JPS6126357B2

JPS6126357B2 -

Info

Publication number: JPS6126357B2
Application number: JP57112271A
Authority: JP
Inventors: Hitoshi Kusakabe; Juichiro Midorikawa
Original assignee: Yamasa Shoyu KK
Current assignee: Yamasa Shoyu KK
Priority date: 1982-06-29
Filing date: 1982-06-29
Publication date: 1986-06-20
Also published as: JPS592687A; US4623626A

Description

【発明の詳細な説明】

〔〕発明の背景技術分野本発明は、新規酵素Ｌ―グルタミン酸オキシダ
ーゼ（以下、「本発明酵素」と略すこともある。）
およびその製造法に関するものである。さらに詳
しくはＬ―グルタミン酸に対して強い親和性と高
い基質特異性を示し、他のアミノ酸に対しては実
質的にはほとんど作用せず、安定性の高いＬ―グ
ルタミン酸オキシダーゼおよびその微生物による
製造法に関するものである。本発明酵素は、Ｌ―グルタミン酸に特異的に作
用し、他のアミノ酸には実質的には作用しないの
で多種類のアミノ酸を含有する系におけるＬ―グ
ルタミン酸の定量に適している。例えば、醤油、
エキス類などの食品中におけるグルタミン酸含量
の測定、グルタミン酸発酵もしくは醤油の製造な
どの分野における工程管理もしくは工程分析また
はグルタミン酸生産菌のスクリーニングなどに使
用することができる。また、グルタミナーゼ、グ
ルタミン酸・オキサロ酢酸トランスアミナーゼ
（GOT）、グルタミン酸・ピルビン酸トランスア
ミナーゼ（GPT）、γ―グルタミルトランスペプ
チダーゼ（γ―GTP）などグルタミン酸を生成
物とする酵素の活性測定を本発明酵素を使用して
容易に行えるので臨床検査もしくは生化学の分野
においても有用である。さらに、本発明酵素は安
定性が高いので酵素電極としてグルタミン酸セン
サーに利用することができ、酵素免疫測定におけ
る標識酵素としての利用（特開昭57−37261号公
報参照）も期待される。従来技術従来、Ｌ―グルタミン酸に対する基質特異性の
高いＬ―アミノ酸オキシダーゼとしはストレプト
マイセス（Streptomyces；以下、「Ｓ」と略すこ
ともある。）属に属する微生物、具体的にはスト
レプトマイセス・バイオレツセンス（S.
violascens）によつて生産されるＬ―グルタミン
酸オキシダーゼ（特開昭57−43685号公報参照；
以下、「公知酵素」と略すこともある。）が知られ
ている。この酵素の蛋白質としての理化学的性質
は明らかではないが、酵素学的性質として記載さ
れている特徴を挙げると次のとおりである。 (1) 基質特異性Ｌ―グルタミン酸に対する活性を100とした場
合、Ｌ―グルタミンに対して8.4、Ｌ―ヒスチジ
ンに対して6.8の相対活性を示し、他のアミノ酸
に対しては実質的な活性は示さない。 (2) 至適PH PH５〜６ (3) PH安定性 PH3.5〜6.5の範囲（37℃、１時間保持）で安定
である。 (4) 温度安定性 50℃まで（10分間保持）安定である。 (5) 阻害剤の影響水銀イオン、銅イオンおよびジエチルジチオカ
ルバメイトによつてほぼ完全に阻害される。本発明酵素は、公知酵素とは以上の酵素学的性
質の全ての点において異る新規な酵素である。また、前記特許出願公開明細書によれば、公知
酵素の生産には前記微生物を液体培養する方法が
好適である旨が記載されているが、本発明酵素の
生産には固体培養法が好適である。〔〕発明の概要要旨本発明者らは微生物の培養物についてＬ―アミ
ノ酸を酸化的に脱アミノする酵素を検索したとこ
