JP3029915B2 - 耐熱性アデノシン−５’−ホスホスルフェートキナーゼ及びその製造法 - Google Patents
耐熱性アデノシン−５’−ホスホスルフェートキナーゼ及びその製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、熱安定性に優れたバイ
オリアクターに有用に用いうる性質を有する耐熱性アデ
ノシン−5'−ホスホスルフェートキナーゼ（以下，ＡＰ
Ｓキナーゼという。）及びその製造法に関するものであ
る。
オリアクターに有用に用いうる性質を有する耐熱性アデ
ノシン−5'−ホスホスルフェートキナーゼ（以下，ＡＰ
Ｓキナーゼという。）及びその製造法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】3'−ホスホアデノシン−5'−ホスホスル
フェート（以下，ＰＡＰＳという）は、微生物から植
物、高等動物に至るまで広く分布する硫酸基供与体であ
る。生体中のＰＡＰＳとプロテオグルカン疾患に代表さ
れるいくつかの疾患との関わりが報告されている〔ブレ
インリサーチ(Brain Research)，Vol.20,p.341-360(197
0)〕。このように、ＰＡＰＳの生体内での役割は非常に
重要であり、医薬などの分野に高い利用価値があると考
えられる。ＰＡＰＳは、下記のように、アデノシン−5'
−３リン酸（以下，ＡＴＰという。）から、アデノシン
−5'−３リン酸スルフリラーゼ（以下，ＡＴＰスルフリ
ラーゼという。）とＡＰＳキナーゼの二つの酵素の働き
で合成される物質である。
フェート（以下，ＰＡＰＳという）は、微生物から植
物、高等動物に至るまで広く分布する硫酸基供与体であ
る。生体中のＰＡＰＳとプロテオグルカン疾患に代表さ
れるいくつかの疾患との関わりが報告されている〔ブレ
インリサーチ(Brain Research)，Vol.20,p.341-360(197
0)〕。このように、ＰＡＰＳの生体内での役割は非常に
重要であり、医薬などの分野に高い利用価値があると考
えられる。ＰＡＰＳは、下記のように、アデノシン−5'
−３リン酸（以下，ＡＴＰという。）から、アデノシン
−5'−３リン酸スルフリラーゼ（以下，ＡＴＰスルフリ
ラーゼという。）とＡＰＳキナーゼの二つの酵素の働き
で合成される物質である。
【０００３】 ATPスルフリラーセ゛ ATP ＋ SO4 2- ←───────→ APS ＋ PPi APS キナーセ゛ APS ＋ ATP ←───────→ PAPS ＋ ADP （式中、ＡＰＳは、アデノシン−5'−ホスホスルフェートを表す。）
【０００４】従来、ＡＰＳキナーゼは、湿菌体当たりの
含量が非常に低く、そのためにＰＡＰＳを大量に合成で
きないという問題点があった。また、パン酵母（Dry ba
ker's yeast, Sigma YSC-1）のＡＰＳキナーゼを３０℃
で保温したところ、１時間で残存活性が約８％しかな
く、ＡＰＳキナーゼは非常に熱に不安定であり、ＰＡＰ
Ｓを効率的に合成することが出来なかった。
含量が非常に低く、そのためにＰＡＰＳを大量に合成で
きないという問題点があった。また、パン酵母（Dry ba
ker's yeast, Sigma YSC-1）のＡＰＳキナーゼを３０℃
で保温したところ、１時間で残存活性が約８％しかな
く、ＡＰＳキナーゼは非常に熱に不安定であり、ＰＡＰ
Ｓを効率的に合成することが出来なかった。
【０００５】上述のような理由から、ＰＡＰＳを効率的
に合成する場合や、ＡＰＳと病態との関連を調べるため
にＡＰＳキナーゼを体液中のＡＰＳ濃度の測定等に利用
しようとする場合、工業的に実施できるものがなく、実
用化することが強く要望されていた。
に合成する場合や、ＡＰＳと病態との関連を調べるため
にＡＰＳキナーゼを体液中のＡＰＳ濃度の測定等に利用
しようとする場合、工業的に実施できるものがなく、実
用化することが強く要望されていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記したよ
うな観点から、安定性の高いＡＰＳキナーゼ及びその製
造法を提供することを目的とするものである。
うな観点から、安定性の高いＡＰＳキナーゼ及びその製
造法を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、安定性の
