JPH0428353B2

JPH0428353B2 -

Info

Publication number: JPH0428353B2
Application number: JP1091676A
Authority: JP
Inventors: Hidehiko Ishikawa; Hideo Misaki; Naoki Muto
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1989-04-11
Filing date: 1989-04-11
Publication date: 1992-05-14
Also published as: JPH02163080A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、少なくともＬ−グルタミン酸に基質
特異性を有し、実質的にＬ−ヒスチジンに基質特
異性を有せず、かつ１モルのＬ−グルタミン酸、
１モルの酸素および１モルの水から、１モルのα
−ケトグルタル酸、１モルのアンモニアおよび１
モルの過酸化水素を生成する反応〔１〕を触媒する酵素作用を有するＬ−グルタミン酸オ
キシダーゼ（H₂O₂・ジエネレイテイング）；Ｌ−
Glutamic acid oxidase（H₂O₂・generating）、
および該Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（H₂
O₂・ジエネレイテイング）の製造法に関する。従来より、Ｌ−グルタミン酸に基質特異性を有
する酸化酵素としては、２モルのＬ−グルタミン
酸、１モルの酸素および１モルの水から、２モル
のα−ケトグルタル酸、２モルのアンモニアおよ
び１モルの水を生成する反応を触媒する酵素作用
を有するＬ−（＋）−グルタミン酸オキシドレダク
ターゼが知られているにすぎない〔Biochimica.
et Biophisica.Acta.，368．（1974）158−172〕。また従来より、Ｌ−アミノ酸に基質特異性を有
し、かつ１モルのアミノ酸、１モルの酸素および
１モルの水から、１モルのα−ケト酸、１モルの
アンモニアおよび１モルの過酸化水素を生成する
反応を触媒する酵素作用を有するＬ−アミノ酸オ
キシダーゼが知られている〔Methods in
Enzymo−logy，Volume ，204−211（1955）
等〕。しかしながら、Ｌ−（＋）−グルタミン酸オキシ
ドレダクターゼは、前述の通り、２モルのＬ−グ
ルタミン酸に作用して、２モルのα−ケトグルタ
ル酸、２モルのアンモニアおよび１モルの水を生
成する反応を触媒する酵素であり、過酸化水素も
発生しない。またＬ−アミノ酸オキシダーゼは、
１モルのアミノ酸に作用して１モルのα−ケト
酸、１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化水
素を生成する反応を触媒する酵素であるが、その
基質たるアミノ酸としてＬ−グルタミン酸に作用
する酵素については報告されておらず、従来のＬ
−アミノ酸オキシダーゼはＬ−グルタミン酸に対
して作用しないと報告されている。〔Methods in
Enzymo−logy，Volume ，204−211
（1955）〕。またＬ−グルタミン酸に基質特異性を有し、か
つ１モルのＬ−グルタミン酸、１モルの酸素およ
び１モルの水から、１モルのα−ケトグルタル
酸、１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化水
素を生成する反応を触媒するＬ−グルタミン酸オ
キシダーゼが存在する。〔特願昭55−117783号、
特開昭57−43685号公報〕が、このＬ−グルタミ
ン酸オキシダーゼはＬ−グルタミン酸に基質特異
性をゆうするのみならず、Ｌ−ヒスチジンに対し
ても6.8％（Ｌ−グルタミン酸を100％とした相対
活性）も作用するもので、Ｌ−ヒスチジンに対し
て作用することからＬ−ヒスチジンが混在するＬ
−グルタミン酸被検液の分析では大きな測定誤差
を生じるもので、満足のいくものではなかつた。本発明者らは、長野県佐久市の畑土壌から分離
した放線菌A7700株および群馬県吾妻郡長野原町
のサツマイモ畑の土壌から分離した放線菌A8063
株が、Ｌ−グルタミン酸に基質特異性を有し、実
質的にＬ−ヒスチジンに基質特異性を有せず、か
つ１モルのＬ−グルタミン酸、１モルの酸素およ
び１モルの水から、１モルのα−ケトグルタル
酸、１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化水
素を生成する反応を触媒する酵素作用を有する新
規な酵素蛋白を産生することを見い出し、かつこ
れを単一な成分として精製、採取することを完成
し、この新規な酵素蛋白をＬ−グルタミン酸オキ
シダーゼ（H₂O₂・ジエネレイテイング）と命名
した。さらにこれらの放線菌A7700株および
A8063株を培養して得られたこのＬ−グルタミン
酸オキシダーゼ（H₂O₂・ジネレイテイング）を
用いることにより、種々のＬ−グルタミン酸を含
有する液体の新規な分析方法を確立した。まず本発明における上記放線菌A7700株および
A8063株の肉眼的および顕微鏡的観察などに基く
各種培地上における培養の特徴は、次に記載する
通りである。 (A) 放線菌A7700株について：顕微鏡的観察スターチ・無機塩寒天培地上で、30℃、10〜15
日間培養し、観察した形態的所見は、次の通りで
ある。なお、オートミール寒天培地およびイース
トエキス、麦芽エキス寒天培地上でもほぼ同様な
形態が観察された。基生菌糸は曲線状で、分岐を伴つて伸長し、直
径0.5〜0.6μで、菌糸の分裂や胞子の着生はない。基生菌糸より生じた気菌糸は、曲線状で単純分
岐をなして伸長し、直径0.6〜0.8μであり、多数
の連鎖した胞子を形成する。胞子の連鎖は螺旋を呈し、２〜３回巻いたもの
が多いが、ループ状あるいはフツク状のものもあ
る。胞子の形は楕円ないし短桿形で、大きさは0.6
〜0.8×0.8〜1.0μであり、その表面は平滑である。鞭毛胞子や胞子のうは形成しない。ジアミノピメリン酸組成全細胞を用いての分析で、Ｌ−型のジアシノピ
メリン酸が検出され、meso−型は検出されなか
つた。肉眼的観察各種培地上で、30℃、14日間培養し、観察した
所見は、第１表に示す通りである。また色の表示は、Color harmony manual
第４版1958年（Container Corporation of
America）によつた。