ろ、自然界より新たに分離された放線菌の培養物
中にＬ―グルタミン酸に対する基質特異性が極め
て高いＬ―アミノ酸オキシダーゼが存在すること
を見出し、このような微生物の培養物中より本発
明酵素を単一の酵素蛋白質として精製単離し、本
発明を完成した。本発明は、Ｌ―グルタミン酸のα―アミノ基を
水と酸素の存在下で酸化的に脱アミノしてα―ケ
トグルタル酸、アンモニアおよび過酸化水素を生
成する作用を有し、Ｌ―グルタミン酸に対する基
質特異性がきわめて高く、Ｌ―グルタミンおよび
Ｌ―ヒスチジンには実質的に全く作用せず、安定
性の高いＬ―アミノ酸オキシダーゼであるＬ―グ
ルタミン酸オキシダーゼを提供するものである。さらに本発明は、ストレプトマイセス
（Streptomycps）属に属し、前記のＬ―グルタミ
ン酸オキシダーゼ生産能を有する微生物を該微生
物が生育しうる培地に培養し、培養物より前記の
Ｌ―グルタミン酸オキシダーゼを採取することを
特微とするＬ―グルタミン酸オキシダーゼの製造
法をも提供するものである。効果本発明酵素はＬ―グルタミン酸に特異的に作用
し、他のアミノ酸には実質的にほとんど作用しな
いので、複数種のアミノ酸を含有する食品中のＬ
―グルタミン酸だけを特異的に定量する際に有用
である。食品、特に醤油、各種エキス類などの液体調味
料は、含有するＬ―グルタミン酸の量がその品質
評価の重要な指標になるが、従来知られている定
量法は簡便性、実用性などの点に難点がある。す
なわち、Ｌ―グルタミン酸を定量する方法として
はクロマトグラフイー法、微生物定量法、電気泳
動法および酵素法が知られているが、Ｌ―グルタ
ミン酸脱水素酵素あるいはＬ―グルタミン酸脱炭
酸酵素を用いる酵素法が一般的である。しかし、
これらの既知酵素を用いた方法は厳密な測定条件
あるいは煩雑な操作が要求されることから簡便な
方法とはいえない。本発明酵素は特異性が高く、また酵素反応が臨
床検査あるいは食品分析等において最も広く実用
化されているオキシダーゼ反応であることから反
応生成物の定量も、たとえば過酸化水素の発色法
あるいは酵素電極法などによつて容易に行える利
点がある。また、本発明酵素は安定性が高いので、酵素電
極として利用することができ、Ｌ―グルタミン酸
センサーとして食品、発酵、臨床検査、生化学な
どの各種の分野に応用することもできる。〔〕発明の具体的説明１本発明酵素の酵素学的および理化学的性質後に示す実施例の方法で製造したＬ―グルタミ
ン酸オキシダーゼの精製酵素標品の酵素学的およ
び理化学的性質は下記のとおりである。 (1) 作用本発明酵素は下記反応式のごとくＬ―グルタミ
ン酸1molにつき、1molの酸素と1molの水を要求
し、1molのα―ケトグルタル酸、1molのアンモ
ニアおよび1molの過酸化水素を生成する。 (2) 基質特異性種々のアミノ酸に対して本発明酵素の精製標品
を作用させた結果が第１表である。各基質の濃度
は10mMであり、反応はPH7.4（0.1Mりん酸カリ
ウム緩衝液）およびPH6.0（0.1M酢酸緩衝液）で
行つた。酵素活性は後述する酸素電極法により測
定し、Ｌ―グルタミン酸に対する活性の相対値と
して表わした。

【表】以上のとおり本発明酵素はＬ―グルタミン酸に
対する基質特異性が高く、他のアミノ酸に対して
は、PH7.4においてＬ―アスパラギン酸にわずか
な活性（0.6％）を示すだけで、Ｌ―グルタミン
およびＬ―ヒスチジンを含む他のＬ―アミノ酸お
よびＤ―グルタミン酸には実質的には全く活性を
示さず、PH6.0においてはＬ―アスパラギン酸に
対しても実質的に活性を示さない。以上の本発明酵素に対し、前記のとおり公知酵
素はＬ―アスパラギン酸に対しては活性を示さな
い（0.1％以下）が、Ｌ―グルタミンに対して8.4
％、Ｌ―ヒスチジンに対して6.8％の活性をそれ
ぞれ示す酵素であり基質特異性において両者は異
る。なお、本発明酵素のＬ―グルタミン酸に対する
