JPS6041594B2 - グルタチオン・スルフイドリル・オキシダ−ゼおよびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔Ｉ〕発明の背景 技術分野 本発明は、新酵素グルタチオン・スルフイドリル・オキ
シダーゼ（以下、ＧＳＯと略称する。

）およびその製造法に関するものである。さらに詳しく
は、還元型グルタチオン（以下、ＧＳＨと略称する。）
に対して強い親和性と高い基質特異性を示すＧＳＯおよ
びその微生物による製造法に関するものである。本発明
のＧＳＯは、ＧＳＨに対する強い親和性と高い基質特異
性を示し、酸素の存在下、ＧＳＨに作用して酸化型グル
タチオン（以下、ＧＳＳＧと略称する。

）と過酸化水素とを生成するので、この過酸化水素の生
成あるいは酸素の減少を公知の方法で定量することによ
つて、生体試料中または食品中などのグルタチオンを定
量することができる。先行技術 従来、本発明のＧＳＯと同様にフラビン化合物を補酵素
として含むフラボプロテイン・スルフイドリル◆オキシ
ダーゼについては、ラットの精嚢分泌物から単離された
酵素（バイオケミストリー（ＢｌＯｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）凹、２６３９（１９８０））が知られているにすぎな
い。

しかし、このラットの酵素は、ＧＳＯと異り、ＧＳＨよ
りもジチオスレイトールに強い親和性と高い基質特異性
を示し、蛋白質中のスルフイドリル基（以下、ＳＨ基と
略称する。）に対しても強い酵素活性を示すことから、
ＧＳＨに特異性の高い酵素とは考えにくい。また、従来
、微生物にフラビン化合物を補酵素として含むフラボプ
ロテイン●スルフイドリル・オキシダーゼが存在するこ
とは知られておらず、したがつてこのような酵素が単離
された例もない。

以上のように従来、動物、植物、微生物をとわずＧＳＨ
に特異性が高く、かつ親和性の強いフラボプロテイン・
スルフイドリル・オキシダーゼが存在することは全く知
られていなかつたのである。

〔旧発明の概要 要旨 本発明は、酵素の存在下、スルフイドリル化合物（ＳＨ
化合物）に作用し、ジスルフィド架橋２分子縮合物と過
酸化水素とを生成する作用を有し、ＧＳＨに対するＫｍ
値が低く、かつ基質特異性．が高いスルフイドリル●オ
キシダーゼであり、補酵素がフラビン・アデニン◆ジヌ
クレオチドであるＧＳＯを提供するものである。

さらに本発明は、アスペルギルス （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎ
ｉｃｉｌｌｌｕｍ），属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍ）属、トリコデルマ（ＴｒｉｃｈＯｄｅｒｍａ）属、
パエシロミセス（ＰａｅｃｉｌＯｍｙｃｅｓ）属または
グリオクラデイウム（ＧｌｌＯｃｌａｄｌｕｍ）属に属
し、ＧＳＯ生産能を有する微生物を該微生物が生育しう
る培地に培養し、培養物よりＧＳＯを採取することを特
徴とするＧＳＯの製造法をも提供するものである。

〔■〕発明の詳細な説明 グルタチオン・スルフイドリル・オキシダーゼの酵素化
学的および理化学的性質本発明のＧＳＯは前記のような
酵素作用および基質特異性を有するものであるが、後に
示す実施例で製造したＧＳＯの精製酵素標品の酵素化学
的および理化学的性質は下記のとおりである。

（１）作用ＧＳＯは公知のラット精嚢分泌物からのスル
フイドリル・オキシダーゼと同様に酸素の存在下におい
てＳＨ化合物を酸化的に２分子縮合して対応するジスル
フィド化合物を生成するが、特にＧＳＨに強い親和性と
高い基質特異性を示し、かつ蛋白質中のＳＨ基に対して
は微弱な活性しか示さないという特徴を有する新規なス
ルフイドリル・オキシダーゼである。

ＧＳＯは、ＧＳＨを基質にした場合、下記反応式のごと
く、ＧＳＨ２ｒＴ）ｏ１につき、１ｍ０１の酸素を要求
し、１ｍ０１のＧＳＳＧと１ｍ０１の過酸化水素とを生
成する。