高いＡＰＳキナーゼを効率よく得ることを目的として鋭
意研究した結果、バチルス・アシドカルダリウス（Baci
llus acidocaldarius），バチルス・コアギュランス
（B.coagulans ），バチルス・リケニフォルミス（B.li
cheniformis ），バチルス・シェレゲリ（B.schlegeli
i），バチルス・ステアロサーモフィルス（B.stearothe
rmophilus）などのバチルス属の細菌が、上記の性質を
有するＡＰＳキナーゼを生産することを見出し、本発明
を完成するに至った。
高いＡＰＳキナーゼを効率よく得ることを目的として鋭
意研究した結果、バチルス・アシドカルダリウス（Baci
llus acidocaldarius），バチルス・コアギュランス
（B.coagulans ），バチルス・リケニフォルミス（B.li
cheniformis ），バチルス・シェレゲリ（B.schlegeli
i），バチルス・ステアロサーモフィルス（B.stearothe
rmophilus）などのバチルス属の細菌が、上記の性質を
有するＡＰＳキナーゼを生産することを見出し、本発明
を完成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明は、以下の理化学的性質
を有する耐熱性アデノシン−5'−ホスホスルフェートキ
ナーゼ及び； （イ）作用：ＡＴＰとＡＰＳに作用し、ＰＡＰＳを生成
する。 （ロ）至適ｐＨ：約７.5〜約９.5である。 （ハ）作用適温：約５０℃〜約７０℃である。 （ニ）耐熱性：約６０℃の緩衝液中で約１５分間処理し
た後の活性が、処理前の活性の約９５％の値を保持して
いる。 （ホ）分子量：約５万（ゲル濾過法）。 バチルス属の細菌（Bacillus sp. ）を培養し、培養物
から以下の理化学的性質を有する耐熱性アデノシン−5'
−ホスホスルフェートキナーゼを採取することを特徴と
する耐熱性アデノシン−5'−ホスホスルフェートキナー
ゼの製造法を要旨とするものである。 （イ）作用：ＡＴＰとＡＰＳに作用し、ＰＡＰＳを生成
する。 （ロ）至適ｐＨ：約７.5〜約９.5である。 （ハ）作用適温：約５０℃〜約７０℃である。 （ニ）耐熱性：約６０℃の緩衝液中で約１５分間処理し
た後の活性が、処理前の活性の約９５％の値を保持して
いる。 （ホ）分子量：約５万（ゲル濾過法）。
を有する耐熱性アデノシン−5'−ホスホスルフェートキ
ナーゼ及び； （イ）作用：ＡＴＰとＡＰＳに作用し、ＰＡＰＳを生成
する。 （ロ）至適ｐＨ：約７.5〜約９.5である。 （ハ）作用適温：約５０℃〜約７０℃である。 （ニ）耐熱性：約６０℃の緩衝液中で約１５分間処理し
た後の活性が、処理前の活性の約９５％の値を保持して
いる。 （ホ）分子量：約５万（ゲル濾過法）。 バチルス属の細菌（Bacillus sp. ）を培養し、培養物
から以下の理化学的性質を有する耐熱性アデノシン−5'
−ホスホスルフェートキナーゼを採取することを特徴と
する耐熱性アデノシン−5'−ホスホスルフェートキナー
ゼの製造法を要旨とするものである。 （イ）作用：ＡＴＰとＡＰＳに作用し、ＰＡＰＳを生成
する。 （ロ）至適ｐＨ：約７.5〜約９.5である。 （ハ）作用適温：約５０℃〜約７０℃である。 （ニ）耐熱性：約６０℃の緩衝液中で約１５分間処理し
た後の活性が、処理前の活性の約９５％の値を保持して
いる。 （ホ）分子量：約５万（ゲル濾過法）。
【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
耐熱性ＡＰＳキナーゼは以下の理化学的性質を有するも
のである。 （イ）作用：ＡＴＰとＡＰＳに作用し、ＰＡＰＳを生成
する。 （ロ）基質特異性：正反応においては、ＡＰＳおよびＡ
ＴＰが基質となる。しかし、ＡＭＰには実質上作用しな
い。逆反応においては、ＰＡＰＳとＡＤＰが基質とな
る。ただし、2'−ホスホアデノシン−5'−ホスホスルフ
ェートは、ＰＡＰＳの０．００５％以下の活性しか示さ
ない。 （ハ）至適ｐＨ：後述する力価の測定法に従い、用いる
緩衝液のｐＨを変えて力価を測定した結果、図１に示す
とおり約７.5〜９.5である。 （ニ）安定ｐＨ：ｐＨ５.0〜10.0の緩衝液中で、４℃、
