JPS63173598A - 光学活性２−ヒドロキシ酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、２−ハロゲノカルボン酸（以下２−ハロ酸と
いう。）の０体に作用する性質を有する２−ハロ酸ハリ
ドヒドロラーゼを用いて光学活性な２−ヒドロキシ酸を
製造する光学活性２−ヒドロキシ酸の製造法に関するも
のである。

（従来の技術） ２−ハｏｉｌハｌＪ　Ｆ　ヒ）”ロラーゼは、２−八日
酸から光学活性な２−ヒドロキシ酸を製造する際に用い
られる酵素である。この光学活性２−ヒドロキシ酸を製
造する従来の方法としては、光学活性アミン類等の光学
分割剤を用いて、０体及びＬ体の２−ヒドロキシ酸を得
る方法が知られている。

しかしながら、この公知の方法は、用いられる光学分割
剤が高価であり、さらに、その操作が極めて煩雑である
ため、工業的に有利な方法ではなかった。そのため、２
−へロ酸ハリドヒドロラーゼが用いられており、この酵
素を用いると、２−八日酸から光学的に純粋な２−ヒド
ロキシ酸が容易にかつ高収率で得られ、光学活性な２−
ヒドロキシ酸を工業的に生産する方法として非常に有利
である。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、従来知られている２−へロ酸ハリドヒド
ロラーゼは、ジャーナル・オブ・バイオロジカルケミス
トリー誌（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）第２４３巻
、４２８頁（１９６８年）及びジャーナル・オプ・ヨー
ロピアン・バイオケミストリー誌（Ｊ。

Ｅｕｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、）第２１巻、９９頁（１
９７１年）等に記載されているように、いずれも２−ハ
ロ酸のＬ体のみに作用し、０体の２−ヒドロキシ酸を生
成し、０体の２−ハロ酸には作用しないものであった。

それゆえ、生化学的観点から、０体と比較し。

より重要なＬ体の２−ヒドロキシ酸の製造は、従来の２
−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを用いては不可能であった
。それに加え、原料である２−ハロ酸は、０体とＬ体と
の混合物であるラセミ体として存在するため、従来の２
−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを用いると、０体の２−ハ
ロ酸は原料のまま残存し、経済的にも不利であった。

（問題点を解決するための手段） そこで１本発明者らは、このような観点から。

安価かつ容易な操作で光学純度の高い光学活性２−ヒド
ロキシ酸の製造法を提供することを目的として鋭意研究
した結果、原料として２−ハロ酸のラセミ体を用い２反
応系に基質に対する立体特異性の異なる２つの酵素を作
用させると上記の目的が達成されることを見い出し２本
発明を完成した。

すなわち１本発明は、２−ハロ酸のＬ体のみに作用する
性質を有する２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを用いて光
学活性２−ヒドロキシ酸を製造するに際し、原料として
２−ハロ酸のラセミ体を用い２反応系に２−ハロ酸の０
体に作用する性質を有する２−ハロ酸ハリドヒドロラー
ゼを作用させることを特徴とする光学活性２−ヒドロキ
シ酸の製造法を要旨とするものである。

本発明において、２−ハロ酸とは、一般式Ｒ・ＣＨＸ・
Ｃ００Ｈ（Ｘはハロゲン原子を表す。）又はＲ−ＣＸＺ
　　・Ｃ０ＯＨで示される化合物で。

そのような具体例としては、モノクロル酢酸、モノブロ
モ酢酸、モノヨード酢酸、ジクロル酢酸。

ジブロモ酢酸あるいはトリクロル酢酸等の酢酸の誘導体
、２−クロルプロピオン酸、２−ブロモプロピオン１１
．２．２−ジクロルプロピオン酸等のプロピオン酸誘導
体、２−クロル酪酸、２−ブロモ酪酸２２．２−ジクロ
ル酪酸等の酪酸の誘導体、２−クロル吉草酸、２−ブロ
モ吉草酸、２，２−ジクロル吉草酸等の吉草酸の誘導体
があげられる。また、炭素数が５個以下のカルボン酸の
２番目の炭素原子に、塩素あるいは臭素等のハロゲン原
子が１個又は２個結合している化合物でもよいし、カル
ボン酸が酢酸の場合には、１〜３個結合している化合物
でもよい。

