JPH02163080A - Ｌ―グルタミン酸オキシダーゼ（ｈ↓２ｏ↓２・ジエネレイテイング）およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、少なくともＬ−グルタミン酸に基質特異性を
有し、実質的にＬ−ヒスチジンに基質特異性を有せず、
かつ１モルのＬ−グルタミン酸、１モルの酸素および１
モルの水から、１モルのα−ケトグルタル酸、１モルの
アンモニアおよび１モルの過酸化水素を生成する反応（
１）ＣＯＯＩＩ　　　　　　　　　Ｃ００Ｈｃｒｔ、　
　　　　　　　　ＣＩ＋Ｉ Ｃｕｔ　　　＋　Ｏｘ　＋　Ｈ２Ｏ２　Ｃ１１ｚ　　　
＋Ｎｔｌｓ　十１ｈｏｚＣＯＯ）ｌ　　　　　　　　　
　　Ｃ０ＯＨ（１）し−グルタミン酸　　　α−ケトグ
ルタル酸を触媒する酵素作用を有するＬ−グルタミン酸
オキシダーゼ（Ｈ２０□・ジエネレイテイング）；Ｌ　
−Ｇｌｕｔａｓｉｃ　　ａｃｉｄ　　ｏｘｉｄａｓｅ（
ＨｚＯｔ　０　ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ）、および１１Ｌ
−グルタミン酸オキシダーゼ（ＨｔＯｏ・ジエネレイテ
イング）の製造法に関する。

従来より、Ｌ−グルタミン酸に基質特異性を有する酸化
酵素としては、２モルのＬ−グルタミン酸、１モルの酸
素および１モルの水から、２モルのα−ケトグルタル酸
、２モルのアンモニアおよび１モルの水を生成する反応
を触媒する酵素作用を有するＬ−（＋）−グルタミン酸
オキシドレダクターゼが知られているにすぎない（Ｂｉ
ｏｃｈｉｍｉｃａ。

ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｉｓｉｃａ、　Ａｃｔａ、、　　３６
８．　　（１９７４）　１５Ｂ−１７２）。

また従来より、Ｌ−アミノ酸に基質特異性を有し、かつ
１モルのアミノ酸、１モルの酸素および１モルの水から
、１モルのα−ケト酸、１モルのアンモニアおよび１モ
ルの過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素作用を有
するし一アミノ酸オキシダーゼが知られている（Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ。

１ｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ　Ｉｌ、　２０４−２１１　（
１９５５）等〕 しかしながら、Ｌ−（＋）−グルタミン酸オキシドレダ
クターゼは、前述の通り、２モルのＬ−グルタミン酸に
作用して、２モルのα−ケトグルタル酸、２モルのアン
モニアおよび１モルの水を生成する反応を触媒する酵素
であり、過酸化水素も発生しない、またＬ−アミノ酸オ
キシダーゼは、１モルのアミノ酸に作用して１モルのα
−ケト酸、１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化水
素を生成する反応を触媒する酵素であるが、その基質た
るアミノ酸としてＬ−グルタミン酸に作用する酵素につ
いては報告されておらず、従来のしアミノ酸オキシダー
ゼはＬ−グルタミン酸に対して作用しないと報告されて
いる（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ−１ｏｇｙ
、Ｖｏｌｕｌｌｅ　ＩＩ、　　２０４　２１１　（１９
５５））。

またＬ−グルタミン酸に基質特異性を有し、かつ１モル
のＬ−グルタミン酸、１モルの酸素および１モルの水か
ら、１モルのα−ケトグルタル酸、１モルのアンモニア
および１モルの過酸化水素を生成する反応を触媒するＬ
−グルタミン酸オキシダーゼが存在する〔特願昭５５−
１１７７８３号、特開昭５７−４３６８５号公報〕が、
このＬ−グルタミン酸オキシダーゼはＬ−グルタミン酸
に基質特異性をゆうするのみならず、Ｌ−ヒスチジンに
対しても６．８％（Ｌ−グルタミン酸を１００％とした
相対・活性）も作用するもので、Ｌヒスチジンに対して
作用することからし一ヒスチジンが混在するＬ−グルタ
ミン酸被検液の分析では大きな測定誤差を生じるもので
、満足のいくものではなかった。

本発明者らは、長野県佐久市の畑土壌から分離した放線
菌Ａ’？ＴＯＯ株および群馬県吾妻郡長野原町のサツマ
イモ畑の土壌から分離した放線菌Ａ８０６３株が、Ｌ−
グルタミン酸に基質特異性を有し、実質的にＬ−ヒスチ
ジンに基質特異性を有せず、かつ１モルのＬ−グルタミ
ン酸、１モルの酸素および１モルの水から、１モルのα
−ケトグルタル酸、１モルのアンモニアおよび１モルの
過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素作用を有する
新規な酵素蛋白を産生ずることを見い出し、かつこれを
単一な成分として精製、採取することを完成し、この新
規な酵素蛋白をＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ
２・ジエネレイテイング）と命名した。さらにこれらの
放線菌Ａ７７００株およびＡ８０６３株を培養して得ら
れたこのＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・シ
ネレイティング）を用いることにより、種々のＬ−グル
タミン酸を含有する液体の新規な分析方法を確立した。

まず本発明における上記放線菌Ａ７７００株およびＡ８
０６３株の肉眼的および顕微鏡的観察などに基く各種培
地上における培養の特徴は、次に記載する通りである。

（Ａ）放線菌Ａ７７００株について： ■顕微鏡的観察 スターチ・無機塩寒天培地上で、３０℃、１０〜１５日
間培養し、観察した形態的所見は、次の通りである。な
お、オートミール寒天培地およびイーストエキス、麦芽
エキス寒天培地上でもほぼ同様な形態が観察された。

基生菌糸は曲線状で、分岐を伴って伸長し、直径０．５
〜０．６μで、菌糸の分裂や胞子の着生はないＯ 基生菌糸より生じた気菌糸は、曲線状で単純分岐をなし
て伸長し、直径０．６〜０．８μであり、多数の連鎖し
た胞子を形成する。

胞子の連鎖は螺旋を呈し、２〜３回巻いたものが多いが
、ループ状あるいはフック状のものもある。

胞子の形は楕円ないし短稈形で、大きさは０．６〜ｏ、
　ｓ　ｘ　ｏ、　ｓ〜ＬＯμであり、その表面は平滑で
ある。

鞭毛胞子や胞子のうは形成しない。

■、ジアミノピメリン酸組成 全細胞を用いての分析で、Ｌ−型のシアジノピメリン酸
が検出され、ｍｅａｏ−型は検出されなかった。

■、肉眼的観察 各種培地上で、３０℃、１４日間培養し、観察した所見
は、第１表に示す通りである。

また色の表示は−，０６１ｏｒ　ｈａｒｍｏｎｙ　ｍａ
ｎｕａｌ　　第４版１９５８年（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ　
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆＡｍｅｒ−１ｃａ　）に
よった。