【表】

【表】生理的性状生育温度範囲：20〜40℃、酸素の要求性：好気性、ゼラチンの液化：陽性（極めて弱い）、スターチの加水分解：陽性、脱脂牛乳：ペプトン化；陽性（弱い）、凝固；陰性、メラニン様色素の生成：チロシン寒天培地上；陰性、ペプトン，イーストエキス・鉄寒天培地
上；陽性、炭素源の利用性：Ｌ−アラビノース、Ｄ−
フラクトース、Ｄ−グルコース、イノシトー
ル、Ｄ−アンニトール、ラフイノース、Ｌ−ラ
ムノース、シユクロースおよびＤ−キシロース
の全てを利用する。以上の通り、本菌A7700株は、真性の基生菌糸
より、多数の胞子の連鎖を有する気菌糸を形成
し、ジアミノピメリン酸がＬ型であり、鞭毛胞子
や胞子のうを形成せず、好気条件で生育すること
などの特徴を有することから、ストレプトマイセ
ス（Streptmyces）属に属するものと認められ、
よつて本菌A7700株をストレプトマイセス・エ
ス・ピー・A7700（Streptmyces sp・A7700）と
称することとし、また工業技術院微生物工業技術
研究所に受託番号、微工研菌寄第6241号
（FERM Ｐ−6241，FERM BP・2676）として
寄託した。 (B) 放線菌A8063株について、顕微鏡的観察スターチ・無機塩寒天培地上で、30℃、10〜15
日間培養し、観察した形態的所見は、次の通りで
ある。なお、グリセリン・アスパラギン寒天培
地、チロシン寒天培地およびイーストエキス・麦
芽エキス寒天培地上においても、ほぼ同様な形態
が観察された。基生菌糸は曲線状で分岐を伴つて伸長し、直径
0.5〜0.6μであり、菌糸の分裂や胞子の着生はな
い。基生菌糸より生じた気菌糸は曲線状で単純分岐
をなして伸長し、直径0.6〜0.8μであり、多数の
連鎖した胞子を形成する。胞子の連鎖は、ループ状、フツク状あるいは２
回巻いた螺旋を呈するものが多く、３回以上巻い
た螺旋も少数存在する。胞子の形は球形で、大きさは直径0.6〜0.8μで
あり、その表面はとげ状を呈している。鞭毛胞子や胞子のうは形成しない。ジアミノピメリン酸組成全細胞を用いての分析で、Ｌ型のジアミノピメ
リン酸が検出され、meso−型は検出されなかつ
た。肉眼的観察各種培地上で、30℃、14日間培養し、観察した
所見は、第２表に示す通りである。また色の表示は、Colov harmony manual
第４版1958年によつた。

