JPS63207385A - Ｄ−セレノシスチン分解酵素およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はＤ−セレノシスチンの０体に作用するＤ−セレ
ノシスチン分解酵素およびその製造方法に関するもので
ある。

（従来の技術） 近年、老化防止などとの関連から必須微量元素としての
セレンが注目されはじめ、グルタチオン・パーオキシダ
ーゼなどのセレンを必須構成成分とする酵素が数種発見
され、その機構や生合成機構が調べられている。しかし
ながらセレンを含有する生体物質については簡便で有効
な検出定量法がなかったため生理的意義に関する知見は
乏しいものであった。これら生体物質のうちセレノシス
チンの還元型は蛋白質アミノ酸として、また放射線防御
剤や抗癌ならびに抗炎症剤として注目を浴びているアミ
ノ酸である。セレノシスチンを定量する従来の方法とし
ては、アミノ酸分析機による方法が知られているが、装
置が高価であＤさらに試料の前処理が煩雑で分析に長時
間を有するため日常の操作としては使用し難いものであ
った。さらに、セレノシスチンには５体、０体、メゾ体
という３種の光学異性体が存在するが、アミノ酸分析機
による方法ではこれらを区別なく全単として定量してし
まうという欠点も有している。また。

従来知られているセレノシスチンに作用する酵素はジャ
ーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）２５７巻、４３８６〜４３９１頁（１９
８２年）に記載されているように、還元型セレノシスチ
ンの５体にのみ作用し。

その酸化型やメゾ体に作用しないものであったが。

この酵素法は試料の前処理も特に要せず、操作も比較的
戸単に行えるという利点を有している。

（発明が解決しようとする問題点） このように、酵素を用いるセレノシスチンの定量では、
特別な分析装置を必要とせず、簡便な比色計で定量可能
であるという長所を有するが、５体のセレノシスチンを
定量するには、メルカプトエタノールなどの還元剤で還
元後公知のセレノシスチンβ−リアーゼという酵素で定
量することで可能であるものの、セレノシスチンの０体
は今まで知られている酵素を組み合わせても定量できな
いという問題点があＤこれまで、０体のセレノシスチン
を酵素法で定量することは知られていなかった。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、このような問題点を解決すべく鋭意研究
した結果、広く微生物を検索してクロストリジウム属に
属する細菌にセレノシスチンの０体に作用する性質を有
するＤ−セレノシスチン分解酵素（Ｄ−セレノシスチン
α、β−リアーゼ）が存在することを見い出し２本発明
を完成した。

すなわち２本発明は９次の（イ）（ロ）の理化学的性質
を性質を有するＤ−セレノシスチン分解酵素およびクロ
ストリジウム属に属する細菌を培養し。

培養物から次の（イ）（ロ）の理化学的性質を性質を有
するＤ−セレノシスチン分解酵素を採取することを特徴
とするＤ−セレノシスチン分解酵素の製造方法を要旨と
するものである。

（イ）作用 下記反応を触媒する。

Ｄ−セレノシスチン＋２Ｈ友０ ↑↓ ２・ピルビン酸＋２・ＮＨ２＋２・セレン（ロ）基質特
異性 Ｄ−セレノシスチンに高い特異性を有する。

次に本発明のＤ−セレノシスチン分解酵素の理化学的性
質を示す。

１、作用 下記反応を触媒する。

Ｄ−セレノシスチン＋２Ｈ２Ｏ ↑↓ ２・ピルビン酸＋２・Ｎ　Ｈ’ｓ　＋　２・セレン２、
基質特異性 Ｄ−セレノシスチンに対するミカエリス定数（Ｋｍ値）
は約１．ＯｙｎＭである。Ｄ−セレノシスチン以外に次
表のような基質にも作用する。

３、至適ｐＨ 約ＰＨ７，０〜８．５（３０℃） ４、安定ｐＨ範囲 ｐ　Ｈ６，０〜８．５で３０℃、９０分間の処理でほと
んど失活が起こらない。

５、作用適温の範囲 ｐＨ８，０で２Ｏ℃より４０℃までの温度上昇とともに
活性は増大する。また、４５℃で１５分間処理（ｐＨ７
，２）　しても、活性は処理前とほとんど同じ値を示す
。