■、生理的性状 ■生育温度範囲＝２０〜４０℃、 ■酸素の要求性：好気性、 ■ゼラチンの液化：陽性（極めて弱い）、■スターチの
加水分解：陽性、 ■脱脂牛乳：ペプト／化：陽性（弱い）、凝固；陰性、 ■メラニン様色素の生成： チロシン寒天培地上；陰性、 ペプト／・イーストエキス・鉄寒天培地上；陽性、 ■炭素源の利用性：Ｌ−アラビノース、Ｄ−フラクトー
ス、Ｄ−グルコース、イノシトール、Ｄ−アンニトール
、ラフィノース、Ｌ−ラムノース、シュクロースおよび
Ｄ−キシロースの全てを利用する。

以上の通り、本菌Ａ７７００株は、真性の基生菌糸より
、多数の胞子の連鎖を有する気菌糸を形成し、ジアミノ
ピメリン酸がＬ型であり、鞭毛胞子や胞子のうを形成せ
ず、好気条件で生育することなどの特徴を有することか
ら、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｅ）属
に属するものと認められ、よって本菌Ａ７７００株をス
トレプトマイセス・エス・ピー・Ａ　７７００　（Ｓｔ
ｒｅｐｔｍｙｃｅｅ　５ｐ−Ａ　７７００）と称するこ
と士し、また工業技術院微生物工業技術研究所に受託番
号、微工研菌寄第６２４１号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−６２４
１）として寄託した０ ｒＢ）放線菌Ａ８０６３株について、 １１顕微鏡的観察 スターチ・無機塩寒天培地上で、３０℃、ｌＯ〜１５日
間培養し、観察した形態的所見は、次の通りである。な
お、グリセリン・アスパラギン寒天培地、チロシン寒天
培地およびイーストエキス・麦芽エキス寒天培地上にお
いても、はぼ同様な形態が観察された。

基生菌糸は曲線状で分岐を伴って伸長し、直径０．５〜
０．６μであり、菌糸の分裂や胞子の着生はない。

基生菌糸より生じた気菌糸は曲線状で単純分岐をなして
伸長し、直径０．６〜０．８μであり、多数の連鎖した
胞子を形成する。

胞子の連鎖は、ループ状、フック状あるいは２回巻いた
螺旋を呈するものが多く、３回以上巻いた螺旋も少数存
在する。

胞子の形は球形で、大きさは直径０．６〜０．８μであ
り、その表面はとげ状を呈している。

鞭毛胞子や胞子のうけ形成しない。

■、ジアミノピメリン酸組成 全細胞を用いての分析で、Ｌ型のジアミノピメリン酸が
検出され、ｍｅｓｏ−型は検出されなかった。

皿肉眼的観察 各種培地上で、３０℃、１４日間培養し、観察した所見
は、第２表に示す通りである。

また色の表示は、０ｏｌｏｖ　ｈａｒｍｏｎｙ　ｍａｎ
ｕａｌ第４■、生理的性状 ■生育温度範囲：１５〜４３℃Ｘ ■酸素の要求性：好気性、 ■ゼラチンの液化：陽性（弱い〕、 ■スターチの加水分解：陽性 ■脱脂牛乳：ペプトン化；陽性、 凝固：陰性、 ■メラニン様色素の生成：チロシン寒天培地およびペプ
トン・イーストエキス・鉄寒天培地上で陽性、 ■炭素源の利用性： 利用するもの；Ｄ−７ラクトース、Ｄ−グルコース、Ｄ
−マンニトール、Ｌ−ラムノースおよびシュクロース、 利用性の弱いもの；Ｌ−アラビノース、イノシトール、
ラフィノースおよびＤ−キシロース、以上の通り、本菌
Ａ８０６３株は、真性の基性薗糸より、多数の胞子の連
鎖を有する気菌糸を形成し、ジアミノピメリン酸がＬ型
であり、鞭毛胞子や胞子のうを形成せず、好気条件で生
育することなどの特徴を有することから、ストレプトマ
イセス属に属するものと認められ、よって本菌へ８０６
３株をストレプトマイセス・エス・ピー・Ａ８０６３　
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅθθｐ、Ａｓｏ６ａ）と称す
ることとし、また工業技術院微生物工業技術研究所に受
託番号、微工研菌寄第６２４２号（ＦＥＢＭＰ−６２４
２）として寄託した。

またこの新規な酵素Ｌ−グルタミン酸オキシダ／酸、１
モルの酸素および１モルの水から、１モルのα−ケトグ
ルタル酸、１モルのアンモニアオよび１モルの過酸化水
素を生成する反応を触媒する酵素であり、種々の定量手
段を用いることにより、Ｌ−グルタミン酸を含有する液
体にこのＬ−グルタミン酸オキシターゼ（Ｈ２Ｏ２・ジ
エネレイテイング〕を作用せしめ、次いで反応系におけ
るＬ−グルタミン酸の量に基いて消費された酸素の量の
定量、または、生成された過酸化水素の定量、アンモニ
アの定量またはα−ケトグルタル酸の定量を行なうこと
によりＬ−グルタミン酸と含有する液体のＬ−グルタミ
ン酸の定量分析方法を見い出した。

本発明は以上の知見に基いて完成されたもので、少なく
とも下記の基質特異性、酵素作用の理化学的性質を有す
る新規なＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジ
エネレイテイング）、・酵素作用：１モルのＬ−グルタ
ミン酸、１モルの酸素および１モルの水から、１モルの
α−ケトグルタル酸、１モルのアンモニアおよび１モル
の過酸化水素を生成する反応（反応式〔Ｉ〕）を触媒す
る Ｌ−グルタミン酸　　　　　　　α−ケトグルタル酸お
よびストレプトマイセス属に属するＬ−グルタミン酸オ
キシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジエネレイテイング）生産菌を
培養し、その培養物からＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（Ｈ２Ｏ２・ジエネレイテイング）を採取することを特
徴とするＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２・ジ
エネレイテイング）の製造。

を 法ぺなｆｂＵＲ〜妥グ入夾諏し酸誓含有京る滴偽心穐へ
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［ｌへ０１徴１１〜萱ズＬロＶ　＠　４−２＼ｌ ）折重へである。　　　　　　　　　　　　　　、（本
発明における新規なＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（■
２ｏｚ・ジエネレイテイング〔以下単にＬ−グルタミン
酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）と称す〕としては、前記の
基質特異性および酵素作用を特徴として有するものであ
ればよく、等電点、Ｋｍ値、ても、上記の特徴を有する
ものは本発明に包含されるものであり、またこの新規な
Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）を得るため
の使用菌としては前記の菌はその例である。