２０時間保存した後、後述する力価の測定法に従って力
価を測定した。その結果は図２に示すとおり約５.0〜
７.5である。 （ホ）作用適温：温度を２０℃〜８０℃に変え、後述の
方法で力価の測定を行った。その結果は図３に示すとお
り、作用適温は約５０℃〜約７０℃である。 （ヘ）耐熱性：約６０℃の緩衝液中で約１５分間処理し
た後、後述する力価の測定法により活性を測定した結
果、処理前の活性の９５％の値を保持している。 （ト）阻害：後述する力価の測定法にリン酸を加えて測
定したところ、リン酸による阻害がみられた。その阻害
定数ＫＩは９０ｍＭである。 （チ）分子量：ゲル濾過法により分子量を測定した。分
子量は約５万である。
耐熱性ＡＰＳキナーゼは以下の理化学的性質を有するも
のである。 （イ）作用：ＡＴＰとＡＰＳに作用し、ＰＡＰＳを生成
する。 （ロ）基質特異性：正反応においては、ＡＰＳおよびＡ
ＴＰが基質となる。しかし、ＡＭＰには実質上作用しな
い。逆反応においては、ＰＡＰＳとＡＤＰが基質とな
る。ただし、2'−ホスホアデノシン−5'−ホスホスルフ
ェートは、ＰＡＰＳの０．００５％以下の活性しか示さ
ない。 （ハ）至適ｐＨ：後述する力価の測定法に従い、用いる
緩衝液のｐＨを変えて力価を測定した結果、図１に示す
とおり約７.5〜９.5である。 （ニ）安定ｐＨ：ｐＨ５.0〜10.0の緩衝液中で、４℃、
２０時間保存した後、後述する力価の測定法に従って力
価を測定した。その結果は図２に示すとおり約５.0〜
７.5である。 （ホ）作用適温：温度を２０℃〜８０℃に変え、後述の
方法で力価の測定を行った。その結果は図３に示すとお
り、作用適温は約５０℃〜約７０℃である。 （ヘ）耐熱性：約６０℃の緩衝液中で約１５分間処理し
た後、後述する力価の測定法により活性を測定した結
果、処理前の活性の９５％の値を保持している。 （ト）阻害：後述する力価の測定法にリン酸を加えて測
定したところ、リン酸による阻害がみられた。その阻害
定数ＫＩは９０ｍＭである。 （チ）分子量：ゲル濾過法により分子量を測定した。分
子量は約５万である。
【００１０】（リ）力価の測定法：測定原理は、ＡＴＰ
とＭｇＳＯ4 を基質として、ＡＴＰスルフリラーゼ（ビ
ール酵母由来）を作用させるとＡＰＳが生成する。これ
に酵素を作用させ、ＡＴＰとＡＰＳから生成したＰＡＰ
Ｓを定量するものである。 〔試薬〕 基質： 100mM ＡＴＰ 1M 硫酸マグネシウム 緩衝液：100mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0） 酵素： 50u/ml ＡＴＰスルフリラーゼ（ビール酵母由
来） 〔操作〕上記基質ＡＴＰ５μｌと硫酸マグネシウム５μ
ｌと緩衝液３８５μｌとＡＴＰスルフリラーゼ５μｌを
撹拌混和した後、酵素溶液１００μｌを加えて３０℃で
１０分間反応させる。反応終了後、沸騰水中に１分間浸
し、反応を停止させる。遠心後、上清をＨＰＬＣにて分
析し、生成したＰＡＰＳを定量する。盲検は、酵素溶液
無添加のものについて同様に処理してＰＡＰＳが生成し
ないことを確認する。このようにして得られた値から、
あらかじめ濃度既知のＡＴＰ溶液を用いてＨＰＬＣ分析
しておいた値に対し、ＰＡＰＳ濃度を定量する。酵素活
性の表示は、１分間に１μｍｏｌのＰＡＰＳを生成する
酵素量を１Ｕとする。
とＭｇＳＯ4 を基質として、ＡＴＰスルフリラーゼ（ビ
ール酵母由来）を作用させるとＡＰＳが生成する。これ
に酵素を作用させ、ＡＴＰとＡＰＳから生成したＰＡＰ
Ｓを定量するものである。 〔試薬〕 基質： 100mM ＡＴＰ 1M 硫酸マグネシウム 緩衝液：100mM トリス塩酸緩衝液(pH8.0） 酵素： 50u/ml ＡＴＰスルフリラーゼ（ビール酵母由
来） 〔操作〕上記基質ＡＴＰ５μｌと硫酸マグネシウム５μ
ｌと緩衝液３８５μｌとＡＴＰスルフリラーゼ５μｌを
撹拌混和した後、酵素溶液１００μｌを加えて３０℃で
１０分間反応させる。反応終了後、沸騰水中に１分間浸
し、反応を停止させる。遠心後、上清をＨＰＬＣにて分
析し、生成したＰＡＰＳを定量する。盲検は、酵素溶液
無添加のものについて同様に処理してＰＡＰＳが生成し
ないことを確認する。このようにして得られた値から、
あらかじめ濃度既知のＡＴＰ溶液を用いてＨＰＬＣ分析
しておいた値に対し、ＰＡＰＳ濃度を定量する。酵素活