Km値はPH7.4において2.1×10^-4Mで、Ｌ―アスパ
ラギン酸に対するKm値はPH7.4において2.9×
10^-2Mである。 (3) 力価の測定本発明酵素の力価の測定は、酸素電極法で行つ
た。すなわち、10mMのＬ―グルタミン酸ナトリ
ウムを含む0.1Mりん酸カリウム緩衝液（PH7.4）
１mlを酸素電極セルに入れ、10μｌの酵素液を添
加して酸素消費速度を測定した。30℃で１分間に
１μmolの酸素を消費する酵素量を１単位
（Unit；本明細書において「Ｕ」と略称する。）と
した。なお、反応液の溶存酸素濃度は温度の上昇とと
もに減少するので高い反応温度での活性測定には
上記方法は使用できない。このような場合には
MBTH法（アナリテイカル・バイオケミストリ
ー（Anal、Biochem）、25，228（1968）参照）に
よつて行う。すなわちＬ―グルタミン酸ナトリウ
ム、カタラーゼおよび本発明酵素を含有する反応
液を適当温度で20分間インキユベートし、トリク
ロロ酢酸（TCA）を加えて反応を停止し、この
反応停止液に酢酸緩衝液（PH5.0）および３―メ
チル―２―ベンゾチアゾリノンヒドラゾンハイド
ロクロライド（MBTH）を加えて50℃で30分間
インキユベートした後、室温まで冷却して316nm
の吸光度を測定し、検量線から生成したα―ケト
グルタル酸を定量する。 (4) 至適PH 至適PHは第１図に示すとおり、PH７〜8.5付近
である。各PHにおける酵素活性の測定は、基質と
してＬ―グルタミン酸ナトリウムを使用し、緩衝
液として0.2M酢酸緩衝液（PH3.5〜6.0）、0.2Mり
ん酸カリウム緩衝液（PH6.0〜8.5）および0.2Mグ
リシン―塩化ナトリウム―水酸化ナトリウム緩衝
液（PH8.5〜12.0）を使用し、30℃で行つた。なお、第１図には本発明酵素と公知酵素の至適
PHの比較のため、本発明酵素（実線）と公知酵素
（点線；特開昭57−43685号公報の第１図より引用
した。）のPH活性曲線を併記した。第１図から明らかなように本発明酵素は至適PH
においても公知酵素とは相異する。また、アスパ
ラギン酸を基質とした場合の作用PH範囲は狭く、
至適PHは７〜８であるが、PH6.0以下およびPH
10.0以上においてはＬ―アスパラギン酸に対して
ほとんど作用しない（PH6.0においてグルタミン
酸に対する活性の0.1％以下）。 (5) PH安定性 PH3.5〜11.5の各PHにおいて37℃、60分間、45
℃、15分間および60℃、15分間の各条件で保持し
た後、PH7.4においてグルタミン酸に対する酵素
活性を測定した。その結果、37℃、60分間保持の条件ではPH5.5
〜10.5の範囲において安定であり（第２図実
線）、45℃、15分間保持の条件でもPH5.5〜9.5の
範囲において安定であり（第３図）、60℃、15分
間保持の条件ではPH5.5〜7.5の範囲において安定
であつた（第４図）。なお、第２図には本発明酵素と公知酵素のPH安
定性の比較のため、公知酵素のPH安定曲線（特開
昭57−43685号公報の第２図より引用し、点線で
示した。）本発明酵素のものと併記した。以上の第２〜４図から明らかなように、本発明
酵素と公知酵素の安定PH範囲を比較すると、両者
は明らかに異なり、前者の方が後者に比べて広い
PH範囲において安定である。 (6) 作用適温の範囲 30℃〜80℃の各温度においてＬ―グルタミン酸
ナトリウムを基質として20分間反応し、前記
MBTH法で酵素活性の測定を行つた。その結果、本発明酵素の作用適温の範囲は30〜
60℃であり、作用至適温度は50℃付近であつた
（第５図）。 (7) 熱安定性 40℃〜90℃の各温度においてPH5.5、PH7.5およ
びPH9.5の各条件で15分間保持した後、PH7.4にお
いてグルタミン酸に対する酵素活性を測定した。その結果、PH5.5においては65℃まで安定であ
り、85℃で約50％の残存活性を示す（第６図、▲