また本発明の製造法における使用菌としては、前記の菌
はその例であって、ストレプトマイセス属に属するＬ−
グルタミン酸オキシダーゼＣＨ２０２）生産能力を有す
るものであればすべて本発明において使用できる。もち
ろん、微生物は、自然的、人工的に変異を起しやすく、
これらの変異株であってもＬ−グルタミン酸オキシダー
ゼの生産能力を失わない限り本発明に使用し得ることは
いうまでもないことであり、さらにこのＬ−グルタミン
酸オキシダーゼ（Ｈ２０ｇ）の生産遺伝子を細胞工ｄ遺
伝子組み換え操作にて他の細胞へと形質転換せしめてＬ
−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）を製造するこ
とも本発明に包含されるものである。

本発明を実施するに当って、ストレプトマイセス属に属
するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）生産菌
による製造法について例示すれば、次の如くである。例
れば、ストレプトマイセス属に属するＬ−グルタミン酸
オキシダーゼ（Ｉ（２０２）生産菌を、抗生物質、酵素
などを生産する通常の方法で培養する。培養の形態は液
体培養でも固体培養でもよく、工業的にはＬ−グルタミ
ン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）生産菌の細胞をその生産
用培地に接種し、深部通気攪拌培養を行なうのが有利で
ある。

培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられる
ものが広く使用される。窒素源としては利用可能な窒素
化合物であればよく、例えばコーン・スチープ・リカー
、大豆粉、ペプトン、種々の肉エキス、酵母エキス、硫
安、塩化アンモニウムやＬ−グルタミン酸などの各種ア
ミノ酸などが使用される。炭素源としては、同化可能な
炭素化合物であればよく、例えばシフロース、グルコー
ス、フラクトース、糖蜜、マルトエキス、スターチ加水
分解物などが使用される。その他、食塩、塩化カリウム
、硫酸マグネシウム、リン酸第−カリウム、リン酸第二
カリウムなどの徨々の無機塩や消泡剤が必要に応じて使
用される。

培養温度は菌が発育し、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ
（Ｈ２Ｏ２）を生産する範囲内で適宜変更し得るが、通
常２０〜３５℃、好ましくは２６℃近辺である。培養時
間は、条件によって多少異なるが、通常５０〜１２０時
間程度であって、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（ａ２
Ｏ２）が最高力価に達する時期をみはからって適当な時
期に培養を終了すればよい。

このようにして得られた培養物において、Ｌ−グルタミ
ン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）はその菌体内に含有され
ている。

さらにこのようにして得られた培養物からＬ−グルタミ
ン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）を抽出し、粗製のＬ−グ
ルタミン酸オキシダーゼ（Ｈｇ０２）を得るに当って例
示すれば、まず培養物を固液分離し得られる湿菌体を、
必要に応じてリン酸緩衝液、トリス−ＨＯノ緩衝液、ジ
メチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液などの緩衝液に懸濁
せしめ、次いでフレンチプレス処理、超音波処理、ミル
処理やりゾチーム処理などの種々の画体破砕処理手段を
適宜選択、組合せて処理して、粗製のＬ−グルタミン酸
オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）含有液を得る。次いでこの溶
液を、さらに公知の蛋白質、酵素などの単離、精製され
たＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）を得るこ
とができる。例えば、粗製のＬ−グルタミン酸オキシダ
ーゼ（ＨｇＯｇ）含有液に、アセト／、メタノール、エ
タノールやイソプロパツールなどの有機溶剤による分別
沈澱法、硫安などによる塩析法などの手段を用いて沈澱
せしめ、回収して粗製のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（Ｈ２Ｏ２）含有物を得てもよい。さらにこれを、例え
ば電気泳動法などにて単一の帯を示すまで精製してもよ
く、その精製手段としては、例えば上記の粗製のＬ−グ
ルタミン酸オキシダーゼ（ＨｇＯｇ）含有物を前記の如
くの緩衝液に溶解せしめ、透析手段やジエチルアミンエ
チルセルロース、ジエチルアミノエチルセファロースな
どのイオン交換体、デキストランゲル、ポリアクリルア
マイドゲルなどのゲルー過剤によるクロマトグラフ法を
行なえばよい。またこれらの手段を適宜組合せて精製す
ればよく、次いでこれを凍結乾燥手段により乾燥してＬ
−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）の精製粉末を
得る。

本発明によって得られるＬ−グルタミン酸オキシダーゼ
（Ｈ２Ｏ２）の活性測定法および理化学的性質は、次の
通りである。

（１）活性測定法 ０．３％４−アミノアンチピリン　　　０．３−ペルオ
キシダーゼ（５ｏＵ鷹）　　　　０．１　ｄｏ、２Ｍ　
リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　　０．６＋ｄＯ０２％Ｎ
、Ｎ−ジメチルーｍ−トルイジン　　　　　　　　　　
　　　　　０．３−０．２ＭＬ−グルタミン酸（ＰＲ ７０に調製）　　　　　　　　　　　　Ｌ５１Ｒ１蒸留
水　　　　　　　　　　　　　　０．２−一一一一」 計８．０ゴ 上記の組成を有する反応液＆０−を調製し、３７℃に加
温して石英セルに加え、酵素液５０μ！を加えてすばや
く混合し、３７℃に調整された恒温セルホルダーを有す
る分光光度計に装着し、混合後２分目から正確に５分間
反応を行ない、この間の５４５ｎｍにおける吸光度変化
（ΔＡ３４５）を測定する。

また活性測定の算出法は、次式に従う。

％式％ 株の産生じたＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（′Ｈ２Ｏ
２）〔以下、Ａ７７００酵素と略す〕およびストレプト
マイセス・エス・ピー・Ａ８０６３株の産生じたＬ−グ
ルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）　Ｃ以下、Ａ８０
６３酵素と略す〕の各酵素を用いて、前記の活性測定法
を利用して、そのＬ−グルタミン酸の代りに、第３表に
記載の種々の基質を用いて、Ｌ−グルタミン酸に対する
相対活性（％）を求めた。

その結果、第３表に示す通りで、両酵素ともＬ−グルタ
ミン酸に基質特異性を有し、Ｌ−チロシン、Ｌ−メチオ
ニ／、Ｌ−フェニルアラニン−Ｌ−アルギニン、Ｌ−リ
ジン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌいものと認められた。

第　　　３　　　表 （３）酵素作用 基質として０．５μｍｏｌｅｓ　Ｌ−グルタミン酸を用
いて、両酵素の作用に基く、消費された酸素の量、生成
されたα−ケトグルタル酸の量、アンモニアの量および
過酸化水素の量を定量した。

その結果は、第４表の通りであった。

第　　　４　　　表 ０ＧＨ Ｃ！ＯＯＨ なお、消費された酸素の量は酸素電極で定量し、生成し
たα−ケトグルタル酸の量は２．．４−ジニトロフェニ
ルヒドラジ７法〔化学の領域、増刊３３第９９〜１０４
頁、「生化学領域における光電比色法」〕で定量し、生
成したアンモニアの量はインドフェノール法（Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、　Ｏｈｅｍ、、上０２　４９９（１９３３））で
定量し、生成した過酸化水素の量はペルオキシダーゼ−
４−アミノアンチピリン−フェノール系の発色法で定量
したものである。