６、分子量 ＴＳＫＧ３０００ＳＷゲルクロマトグラフィー（東洋曹
達社製）から約７．２万と算出された。また、ラウリル
硫酸ナトリウムを含む１２．５％アクリルアミドゲルス
ラブ電気泳動法によりサブユニットの分子量は約３．５
万と算出され１本発明の酵素が２個の同一のサブユニッ
トからなることが示された。

７、補酵素要求性 本発明の酵素は、カルボニル試薬処理による失活、およ
びピリドキサール５゛−リン酸による再賦活性化による
補酵素としてピリドキサール５゛−リン酸を要求するこ
とが示された。

８、力価の測定法 ｐＩ（８，０，０，２Ｍ１−リシン−ｐＪ　ａ　ＯＨ緩
衝液中０．１ｍＭピリドキサール５”−リン酸、３．２
ｍＭＤ−セレノシスチンを含む混合溶液を調製し、その
混合溶液に適当量のＤ−セレノシスチン分解酵素を加え
て、３７℃、５分間インキュベージコン後。

生成するピルビン酸を２．４−ジニトロフェニルヒドラ
ジン法にて計測し、１分間あたり１マイクロモルのピル
ビン酸生成を触媒せしめる酵素量を１単位とした。

９、単一性 精製標品は、ｐＨ８，３の７．５％アクリルアミドゲル
ディスク電気泳動法により陽極側に移動し。

単一なバンドを与えた。

１０、元素分析 元素分析値はまだ測定していない。

１１、結晶構造 現在まだ結晶として得られていないため不明。

本発明のＤ−セレノシスチン分解酵素を製造するには９
次のごとき方法を採用することができる。

すなわち、クロストリジウム属に属する細菌を培養し、
その培養物から本発明のＤ−セレノシスチン分解酵素を
採取することによって得ることができる。

本発明に使用する細菌は１本発明のＤ−セレノシスチン
分解酵素を産出しうるクロストリジウム属の細菌であＤ
そのような細菌であれば、いかなるものでも使用できる
。好ましい細菌としては。

たとえば、クロストリジウム・スティックランディ（Ｃ
ｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　５ｔｉｃｋｌａｎｄｉ）やクロ
ストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
旺肛姐肌照）があげられる。クロストリジウム・スティ
ックランディとしての具体例としてはＡＴＣＣ１２６６
２，クロストリジウム・スポロゲネスとしての具体例と
してはＡＴＣＣ１１４３７，７９５５などがある。

その他に、ニジエリア属に属する細菌（たとえばニジエ
リア・コリＫ　−１２１Ｆ０３２Ｏ８）　、バチルス属
（たとえばバチルス・セレウスＩＦＯ３００１）　。

バクテウム属に属する細菌（バクテリウム・マイコイデ
スＩＦＯ３０４０）　、およびエンテロバクタ−属に属
する細菌（たとえばエンテロバクタ−・クロアセイ　Ｉ
ＦＯ３３０２）なども用いることができる。

本発明における細菌を培養するに際して用いられる栄養
培地において炭素源として、たとえば。

グルコース、シュークロース、フルクトース、乳糖、澱
粉および加水分解物、糖蜜、亜硫酸パルプ廃液のＩＩ［
、ギ酸、帥酸、乳酸等の有機酸類、さらには使用する細
菌が責化しうるアルコール類。

油脂、脂肪酸およびグリセリン等も使用でき、窒素源と
して、たとえば、硫酸アンモニウム、塩化・　アンモニ
ウム、リン酸アンモニウム、アンモニア。

アミノ酸、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、肝臓エキ
ス、消化血清末１等の無機又はを機物が使用できる。さ
らに、無機塩類として、たとえばカリウム、ナトリウム
、リン酸、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガン、銅、カ
ルシウム、コバルト等の各塩類、必要に応じて微量金属
塩、コーン・ステイープ・リカー、チオグリコール酸ナ
トリウム。