−▲）。PH7.5においては50℃まで安定であり、75
℃で約60％の残存活性を示す（第６図、●−
●）。PH9.5においても45℃まで安定であり、70℃
で約50％の残存活性を示す（第６図、■−■）。なお、本発明酵素と公知酵素の熱安定性の比較
のため、公知酵素の温度安定曲線（特開昭57−
43685号公報の第３図より引用し、点線で示し
た。）を本発明酵素のものと併記した。第６図より明らかなように、本発明酵素は公知
酵素よりも温度安定性が高い。 (8) 阻害、活性化および安定化本発明酵素に対する種々の添加物質の影響を調
べるために、第２表に示す各物質1mMを含む反
応液（PH7.4）中で酵素反応を行つた。その結果は第２表に示すとおりである。

【表】

【表】第２表より明らかなように本発明酵素は、パラ
クロロマーキユリベンゾエイトによつて約45％阻
害されるが、塩化第二銅およびジエチルジチオカ
ルバメイトによつては全く阻害されない。一方、
公知酵素は塩化第二銅およびジエチルジチオカル
バメイトによつて完全に阻害される。したがつて
両酵素は阻害剤による影響という点においても相
異する。なお、本発明酵素の活性化剤および安定化剤は
まだ見出されていない。 (9) 紫外線吸収スペクトル（第７図参照） λmax：273nm、385nm、465nm 肩：290nm付近、490nm付近 (10) 補酵素本発明酵素を熱処理またはトリクロロ酢酸
（TCA）処理し、遠沈して得られた上清は、その
吸収がフラビンアデニンジヌクレオチド
（FAD）と一致し、Ｄ―アミノ酸オキシダーゼの
アポ酵素を活性化したので、本発明酵素の補酵素
がFADであることが判明した。また、薄層クロマ、グラフイーにおけるRf値
からもFADであると同定された。 FADは本発明酵素1molにつき2mol存在するも
のと推定された。 (11) ポリアクリルアミドゲル電気泳動精製された
本発明酵素は単一バンドを示した。 (12) 分子量本発明酵素の分子量は、セフアデツクスＧ―
200（フアルマシア・フアインケミカルズ社製）
によるゲル濾過法では135.000±10.000と測定さ
れた。 (13)等電点アンフオライン（LKB社製）を用いた等電点
電気泳動により測定したところ、plは6.2であつ
た。 (14) 結晶構造および元素分析本発明酵素は結晶化されていないので測定して
いない。 (15) 精製方法本発明酵素の精製は塩析法、等電点沈澱法、有
機溶媒による沈澱法、けいそう土、活性炭などに
よる吸着法、各種クロマトグラフ法等を適宜に組
合せて行うことができる。精製方法の具体例は実
施例に示すとおりである。２本発明酵素お製造次に本発明酵素を微生物の培養によつて製造す
る方法を具体的に示す。使用微生物本発明酵素の製造に使用される微生物は、スト
レプトマイセス（Streptomyces）属に属し、本
発明酵素を生産する能力を有する微生物である。このような微生物の具体例としては、千葉県香
取郡東庄町の土壌より分離され、単一の菌株とし
て単離されたＸ―119―６株を挙げることができ
る。この菌株の菌学的性質を以下に記載する。Ａ顕微鏡的観察気菌糸は、直線状でその幅は0.9〜1.0μであ
り、単純分枝を示す。胞子柄は、多数の胞子の連
鎖よりなつており、２〜５回転の螺旋を形成す
る。胞子はやや惰円形で、その大きさは0.9〜1.0
×1.1×1.2μであり、電子顕微鏡によつて表面は
とげ状構造であることが観察される。基菌糸の分
断は認められない。Ｂ肉眼的観察各種培地における生育（30℃、16日間培養）の
肉眼的観察の結果は次のとおりである。 (1) シユークロース、硝酸塩寒天培地その生育は不良である。基菌糸は灰褐色で寒天
中に侵入せず、気菌糸は粉状で寒天上に放射状に
薄く広がる。色は灰褐色で、灰色の胞子を形成す
る。培地中への色素の生成は認められない。 (2) グルコース・アスパラギン寒天培地その生育は良好である。基菌糸は白黄色で寒天