以上の結果、両酵素とも、１モルのＬ−グルタミン酸、
１モルの酸素および１モルの水から、１モルのα−ケト
グルタル酸、１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化
水素を生成する反応（反応式〔ｌ〕）を触媒することが
確認された。

０００Ｈ０ＯＯＨ Ｌ−グルタミン酸　　　　　　　α−ケトグルタル酸（
４）等電点 Ａ７７００酵素およびＡ８０６３酵素の等電点を、キャ
リアー・アンフオライトｐＨ＆５〜ｐＨ６，０（ＬＫＢ
社製）を用いて等電点電気泳動法にて、両酵素の等電点
を求めた結果、Ａ　７７００酵素はｐＨ４，３付近、Ａ
８０６３酵素はｐＨ４，１付近であった。

（５）　Ｋｍ値 両酵素のＬ−グルタミン酸に対するｎ値は、Ａ７７００
酵素が約６６Ｘ１０−４Ｍ、Ａ８０６３酵素が約ＬＩＸ
ＩＯＭと測定された。

（６）至適ｐＨ 活性測定法における緩衝液の代りに、グリシ／−ＨＣｊ
Ｊ緩衝液（ｐＨ１５〜４．５）、ジメチルグルタル酸−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ４〜７）、リン酸緩衝液（ｐＨ６
〜８）、トリス−ＨＯノ緩衝液（ｐＨ７〜９）、グリシ
ｙ−ＮａＯＨ緩衝液ＣｐＨ９〜９．５）の各緩衝液を用
いて、両酵素の活性測定を行なってその至適ｐＨを測定
した。

その結果、第１図はＡ７７００酵素の至適ｐＨ凹曲線示
し、図中、・はグリシン−ＨＣＪ緩衝液、×はジメチル
グルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液、ムはリン酸緩衝液、ｌＩ
はトリス−Ｈ（Ｊ緩衝液、◆はグリシ７−ＮＰＬＯＨ緩
衝液の場合を示し、第２図はＡ８０６３酵素の至適ｐＨ
凹曲線示し、図中Ｏはグリシン−ＨＣｊＪ緩衝液、×は
ジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液、Δはリン酸緩衝
液、口はトリス−ＨＣ！緩衝液、◇はグリシン−ＮａＯ
Ｈ緩衝液の場合を示すもので、両酵素ともｐＨ５〜７．
５に至適ｐＨを有するものと測定された。

（７）熱安定性 ２０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ　Ｈ７，Ｏ）に、各酵素Ａ７
７００酵素、Ａ８０６３酵素を溶解し、種々の温度で１
０分間加熱し、処理後直ちに水浴に入れて冷した後、各
酵素の残存活性を活性測定法に基いて測定した。

その結果、第３図に示す通りで、図中、・はＡ７７００
酵素の場合を示し、ＯはＡ８０６３酵素の場合を示し、
両酵素とも５５℃までは安定であり、７０℃では完全に
失シｔ　Ｌ、た。

（８）　Ｐ　Ｈ安定性 種々の緩衝液を用いて、Ａ７７００酵素のｐＨ安定性曲
線（第４図に示す）およびＡ８０６３酵素のＰＲ安定性
曲線（第５図に示す）を求めた。

用いた緩衝液としては濃度４０ｍＭで、グリシ７−Ｈ（
Ｊ緩衝液（ｐＨ２，５〜４．５　）　（第４図および第
５図中Ｏにて示す〕、ジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩
衝液（ｐＨ４〜７．５）（第４図および第５図中・にて
示す〕、リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８〕（第４図および第
５図中ムにて示す〕、トリス−ｎａｚ緩衝液（ｐＨ７〜
９〕（第４図および第５図中Δにて示す）、グリシン−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９〜９．５）（第４図および第５
図中口にて示す９を用い、各種緩衝液にそれぞれの酵素
を溶解し、３７℃で６０分間加温した後、直ちに氷冷し
、それぞれのｐＨにおける残存活性を活性測定法に基い
て測定した。

その結果、Ａ７７００酵素の場合は第４図に示す通りで
Ｐ　Ｈ４，５〜７５で安定と認められ、またＡ８０６３
酵素の場合は第５図に示す通りでｐＨ４〜７．５で安定
と認められた。

（９）金属塩の影響 Ａ７７００酵素およびＡ８０６３酵素の活性に対する金
属イオンの影響を測定した結果、第５表に示す。Ｃｕ２
＋イオン以外はとんど影響はなかった。

（至）界面活性剤およびその他の物質の阻害、活性化、
種々の界面活性剤およびその他の物質の阻害、活性化の
結果について、第６表に示す。

その結果、ＥＤＴＡによる影響が認められないことから
、両酵素とも金属酵素でないと推定される。また両酵素
とも、ＮａＮ３やＫＯＮによっても阻害されず、ＦＡＤ
、−ＦＭＮによっても大きく影響されなかった。

第　　　６　　　表 以上の通り、Ａ７７００酵素およびＡ８０６３酵素は、
Ｌ−グルタミン酸に基質特異性を有し、かつ１モルのＬ
−グルタミン酸、１モルの酸素および１モルの水から、
１モルのα−ケトグルタル酸、１モルのアンモニアおよ
び１モルの過酸化水素を生成する反応を触媒するＬ−グ
ルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）で、新規な酵素と
認められる。

また新規なこのＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ
２）は、その酵素作用に基いて消費された成分である酸
素の量、生成された成分であるα−ケトグルタル酸の量
、アンモニアの景、過酸化水素の量の定量を行なうこと
によりＬ−グルタミン酸を含有する液体の新規な分析方
法に使用されるっ本発明の対象となるＬ−グルタミン酸
を含有する液体としては、Ｌ−グルタミン酸を含有する
ものであればすべて包まれる。例えばＬ−グルタミン酸
試薬、Ｌ−グルタミン酸醗酵液、Ｌ−グルタミン酸を含
有する飲食品などの被検液や、Ｌ−グルタミン酸を生成
、遊離する酵素反応系やＬ−グルタミン酸を基質として
消費する酵素反応系の酵素活性測定用またはその酵素基
質定量用被検液が挙られる。またその酵素活性測定用ま
たはその酵素基質定量用被検液の酵素反応系としては、
以下の種々の反応系が挙られる。