ビタミン類、アミノ酸、核酸等を使用してもよく。

細菌の一般的栄養培地が使用できる。

これらの培地を用いて、クロストリジウム属に属する細
菌を好ましくはｌＯ℃〜４５℃、さらに好ましくは２Ｏ
℃〜４２℃、最適には２５℃〜４０℃で、約５〜４８時
間、＆！気的に培養すればよい。また、窒素封入上攪拌
しながら培養する方法も採用できる。

次に得られた培養物から本発明のＤ−セレノシスチン分
解酵素が採取されるが、培養物１分離生菌体１分離菌体
の処理物、粗製酵素、精製酵素等のあらゆる段階で採取
できる。精製法としては。

通常の酵素精製法を用いることができる。すなわち、遠
心分離等により菌体を得た後、菌体をマントンゴーリン
、ダイノミル、フレンチプレス、超音波処理、乳鉢磨砕
等により細胞破砕後、遠心分離により細胞片を除去し、
細胞抽出液を得、これに硫酸ストレプトマイシン又は硫
酸プロタミン処理を行い１次いでＤＥＡＥ−トヨパール
カラム（東洋曹達社製）等のイオン交換クロマトグラフ
ィーブチル−トヨパールカラム（東洋曹達社製）等の疎
水性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトカラム
等の吸着クロマトグラフィー、セファデックスカラム（
ファルマシア社製）等のゲル濾過クロマトグラフィー、
グイマードレックスブルーＡクロマトグラフィー（アミ
コン製）等のアフィニティクロマトグラフィーおよび高
速液体クロマトグラフィーや調製用電気泳動等を適宜組
合わせて行うことができる。

（実施例） 次に本発明を実施例により具体的に説明する。

実施例Ｉ Ｌ−アルギニン塩酸塩２　ｇ／　Ｉ！　、酵母エキス５
ｇ／ｌ、Ｌ−リジン塩酸塩２　ｇ／　ｌ　、ギ酸ナトリ
ウム２ｇ／　ｌ　、塩化アンモニウム２　ｇ／　１　、
　　リン酸二カリウム１．７５ｇ／ｊ！、　　リン酸−
カリウム２　ｇ／　ｌ　、硫酸マグネシウム０．２ｇ／
ｌ、塩化カルシウム０．０１ｇ／ｊ２゜硫酸第一鉄０．
０１ｇ＃’、そしてｐ　Ｈ７，２に調整した培地７００
ｊ！を、１２Ｏ℃、３０分間加熱殺菌した後、１％硫化
ナトリウム２１１を添加して。

次いでクロストリジウム・ステイクランディＡＴＣＣ１
２６６株を接種し、３７℃で１８時間、嫌気的に培養し
た。培養後、遠心骨分離機で菌体を採取して１．０ｋｇ
の湿菌体を得た。得られた菌体を凍結状態で保存した。

次に凍結菌体６８０ｇを、２−メルカプトエタノールを
０．０１容量％ならびにピリドキサール５“−リン酸２
ＯμＭを含む２ＯｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，
２）（標準緩衝液Ａ）１１に懸濁し、連続式超音波破砕
機を用いて細胞を破壊後。

遠心分離機により細胞片を除去し、Ｄ−セレノシスチン
分解酵素を含む粗抽出液を得た。この粗抽出液に硫酸プ
ロタミンを徐々に°加えて最終濃度を０．２％とした。

生成した沈澱を遠心分離により除去し、上清を０．１ｍ
Ｍフェニルメチルスルホニウムフルオライド、０．０１
ｍＭ）シルフェニルアラニルクロロメチルケトン、１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡを含む１０００倍屋の前記リン酸緩衝液
（標準緩衝液Ｂ）に対して４８時間透析した（４℃）。

この粗酵素液をあらかじめ標準緩衝液Ｂで平衡化したＤ
ＥＡＥ−）ヨパールカラム６５０Ｍ（東洋ａ達社製）に
通じＫＣＩをその標準緩衝液Ｂに加えた溶液で溶出せし
めると、ＫＣＩ濃度１５０ｍＭ付近で目的のＤ−セレノ
シスチン分解酵素が溶出した。