次に１本発明に用いられる２−ハロ酸の０体に作用する
性質を有する２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼの理化学的
性質を示す。

（１）作用 Ｌ−Ｒ，ＣＩＩＸ・Ｃ０ＯＨ＋　ＨｚＯ→Ｄ−Ｒ−ＣＩ
ＩＯ）Ｉ−ＣＯＯＩＩ　＋　Ｈ”　＋　Ｘ−Ｄ−Ｒ−Ｃ
ＩＩＸ・Ｃ００ＩＩ　＋　１１２０→Ｌ−Ｒ，Ｃｌｌ０
１ｌ・Ｃｏｏｌ　＋　１１”　＋　Ｘ−Ｒ，ＣＸＺ・Ｃ
０ＯＨ＋　１１，０→Ｒ，ＣＯ・Ｃ００ＩＩ　＋　２１
１”　＋　２Ｘ−上記反応を触媒する。

なお、上記一般式中のＲは、Ｈ，Ｈ２，ＨＸ。

ｘＺ、ＣＨ：ｌ、ＣｚＨｓ、ＣｘＨ７等の原子団を表し
。

Ｘは塩素、臭素等のハロゲン原子を表す。水の存在下に
Ｌ−２−ハロ酸に作用してハロゲン原子を加水分解し、
Ｄ−２−ヒドロキシ酸を生成する。２−ハロ酸が０体の
場合には、Ｌ体の２−ヒドロキシ酸を生成する。また、
基質が２−ジハロ酸の場合には、２−ケト酸を生成する
。

（２）基質特異性 り、Ｌ＆びＤＬ−２−クロルプロピオン酸に対するミカ
エリス定数（ｋｍ値）は、各々４．８゜１．１，３．２
ｍＭである。この他に、炭素数が２〜５個までの２−ハ
ロ酸が基質となり、ＤＬ−２−クロルプロピオン酸を１
００とした場合の他の基質の反応速度は２次表のとおり
である。

（３）至適ｐＨ ｐＨ約９．５　　（ＤＬ−２−クロルプロピオン酸を基
質とし、３０℃にて測定した。） （４）安定ｐＨ範囲 ｐＨ約６〜１２（４°Ｃ２２４時間経過後、もとの活性
の９０％以上が存在。） （５）作用適温及び耐熱性 ｐＨ９，５で２０℃より４５℃まで温度の上昇とともに
活性は増大するが、４５℃で１５分間処理すると、活性
は５０％以下に低下する。

（６）力価の測定法 ５０マイクロモルのり、Ｌ−２−クロルプロピオン酸を
含む０．１　Ｍ　ｌ−リス硫酸緩衝液（ｐＨ９，５）２
ｍ＆に酵素１１〜１００．ｕｆｆｉを加え。

３０°Ｃにて１０分間反応後、３．６規定硫酸０．１ｍ
ｌを添加し１反応を停止した。この反応混合液中の塩素
イオンをチオシアン酸法により定量した。

すなわち２反応混合液あるいはその希釈溶液１ｍｌに対
し、チオシアン酸水１ｆｆ１０．１％を含む１０％エタ
ノール含有ジオキサン？容ン夜１ｍ！。

さらに、８％の鉄門パンを含む６規定硝酸？容液Ｑ、４
　ｍ　ｌを加え、４６０ｎｍの吸光度を測定し。

検量線から塩素イオン濃度を求めた。３０℃で１分間に
１マイクロモルの塩素イオンを生成する酵素量を１単位
とした。

（７）分子量 セファデックスＧ−１５０ゲルクロマトグラフイーによ
り、約５万の分子量であった。

（８）阻害、活性化及び安定化剤 種々の金属イオン又は添加物を加え、酵素活性を測定し
たところ、下表に示すごとく、塩化第二水銀、亜鉛、マ
ンガン及びニッケル等により阻害された。また、今のと
ころ本酵素に特異的な活性化剤あるいは安定化剤は見い
出されていない。

