JPS6368080A - α，ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はα、ε−ジアミノピメリン酸のＤ体に作用する
性質を有するα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。

（その製造方法に関するものである。

（従来の技術） α、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。（α。

ε−ジアミノピメリン酸の定量に用いられる酵素である
。α、ε−ジアミノピメリン酸を定量する従来の方法と
しては、アミノ酸分析機による方法が知られているが、
装置が高価であり、さらに試料の前処理が煩雑で時間を
要することが問題とされている。さらに、α、ε−ジア
ミノピメリン酸には５体、Ｄ体、メゾ体という３種の光
学異性体が存在するが、アミノ酸分析機による方法では
これらを区別なく全量として定量してしまうという欠点
も有している。そのため、α、ε−ジアミノＬ°メリン
酸脱水素酵素。（いる方法が提案されており、この方法
は試料の前処理も特に要せず、操作も比較的簡単に行え
るという利点を有している。

しかしながら、従来知られているα、ε−ジアミノピメ
リン酸脱水素酵素。（　Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、。

４４、Ｎｏ、１（１９８０年）２２７〜２２９頁及びＮ
ｏ、、　９　（１９８０年）２１２５〜２１２８頁など
に記載されているように、α。

ε−ジアミノピメリン酸のメゾ体にのみ作用し。

５体やＤ体には作用しないものであった。

（発明が解決しようとする問題点） このように、酵素を用いるα、ε−ジアミノピメリン酸
の定量では、特別な分析装置を必要とせず、簡単な比色
計で定量可能であるという長所を有するが、５体のα、
ε−ジアミノピメリン酸を定量するには、公知のジアミ
ノピメリン酸エピメラーゼという酵素で５体をメゾ体に
変換した後に定量することで可能であるものの、α、ε
−ジアミノピメリン酸のＤ体は今まで知られている酵素
を組み合わせても定量はできないという問題点があり、
これまで、Ｄ体のα、ε−ジアミノピメリン酸を酵素法
で定量することは知られていなかった。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、このような問題点を解決すべく鋭意研究
の結果、バチルス属に属する微生物菌体にα、ε−ジア
ミノピメリン酸のＤ体に作用する性質を有するα、ε−
ジアミノピメリン酸脱水素酵素。（在することを見いだ
し２本発明を完成した。

すなわち１本発明は１次の（イ）、（ｏ）の理化学的性
質を有するα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。（
バチルス属に属する細菌を培養し、培養物から次の＜４
）　、　（Ｅｌ）の理化学的性質を有するα。

ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素を採取することを特
徴とするα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。（造
方法を要旨とするものである。

（イ）作用 下記反応を触媒する。

α、ε−ジアミノピメリン酸＋ｌ（！Ｏ＋ＮＡＤ”↓　
↑ α−アミ八へε　−ケＦピメリン酸十ＮＨ，“　＋ＮＭ
ＤＩ＋（０）基質特異性 Ｄ−α、ε−ジアミノピメリン酸、又はメゾ−α−ジア
ミノピメリン酸に作用し。

特にＤ−α、ε−ジアミノピメリン酸に高い特異性を有
する。

次に本発明のα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。

（化学的性質を示す。

１、作用 前記のとおり。

２、基質特異性 前記のとおり。

なお、Ｄ−α、ε−ジアミノピメリン酸に対するミカエ
リス定数（Ｋｍ値）は、約６．０ｍＭである。Ｄ−α、
ε−ジアミノピメリン酸以外に次表のような基質にも作
用する。