（２）基質特異性 種々のＳＨ化合物に対して精製されたＧＳＯを酸性（Ｐ
Ｈ５．Ｏ；０．２Ｍ酢酸緩衝液）、中性（ＰＨ７．４；
０．２Ｍりん酸緩衝液）およびアルカリ性（ＰＨ９．３
；０．△ひリス緩衝液）の各ＰＨて作用させた結果が第
１表である。

第１表において各基質の濃度は２ｍＭてある。また酵素
活性は、後記する酸素電極法により測定し、各ＰＨにお
けるＧＳＨに対する活性の相対値として表わした。第１
表から明らかなようにＧＳＯはＰＨ７．４およびＰＨ５
．ＯにおいてＧＳＨに高い基質特異性を示した。特にＧ
ＳＯの安定ＰＨ範囲内であるＰＨ５．Ｏにおいて、ＧＳ
Ｈに極めて高い基質特異性を示した。また、ＰＨ７．４
ではＬ−システイン、ジチオスレイトールなどにもかな
り高い活性を示したが、ＰＨ７．４におけるＫｍ値を測
定した結果、ＧＳＨに対してはＫｍ値が６．８×１０−
４Ｍと低いのに対し、Ｌ−システインおよびジチオスレ
イトールに対してはＫｍ値が高く、それぞれ３．７×１
０−３Ｍおよび６．８×１０−３Ｍであつた。したがつ
て基質濃度が低く、かつＰＨが酸性側の場合にはほぼ特
異的にＧＳＨのみに作用する極めてＧＳＨに基質特異性
の高いスルフイドリル・オキシダーーゼであることが認
められた。この点、公知のラット精嚢分泌物からのスル
フイドリル・オキシダーゼはＧＳＨよりジチオスレイト
ールに高い基質特異性を示し、Ｋｍ値もＧＳＨ（４．４
×１０−３Ｍ）よりジチオスレイトールの方が低く（７
×１０−４Ｍ）、本発明のＧＳＯとは明確に区別される
。また、ＧＳＯは蛋白質のＳＨ基にはほとんど作用せず
、この点でも既知酵素と区別できた。

たとえば、？尿素存在下、２−メルカプトエタ．ノール
中で還元したリボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅＡ；分子
量１３７００）のＳＨ基にＧＳＯを作用させたところ、
ＧＳＯを十分量（５ＵＩｍ１）添加した場合においてさ
え、ＲＮａｓｅＡｌ分子当りのＳＨ基（８個）の減少速
度は４時間に１ｋ個程度であり、自然酸化によるＳＨ基
の減少速度（１．陥／４時間）を若干上まわる程度であ
つた。

これに対して、公知のラット精嚢分必物のスルフイドリ
ル・オキシダーゼは、０．５ＵＩｍ１添加した場合、４
時間に７．陥／ＭＯｌ以上の減少を示し（前出ＢｌＯｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙＵｌ２６３９（１９８０）のＦｉｇ７
参照）、ＲＮａｓｅＡに対し顕著な活性を示す酵素であ
る。すなわち、本発明のＧＳＯは酸性および中性側でＧ
ＳＨに強い親和性を示し、特異的に作用する新規なフラ
ボプロテイン・スルフイドリル・オキシダーゼである。

（）力価の測定 ＧＳＯの力価の測定は、酸素電極法で行つた。

すなわち、１０ｍ．Ｍ（７）ＧＳＨを含む０．１Ｍりん
酸カリウム緩衝液（ＰＨ７．４）１ｍ１を酸素電極セル
に入れ、１０Ｐｅの酵素液を添加して酸素消費速度を測
定した。３０℃で１分間に１μＭＯｌの酵素を消費する
酵素量を１単位（Ｕｎｉｔ；本明細書において、Ｕと略
称する。