中に侵入するとともに、わずかに盛り上る。気菌
糸は白色で、貧弱であり、培地中への色素の生成
は認められない。 (3) グリセリン・アスパラギン寒天培地その生育は良好である。基菌糸は白黄色で、寒
天中に侵入するとともに盛り上る。気菌糸は形成
されず、培地への色素の生成も認められない。 (4) 澱粉、無機塩寒天培地その生育は良好である。基菌糸は白黄色で、寒
天中に侵入するとともに盛り上る。気菌糸は白色
で、豊富であり、灰色の胞子を着生する。培地中
への色素の生成は認められない。 (5) チロシン寒天培地その生育は良好である。基菌糸は白黄色であ
る。気菌糸は白色で、豊富であり、灰色の胞子を
着生する。培地中への色素の生成は認められな
い。 (6) 栄養寒天培地その生育は極めて良好である。基菌糸は白黄色
で寒天中に侵入するとともに盛り上る。気菌糸は
白色で、胞子の着生は認められない。培地中への
色素の生成も認められない。 (7) イースト、麦芽寒天培地その生育は極めて良好である。基菌糸は白黄色
で、寒天中に侵入するとともに盛り上る。気菌糸
は白色で、豊富であり、灰色の胞子を着生する。
培地中への色素の生成は認められない。 (8) オートミール寒天培地その生育は極めて良好である。基菌糸は白色
で、寒天中に侵入するが、培地上には盛り上らな
い。気菌糸は白色で、豊富であり、灰色の胞子を
着生する。培地中への色素の生成は認められな
い。Ｃ生理的性質生育温度範囲は８〜40℃であり、35℃近辺が最
適である。チロシン寒天培地およびペプトン：イースト鉄
寒天培地では、共にメラニン様色素は生成せず、
ゼラチンをわずかに液化し、澱粉を加水分解す
る。Ｄ各種炭素源の同化性プリドハム・ゴドリーブ寒天培地上での各種炭
素源の利用性は第３表のとおりである。

【表】以上の性状を要約すると次のとおりである。す
なわち、気菌糸は螺旋状で、胞子の表面はとげ状
である。培地上での発育では白黄色または灰褐色
を呈し、気菌糸は白色〜灰褐色で、溶解性の色素
およびメラニン様色素の生成は認められない。ま
た、スターチ水解性は強い方である。これらの結果と第３表に示した炭素源の同化性
を基準にバージエーズ・マニユアル・オブ・デイ
タミネーテイブ・バクテリオロジー（Bergey’
ｓ Manual of Determinative Bacteriology）第
８版（1974年）における分類体系に従つて本菌株
の同定を行つたところ、本菌株はストレプトマイ
セス属に属するが、本菌株の特徴に十分に合致す
る公知の種は見出さず、本菌株を新菌株であると
同定し、ストレプトマイセス・エスピー・Ｘ―
119−６（Streptomyces sp.X−119−６）と命名
した。本菌株について、昭和56年通商産業省告示第
178号に従つて工業技術院微生物工業技術研究所
に対して寄託申請を行い、昭和57年６月５日付け
で受託され、受託番号として微工研菌寄第6560号
（FERM Ｐ−6560）が付与されている。上記菌株は本発明酵素の生産能の高い菌株の一
例であり、本発明の使用微生物はこれに限定され
るものではない。このような本発明酵素生産菌を
通常の微生物突然変異誘導法、たとえば紫外線、
Ｘ線、γ線照射などの物理的処理、ニトロソグア
ニジンなどの薬剤による化学的処理などの処理法
によつて変異させて得られた本発明酵素の高生産
性突然変異株のいずれをも好適に使用できる。さ
らに本発明の製造法の目的は基本的には、前記微
生物の本発明酵素の生産に関する遺伝情報を担う
遺伝子デオキシリボ核酸（DNA）による酵素蛋
白の合成機能を利用することにある。したがつ
て、このような遺伝子DNAを適当なベクターに
組み込み、前記以外の属の微生物へ形質転換によ
り移入させるか、または遺伝子DNAをプロトプ
ラスト法による細胞融合によつて他属微生物に取
り込ませるなど遺伝子操作的手法によつて得た微
生物による本発明酵素の製造法も本発明の範囲に