【表】生理的性状生育温度範囲：15〜43℃、酸素の要求性：好気性、ゼラチンの液化：陽性（弱い）、スターチの加水分解：陽性脱脂牛乳：ペプトン化；陽性、凝固：陰性、メラニン様色素の生成：チロシン寒天培地
およびぺプトン・イーストエキス・鉄寒天培地
上で陽性、炭素源の利用性：利用するもの；Ｄ−フラクトース、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−マンニトール、Ｌ−ラムノースおよび
シユクロース、利用性の弱いもの；Ｌ−アラビノース、イノシト
ール、ラフイノースおよびＤ−キシロース、以上の通り、本菌A8063株は、真性の基生菌糸よ
り、多数の胞子の連鎖を有する気菌糸を形成し、
ジアミノピメリン酸がＬ型であり、鞭毛胞子や胞
子のうを形成せず、好気条件で生育することなど
の特徴を有することから、ストレプトマイセス属
に属するものと認められ、よつて本菌A8063株を
ストレプトマイセス・エス・ピー・A8063
（Streptomyces sp・A8063）と称することとし、
また工業技術院微生物工業技術研究所に受託番
号、微工研菌寄第6242号（FERM Ｐ−6242・
FERM BP−2677）として寄託した。またこの新規な酵素Ｌ−グルタミン酸オキシダ
ーゼ（H₂O₂・ジエネレイテイング）Ｌ−グルタ
ミン酸に基質特異性を有し、実質的にＬ−ヒスチ
ジンに基質特異性を有せず、かつ１モルのＬ−グ
ルタミン酸、１モルの酸素および１モルの水か
ら、１モルのα−ケトグルタル酸、１モルのアン
モニアおよび１モルの過酸化水素を生成する反応
を触媒する酵素であり、種々の定量手段を用いる
ことにより、Ｌ−グルタミン酸を含有する液体に
このＬ−グルタミン酸オキシターゼ（H₂O₂・ジ
エネレイテイング）を作用せしめ、次いで反応系
におけるＬ−グルタミン酸の量に基いて消費され
た酸素の量の定量、または、生成された過酸化水
素の定量、アンモニアの定量またはα−ケトグル
タル酸の定量を行なうことによりＬ−グルタミン
酸と含有する液体のＬ−グルタミン酸の定量分析
方法を見い出した。本発明は以上の知見に基いて完成されたもの
で、少なくとも下記の理化学的性質を有する新規
なＬ−グルタミン酸オキシターゼ（H₂O₂・ジエ
ネレイテイング）、基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に基質特異性を
有し、実質的にＬ−ヒスチジンに基質特異性を有
しない酵素作用：１モルのＬ−グルタミン酸、１モル
の酸素および１モルの水から、１モルのα−ケト
グルタル酸、１モルのアンモニアおよび１モルの
過酸化水素を生成する反応（反応式〔１〕）を触
媒する至適PHが５〜7.5付近である。熱安定性が55℃付近までである。 PH安定性がPH４〜7.5付近である。およびストレプトマイセス属に属するＬ−グル
タミン酸オキシダーゼ（H₂O₂・ジエネレイテイ
ング）生産菌を培養し、その培養物からＬ−グル
タミン酸オキシダーゼ（H₂O₂・ジエネレイテイ
ング）を採取することを特徴とするＬ−グルタミ
ン酸オキシダーゼ（H₂O₂・ジエネレイテイング）
の製造法である。本発明における新規なＬ−グルタミン酸オキシ
ダーゼ（H₂O₂・ジエネレイテイング〔以下単に
Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（H₂O₂）と称す〕
としては、前記の基質特異性および酵素作用を特
徴として有するものであればよく、等電点、Km
値、至適PH、熱安定性、PH安定性、添加物による
阻害、活性化などにおいて差異を示すものであつ
ても、上記の特徴を有するものは本発明に包含さ
れるものであり、またこの新規なＬ−グルタミン
酸オキシダーゼ（H₂O₂）を得るための使用菌と
しては前記の菌はその例である。また本発明の製造法における使用菌としては、
前記の菌はその例であつて、ストレプトマイセス
属に属するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（H₂
O₂）生産能力を有するものであればすべて本発
明において使用できる。もちろん、微生物は、自
然的、人工的に変異を起しやすく、これらの変異
株であつてもＬ−グルタミン酸オキシダーゼの生
産能力を失わない限り本発明に使用し得ることは
いうまでもないことであり、さらにこのＬ−グル
タミン酸オキシダーゼ（H₂O₂）の生産遺伝子を
細胞工学や遺伝子組み換え操作にて他の細胞へと
形質転換せしめてＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（H₂O₂）を製造することも本発明に包含されるも
のである。本発明を実施するに当つて、ストレプトマイセ
ス属に属するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（H₂O₂）生産菌による製造法について例示すれ
ば、次の如くである。例れば、ストレプトマイセ
ス属に属するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（H₂O₂）生産菌を、抗生物質、酵素などを生産す
る通常の方法で培養する。培養の形態は液体培養
でも固体培養でもよく、工業的にはＬ−グルタミ
ン酸オキシダーゼ（H₂O₂）生産菌の細胞をその
生産用培地に接種し、深部通気攪拌培養を行なう
のが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられるものが広く使用される。窒素源としては