＋Ｉ文十’ｔＭ生：％ 上記の２−へロ酸ハリドヒドロラーゼを製造するには１
次のごとき方法を採用することができる。

すなわち、シュードモナス属に属する細菌を培養し、そ
の培養物から上記の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを採
取することによって得ることができる。シュードモナス
属に属する細菌の好ましい具体例としては１例えば１本
発明者らが京都府宇治市の土壌より分離した新菌株シュ
ードモナスＵＫ１１３株（微工研菌寄第５６６６号）が
あげられる。この菌株は、特に上記の２−ハロ酸ハリド
ヒドロラーゼ生産能が高（、実用化に適したものである
。

このシュードモナス属に属する細菌を培養するに際して
用いられる培地の栄養源としては、細菌が資化可能な栄
養源であればいかなるものでも使用でき、炭素源として
は２例えば、グルコース。

グリセリン、アルコール類、油脂、脂肪酸、さらに２−
ハロ酸等が使用でき、窒素源としては２例えば、硫酸ア
ンモニウム、アンモニア、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、各種アミノ酸。

ペプトン、肉エキス、酵母エキス等無機又は有機物が使
用できる。さらに、無機塩類として２例えば、カリウム
、ナトリウム、リン酸、鉄、亜鉛。

マグネシウム、マンガン、銅、カルシウム、コバルト、
モリブデン等の各塩類、必要に応じて微量金属塩、コー
ン・ステイープ・リカー、ビタミン類、核酸等を使用し
てもよく、細菌の一般的栄養培地が使用できる。

これらの培地を用いて１本菌株を、好ましくは１０〜３
６℃、さらに好ましくは２０〜３３°Ｃ２最適には２０
〜３０℃で約５〜４８時間、好気的に培養し、得られた
培養物から本発明の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼが採
取されるが、培養物。

分離生菌体１分離菌体の処理物、粗製酵素、精製酵素等
のあらゆる段階で採取できる。

精製法としては１通常の酵素精製法を用いることができ
る。すなわち、遠心分離等により菌体を得た後、菌体を
マントンゴーリン、ダイノミル。

フレンチプレス、超音波処理等により細菌破砕後。

遠心分離により細胞片を除去し、細胞抽出液を得。

これに硫酸ストレプトマイシン又は硫酸プロタミン処理
を行い、さらには、硫酸アンモニウム等による塩析処理
又はアセトン等による有機溶媒処理等を行い、精製する
ために、ＤＥＡＥセルロースカラム等のイオン交換クロ
マトグラフィー、ヒドロキシアパタイトカラム等の吸着
クロマトグラフィー、セファデツタスクロマトグラフイ
ー等によるゲルクロマトグラフィーを組み合わせて行う
ことができる。このようにして、上記の２−ハロ酸ハリ
ドヒドロラーゼを単離、精製することができる。

また１本発明に用いられる２−ハロ酸のＬ体のみに作用
する性質を有する２−へロ酸ハリドヒドロラーゼとして
は１例えば、前記したジャーナル・オブ・バイオロジカ
ルケミストリー誌（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｌｌｌ、）第２４３巻、４２８頁（１９６８年）
及びジャーナル・オブ・ヨーロピアン・バイオケミスト
リー誌（Ｊ、　Ｅｕｒ、Ｂｉｏｃｈｅｓ、）第２１巻、
９９頁（１９７１年）等に記載されているシュードモナ
ス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ−匹旦並）から抽
出、精製した２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼがあげられ
る。