包含される。培養方法および条件前記使用微生物の培養方法および条件は、該微
生物が良好に生育し、本発明酵素が十分に生産さ
れる方法および条件であれば特に限定されない
が、固体培養法もしくはそれに準ずる方法が好適
である。固体培養に使用する固体培地は通常使用される
ものと何ら変らない。すなわち、固体培地とはフ
スマ、脱脂大豆、米ヌカ、トウモロコシ、菜種
粕、小麦、米、もみがら等の天然固体原料の単独
あるいは二種以上の組合せたものを主体とし、さ
らに必要に応じて本発明の使用微生物が資化可能
な栄養源、たとえばグルコース、シユークロー
ス・アラビノース・フラクトース、マソニトー
ル、イノシトール、可溶性澱粉、エタノール等の
炭素源、各種アミノ酸、ペプトン、大豆粉、蛋白
質加水分解物、コーンステイープリカー、肉エキ
ス、酵母エキス、各種アンモニウム塩、各種硝酸
塩、尿素等の窒素源、各種のナトリウム塩、カリ
ウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、マグネシウ
ム塩、亜鉛塩、鉄塩、りん酸塩、硫酸塩等の塩
類、サイアミン、リボフラビン、ニコチン酸、パ
ントテン酸、ビオチン、ｐ―アミノ安息香酸、ビ
タミンB₁₂等の発育素を適宜添加した培地、また
はこれらを適宜な配合、大きさ、形状に造粒した
培地などである。このような固体培地は常法によ
り滅菌あるいは変性処理し、種菌を接種して固体
培養を行う。また、上記以外の培養法、たとえばスポンジ等
の適宜の担体に液体培地を吸収または被覆し（特
開昭49−14679号公報参照）、種菌を接種して培養
する方法であつても使用微生物が繁殖し、本発明
酵素を良好に生産する限り採用できる。培養条件は使用微生物の種類に応じて酵素の生
産に最適の条件を選択すればよく、特に限定され
ない。通常、たとえば20〜30℃、PH５〜７で５〜
15日間培養すればよい。本発明酵素の採取使用微生物の培養により生産された本発明酵素
は、適当な抽出法により培養物、すなわち培地お
よび／または培養菌体から抽出分離され、そのま
ま粗酵素液として使用するが、あるいは前記した
とおり通常の酵素精製法に従つて使用目的に応じ
た精製段階に精製される。抽出法は、特に限定されず、常法により行われ
る。たとえば、固体培養物からの抽出は、通常、
水または緩衝液により行われる。また、菌体内の
本発明酵素は常法により菌体を破砕し、可溶化し
て抽出する。以下、本発明における培養法および培養条件な
らびに酵素の抽出法および精製法の具体的一例を
実施例として示す。ただし、本発明はこの実施例
に限定されるものではない。実施例 500ml容三角フラスコにフスマ20gおよび水16
mlを入れ、120℃、30分間加圧滅菌して調製した
フスマ培地にストレプトマイセス・エスピーＸ−
119−６（微工研菌第6560号）を植菌し、28℃、
７日間培養して種菌を調製した。５容三角フラスコ25本にそれぞれフスマ
200gおよび水160mlを入れ、120℃、30分間加圧
滅菌した後、前記の種菌を無菌的に接種し、28℃
で２日間培養後、温度を20℃に下げてさらに２週
間培養した。得られた培養物を37.5の水に１時間浸漬した
後、濾過し、さらにけいそう土を通過させて粗酵
素液約34を得た。この粗酵素液に硫酸アンモニ
ウムを50％飽和まで加え、生成した沈澱を遠沈採
取して0.02M酢酸緩衝液（PH5.5）3.9に溶解
し、57℃で30分間加熱した。この熱処理した酵素
液を５℃以下に冷却後、２倍量の予め冷却したエ
タノールを加え、生成した沈澱を遠沈採取して
0.02Mりん酸緩衝液（PH7.4）２に溶解し、同
一緩衝液で一夜透析した。透析中に生成した沈澱
を遠沈除去し、上清液を同一緩衝液で平衡化した
DEAE（ジエチルアミノエチル）―セルロースカ
ラム（3.5×50cm）に通し、吸着した酵素を食塩
0.35Mを含む同一緩衝液を用いて溶出した。溶出