性の表示は、１分間に１μｍｏｌのＰＡＰＳを生成する
酵素量を１Ｕとする。
【００１１】本発明の耐熱性ＡＰＳキナーゼは、バチル
ス属の細菌から得られるものであり、そのようなバチル
ス属の細菌としては、例えばバチルス・アシドカルダリ
ウス（Bacillus acidocaldarius），バチルス・コアギ
ュランス（B.coagulans ），バチルス・リケニフォルミ
ス（B.licheniformis ），バチルス・シェレゲリ（B.sc
hlegelii），バチルス・ステアロサーモフィルス（B.st
earothermophilus）などがあげられる。
ス属の細菌から得られるものであり、そのようなバチル
ス属の細菌としては、例えばバチルス・アシドカルダリ
ウス（Bacillus acidocaldarius），バチルス・コアギ
ュランス（B.coagulans ），バチルス・リケニフォルミ
ス（B.licheniformis ），バチルス・シェレゲリ（B.sc
hlegelii），バチルス・ステアロサーモフィルス（B.st
earothermophilus）などがあげられる。
【００１２】次に本発明の耐熱性ＡＰＳキナーゼの製造
法について説明する。本発明の耐熱性ＡＰＳキナーゼの
製造法は、上記したようなバチルス属の細菌を培養し、
その培養物から耐熱性のＡＰＳキナーゼを採取するもの
である。本発明におけるバチルス属の細菌を培養するに
際して用いられる栄養培地において、炭素源として、例
えば、グルコース、シュークロース、フルクトース、澱
粉加水分解物、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液の糖類、酢酸、
乳酸等の有機酸、さらには使用する細菌が資化しうるア
ルコール類、油脂、脂肪酸およびグリセリン等が使用で
き、窒素源として、例えば、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、アミノ
酸、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等の無機または有
機物が使用できる。さらに無機塩類として、例えば、カ
リウム、ナトリウム、リン酸、亜鉛、鉄、マグネシウ
ム、マンガン、銅、カルシウム、コバルト等の各塩類、
必要に応じて微量金属塩、コーンスティープリカー、ビ
タミン類、核酸等を使用してもよく、細菌の一般的栄養
培地が使用できる。これらの培地を用いて、バチルス属
の細菌を２０〜８０℃、好ましくは４０〜７０℃、最適
には６０℃で、２〜６時間、好気的に培養すればよい。
法について説明する。本発明の耐熱性ＡＰＳキナーゼの
製造法は、上記したようなバチルス属の細菌を培養し、
その培養物から耐熱性のＡＰＳキナーゼを採取するもの
である。本発明におけるバチルス属の細菌を培養するに
際して用いられる栄養培地において、炭素源として、例
えば、グルコース、シュークロース、フルクトース、澱
粉加水分解物、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液の糖類、酢酸、
乳酸等の有機酸、さらには使用する細菌が資化しうるア
ルコール類、油脂、脂肪酸およびグリセリン等が使用で
き、窒素源として、例えば、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、アミノ
酸、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等の無機または有
機物が使用できる。さらに無機塩類として、例えば、カ
リウム、ナトリウム、リン酸、亜鉛、鉄、マグネシウ
ム、マンガン、銅、カルシウム、コバルト等の各塩類、
必要に応じて微量金属塩、コーンスティープリカー、ビ
タミン類、核酸等を使用してもよく、細菌の一般的栄養
培地が使用できる。これらの培地を用いて、バチルス属
の細菌を２０〜８０℃、好ましくは４０〜７０℃、最適
には６０℃で、２〜６時間、好気的に培養すればよい。
【００１３】本発明で細胞破砕液を得る手段としては、
例えば、培養物から菌体を集菌したのち、ホモジナイザ
ー、ブレンダー、マントンゴーリン、ダイノミル、フレ
ンチプレス、超音波処理、凍結融解、リゾチーム処理等
により細胞を破砕して得ることが出来る。