本発明で用いられる２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼの１
つは、２−ハロ酸の０体に作用するために、Ｌ−２−ハ
ロ酸に作用してＤ−２−ヒドロキシ酸を生成し、さらに
、Ｄ−２−ハロ酸に作用してＬ−２−ヒドロキシ酸を生
成す゛る。そのため。

Ｌ−２−ハロ酸にのみ作用し、Ｄ−２−ハロ酸には作用
しない従来の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを用いては
不可能であったＬ−２−ヒドロキシ酸の製造を可能にす
ることができる。

例えば、２−ハロ酸として、ＤＬ−２−クロルプロピオ
ン酸を用いて光学活性な乳酸を採取するためには、まず
、従来知られているＬ体にのみ作用する２−ハロ酸ハリ
ドヒドロラーゼを用いて。

Ｌ−２−クロルプロピオン酸をＤ−乳酸に変換した後、
Ｄ−乳酸と残存するＤ−２−クロルプロピオン酸とを分
離する。その際の分離方法としては。

例えば、溶媒に対する溶解度の差あるいはイオン交換法
等が適用できる。次に１分離したＤ−２−クロルプロピ
オン酸を２−ハロ酸の０体に作用する性質を有する２−
ハロ酸ハリドヒドロラーゼを用いてＬ−乳酸に変換すれ
ばよい。このようにして、原料としてＤＬ−２−クロル
プロピオン酸を用いた場合には、光学活性な乳酸を高収
率で採取することができ、従来の酵素で不可能であった
し一乳酸の生産が可能となる。

さらに、従来のし一乳酸の製造は、主として乳酸菌を用
いた醗酵基で行われているが９本発明における２−ハロ
酸の０体に作用する性質を有する２−ハロ酸ハリドヒド
ロラーゼを用いて製造する場合には、原料の価格が安価
であること、酵素法の利点である無公害、省エネルギー
等の点で従来法と比較して優れており、光学活性な乳酸
製造法として非常に有利である。

また、２−ハロ酸を原料として得られる光学活性な２−
ヒドロキシ酸は、医薬品又はアミノ酸の合成中間体とし
て有用であり、さらには、生化学的試薬としても使用で
きる。

（実施例） 次に９本発明を実施例により具体的に説明する。

参考例１ 硫酸アンモニウム５　ｇ／ｌ、　　リン酸−カリウム１
　ｇ／ａ、　　リン酸二ナトリウムＩｇ／ｆｆｉ、硫酸
マグネシウム０．０５ｇ／ｌ、硫酸第一鉄０．００５ｇ
／Ａ。

水酸化カルシウム０．００５　ｇ　／　Ａ　、硫酸マン
ガン０．００１５　ｇ　／　１　、　モリブデン酸ナト
リウム０．００１５　ｇ／ｌ、ｐＨ７，０に調整した培
地２４日ｉを１２０℃、３０分間加熱殺菌した後、ＤＬ
−２−クロルプロピオン酸７５０ｇを、水酸化ナトリウ
ムにてｐＨ７に調整後、除菌濾過したちの２１を加え。

シュードモナスＵＫ１１３株（徽工研菌寄第５６６６号
）を接種し、３０℃で１８時間通気攪拌培養し１次いで
、シャープレスを用いて遠心分離により菌体を採取して
、６００ｇの菌体を得た。得られた菌体を凍結状態で保
存した。

次に、凍結菌体６００ｇを１．２２の０．１　Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，５）に懸濁し、ダイノミルを用いて細
胞を破壊後、遠心分離により細胞片を除去し、２−ハロ
酸ハリドヒドロラーゼを含む粗抽出液を得た。この粗抽
出液１１当り２％の硫酸ブロタミン水溶液２００　ｍ　
ｌを添加し、十分攪拌した後、生じた沈殿を遠心分離に
より除去し、プロタミン上澄みを得た。この上澄みに固
形硫酸アンモニウムを徐々に加えて４０％飽和（４℃）
とした。