（以下余白） ３、至適ｐＨ 約ｐＨ９，５（５５℃） ４、安定ｐＨ範囲 ｐＨ７，０〜１）．０で３７℃で２０分間の処理でほと
んど失活が起こらない。

５、作用適温の範囲 ｐＨ９，５で２５℃より７０℃までの範囲。

６、耐熱性及び保存安定性 ６０℃の緩衝液中で２０分間処理した後も、その活性は
処理前の活性とほとんど同じ値を示す。

また、緩衝液中で室温にて２週間保存した後でも。

はとんど活性の低下は認められない。。

７、分子量 スーパローズ１２ゲルクロマトグラフイー（ファルマシ
ア社製）から約８万と算出された。

８、力価の測定法 ｐＨ９，５，０，１Ｍ）リス−塩酸緩衝液中２．５ｍＭ
ＮＡＤ、５０ｍＭ　　Ｄ−α、ｔ−ジアミノピメリン酸
を含む混合溶液を調製し、その混合溶液に適当量のα、
ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。（えて、５５℃に
おける還元型ＮＡＤの単位時間あたりの増加を３４０ｎ
ｍの吸光度の増加として計測し、１分間あたり１マイク
ロモルのＮＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸光度を増加せ
しめる酵素量を１単位とした。

９、単一性 精製標品は、ｐＨ９，４の７．５％アクリルアミドゲル
ディスク電気泳動法により陽極側に移動し。

単一なバンドを与えた。

１０、元素分析 元素分析値はまだ測定していない。

１）、結晶構造 現在まだ結晶として得られていないため不明。

本発明のα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。（造
するには１次のごとき方法を採用することができる。す
なわち、バチルス属に属する細菌を培養し、その培養物
から本発明のα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。

（取することによって得ることができる。

本発明に使用する細菌は２本発明のα、８−ジアミノピ
メリン酸脱水素酵素。（出しうるバチルス属の細菌であ
り、そのような細菌であれば、いかなるものでも使用で
きる。好ましい細菌としては、たとえば、バチルス・ス
テアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｓｔｅａｒ
ｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　）があげられる。ステア
ロサーモフィルスとしての具体例としては、八ＴＣＣ７
９５３，７９５４，８００５，１０１９４，１２９８０
，ＩＦＯ１２５５０，１２９８３，ＮＣ八　１５０３．
などがある。

９一 本発明における細菌を培養するに際して用いられる栄養
培地において炭素源として、たとえば。

グルコース、シュークロース、フルクトース、澱粉加水
分解物、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液の糖類。

酢酸、乳酸等の有機酸類、さらには使用する細菌が資化
しうるアルコール類、油脂、脂肪酸およびグリセリン等
が使用でき、窒素源として、たとえば、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニ
ア、アミノ酸、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等の無
機又は有機物が使用できる。さらに、無機塩類として、
たとえばカリウム、ナトリウム、リン酸、亜鉛、鉄、マ
グネシウム、マンガン、銅、カルシウム、コバルト等の
各塩類、必要に応じて微量金属塩、コーン・ステイープ
・リカー、ビタミン類、核酸等を使用してもよく、細菌
の一般的栄養培地が使用できる。

これらの培地を用いて、バチルス属に属する細菌を２０
℃〜８０℃、好ましくは４０℃〜７０℃。

最適には５５℃で、約２〜１６時間、好気的に培養すれ
ばよい。また、工業的には、たとえば希釈率（醗酵槽に
培地液を供給する速度及び同時に醗酵槽より抜出す速度
を醗酵槽中の培養液量で割った値）を使用する菌株の最
大比増殖速度の０．３〜１．０．好ましくは０．５〜１
．ｏ、最適には０．７〜１゜０の範囲で制御しながら連
続的に培養する連続培養法も用いることができる。

次に得られた培養物から本発明のα、ε−ジアミノピメ
リン酸脱水素酵素。（取されるが、培養物２分離生菌体
１分離菌体の処理物、粗製酵素。

精製酵素等のあらゆる段階で採取できる。精製法として
は１通常の酵素精製法を用いることができる。すなわち
、遠心分離等により菌体を得た後。

菌体をマントンゴーリン、ダイノミル、フレンチプレス
、超音波処理、乳鉢磨砕等により細胞破砕後、遠心分離
により細胞片を除去し、細胞抽出液を得、これに硫酸ス
トレプトマイシン又は硫酸プロタミン処理を行いさらに
は、ポリエチレングリコール沈澱、アセトン沈澱、加熱
処理等を行い。