利用可能な窒素化合物であればよく、例えばコー
ン・スチーブ・リカー、大豆粉、ペプトン、種々
の肉エキス、酵母エキス、硫安、塩化アンモニウ
ムやＬ−グルタミン酸などの各種アミノ酸などが
使用される。炭素源としては、同化可能な炭素化
合物であればよく、例えばシクロース、グルコー
ス、フラクトース、糖蜜、マルトエキス、スター
チ加水分解物などが使用される。その他、食塩、
塩化カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸第一カ
リウム、リン酸第二カリウムなどの種々の無機塩
や消泡剤が必要に応じて使用される。培養温度は菌が発育し、Ｌ−グルタミン酸オキ
シダーゼ（H₂O₂）を生産する範囲内で適宜変更
し得るが、通常20〜35℃、好ましくは26℃近辺で
ある。培養時間は、条件によつて多少異なるが、
通常50〜120時間程度であつて、Ｌ−グルタミン
酸オキシダーゼ（H₂O₂）が最高力価に達する時
期をみはからつて適当な時期に培養を終了すれば
よい。このようにして得られた培養物において、Ｌ−
グルタミン酸オキシダーゼ（H₂O₂）はその菌体
内に含有されている。さらにこのようにして得られた培養物からＬ−
グルタミン酸オキシダーゼ（H₂O₂）を抽出し、
粗製のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（H₂O₂）
を得るに当つて例示すれば、まず培養物を固液分
離し得られる湿菌体を、必要に応じてリン酸緩衝
液、トリス−HCl緩衝液、ジメチルグルタル酸−
NaOH緩衝液などの緩衝液に懸濁せしめ、次い
でフレンチプレス処理、超音波処理、ミル処理や
リゾチーム処理などの種々の菌体破砕処理手段を
適宜選択、組合せて処理して、粗製のＬ−グルタ
ミン酸オキシダーゼ（H₂O₂）含有液を得る。次
いでこの溶液を、さらに公知の蛋白質、酵素など
の単離、精製されたＬ−グルタミン酸オキシダー
ゼ（H₂O₂）を得ることができる。例えば、粗製
のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（H₂O₂）含有
液に、アセトン、メタノール、エタノールやイソ
プロパノールなどの有機溶剤による分別沈澱法、
硫安などによる塩析法などの手段を用いて沈澱せ
しめ、回収して粗製のＬ−グルタミン酸オキシダ
ーゼ（H₂O₂）含有物を得てもよい。さらにこれ
を、例えば電気泳動法などにて単一の帯を示すま
で精製してもよく、その精製手段としては、例え
ば上記の粗製のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（H₂O₂）含有物を前記の如くの緩衝液に溶解せし
め、透析手段やジエチルアミノエチルセルロー
ス、ジエチルアミノエチルセフアロースなどのイ
オン交換体、デキストランゲル、ポリアクリルア
マイドゲルなどのゲル過剤によるクロマトグラ
フ法を行なえばよい。またこれらの手段を適宜組
合せて精製すればよく、次いでこれを凍結乾燥手
段により乾燥してＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（H₂O₂）の精製粉末を得る。本発明によつて得られるＬ−グルタミン酸オキ
シダーゼ（H₂O₂）の活性測定法および理化学的
性質は、次の通りである。 (1) 活性測定法 0.3％４−アミノアンチピリン 0.3ml ペルオキシダーゼ（50U／ml） 0.1ml 0.2M リン酸緩衝液（PH7.0） 0.6ml 0.2％N.N−ジメチル−ｍ−トルイジン 0.3ml 0.2M Ｌ−グルタミン酸（PH7.0に調製） 1.5ml 蒸留水 0.2ml 計3.0ml 上記の組成を有する反応液3.0mlを調製し、37
℃に加温して石英セルに加え、酵素液50μlを加え
てすばやく混合し、37℃に調整された恒温セルホ
ルダーを有する分光光度計に装着し、混合後２分
目から正確に５分間反応を行ない、この間の
545nmにおける吸光度変化（ΔA545）を測定す
る。また活性測定の算出法は、次式に従う。Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（H₂O₂）活性
（単位／ml）＝ΔA545／32×１／２×１／５×3.05／0.05×希釈倍
率 (2) 基質特異性ストレプトマイセス・エス・ピー・A7700株の
産生したＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（H₂O₂）
〔以下、A7700酵素と略す〕およびストレプトマ
イセス・エス・ピー・A8063株の産生したＬ−グ
ルタミン酸オキシダーゼ（H₂O₂）〔以下、A8063
酵素と略す〕の各酵素を用いて、前記の活性測定
法を利用して、そのＬ−グルタミン酸の代りに、
第３表に記載の種々の基質を用いて、Ｌ−グルタ
ミン酸に対する相対活性（％）を求めた。その結果、第３表に示す通りで、両酵素ともＬ
−グルタミン酸に基質特異性を有し、Ｌ−チロシ
ン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フエニルアラニン−Ｌ
−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ
−アラニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−セリンに実質的に基質特異性
を有さないものと認められた。