例えば、培養物から菌体を集菌したのち、ホモジナイザ
ー、ブレンダー、マントンゴーリン、ダイノミル、フレ
ンチプレス、超音波処理、凍結融解、リゾチーム処理等
により細胞を破砕して得ることが出来る。
【００１４】次に上記細胞破砕液（細胞抽出液）にカチ
オン系高分子凝集剤を添加して、細胞破砕片及び核酸を
沈澱させる。本発明に用いられるカチオン系高分子凝集
剤としては、例えば、ポリアミノアルキルメタアクリレ
ート類、ポリアミノアルキルメタアクリレートとアクリ
ルアミドの共重合物類、ポリアクリルアミドのマンニツ
ヒ変性物類、ポリジメチルジアリルアンモニウム塩類、
ポリビニルイミダゾリン類、ポリアクリルアミド類、ア
ミン系重縮合物類などがあげられる。その際の高分子凝
集剤の添加量としては、凝集剤の種類によって異なる
が、破砕した微生物の乾燥重量１００重量部に対し１〜
４０重量部が好ましい。このカチオン系高分子凝集剤を
予め水に溶解した後、細胞破砕液に添加して１０分から
２４時間撹拌する。また、ｐＨの調整が必要な場合に
は、適宜１０〜２００ｍＭになるように緩衝液を加える
こともできるし、蛋白質の安定化のために、グルコース
を細胞破砕液１００重量部に対し、１〜５０重量部添加
してもよい。
オン系高分子凝集剤を添加して、細胞破砕片及び核酸を
沈澱させる。本発明に用いられるカチオン系高分子凝集
剤としては、例えば、ポリアミノアルキルメタアクリレ
ート類、ポリアミノアルキルメタアクリレートとアクリ
ルアミドの共重合物類、ポリアクリルアミドのマンニツ
ヒ変性物類、ポリジメチルジアリルアンモニウム塩類、
ポリビニルイミダゾリン類、ポリアクリルアミド類、ア
ミン系重縮合物類などがあげられる。その際の高分子凝
集剤の添加量としては、凝集剤の種類によって異なる
が、破砕した微生物の乾燥重量１００重量部に対し１〜
４０重量部が好ましい。このカチオン系高分子凝集剤を
予め水に溶解した後、細胞破砕液に添加して１０分から
２４時間撹拌する。また、ｐＨの調整が必要な場合に
は、適宜１０〜２００ｍＭになるように緩衝液を加える
こともできるし、蛋白質の安定化のために、グルコース
を細胞破砕液１００重量部に対し、１〜５０重量部添加
してもよい。
【００１５】次いで沈澱させた細胞破砕片及び核酸を分
離する。そのためには、例えば、静置するか、遠心分離
するか、あるいは濾過するかして行えばよい。これらの
操作により、粗酵素標品を得ることができる。さらに高
度に精製された酵素標品を得るには、ゲル濾過クロマト
グラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ等
の各種クロマトグラフィーを用いることができる。本発
明のＡＰＳキナーゼは、特にアフィニティークロマトグ
ラフィーを用いた場合、精製倍率が高くなり、より好ま
しい。上記のような方法により、本発明のＡＰＳキナー
ゼの標品が得られる。
離する。そのためには、例えば、静置するか、遠心分離
するか、あるいは濾過するかして行えばよい。これらの
操作により、粗酵素標品を得ることができる。さらに高
度に精製された酵素標品を得るには、ゲル濾過クロマト
グラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ等
の各種クロマトグラフィーを用いることができる。本発
明のＡＰＳキナーゼは、特にアフィニティークロマトグ
ラフィーを用いた場合、精製倍率が高くなり、より好ま
しい。上記のような方法により、本発明のＡＰＳキナー
ゼの標品が得られる。
【００１６】
【実施例】以下に本発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例中、酵素標品の蛋白質量は、２８０ｎｍの吸
収１を蛋白質１ｍｇ／ｍｌと仮定して求めた。 実施例１ グルコース濃度１.2％、酵母エキス濃度１％、リン酸濃
度0.２％及び若干のミネラルを含んだ培地を殺菌した
後、ｐＨを６.3に調整し、バチルス・ステアロサーモフ
ィルス（ＡＴＣＣ７９５３株）を接種し、培養を行っ
た。６０℃で４時間培養後、培地中のグルコースが消費
されたことを確認し、遠心分離にて集菌して菌体を得
た。上記のようにして得られた湿菌体を凍結融解法で破
砕したのち、ポリアクリルアミド系の高分子凝集剤を用