この区分を集め、硫酸アンモニウム（８０％飽和）を加
え、その沈澱を少量の標準緩衝液Ｂで溶解し。

硫酸アンモニウム２５％飽和を含む標準緩衝液Ｂで平衡
化したブチル−トヨパールカラム（東洋曹達社製）に通
じ、硫酸アンモニウム濃度を連続的に低下させたところ
、１０％飽和濃度近くに目的のＤ−セレノシスチン分解
酵素が溶出した。この溶出区分を８０％飽和硫酸アンモ
ニウムで沈澱させ、その沈澱物を少量の標準緩衝液Ａで
溶解後。

同一の緩衝液を溶出液に用いたセルロファインＧＣＬ２
Ｏ００カラ′ＪＡ多ロマトグラフィー（チッ素社製）を
行ない、活性画分をアミコン２Ｏ０（アミコン社製）で
濃縮した。次いで、この濃縮物をＦＰＬＣＭｏｎｏＱ　
　ＨＲ１０／１０カラムクロマトグラフイー（ファルマ
シア製）に通じ本酵素画分を吸着させた。このカラムを
０．０１％２−メルカプトエタノールを１０ｍＭビス−
トリス１ａ　ｔＭ液（ｐＨ８，２）で洗浄後、０．３〜
０．５Ｍの食塩で直線グラジェントを行い、活性画分を
集め濃縮した。この濃縮物を０．０１％２−メルカプト
エタノール、ピリドキサール５゛−リン酸、２Ｏ０ｍＭ
食塩を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）で平衡
化したＴＳＫＧ３０００ＳＷカラム（東洋曹達社製）に
通じ、その活性画分を集めた。次いで。

０．０１％２−メルカプトエタノールを含む２ＯｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化したクルトロン３０
０Ｘカラム（ＬＫＢ社製）に通じ１食塩濃度θ〜０．８
　Ｍのグラジェントにより精製されたＤ−セレノシスチ
ン分解酵素を得ることができた。

゛　　　このようにして得たＤ〜セレノシスチン分解酵
素は、ｐＨ８，３の７．５％アクリルアミドディスク電
気泳動で陽極側に移動し、単一なバンドを与え。

ＴＳＫＧ３０００ＳＷゲルクロマトグラフィー（東洋曹
達社製）より９分子量は約７．２万であった。

また、ラウリル硫酸ナトリウムを門む１２．５％アクリ
ルアミドスラブ電気泳動において分子量約３゜５万の位
置に単一のバンドを与えた。また、活性の収率は約７％
で、酵素１■あたり約４１０ｊｌＬ位の力価を示し、そ
の精製度は粗抽出液を１とすると　約５８００であった
。

次に、このようにして得たＤ−セレノシスチン分解酵素
をフエ゛ニルヒドラジン塩酸塩や塩酸ヒドロキシルアミ
ン等のカルボニル試薬で処理すると。

残存活性は各々Ｏ％および３％となった。これにピリド
キサール５゛−リン酸を添加すると各々９０％と１００
％の活性が検出され２本発明の酵素が補酵素としてピリ
ドキサール５°−リン酸を要求することが示された。

参考例１ 実施例１で得たＤ−セレノシスチン分解酵素を用いてＤ
−セレノシスチンを測定するに必要な検量線を作製した
。

その測定方法は、２Ｏ０μｍｏｌｅのトリシン−ＮａＯ
Ｈに緩衝液（ｐＨ８，０）、０．１．ｕｍｏ　１６（７
）ピリドキサール５°−リン酸、０．２５μｍｏｌｅの
Ｄ−セレノシスチンを含む１．０ｍｌを反応溶液とし、
約５単位のＤ−セレノシスチン分解酵素を添加し、３０
℃で３０分間保温した後、２．４−ジニトロフェニルヒ
ドラジン試薬を添加し、４２ＯｎＩＩ＋の吸光度変化量
と添加したＤ−セレノシスチンの螢との間には、第１図
に示すように良好な比例関係が認められ２本発明のＤ−
セレノシスチン分解酵素を用いてＤ−セレノシスチンが
精度良く測定できることがわかった。

別に、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン試薬の代わ
りに、２Ｏ０＃ｍｏｌｅのトリシン−ＮａＯＨ緩衝液（
ｐＨ８，５）、０．２５＃ｍｏ　１　ｅのＮＡＤＨ。