【表】

【表】 (3) 酵素作用基質として0.5μmolesL−グルタミン酸を用い
て、両酵素の作用に基く、消費された酸素の量、
生成されたα−ケトグルタル酸の量、アンモニア
の量および過酸化水素の量を定量した。その結果は、第４表の通りであつた。

【表】なお、消費された酸素の量は酸素電極で定量
し、生成したα−ケトグルタル酸の量は2.4−ジ
ニトロフエニルヒドラジン法〔化学の領域、増刊
33第99〜104頁、「生化学領域における光電比色
法」〕で定量し、生成したアンモニアの量はイン
ドフエノール法〔J.Biol.Chem.，102、499
（1933）〕で定量し、生成した過酸化水素の量はペ
ルオキシダーゼ−４−アミノアンチピリン−フエ
ノール系の発色法で定量したものである。以上の結果、両酵素とも、１モルのＬ−グルタ
ミン酸、１モルの酸素および１モルの水から、１
モルのα−ケトグルタル酸、１モルのアンモニア
および１モルの過酸化水素を生成する反応（反応
式〔〕）を触媒することが確認された。 (4) 等電点 A7700酵素およびA8063酵素の等電点を、キヤ
リアー・アンフオライトPH3.5〜PH6.0（LKB社
製）を用いて等電点電気泳動法にて、両酵素の等
電点を求めた結果、A7700酵素はPH4.3付近、
A8063酵素はPH4.1付近であつた。 (5) Km値両酵素のＬ−グルタミン酸に対するKm値は、
A7700酵素が約5.6×10^-4Ｍ，A8063酵素が約1.1
×10^-3Ｍと測定された。 (6) 至適PH 活性測定法における緩衝液の代りに、グリシン
−HCl緩衝液（PH2.5〜4.5）、ジメチルグルタル酸
−NaOH緩衝液（PH４〜７）、リン酸緩衝液（PH
６〜８）、トリス−HCl緩衝液（PH７〜９）、グリ
シン−NaOH緩衝液（PH９〜9.5）の各緩衝液を
用いて、両酵素の活性測定を行なつてその至適PH
を測定した。その結果、第１図はA7700酵素の至適PH曲線を
示し、図中、●はグリシン−HCl緩衝液、×はジ
メチルグルタル酸−NaOH緩衝液、▲はリン酸
緩衝液、■はトリス−HCl緩衝液、◆はグリシン
−NaOH緩衝液の場合を示し、第２図はA8063酵
素の至適PH曲線を示し、図中○はグリシン−HCl
緩衝液、×はジメチルグルタル酸−NaOH緩衝
液、△はリン酸緩衝液、□はトリス−HCl緩衝
液、◇はグリシン−NaOH緩衝液の場合を示す
もので、両酵素ともPH５〜7.5に至適PHを有する
ものと測定された。 (7) 熱安定性 20mMリン酸緩衝液（PH7.0）に、各酵素A7700
酵素、A8063酵素を溶解し、種々の温度で10分間
加熱し、処理後直ちに氷浴に入れて冷した後、各
酵素の残存活性を活性測定法に基いて測定した。その結果、第３図に示す通りで、図中、●は
A7700酵素の場合を示し、○はA8063酵素の場合
を示し、両酵素とも55℃までは安定であり、70℃
では完全に失活した。 (8) PH安定性種々の緩衝液を用いて、A7700酵素のPH安定性
曲線（第４図に示す）およびA8063酵素のPH安定
性曲線（第５図に示す）を求めた。用いた緩衝液としては濃度40mMで、グリシン
−HCl緩衝液（PH2.5〜4.5）（第４図および第５図
中○にて示す）、ジメチルグルタル酸−NaOH緩
衝液（PH４〜7.5）（第４図および第５図中●にて
示す）、リン酸緩衝液（PH６〜８）（第４図および
第５図中▲にて示す）、トリス−HCl緩衝液（PH
７〜９）（第４図および第５図中△に示す）、グリ
シン−NaOH緩衝液（PH９〜9.5）（第４図および
第５図中□にて示す）を用い、各種緩衝液にそれ
ぞれの酵素を溶解し、37℃で60分間加温した後、
直ちに氷冷し、それぞれのPHにおける残存活性を
活性測定法に基いて測定した。その結果、A7700酵素の場合は第４図に示す通
りでPH4.5〜7.5で安定と認められ、またA8063酵
素の場合は第５図に示す通りでPH４〜7.5で安定
と認められた。 (9) 金属塩の影響 A7700酵素およびA8063酵素の活性に対する金
属イオンの影響を測定した結果、第５表に示す。
Cu²⁺イオン以外ほとんど影響はなかつた。