いて除核酸を行った。生じた沈澱を遠心分離で除去し
て、上清を得た。
る。実施例中、酵素標品の蛋白質量は、２８０ｎｍの吸
収１を蛋白質１ｍｇ／ｍｌと仮定して求めた。 実施例１ グルコース濃度１.2％、酵母エキス濃度１％、リン酸濃
度0.２％及び若干のミネラルを含んだ培地を殺菌した
後、ｐＨを６.3に調整し、バチルス・ステアロサーモフ
ィルス（ＡＴＣＣ７９５３株）を接種し、培養を行っ
た。６０℃で４時間培養後、培地中のグルコースが消費
されたことを確認し、遠心分離にて集菌して菌体を得
た。上記のようにして得られた湿菌体を凍結融解法で破
砕したのち、ポリアクリルアミド系の高分子凝集剤を用
いて除核酸を行った。生じた沈澱を遠心分離で除去し
て、上清を得た。
【００１７】あらかじめ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で平衡化したマトレックスゲルブルーＡカラ
ムにアプライした後、同緩衝液で十分洗浄し、１．５Ｍ
塩化カリウムを含む同緩衝液を送液した。得られた活性
画分に８００ｍＭとなるように硫酸アンモニウムを加
え、８００ｍＭ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したフェニルセルロファ
インカラムにアプライした。同緩衝液で十分洗浄した
後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を送液した。
活性画分を回収し、あらかじめ５０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース
カラムにアプライし、同緩衝液で十分洗浄したのち、同
緩衝液を用いて０から５００ｍＭの塩化ナトリウムの直
線濃度勾配にて溶出を行なった。その活性画分を回収
し、濃縮後、ポリアクリルアミド電気泳動を行ったとこ
ろ、単一なバンドが得られた。
Ｈ７．５）で平衡化したマトレックスゲルブルーＡカラ
ムにアプライした後、同緩衝液で十分洗浄し、１．５Ｍ
塩化カリウムを含む同緩衝液を送液した。得られた活性
画分に８００ｍＭとなるように硫酸アンモニウムを加
え、８００ｍＭ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したフェニルセルロファ
インカラムにアプライした。同緩衝液で十分洗浄した
後、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０を送液した。
活性画分を回収し、あらかじめ５０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−セファロース
カラムにアプライし、同緩衝液で十分洗浄したのち、同
緩衝液を用いて０から５００ｍＭの塩化ナトリウムの直
線濃度勾配にて溶出を行なった。その活性画分を回収
し、濃縮後、ポリアクリルアミド電気泳動を行ったとこ
ろ、単一なバンドが得られた。
【００１８】酵素標品の比活性は、１．５Ｕ／ｍｇであ
った。得られた酵素標品について、理化学的諸性質を調
べたところ前記した（イ）から（チ）に記載した性質を
有していた。
った。得られた酵素標品について、理化学的諸性質を調
べたところ前記した（イ）から（チ）に記載した性質を
有していた。
【００１９】実施例２ グルコース濃度0.７％、酵母エキス濃度0.８％、リン酸
濃度0.０５％及び若干のミネラルを含んだ培地を殺菌し
た後、ｐＨを６.5に調整し、バチルス・コアギュランス
（ＡＴＣＣ７０５０株）を接種し、培養を行った。６０
℃で４時間培養後、培地中のグルコースが消費されたこ
とを確認し、遠心分離にて集菌して菌体を得た。上記の
ようにして得られた湿菌体をフレンチプレスにて破砕し
たのち、ポリアクリルアミド系の高分子凝集剤を用いて
除核酸を行った。生じた沈澱を遠心分離で除去して、Ａ
ＰＳキナーゼを含む粗抽出液を得た。
濃度0.０５％及び若干のミネラルを含んだ培地を殺菌し
た後、ｐＨを６.5に調整し、バチルス・コアギュランス
（ＡＴＣＣ７０５０株）を接種し、培養を行った。６０
℃で４時間培養後、培地中のグルコースが消費されたこ
とを確認し、遠心分離にて集菌して菌体を得た。上記の
ようにして得られた湿菌体をフレンチプレスにて破砕し
たのち、ポリアクリルアミド系の高分子凝集剤を用いて