された活性区分を集め、0.05Mの食塩を含む
0.05M酢酸緩衝液（PH5.5）で一夜透析した。こ
の透析内液を同一緩衝液で平衡化したDEAE―セ
フアロースCL―6B（フアルマシア・フアインケ
ミカルズ社製）カラム（２×10cm）に通し、吸着
した酵素を食塩0.05〜0.75Mのリニアグラジエン
ト法で溶出した。溶出された活性区分を集め、透
析濃縮後、セフアデツクスＧ―200（フアルマシ
ア・フアインケミカルズ社製）カラム（2.5×120
cm）を用いてゲル濾過を行い、活性区分を集めて
濃縮後、0.02Mりん酸カリウム緩衝液（PH7.4）
で透析した。この透析内液を遠沈し、上清液を精
密濾過した後、凍結乾燥してＬ―グルタミン酸オ
キシダーゼの精製標品（比活性55.1U／mg蛋白収
率18.4％）30mgを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明酵素（実線）と公知酵素（点
線）の作用PH範囲を示す。第２図は本発明酵素
（実線）と公知酵素（点線）の安定PH範囲（37
℃、60分間保持）を示す。第３図は本発明酵素の
安定PH範囲（45℃、15分間保持）を示す。第４図
は本発明酵素の安定PH範囲（60℃15分間）を示
す。第５図は本発明酵素の作用適温範囲を示す。
第６図は本発明酵素（実線）と公知酵素（点線、
〇−〇）の安定温度範囲を示す。第６図において
▲−▲はPH5.5、●−●はPH7.5、■−■はPH9.5の
各条件における温度安定曲線を示す。第７図は本
発明酵素の紫外線吸収スピクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の特性を有し、安定性の高いＬ―アミノ
酸オキシダーゼであるＬ―グルタミン酸オキシダ
ーゼ。Ａ作用下記反応式のごとくＬ―グルタミン酸1molに
つき、1molの酸素ち1molの水を要求し、1molの
α―ケトグルタル酸、1molのアンモニアおよび
1molの過酸化水素を生成する。Ｂ基質特異性Ｌ―グルタミン酸に対する基質特異性が高く、
Ｌ―グルタミンおよびＬ―ヒスチジンには実質的
に全く作用しない。Ｃ至適PH 至適PHはPH７〜8.5付近である。Ｄ PH安定性 37℃、60分間保持の条件ではPH5.5〜10.5の範
囲において安定である。Ｅ熱安定性 PH5.5、15分間保持の条件において65℃まで安
定である。Ｆ分子量ゲル濾過法（セフアデツクスＧ―200（フアル
マシア・フアインケミカルズ社製））で測定した
分子量が135.000±10.000である。Ｇ補酵素補酵素はフラビンアデニンジヌクレオチド
（FAD）である。２塩化第二銅およびジエチルジチオカルバメイ
トによつて阻害されない特許請求の範囲第１項記
載のＬ―グルタミン酸オキシダーゼ。３ストレプトマイセス属に属し、下記の特性を
有するＬ―グルタミン酸オキシダーゼを生産する
能力を有する微生物を、該微生物が生育しうる培
地に培養し、培養物より前記Ｌ―グルタミン酸オ
キシダーゼを採取することを特徴とするＬ―グル
タミン酸オキシダーゼの製造法。Ａ作用下記反応式のごとくＬ―グルタミン酸1molに
つき、1molの酵素と1molの水を要求し、1molの
α―ケトグルタル酸、1molのアンモニアおよび
1molの過酸化水素を生成する。 B.基質特異性Ｌ―グルタミン酸に対する基質特異性が高く、
Ｌ―グルタミンおよびＬ―ヒスチジンには実質的
に全く作用しない。 C.至適PH 至適PHはPH７〜8.5付近である。 D.PH安定性 37℃、60分間保持の条件ではPH5.5〜10.5の範
囲において安定である。 E.熱安定性 PH5.5、15分間保持の条件において65℃まで安
定である。 F.分子量ゲル濾過法（セフアデツクスＧ―200（フアル
マシア・フアインケミカルズ社製））で測定した
分子量が135.000±10.000である。Ｇ補酵素補酵素はフラビンアデニンジヌクレオチド
（FAD）である。