・グルタメイト・ビルベイト・トランスアミナーゼ（Ｇ
ＰＴ）活性反応系 ＧＰＴ Ｌ−アラニン＋α−ケトグルタル酸□ ピルビン酸＋Ｌ−グルタミン酸 ・グルタメイト・オキ”ザロアセテート・トランスアミ
ナーゼ（ＧＯＴ）活性反応系 ０Ｔ Ｌ−アスパラギン酸＋α−ケトグルタル酸□ヨオギザロ
酢酸＋Ｌ−グルタミン酸 ・システィン・アミントランスフェラーゼ（ＯＡ’ｐａ
ｓｅ　）活性反応系 ＡＴａｓｅ Ｌ−システィン＋α−ケトグルタル酸 β−メルカプトピルビン酸＋Ｌ−グルタミン酸・チロシ
ン・アミントランスフェラーゼ（ＴＡＴａｓｓ　）活性
反応系 ＴＡＴ　ａｓθ Ｌ−チロシン＋α−ケトクルタル酸 Ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸＋Ｌ−グルタミン酸
・ロイン／・アミノトランスフェラーゼ（ＬＡＴａ日ｅ
）活性反応系 ＬＡ’ｌ’ａｓｅ Ｌ−ロイシン＋α−ケトグルタル酸 ２−オキソイソカプロン酸＋Ｌ−グルタミン酸・キヌレ
ン・アミノトランスフェラーゼ（ＫＡ’［’ａｓｅ　）
活性反応液 ＫＡＴａ　ｓ　ｅ Ｌ−キヌレン＋α−ケトグルタル酸 ０−アミノベンゾイルピルビン酸＋Ｌ−グルタミン酸・
アミノブチレート・アミントランスフェラーゼ（ＡＡＴ
ａｓθ）活性反応系 ＡＴａｅｅ ４−アミノブタン酸＋α−ケトグルタル酸−−−→サク
シニックセミアルデヒド＋Ｌ−グルタミン酸・γ−グル
タミル・トランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）活性反応
系 γ−は Ｌ−グルタミール−Ｘ＋Ｌ−グルタミン酸−一→グリシ
ルーグリシルーＸ＋Ｌ−クルタミン酸（ただしＸはグル
タミル−アミノ酸などの転位基）・グルメメイト・ラセ
マーゼ（ＧＲａｅｅ）活性反応系 ＧＲａｅｅ Ｄ−グルタミン酸　　　　Ｌ−グルタミン酸これらの酵
素反応系は例示であって、何んら本発明の被検液を限定
するものではなく、またこれらの反応系において、生成
、遊離されるＬ−グルタミン酸の量を定量分析すること
により、その酵素活性測定を行なうが１、またその酵素
基質定量となるものである。

・アミノ−アシッド・アセチルトランスフェラーゼ（Ａ
ＡＡＴ　ａｓｓ　）活性反応系 ＡＡＡＩＩＬ　Ｂ　Ｂ アセチル−ＣｏＡ＋Ｌ−グルタミン酸 Ｃｏ　Ａ　Ｓ　Ｈ＋　Ｎ−アセチル−Ｌ−グルタミン酸
・グリシン・アミントランスフェラーゼ（ＧＬＡ’ｌ’
ａｓｅ）活性反応系 ０ＬＡＴａｓｅ グリオキサル酸＋Ｌ−グルタミン酸 グリシ／＋α−ケトグルタル酸 ・グルタルメイト・デカルボキシラーゼ（ＧＤａｓθ）
活性反応系 ■ａｓｅ Ｌ−グルタミン酸 γ−アミノブタン酸＋Ｃｏ２ ・γ−グルタミルーシスティン・シンセターゼ（γ−Ｇ
ＬＯ８ａｓｅ）活性反応系 ７−ＧＬＯＳ　ａｓｓ Ａ’ｌ’Ｐ＋Ｌ−グルタミン酸＋Ｌ−システィンγ−Ｌ
−グルタミル−Ｌ−システィン＋ＡＤＰ十無機９ノ酸上
記の酵素反応系は例示であって、何んら本発明の被検液
を限定するものではなく、またこれらの反応系において
酵素基質として消費されたＬ　−グルタミン酸の量を定
量することにより、その酵素活性測定を行なうものであ
る。

次いでこのようにして用意されたＬ−グルタミン酸を含
有する液体に、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（ＨｇＯ
２）を作用せしめるのであるが、このＬ−グルタミン酸
オキシダーゼ（ＨｇＯ２）は酵素の安定ｐＨ域の緩衝液
に溶解した溶液であってもよく、さらにその酵素活性を
劣化せしめない状態にて、マイクロカプセル化手段、樹
脂または多糖類や無機ガラスなどとの共有結合手段、吸
光手段などの酵素の固定化手段を工乞したものであって
もよい。またＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（ＨｇＯ２
）の使用量としては、用いる液体の素や反応時間などに
よって異なるが、ｌテスト当り通常０．３単位以上であ
ればよく、好ましくは２〜１０単位程度である。また用
いるＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（ＨｇＯ２）の比活
性は高いものほど反応にとって良好であることは言うま
でもないことであるが、必ずしも最高純度のものを要求
するものではない。

また用いられるＬ−グルタミン酸を含有する液体の量と
しては、特に限定されるものではなく、適宜希釈するか
、またはその株の状態にて用いる。

このようにして、該液体に、Ｌ−グルタミン酸オキシダ
ーゼ（ＨａＯｚ　）を作用せしめて、一定時間、一定温
度、例えば５〜２０分間、約３７℃にてイノキュベイト
することにより、該液体中のＬ−グルタミン酸１モル比
当り、１モルの酸素を消費し、１モルのα−ケトグルタ
ル酸、１モルのアンモニアおよび１モルの過酸化水素が
生成される。次いでこれらの酸素、α−ケトグルタル酸
、アンモニアまたは過酸化水素の定量を行なうものであ
るが、酸素の定量に当っては酸素電極を用い、！気的変
化として定量する方法が最も簡便であり、α−ケトグル
タル酸の定量に当っては例えば２．４−ジニトロフェニ
ルヒドラジンを用いるヒドラゾ／法により比色定ｔ（吸
収波長４１５ｎｍ又は５３０ｎｍ）にて行なうことが簡
便である。またアンモニアの定量としては、アンモニア
電極やアンモニウムイオンとなした後にイオ／ｉｉ極で
電気的変化として定量するか、インドフェノール法にて
定量すればよい。さらに過酸化水素の定量としては、過
酸化水素電極を用い電気的変化として定量するか、過酸
化水素と反応して検出できる生成物に変化する指示薬組
成物を用いて定量してもよい。またこの指示薬組成物と
しては、通常色調の変化を可視にて生ずる呈色薬組成物
、紫外線照射により螢光を発する螢光薬組成物や発色す
る発光薬組成物である分光光学的手段によりその変化を
定量し得る組成物が用いられる。例えば呈色薬組成物と
してはペルオキシダーゼ作用を有する物質と染料前駆体
との含有物が用いられる。このペルオキシダーゼ作用を
有する物質としては、西洋わさび由来のペルオキシダー
ゼが通常よく用いられ、また染料前駆体としては電子受
容体とフェノール誘導体またはアニリン誘導体の組合せ
が通常よく用いられる。