除核酸を行った。生じた沈澱を遠心分離で除去して、Ａ
ＰＳキナーゼを含む粗抽出液を得た。
【００２０】あらかじめ５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で平衡化したマトレックスゲルブルーＡカラ
ムにアプライした後、同緩衝液で十分洗浄し、１．５Ｍ
塩化カリウムを含む同緩衝液を送液した。得られた活性
画分を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡
化したヒドロキシアパタイトにアプライした。同緩衝液
で十分洗浄した後、１００ｍＭリン酸二カリウムを含む
同緩衝液を送液した。溶出した活性画分を濃縮後、５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を溶出液に用いた
セファデックスＧ−１００カラムクロマトグラフィーに
より分画し、活性画分を得た。濃縮後、ポリアクリルア
ミド電気泳動で単一なバンドを与えるまで精製できた。
Ｈ７．５）で平衡化したマトレックスゲルブルーＡカラ
ムにアプライした後、同緩衝液で十分洗浄し、１．５Ｍ
塩化カリウムを含む同緩衝液を送液した。得られた活性
画分を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡
化したヒドロキシアパタイトにアプライした。同緩衝液
で十分洗浄した後、１００ｍＭリン酸二カリウムを含む
同緩衝液を送液した。溶出した活性画分を濃縮後、５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を溶出液に用いた
セファデックスＧ−１００カラムクロマトグラフィーに
より分画し、活性画分を得た。濃縮後、ポリアクリルア
ミド電気泳動で単一なバンドを与えるまで精製できた。
【００２１】この酵素標品の比活性は、２．２０Ｕ／ｍ
ｇであった。得られた酵素標品について、理化学的諸性
質を調べたところ前記した（イ）から（チ）に記載した
性質を有していた。
ｇであった。得られた酵素標品について、理化学的諸性
質を調べたところ前記した（イ）から（チ）に記載した
性質を有していた。
【００２２】
【発明の効果】本発明のＡＰＳキナーゼは、従来知られ
ているＡＰＳキナーゼに比べ、はるかに熱安定性に優れ
ているため、バイオリアクタ−等として好適に使用する
ことができる。
ているＡＰＳキナーゼに比べ、はるかに熱安定性に優れ
ているため、バイオリアクタ−等として好適に使用する
ことができる。
【図１】本発明のＡＰＳキナーゼの至適ｐＨ曲線を示す
図である。
図である。
【図２】本発明のＡＰＳキナーゼのｐＨ安定性曲線を示
す図である。
す図である。
【図３】本発明のＡＰＳキナーゼの作用適温を示す図で
ある。
ある。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−268180（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−65181（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−164787（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/64 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 以下の理化学的性質を有する耐熱性アデ
ノシン−5'−ホスホスルフェートキナーゼ。 （イ）作用：アデノシン−5'−３リン酸とアデノシン−
5'−ホスホスルフェートに作用し、3'−ホスホアデノシ
ン−5'−ホスホスルフェートを生成する。 （ロ）至適ｐＨ：約７.5〜約９.5である。 （ハ）作用適温：約５０℃〜約７０℃である。 （ニ）耐熱性：約６０℃の緩衝液中で約１５分間処理し
た後の活性が、処理前の活性の約９５％の値を保持して
いる。 （ホ）分子量：約５万（ゲル濾過法）。 - 【請求項２】 バチルス属の細菌（Bacillus sp. ）を
培養し、培養物から以下の理化学的性質を有する耐熱性
アデノシン−5'−ホスホスルフェートキナーゼを採取す
ることを特徴とする耐熱性アデノシン−5'−ホスホスル
フェートキナーゼの製造法。 （イ）作用：アデノシン−5'−３リン酸とアデノシン−