３００μｍｏｌｅの塩化アンモニウム、約１０単位のア
ラニン脱水素酵素（シグマ社製）を含む１．０ｍｌの反
応溶液を作成し、Ｄ−セレノシスチン分解酵素の反応で
生成したとりビン酸を定量した。

同様に、２Ｏ０μｍｏｌｅのリン酸緩衝液（ｐ）Ｉ７．
５）　、　０．２５．ｃｒｍｏ　１　ｅのＮＡＤＨ，約
５単位の乳酸脱水素酵素（ベーリンガー・マンハイム山
之内社製）を含む１．０　ｍ　ｊ！の反応溶液を作成し
。

Ｄ−セレノシスチン分解酵素の反応で生成したピルビン
酸を定量した。その結果、　０．７５μｍｏｌｅのＤ−
セレノシスチンに対し、各々１゜５８μｍｏｌｅと１．
５３μｍｏｌｅのピルビン酸が定量でき、化学量論的に
Ｄ−セレノシスチンが定量できることがわかった。

さらに、Ｄ−セレノシスチン分解酵素の反応で生成した
アンモニアを市販グルタミン酸脱水素酵素（ベーリンガ
ー・マンハイム山之内社製）で定量できることもわかっ
た。すなわち、２Ｏ０μｍｏｌｅのトリシン−ＮａＯＨ
ＩＪｊ街液（ｐＨ８，５）　。

０．２５＃ｍｏｌｅのＮＡＤＰＨ，２Ｏｕｍｏ　ｌ　ｅ
のα−ケトグルタル酸を含む１．０ｎｉ１の反応溶液を
生成し、Ｄ−セレノシスチン分解酵素の反応で生成した
アンモニアを定量したところ、Ｄ−セレノシスチン０．
７５μｍｏｌｅに対し＋　１．６３　μｍｏｌｅのアン
モニアが定量できた。

このような共役酵素はＤ−セレノシスチン分解酵素の反
応と同時に行うこともできる。

（発明の効果） 本発明のＤ−セレノシスチン分解酵素は、セレノシスチ
ンの０体に特異的に作用するという性質を有しているた
め、これまで酵素法では行うことができなかったＤ−セ
レノシスチンの量が筒便な分光器で定量可能となった。

また、ブタ肝臓からのＬ−セレノシスチンβ−リアーゼ
や高速液体クロマトグラフィー（あるいはアミノ酸分析
機）と組み合わせることによＤセレノシスチンの０体。

Ｌ体、およびメゾ体の３種の光学異性体を分別定量する
ことも可能となる。これによＤ生体中でのセレノシスチ
ンの動態を把握でき、実用面でのセレノシスチンの利用
が発展するものと考えられる。さらに９本発明のＤ−セ
レノシスチン分解酵素を利用してＤ−セレノシスチンの
定量も可能であＤこの方面での有用性もある。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明のＤ−セレノシスチン分解酵素を用い
て作製したＤ−セレノシスチンに対する検量線を示す図
である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の（イ）（ロ）の理化学的性質を有するＤ−セ
   レノシスチン分解酵素。 （イ）作用 下記反応を触媒する。 Ｄ−セレノシスチン＋２Ｈ＿２Ｏ　 ↑↓ ２・ピルビン酸＋２・ＮＨ＿３＋２・セレン（ロ）基質
   特異性 Ｄ−セレノシスチンに高い特異性を有する。
2. （２）クロストリジウム属に属する細菌から得られる特
   許請求の範囲第１項記載のＤ−セレノシスチン分解酵素
   。
3. （３）クロストリジウム属に属する細菌を培養し、培養
   物から次の（イ）（ロ）の理化学的性質を有するＤ−セ
   レノシスチン分解酵素を採取することを特徴とするＤ−
   セレノシスチン分解酵素の製造方法。 （イ）作用 下記反応を触媒する。 Ｄ−セレノシスチン＋２Ｈ＿２Ｏ　 ↑↓ ２・ピルビン酸＋２・ＮＨ＿３＋２・セレン（ロ）基質
   特異性 Ｄ−セレノシスチンに高い特異性を有する。