さらに電子受容体としては、例えば４−アミノアンチピ
リン、４−アミノ−３−ヒドラジノ−５−メルカプト−
１，２，４−トリアゾール、２−ヒドラジノベンゾチア
ゾール、３−メチル−２−ベンゾチアゾロンヒドラゾン
、２−アミノベンゾチアゾールなどが用いられ、またフ
ェノール誘導体またはアニリン誘導体としては、例えば
フェノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ナトリウム、ｐ−
クロロフェノール、２．４−ジクロロフェノール、４．
６−ジクロロ−〇−クレゾール、２．４−シフロモフェ
ノール、Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリ／、Ｎ、Ｎ−ジエチル
アニリン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｍ　−）ルイシン、Ｎ、
Ｎ−ジエチル−ｍ−）ルイジ／、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｍ
−メトキシチラミン／、Ｎ、Ｎ−ジェタノール−ｍ−）
ルイジン、３−メチル−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエ
チルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−）チルフェニル
）−Ｎ−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−
ヒドロキシエチル−ｍ−トルイジ／、Ｎ−エチル−Ｎ−
スルホプロピル−ｍ−）ルイジンナトリウム、Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシン−３−スルホプロピル〕−
ｍ−トルイジンナトリウム、ｍ−アセトアミノ−Ｎ、Ｎ
−ジエチルアニリンなどが挙られ、る。また４−アミノ
アンチピリ／とフェノール誘導体とによる呈色化合物は
特異的吸収波長として５００〜５２０ｎｍ近辺を有し、
また４−アミノアンチピリンとアニリン誘導体とによる
呈色化合物は特異的吸収波長として５３５〜５８０　ｎ
ｍ近辺を有するものである。また螢光薬組成物や発光薬
組成物における発螢光基質としては、公知の種々のもの
が挙られ、例えばビス（２，４，６−）リクロロフエノ
ール〕オギザレイト、フェニルチオヒダントイン、ホモ
バニリン酸、４−ヒドロキシフェニル酢酸、バニリルア
ミン、３−メトキシチラミン、フロレチン酸、ホルデニ
ン、ルミノールモノアニオン、質とともに用いて過酸化
水素を定量してもよい。

これらの過酸化水素と反応して検出できる生成物に変化
する指示薬組成物において、例えばペルオキシダーゼの
使用量としては、１テスト当り通常０．１単位以上、好
ましくは１〜１０単位程度使用すればよく、また４−ア
ミンアンチピリンなどの電子受容体やフェノール誘導体
またはアニリン誘導体は、２モル比の過酸化水素当り各
１モルが反応し、消費されるもので、生成される過酸化
水素の量に対して上記モル比以上用いればよいが、通常
過酸化水素の量に対して５倍モル比以上の適宜量が使用
される。さらにこれらの各試薬は溶液としてあらかじめ
混合、調整すればよく、またＬ−グルタミン酸オキシダ
ーゼ（Ｈｚ０２）の溶液と混合、調整してもよく、さら
に合成樹脂フィルムやｐ％アンモニアや過酸化水素の定
量において、電気的変化にて定量する際には、用いる電
極の検知部にＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２
）の固定化酵素を付着せしめた酵素電極型として行なう
ことが簡便である。

このようにして定量された酸素の量、α−ケトグルタル
酸の量、アンモニアの量、過酸化水素の量は、それらの
検量線により、使用した被検液中のＬ−グルタミン酸の
含有量を求めればよく、Ｌグルタミン酸そのものを測定
するＬ−グルタミン酸試薬、Ｌ−グルタミン酸醗酵液や
飲食物中のＬ−グルタミン酸を分析目的とする場合には
そのままの値から求められるもので、またＬ−グルタミ
ン酸を遊離、生成する酵素反応系やＬ−グルタミン酸を
基質として消費する酵素反応系では、Ｌ−グルタミン酸
の定量算出値から各反応系の酵素活性値や基質となる物
質の濃度を算出することにより良好に定量分析されるも
のである。

次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本発
明はこれらによって何んら限定されるものではない。

実施例１ ペプトン０．５％、肉エキス０．３％および酵母エキス
０．１％、マルトエキス０．５％を含有する培地１００
ｄ（ｐＨ７，０）を５００−容三角フラスコに入れ、１
２０℃、２０分間滅菌した後、４日間培養したストレプ
トマイセス・エス・ピー・Ａ７７００株（ＦＩＲＭ　　
Ｐ−６２４１）を白金耳で接種し、２６℃で４日間攪拌
培養した。次いで培養物を遠心分離して菌体を回収し、
この菌体を石英砂存在下にて乳鉢ですりつぶした。次い
でこれに２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を加えて
抽出し、その抽出液を回収した。

その結果、そのＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ
２）の活性は培養液換算１−当り０．１３単位であった
。

実施例２ 実施例と同一組成の培地を甲いて、４日間培養シタスト
レプトマイセス・ニス・ピー、Ａ８０６３株（ＦＥＢＭ
　　Ｐ−６２４２）を白金耳で接種し、２６℃で４日間
培養した後、以下実施例１と同様に行なつ゛て抽出液を
回収した。

その結果、そのＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ
２）の活性は、０．５８単位／献であった。

実施例３ ペプトン０．５％、肉エキス０．３％および酵母エキス
０．１％、アルドエキス０．５％を有する培地１００　
ｍｌ　（Ｐ　Ｈ７，０）を５００　ｍｌ容三角フラスコ
に分注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌した後、ストレ
フトマイセス、ニス・ピー・Ａ８０６３株（ＦＥＢＭ　
　Ｐ−６２４２）の−白金耳を移植して２６℃で３日間
培養して種培養物を得た。

する培地２０＃（ｐＨ７，０）を３０ノ容ジヤー・ファ
メンターに仕込み、１２０℃、２０分間加熱滅菌後、上
記の種培養物的２００ｍ（２本分）を移植した。次いで
これを、２６℃で無菌空気２０！／分、３００　ｒｐｍ
の通気攪拌条件にて９６時間培養した。培養後培養物を
５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離してその菌体を得た。

次いでこの菌体を、１５分間遠心分離して上清液１８２
７（１１２００単位）を得た。さらにこの上清液に硫安
を加え、０、４−０．５３飽和硫安にて沈澱した画分を
回収した。次いでこの沈澱物を２０　ｍ　Ｍ　！Ｊン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、これをセロファンチュ
ーブにて２０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ　Ｈ７，０）　１２
　Ｊに対して２０時間透析せしめ、これをＤＥＡＲ−セ
ファロース０Ｌ−６Ｂのカラム（径５０Ｘ４００ｍ　／
　ｍ　）にチャージして、０−０．７　ＭＫＣＪの２０
ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ　Ｈ７，０）を用いる直線濃度勾
配法で溶出せしめ、その０．５ＫＯｊ付近の溶出液１３
０ｍ／（６６９０単位）を得た。さらにこの溶出液を透
析（セロファンチューブを用い、２０ｍＭリン酸緩衝液
６１対して１８時間透析）した後濃縮しく　１５ａ／）
　、さらにこれをセファロース０Ｌ−６Ｂにチャージし
、１０ｍＭ５　リン酸緩衝液（Ｐ　Ｈ７，０）で溶出せ
しめてその流出液８０ｍ／（５９００単位）を得た。こ
の溶液を限外口過膜で８−に濃縮したのちさらにセファ
ロースＣＬ−６Ｂにチャージしてその流出液６０ｍ（４
８９０単位〕を得、これを凍結乾燥してＬ−グルタミン
酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）　７８．９　＋＋１９　（
５８，２単位／■、４５９５単位）を得た。