5'−ホスホスルフェートに作用し、3'−ホスホアデノシ
ン−5'−ホスホスルフェートを生成する。 （ロ）至適ｐＨ：約７.5〜約９.5である。 （ハ）作用適温：約５０℃〜約７０℃である。 （ニ）耐熱性：約６０℃の緩衝液中で約１５分間処理し
た後の活性が、処理前の活性の約９５％の値を保持して
いる。 （ホ）分子量：約５万（ゲル濾過法）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8164792A JP3029915B2 (ja) | 1992-03-02 | 1992-03-02 | 耐熱性アデノシン−５’−ホスホスルフェートキナーゼ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8164792A JP3029915B2 (ja) | 1992-03-02 | 1992-03-02 | 耐熱性アデノシン−５’−ホスホスルフェートキナーゼ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05236954A JPH05236954A (ja) | 1993-09-17 |
| JP3029915B2 true JP3029915B2 (ja) | 2000-04-10 |
Family
ID=13752134
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8164792A Expired - Fee Related JP3029915B2 (ja) | 1992-03-02 | 1992-03-02 | 耐熱性アデノシン−５’−ホスホスルフェートキナーゼ及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3029915B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2100956A1 (en) | 2005-01-25 | 2009-09-16 | Yamasa Corporation | Method of enzymatically synthesizing 3'-phosphoadenosine-5'-phophosulfate |
| JP2012201665A (ja) * | 2011-03-28 | 2012-10-22 | Yamasa Shoyu Co Ltd | 保湿作用を有する皮膚外用剤 |
| KR102269115B1 (ko) * | 2019-08-28 | 2021-06-24 | 이태준 | 시각적인 확인이 가능한 대류현상 실험장치 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110862953B (zh) * | 2019-12-19 | 2022-08-09 | 深圳市安达医疗感控科技有限公司 | 一种嗜热脂肪地芽孢杆菌芽孢的制备和萌发方法及其应用 |
-
1992
- 1992-03-02 JP JP8164792A patent/JP3029915B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2100956A1 (en) | 2005-01-25 | 2009-09-16 | Yamasa Corporation | Method of enzymatically synthesizing 3'-phosphoadenosine-5'-phophosulfate |
| JP2012201665A (ja) * | 2011-03-28 | 2012-10-22 | Yamasa Shoyu Co Ltd | 保湿作用を有する皮膚外用剤 |
| KR102269115B1 (ko) * | 2019-08-28 | 2021-06-24 | 이태준 | 시각적인 확인이 가능한 대류현상 실험장치 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05236954A (ja) | 1993-09-17 |
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