）とした。１）至適ＰＨ 至適ＰＨは第１図に示すように、ＰＨ６．５〜８．２付
近、特にＰＨ７．ｌ〜７．８ｆｊ′近である。

なお、至適ＰＨの測定は、０．１５Ｍ酢酸ナトリウムー
塩酸緩衝液、０．１５モル酢酸ナトリウムー酢酸緩衝液
、０．１５Ｍりん酸カリウム緩衝液、０．１５Ｍトリス
ー塩酸緩衝液および０．１５Ｍグリシンー塩化ナトリウ
ムー水酸化ナトリウム緩衝液の各緩衝液を使用し、ＰＨ
２．４〜１０．８の範囲で行つた。〕）ＰＨ安定性およ
び熱安定性 ＰＨ安定性は、前記各緩衝液中、ＰＨ３．Ｏ〜１０．８
において、４５゜Ｃ１１紛間保持した後、酵素活性を測
定した。

結果は第２図に示すとおりであり、ＰＨ５〜９の範囲で
安定であつた。また、熱安定性は、０．１Ｍりん酸カリ
ウム緩衝液（ＰＨ７．４）中、４０〜８０℃において１
紛間保持し、酵素活性を測定した。

結果は、第３図に示すとおりであり、５５℃までは完全
に活性を維持していたが、８０゜Ｃでは完全に失活した
。３）作用適温の範囲 ＧＳＯの酵素活性の測定に使用する酸素電極法において
は、温度によつて反応液の溶存酸素量が異るので正確な
範囲は特定できないが、過酸化水素の生成を公知の方法
で測定したところ、およそ３０〜５０℃の範囲で好適で
あつた。

ハ 阻害、活性化および安定化種々の金属塩およびエチ
レンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの阻害剤１ｍＭを
含む０．１Ｍりん酸カリウム緩衝液（ＰＨ７．４）中て
酵素反応を行い、各物質による阻害の有無を検討した。

その結果は第２表に示すとおりであり、硫酸亜鉛、すな
わち亜鉛イオンによつて完全に阻害された。また、ＧＳ
Ｏは特別な活性化剤や安定化剤を必要としない。

（８）紫外線吸収スペクトル（第４図参照）λＭａｘ２
７２ｒｌＴＬ．、３６５ｒ１ｒｒ１，、４４頷ＭＥ？Ｍ
ｌ４．７８（９）補酵素 ＧＳＯを熱処理またはトリクロロ酢酸 （ＴＣＡ）処理し、遠沈して得られた上清は、その吸収
スペクトルがフラピンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ
）と一致し、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼのアポ酵素を活
性化したので、本酵素の補酵素がＦＡＤであることが判
明した。

また、ＦＡＤは、ＧＳＯｌｍＯＩあたり２ｒｒ１０１存
在している。（１０）ポリアクリルアミドゲル電気泳動
およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動精製酵
素はいずれの方法でも単一バンドを示した。

（１１）等電点 アンフオライン（スウエーテン国、ＬＫＢ社製）を用い
た等電点電気泳動法により測定したところ、ＰＩは４．
２１てあつた。

（１２）分子量 ＧＳＯの分子量は、セフアデツクスＧ−２００（フアル
マシア・フアインケミカルズ社製）によるゲル濾過法で
は９４０００±５０００と測定された。

また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
り、ＧＳＯは分子量４７０００±３０００のサブユニッ
ト２個から構成される二量体酵素であることが示された
。（１３）結晶構造および元素分析 ＧＳＯは結晶化されていないので測定していない。

（１４）精製方法 ＧＳＯの精製は塩析法、等電点沈澱法、有機溶媒による
沈澱法、けいそう土、活性炭などによる吸着法、各種ク
ロマトグラフ法等を適宜に組合せて行うことができる。

精製方法の具体例は実施例に示すとおりである。次に本
発明の方法、すなわち微生物の培養によるＧＳＯの製造
法を具体的に示す。

・使用微生物 本発明のＧＳＯの製造に使用される微生物は、アスペル
ギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ；以下Ａ．と略称する
。

）属、ペルシリウム（ＰｅｎｉｃｉｌｌｌＬｌｍ；以下
、Ｐ．と略称する。）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍ；以下、Ｆ．と略称する。）属、トリコデルマ（Ｔｒ
ｉｃｈＯｄｅＩｍｌａ；以下、Ｔ．と略称する。