精製するために、ＤＥＡＥ−）ヨパール力ラム（東洋曹
達社製）等のイオン交換クロマトグラフィー、ブチル−
トヨバールカラム（東洋曹達社製）等の疎水性クロマト
グラフィー、ヒドロキシアパタイトカラム等の吸着クロ
マトグラフィー、セファデックスカラム（ファルマシア
社製）等のゲル濾過クロマトグラフィー等のクロマトグ
ラフィーを組合わせて行うことができる。このようにし
て。

本発明のα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。（離
、精製することができる。

（実施例） 次に本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例１．比較例１ ポリペプトン２０ｇ／β、酵母エキス２ｇ／ｊ！、肉エ
キスＩｇ／Ａ、グリセリン１０ｇ／Ａ、塩化ナトリウム
２　ｇ／　Ｒ、リン酸二カリウム２ｇ／７！、　　リン
酸−カリウム２ｇ／Ｉｌ、硫酸マグネシウム０．１ｇ／
ｊ！、塩化力／ｌ／　シラＬ　０．０７４ｇ／　Ｉｌ、
硫酸マンガン０．ｏｏ１８ｇ／ＣｐＨ７，２に調整した
培地１２０βを、１２０”Ｃ１）０分間加熱殺菌した後
、バチルス・ステアロサーモフィルスＩＰ０１２９８３
株を接種し、５５℃で１）時間、好気的に培養した。培
養後、遠心骨分離機で菌体を採取して１．５ｋｇの湿菌
体を得た。

得られた菌体を凍結状態で保存した。

次に凍結菌体５００ｇを、２−メルカプトエタノールを
０．０１容量％含む２５ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８）ＩＩｌに懸濁し、連続式超音波破砕機を用いて細胞
を破壊後、遠心分離機により細胞片を除去しα、ε−ジ
アミノピメリン酸脱水素酵素。（む粗抽出液を得た。こ
の粗抽出液に固形硫酸アンモニウムを徐々に加えて３０
％飽和（４℃）とした。生成した沈澱を遠心分離により
除去し。

上清にさらに固形硫酸アンモニウムを徐々に加えて７０
％飽和（４℃）とした。生成した沈澱を遠心分離により
集め、２−メルカプトエタノールを０．０１容量％含む
２５ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，以下バッファと
いう）にとかし、ついで３０倍量のバッファに対して透
析、脱塩して粗酵素液を得た。この粗酵素液をあらかじ
めバッファで平衡化したＤＥＡＥ−）ヨパール力ラム（
東洋曹達社製）に通じ食塩をバッファに加えた溶液で溶
出せしめると１食塩濃度３００ｍＭの近くで目的のα、
ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。（出した。この区
分を集め、硫酸アンモニウム３０％飽和源度のバッファ
で透析した後、あらかじめ同じバッファで平衡化したブ
チル−トヨパールカラム（東洋曹達社製）に通じ硫酸ア
ンモニウム濃度を連続的に低下させたところ、１０％飽
和濃度近くに目的のα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素
酵素。（出した。この溶出区分を濃縮後、２−メルカプ
トエタノールを０．０１容量％含む２５ｍＭ）リス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８）を溶出液に用いたセファデックスＧ
−１５０カラムクロマトグラフイー（ファルマシア社製
）を行うことにより、精製されたα、ε−ジアミノピメ
リン酸脱水素酵素。（ることができた。このようにして
得たα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。（ｐＨ９
，４の７．５％アクリルアミドディスク電気泳動で陽極
側に移動し、単一なバンドを与え、スーパローズ１２ゲ
ルクロマトグラフイー（ファルマシア社製）より。

分子量は約８万であった。また、ラウリル硫酸ナトリウ
ムを含む１２％アクリルアミドゲルスラスラブ電気泳動
において分子量約４万の位置に単一のバンドを与えた。

また、活性の収率は約９％で。

酵素１■あたり約１７単位の力価を示し、その精製度は
粗抽出液を１とすると約４３０であった。

次に、このようにして得たα、ε−ジアミノピメリン酸
脱水素酵素。（定性と、従来より知られているバチルス
・スフエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　二戸μ阻）から
得たα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。（較例１
）の安定性とを比較した。その結果、２−メルカプトエ
タノールを０．０１容量％含むｐ　Ｈ７，０の２５ｍＭ
リン酸緩衝液中、６０℃で２０分間加熱処理を行った後
の残存活性を測定したところ、バチルス・スフエリカス
のα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。（００％失
活していた。ところが２本発明のα、ε−ジアミノピメ
リン酸脱水素酵素。（０℃、２０分間の加熱処理によっ
て全くその活性を失わなかった。

