja) | 1985-02-01 | 1985-02-01 | ピラノ−ス・オキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS61177986A (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5468621A (en) * | 1992-03-02 | 1995-11-21 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol |
-
1985
- 1985-02-01 JP JP60017940A patent/JPS61177986A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5468621A (en) * | 1992-03-02 | 1995-11-21 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol |
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