実施例４ ペプトン０．５％、肉エキス０．３％、酵母エキス０．
１％およびマルトエキス０．５％を含有する培地２０Ｊ
（ｐＨ７，０）を３０！容ジヤー・ファーメンタ−に仕
込み、１２０℃、２０分間滅菌後、同一培地で３日間培
養したストレプトマイセス・エス・ピー・Ａ７７００株
（ＦＩＲＭ　　Ｐ−６２４１）の種培養物２００ｍ（２
本分〕を移植し、次いで２６℃、９６時間、２０ノ／分
の無菌空気、３００　ｒｐｍの通気攪拌条件にて培養し
た。培養後これを５０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して
菌体を回収し、これを３１の２０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ
て上清液（２，８４Ｊ、２９５０単位）を得た。次いで
これに硫安を加えて０．４７−０．６１飽和硫安での沈
澱物を回収し、さらにこの沈澱物を２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）に溶解し、これをセロファンチューブ
にて透析（２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７，０対して２
０時間）せしめた。透析後、ＤＢＡＥ−セファロース０
Ｌ−６Ｂのカラムにチャージし、Ｏ−０，７ＭＫＯＡの
２０ｍＭリン酸緩衝液（Ｐ　Ｈ７，０）を用いる直線濃
度勾配法で溶出せしめ、０．５　ＭＫＯｔ付近での溶出
液を回収し、さらにこれを透析せしめ（セロファンチュ
ーブを用い、１０ｍＭ、リン酸緩衝液Ｐ　Ｈ７，ｒ　Ｌ
で１８時間濃縮した。さらにこれを、セファロース０Ｌ
−６Ｂのカラムにチャージして精製し、その流出液を回
収し、濃縮したのち、再度セファロース０Ｌ−６Ｂのカ
ラムにチャージしてその流出液を得、これを凍結乾燥し
てＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）粉末２．
ｌ０Ｑ（４９，５ＪＩｔ位／■、１０９０単位）を得た
。

実施例５［Ｌ−グルタミン酸の定量３ ４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，５） ０．０３％４−アミノアンチピリン ０．０４％Ｎ、Ｎ−ジメチルーｍ　−トルイジン２単位
／−ペルオキシダーゼ ２単位／ｄＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）
上記の組成を有する反応液３．　Ｏｆｎｌを分取し、こ
れつ透加し、３７℃で１０分間反応せしめた。反応終了
後、その呈色を波長５４５ｎｍで比色定量した。

その結果、第６図に示す通りで、また図中○は実施例３
で得られたＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈｇ０２）
を用いた場合を示し、Δは実施例４で得られたＬ−グル
タミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）を用いた場合を示し
、両酵素ともよく一致し、がつＬ−グルタミン酸量と吸
光度の間に良い直線性が得られた。

さらにこの両酵素ともよく一致したとの結果かＮ、Ｎ−
ジエチル−ｍ−）ルイジン　　　３ｍＭ４−アミノアン
チビリ７　　　　　　１５　ｍＭペルオキシダーゼ　　
　　　　　　５単位／ゴＬ−アラニン　　　　　　　　
　　２００ｍＭα−ケトグルタル酸　　　　　　　　１
０ｍＭトリス−ＨＣ！緩衝液（ｐＨ７，５）　　　　　
５０　ｍ＝ＭＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２
）　　　　６単位／−上記組成を有する反応液Ｌ　Ｏｍ
ｌを小試験管に分取し、３７℃に加温した。これに血清
（１／１　。

３／４　、１／２　、１／４　、１／１０の各希釈液と
した）を５０μノ添加し、３７℃で正確に２０分間反応
せしめた後、０．１　Ｍ−ｆツク・イルペイｙ　（Ｍｃ
　ｌ１ｖａｉｎ）緩衝液（ｐＨ５，５）ｌＯ＋ＰＬｔを
添加し、次いでその呈色を波長５４５ｎｍにて比色定量
した。（なお、盲検としては上記反応液中のＬ−アラニ
ンを除去したものを用いた。） その結果、第７図に示す通りで、血清中のＧＰＮ、Ｎ−
ジエチル−ｍ　−）ルイジン　　　３ｍＭ４−アミノア
ンチピリン　　　　　　Ｌ５　ｍＭペルオキシダーゼ　
　　　　　　　５単位／−Ｌ−アスパラギン酸　　　　
　　　２００ｍＭα−ケトグルタル酸　　　　　　　　
１０ｍＭトリス−′ＨＣ！緩衝液（ｐＨ７，５）　　　
　　５０ｍＭＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２０ｇ
）　　　６単位／コ上記組成を有する反応液ＬＯＮｔを
小試験管に分取し、３７℃に加温した。これに血清（１
／１．３／４゜１／２　、１／４　、１／１０の各稀釈
液とした）５０μノを添加し、３７℃で正確に２０分間
反応せしめた後、０、１　ＭＭｃ　１１ｖａｉｎ緩衝液
（ｐＨ５，５）１０−を添加し、次いでその呈色を波長
５４５ｎｍにて比色定量した。なお、盲検としては上記
反応液中のＬ−アスパラギ／酸を除去したものを用いた
。

その結果、第８図に示す通りで、血清中のＧｏ〔試薬■
〕 Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ　−トルイジン　
３ｍＭペルオキシダーゼ　　　　　　　　５単位／ｍｔ
Ｌ−アラニン　　　　　　　　　　２００ｍＭα−ケト
グルタル酸　　　　　　　　１０ｍＭトリス−ＨＣＪ緩
衝液　　　　　　　　５０ｍＭＬ−グルタミン酸オキシ
ダーゼ（Ｈ２Ｏ２）　　　５単位／−アスコルビ／酸オ
キシダーゼ　　　５単位／ゴ〔試薬■〕 ４−アミノアンチピリ７　　　　　　１５ｍＭ上記の組
成を有する試薬Ｉの１０ゴを石英セルに分取し、これに
血清５０μｊを添加し、３７℃で５分間反応せしめた後
、３７℃に加温した試薬■０．１−をさらに添加し、３
７℃で種々の時間反応せしめ、次いで波長５５０ｎｍに
おける吸光度変化を測定した。