次に、２−メルカプトエタノールを０．０１容量％含む
ｐＨ７，０の２５ｍＭリン酸緩衝液中で、室温における
保存安定性を調べた。

その結果を第１図に示す。

第１図において曲線Ａは実施例１）曲線Ｂは比較例１で
ある。第１図から明らかなようにバチルス・スフエリカ
スから得たα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。（
４日間で活性が５０％以下に減少し、２週間でほぼ活性
を失うのに対し１本発明のα、ε−ジアミノピメリン酸
脱水素酵素。（２週間経過後も約１００％の活性を保持
していた。

参考例１ 実施例１で得たα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素
。（いてＤ−α、ε−ジアミノピメリン酸を測定する際
に必要な検量線を作製した。

その測定方法は、２００マイクロモルのグリシン−ＫＣ
Ｉ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０，５，２，５マイクロギ
ルのＮＡＤ、０〜０．２マイクロモルのＤ−α、ε−ジ
アミノピメリン酸を含む１．Ｏｍｊ＋を反応溶液とし、
３４０ｎｍにおける吸光度を測定してから約１単位のα
、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。（加し、３７℃
で３０分間保温した後、３４０ｎｍの吸光度の増加と２
反応液中に添加したＤ−α、ε−ジアミノピメリン酸の
量との間には、第１図に示すように良好な比例関係が認
められ２本発明のα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵
素。（いてＤ−α、ε−ジアミノピメリン酸が精度良く
測定できることがわかった。

（発明の効果） 本発明のα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。（α
、ε−ジアミノピメリン酸の０体に作用するという性質
を有しているため、これまで酵素法では行うことのでき
なかったＤ−α、ε−ジアミノピメリン酸の定量が可能
となる。また、バチルス・スフエリカスからのメゾーα
、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素やジアミノピメリ
ン酸エピメラーゼと組み合わせて使用することにより。

α、ε−ジアミノピメリン酸のＬ体、０体及びメゾ体の
３つの光学異性体を分別定量することも可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明のα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素
酵素。（線Ａ）及びバチルス・スフエリカスから得たα
、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。（線Ｂ）を室温
で放置した後の残存活性を示す図であり、第２図は本発
明のα、ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。（いて作
製したα、ε−ジアミノピメリン酸に対する検量線を示
す図である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の（イ）、（ロ）の理化学的性質を有するα，
   ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素。 （イ）作用 下記反応を触媒する。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ロ）基質特異性 Ｄ−α，ε−ジアミノピメリン酸、又 はメゾ−α，ε−ジアミノピメリン酸に 作用し、特にＤ−α，ε−ジアミノピメ リン酸に高い特異性を有する。
2. （２）バチルス属に属する細菌から得られる特許請求の
   範囲第１項記載のα，ε−ジアミノピメリン酸脱水酵素
   。
3. （３）バチルス属に属する細菌を培養し、培養物から次
   の（イ）、（ロ）の理化学的性質を有するα，ε−ジア
   ミノピメリン酸脱水素酵素を採取することを特徴とする
   α，ε−ジアミノピメリン酸脱水素酵素の製造方法。 （イ）作用 下記反応を触媒する。 ▲数式、化学式、表等があります▼ （ロ）基質特異性 Ｄ−α，ε−ジアミノピメリン酸、又は メゾ−α−ジアミノピメリン酸に作用し、 特にＤ−α，ε−ジアミノピメリン酸に高 い特異性を有する。
4. （４）バチルス属に属する細菌が、バチルス・ステアロ
   サーモフィルスである特許請求の範囲第３項記載の製造
   方法。