生成した沈殿を遠心分離により除去し、上澄みにさらに
固形硫酸アンモニウムを徐々に加えて７０％飽和（４℃
）とした。生成した沈殿を遠心分離により集め、再び５
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶かし１次いで、
３０倍量の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対し
て透析、脱塩して粗酵素液を得た。この粗酵素液を予め
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化したＤＥ
ＡＥセルロースカラムに通じ、リン酸緩衝液の濃度を徐
々に増して溶出せしめると、リン酸濃度１００ｍＭ近く
で目的の２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼが溶出した。こ
の区分を集め　ｆｇ縮、脱塩後、さらに、５ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化したヒドロキシアパタイ
トカラムにその溶出液を通し、５ｍＭリン酸緩衝液から
１００ｍＭＩＪン酸緩衝液の直線勾配の溶出を行ったと
ころ、　　２５　ｍＭｔＱ度近（に目的の２−へロ酸ハ
リドヒドロラーゼが溶出した。この溶出区分を濃縮後、
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）を溶出液に用いた
セファデックスＧ−１５０カラムクロマトグラフイーを
行うことにより、精製された２−ハロ酸ハリドヒドロラ
ーゼを得ることができた。

このようにして得た２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼは、
ｐＨ９，４の７．５％アクリルアミドディスク電気泳動
で陽極側に移動し、単一なバンドを与え、セファデック
スＧ−１５０ゲルクロマトグラフイーより９分子量は約
５万であった。その収量は約１００■で、酵素１■当り
約３５単位の力価を示し、その精製度は、粗抽出液を１
とすると約６０であった。

実施例１ Ｄ及びＬ−２−クロルプロピオンａ５０マイクロモルを
含む０．１　Ｍ　ｌ−リス硫酸緩衝液（ｐ　Ｈ９，５）
２ｍｌに、ジャーナル・オブ・ヨーロピアン・バイオケ
ミストリー誌（Ｊ、　Ｅｕｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）第
２１巻、９９頁（１９７１年）に記載されている方法に
より得た２−八日酸のＬ体にのみ作用する性質を有する
２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼ約１．５ユニットを添加
し、３０℃にて２時間反応させた後２反応液中のＤ及び
Ｌ−乳酸を定量した。その結果。

Ｄ−乳酸（４７マイクロモル）の生成が認められたが、
Ｌ−乳酸は検出されなかった。

次に、参考例１にて採取した精製酵素１．５ユニツトを
添加し、３０℃にて２時間反応を行わしめた後２反応液
中のし一乳酸を定量したところ。

５２マイクロモルのし一乳酸が生成していた。これらの
結果をまとめて第１表に示す。

なお、乳酸の定量は、０．４Ｍのヒドラジンを含む０．
５Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ９，０）０．５ｍｊ！に３０
ｍＭのＮＡＤ　にコチンアミドアデニンジヌクレオチド
）及び被検液を各々５０μｌ添加し。

ＤあるいはＬ−乳酸脱水素酵素２．５ユニツトを加え、
２５℃において３４０　ｎｍにおける単位時間当りの吸
光度の増加を測定し、濃度既知の乳酸カルシウム溶液を
用いて予め作製した検量線から被検液中の乳酸を定量し
た。

第　　１　　表 第１表から明らかなように２本発明の方法により光学活
性２−ヒドロキシ酸の製造が可能である。

（発明の効果） 本発明によれば、安価な原料から容易な操作でかつ光学
的に純粋な２−ヒドロキシ酸を製造することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）２−ハロゲノカルボン酸のＬ体のみに作用する性
   質を有する２−ハロ酸ハリドヒドロラーゼを用いて光学
   活性２−ヒドロキシ酸を製造するに際し、原料として２
   −ハロゲノカルボン酸のラセミ体を用い、反応系に２−
   ハロゲノカルボン酸のＤ体に作用する性質を有する２−
   ハロ酸ハリドヒドロラーゼを作用させることを特徴とす
   る光学活性２−ヒドロキシ酸の製造法。