その結果、第９図に示す通りで、血清中ＧＰＴ活性測定
においてラグタイムが認められず、原点を通る良好な直
線性が得られた。また本発明方法で測定することにより
第一段反応で非特異的反応およびラグタイムを改善、除
去しているために盲〔試薬Ｉ〕 Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイジン　３
ｍ′Ｍペルオキシダーゼ　　　　　　　　５単位／ゴＬ
−アスパラギン酸　　　　　　　２００ｍＭα−ケトグ
ルタル酸　　　　　　　　１０ｍＭトリス−Ｈ０ｔ緩衝
液　　　　　　　　５０ｍＭＬ−グルタミン酸オキシダ
ーゼ［２０２）　　５単位／−アスコルビン酸オキシダ
ーゼ　　　５単位／−〔試薬■〕 ４−アミノアンチビリ７　　　　　　１５ｍＭ上記の組
成を有する試薬ＩのＬｏｓｔを石英セルに分取し、これ
に血清５０μノを添加し、３７℃で５分間反応せしめた
後、３７℃に加温した試薬■Ｑ、　１　ｍをさらに添加
し、３７℃で種々の時間反応せしめ、次いで波長５５０
ｎｍにおける吸光度変化を測定した。

その結果、第１０図に示す通りで、測定においてラグタ
イムが認められず、かっ盲検も必要としない、原点を通
る良好な直線性を与えるＧＯ’Ｉ’活測定した。

又 ワコー〕にて測定した。

両方法の結果に基いて相凶を求めた結果、γ−０，９９
８ ｙ　＝　　ＬＯ３ｘ＋１６ で、非常に良好な相所を示した。またその相醗図を測定
した。

また同一サンプルを用いてζ従来のＧＯ’ｌ’活性測定
法〔ＵＶ法：和光紬薬（株〕キット、ｏｃＮ＝ｕｖワコ
ー〕にて測定した。

両方法の結果に基いて相−を求めた結果、γ−０，９９
７ ｙ　＝　　ＬＯ］　！＋１．１ で非常に良好な相面を示した。またその相凶図は第１２
図に示す通りであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）で
あるＡ７７００酵素の至適ｐＨ曲線を示し、第２図はＬ
−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ２Ｏ２）　　であるＡ
８０６３酵素の至適ｐＨ曲線を示し、第３図はそのＡ７
７００酵素およびＡ８０６３酵素の熱安定性白線を示し
、第４図はそのＡ７７００酵素のｐＨ安定性曲線を示し
、第５図はそのＡ８０６３酵素のｐＨ安定性曲線を示し
、第６図はそのＡ７７００酵素およびＡ８０６３酵素を
用いるＬ−グルタミン酸の定量曲線を示し、第７図は血
清中ＧＰＴ活性測定曲線を示し、第８図は血清中ＧＯＴ
活性測定曲線を示し、第９図は血清中ＧＰＴ活性測定曲
線を示し、第１０図は血清中ＧＯＴ活性測定曲線を示し
、第１１図はＧＰＴ活性測定における相函図を示し、第
１２図はＧＯＴ活性測定における相函図を示す。 第 図 第 図 温 度 〔＠Ｃ〕 第 図 第 ＋１ 図 ６．１ 第 Ｓ 図 第 図 ｔ／、ｏｌ／４ｓ／４１／１　、　釈。 第 図 希 釈 率 第 図 Ｓ ２５反 応 時 間 手 続 （市 正 書（方式） ％式％ 発明の名称 グルタミン酸オキシダ ゼ（Ｈ２ エネレイテイング） およびその製造法 ３゜ 補正をする者 事件との関係

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも下記の基質特異性、酵素作用の理化学
   的性質を有する新規なＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（
   Ｈ＿２Ｏ＿２・ジエネレイテイング）、・基質特異性：
   少なくともＬ−グルタミン酸に基質特異性を有し、実質
   的にＬ−ヒスチジンに基質特異性を有しない、 ・酵素作用：１モルのＬ−グルタミン酸、１モルの酸素
   および１モルの水から、１モルのα−ケトグルタル酸、
   １モルのアンモニアおよび１モルの過酸化水素を生成す
   る反応〔 I 〕を触媒する▲数式、化学式、表等があり
   ます▼〔 I 〕 Ｌ−グルタミン酸　α−ケトグルタル酸
2. （２）・等電点がｐＨ４．３付近（キャリアーアンホラ
   イトｐＨ３．５〜６．０による測定値）であり、 ・Ｌ−グルタミン酸に対するＫｍ値が約５．６×１０＾
   −＾４Ｍであり、 ・至適ｐＨが５〜７．５付近であり、 ・熱安定性が５５℃付近までであり、 ・ｐＨ安定性がｐＨ４．５〜７．５である特許請求の範
   囲第１項記載のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ＿２
   Ｏ＿２・ジエネレイテイング）。
3. （３）・等電点がｐＨ４．１付近（キャリアーアンホラ
   イトｐＨ３．５〜６．０による測定値）であり・Ｌ−グ
   ルタミン酸に対するＫｍ値が約１．１×１０＾−＾３Ｍ
   であり、 ・至適ｐＨが５〜７．５付近であり、 ・熱安定性が５５℃付近までであり、 ・ｐＨ安定性がｐＨ４〜７．５である特許請求の範囲第
   １項記載のＬ−グルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ＿２Ｏ＿
   ２・ジエネレイテイング）。
4. （４）ストレプトマイセス属に属する少なくとも下記の
   基質特異性、酵素作用の理化学的性質を有するＬ−グル
   タミン酸オキシダーゼ（Ｈ＿２Ｏ＿２・ジエネレイテイ
   ング）生産菌を培地に培養し、その培養物から該Ｌ−グ
   ルタミン酸オキシダーゼ（Ｈ＿２Ｏ＿２・ジエネレイテ
   イング）を採取することを特徴とする新規な該Ｌ−グル
   タミン酸オキシダーゼ（Ｈ＿２Ｏ＿２・ジエネレイテイ
   ング）の製造法。 ・基質特異性：少なくともＬ−グルタミン酸に基質特異
   性を有し、実質的にＬ−ヒスチジンに基質特異性を有し
   ない、 ・酵素作用：１モルのＬ−グルタミン酸、１モルの酸素
   および１モルの水から、１モルのα−ケトグルタル酸、
   １モルのアンモニアおよび１モルの過酸化水素を生成す
   る反応〔 I 〕を触媒する ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 Ｌ−グルタミン酸　α−ケトグルタル酸
5. （５）ストレプトマイセス属に属する該Ｌ−グルタミン
   酸オキシダーゼ（Ｈ＿２Ｏ＿２・ジエネレイテイング）
   生産面が、ストレプトマイセス・エス・ピー・Ａ７７０
   ０、ＦＥＲＭＰ−６２４１である特許請求の範囲第４項
   記載の製造法。
6. （６）ストレプトマイセス属に属する該Ｌ−グルタミン
   酸オキシダーゼ（Ｈ＿２Ｏ＿２・ジエネレイテイング）
   生産菌が、ストレプトマイセス・エス・ピー・Ａ８０６
   ３、ＦＥＲＭＰ−６２４２である特許請求の範囲第４項
   記載の製造法。