【表】

【表】 (10) 界面活性剤およびその他の物質の阻害、活性
化、種々の界面活性剤およびその他の物質の阻
害、活性化の結果について、第６表に示す。その結果、EDTAによる影響が認められな
いことから、両酵素とも金属酵素でないと推定
される。また両酵素とも、NaN₃やKCNによ
つても阻害されず、FAD，FMNによつても大
きく影響されなかつた。

〔試薬〕

Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイ
ジン 3mM ペルオキシダーゼ５単位／ml Ｌ−アラニン 200mM α−ケトグルタル酸 10mM トリス−HCl緩衝液 50mM Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（H₂O₂）
５単位／ml アスコルビン酸オキシダーゼ５単位／ml 〔試薬〕４−アミノアンチピリン 15mM 上記の組成を有する試薬の1.0mlを石英セル
に分取し、これに血清50μlを添加し、37℃で５分
間反応せしめた後、37℃に加温した試薬0.1ml
をさらに添加し、37℃で種々の時間反応せしめ、
次いで波長550nmにおける吸光度変化を測定し
た。その結果、第９図に示す通りで、血清中GPT
活性測定においてラグタイムが認められず、原点
を通る良好な直線性が得られた。また本発明方法
で測定することにより第一段反応で非特異的反応
およびラグタイムを改善、除去しているために盲
検を必要としない良好な測定法である。参考例４〔血清中GOT活性測定〕〔試薬〕Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイ
ジン 3mM ペルオキシダーゼ５単位／ml Ｌ−アスパラギン酸 200mM α−ケトグルタル酸 10mM トリス−HCl緩衝液 50mM Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（H₂O₂）
５単位／ml アスコルビン酸オキシダーゼ５単位／ml 〔試薬〕４−アミノアンチピリン 15mM 上記の組成を有する試薬の1.0mlを石英セル
に分取し、これに血清50μlを添加し、37℃で５分
間反応せしめた後、37℃に加温した試薬0.1ml
をさらに添加し、37℃で種々の時間反応せしめ、
次いで波長550nmにおける吸光度変化を測定し
た。その結果、第１０図に示す通りで、測定に
おいてラグタイムが認められず、かつ盲検も必要
としない、原点を通る良好な直線性を与える
GOT活性の測定をなし得たものであつた。参考例５参考例３と同一の試薬および試薬を用い
て、血清40サンプルを被検液（各50μl）として、
参考例３と同様に行なつて各血清中GPT活性を
測定した。また同一サンプルを用いて、従来のGPT活性
測定法〔UV法：和光純薬(株)キツト、GPT−UV
ワコー〕にて測定した。両方法の結果に基いて相凾を求めた結果、 γ＝0.998 ｙ＝1.03_x＋1.6 で、非常に良好な相凾を示した。またその相凾図
は第１１図に示す通りであつた。参考例６参考例４と同一の試薬および試薬を用い
て、血清40サンプルを被検液（各50μl）として、
参考例４と同様に行なつて各血清中のGOT活性
を測定した。また同一サンプルを用いて、従来のGOT活性
測定法〔UV法：和光純薬(株)キツト，GOT−UV
ワコー〕にて測定した。両方法の結果に基いて相凾を求めた結果、 γ＝0.997 ｙ＝1.01_x＋1.1 で非常に良好な相凾を示した。またその相凾図は
第１２図に示す通りであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図はＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（H₂
O₂）であるA7700酵素の至適PH曲線を示し、第２
図はＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（H₂O₂）で
あるA8063酵素の至適PH曲線を示し、第３図はそ
のA7700酵素およびA8063酵素の熱安定性曲線を
示し、第４図はそのA7700酵素のPH安定性曲線を
示し、第５図はそのA8063酵素のPH安定性曲線を
示し、第６図はそのA7700酵素およびA8063酵素
を用いるＬ−グルタミン酸の定量曲線を示し、第
７図は血清中GPT活性測定曲線を示し、第８図
は血清中GOT活性測定曲線を示し、第９図は血
清中GPT活性測定曲線を示し、第１０図は血清
中GOT活性測定曲線を示し、第１１図はGPT活
性測定における相凾図を示し、第１２図はGOT
活性測定における相凾図を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１少なくとも下記の理化学的性質を有する新規
なＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（H₂O₂・ジエ
ネレイテイング）。基質特異性：少なくともＬ−グルタミン酸に基
質特異性を有し、実質的にＬ−ヒスチジンに基質
特異性を有しない。酵素作用：１モルのＬ−グルタミン酸、１モル
の酵素および１モルの水から、１モルのα−ケト
グルタル酸、１モルのアンモニアおよび１モルの
過酸化水素を生成する反応〔１〕を触媒する。至適PHが５〜7.5付近である。熱安定性が55℃付近までである。 PH安定性がPH４〜7.5付近である。２ストレプトマイセス属に属する少なくとも下
記の理化学的性質を有するＬ−グルタミン酸オキ
シダーゼ（H₂O₂・ジエネレイテイング）生産菌
を培地に培養し、その培養物から該Ｌ−グルタミ
ン酸オキシダーゼ（H₂O₂・ジエネレイテイング）
を採取することを特徴とする新規な該Ｌ−グルタ
ミン酸オキシダーゼ（H₂O₂・ジエネレイテイン
グ）の製造法。基質特異性：少なくともＬ−グルタミン酸に基
質特異性を有し、実質的にＬ−ヒスチジンに基質
特異性を有しない。酵素作用：１モルのＬ−グルタミン酸、１モル
の酸素および１モルの水から、１モルのα−ケト
グルタル酸、１モルのアンモニアおよび１モルの
過酸化水素を生成する反応〔１〕を触媒する。至適PHが５〜7.5付近である。熱安定性が55℃付近までである。 PH安定性がPH４〜7.5付近である。３ストレプトマイセス属に属する該Ｌ−グルタ
ミン酸オキシダーゼ（H₂O₂・ジエネレイテイン
グ）生産菌が、ストレプトマイセス・エス・ピ
ー・A7700，FERM Ｐ−6241，FERM BP−
2676である特許請求の範囲第２項記載の製造法。４ストレプトマイセス属に属する該Ｌ−グルタ
ミン酸オキシダーゼ（H₂O₂・ジエネレイテイン
グ）生産菌が、ストレプトマイセス・エス・ピ
ー・A8063，FERM Ｐ−6242、FERM BP−
2677である特許請求の範囲第２項記載の製造法。