）属、パエシロミセス（ＰａｅｃｉｌＯｍｙｃｅｓ；Ｐ
ａｅ．と略称する。）属またはグリオクラデイウム（Ｇ
ｌｌＯｃｌａｄｉｕｍｌ；以下Ｇ．と略称する。）属に
属し、ＧＳＯ生産能を有する微生物である。これらの属
に属するＧＳＯ生産菌の具体例としては第３表の（イ）
および（口）に示す菌株が挙げられる。ただし、本発明
の使用微生物はこれらの菌株に限定されるものではない
。また、これらＧＳＯ生産菌を通常の微生物突然変異誘
導法、たとえば紫外線、Ｘ線、γ線照射などの物理的処
理、ニトロソグアニジンなどの薬剤による化学的処理な
どの処理法によつて変異させて得られたＧＳＯ高生産性
突然変異株のいずれをも好適に使用できる。さらに本発
明によるＧＳＯの製造法は基本的には、前記微生物のＧ
ＳＯ生産に関する遺伝情報を担う遺伝子デオキシリボ核
酸（ＤＮＡ）によるＧＳＯ合成機能を利用するものであ
る。

したがつて、このような遺伝子ＤＮＡを適当なベクター
に組み込み、前記以外の属の微生物へ形質転換により移
入させるか、または遺伝子ＤＮＡをプロトプラスト法に
よる細胞融合によつて他属微生物に取り込ませるなど遺
伝子操作的手法によつて得た微生物によるＧＳＯ製造法
も本発明の範囲に包含される。以下に第３表を示す。

第３表の（イ）および（口）は本発明に包含される属の
代表的菌株を固体培地（フスマ培地：フスマ２０ｙ１水
１４ｍ１）に接種して培養（２８℃、５日間）し、培養
後、培養物を水（１５０ｍＬ）で抽出して得た酵素液の
ＧＳＯの活性を測定したものである。なお、表中のタイ
プカルチャーはそれぞれ次の機関に保存されている菌株
である。

ＩＡＭ：東京大学応用微生物研究所 ＩＦ′Ｏ：財団法人 発酵研究所 ０ＵＴ：大阪大学工学部 ＡＴＣＣ：ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣ
ＯＩｌｅｃｔｉＯｎ以上の第３表の（イ）および（口）
は固体培養による菌体外へのＧＳＯの生産を示すもので
あるが、ＧＳＯは菌体外に限らず菌体内にも生産される
。

たとえば、ペニシリウム●アクレアタムＩＦＯ５７２９
をＭＧＰ培地（組成：グルコース２５ｇ１′、ペプトン
２．５ｙＩ′、肉工キズ１．２５ｙＩｅ１硫酸マグネシ
ウム０．２５ｙＩ′、塩化カリウム０．２５ｇ１ｅ１硫
酸第一鉄０．００５ｇノｆ）に培養（２８゜Ｃ１５日）
した場合、培養液中には０．１２ＵＩｍ１（７）ＧＳＯ
が生産されていたが、培養菌体を集菌し、破砕して抽出
した抽出液ａには０．４５ＵＩＴｒＬ９蛋白のＧＳＯが
含まれていた。培養方法および案件本発明における微生
物の培養方法および条件は、該微生物が良好に生育し、
ＧＳＯが菌体外および／または菌体内に十分に生産され
る方法、条件であれば特に限定されない。

ただし、液体培養の場合菌体外へのＧＳＯの生産量は少
いので、菌体外生産を目的とする場合には固体培養が好
ましい。固体培養に使用する固体培地は通常使用される
ものと何ら変らない。

すなわち、固体培地とはフスマ、脱脂大豆、米ヌカ、ト
ウモロコシ、菜種粕、小麦、米、もみがら等の天然固体
原料の単独あるいは二種以上の組合せたものを主体とし
、さらに必要に応じて本発明の使用微生物が資化可能な
栄養源、たとえばグルコース、マルトース、グリセリン
、可溶性澱粉、エタノール等の炭素源、各種アミノ酸、
ペプトン、大豆粉、蛋白質加水分解物、コーンステープ
リカー、肉工キズ、酵母工キズ、各種アンモニウム塩、
各種硝酸塩、尿素等の窒素源、各種のナトリウム塩、カ
リウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、マグネシウム塩
、亜鉛塩、鉄塩、りん酸塩、硫酸塩等の塩類、サイアミ
ン、リボフラビン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチ
ン、ｐ−アミノ安息香酸、ビタミンＢｌ２等の発育素を
適宜添加した培地、またはこれらを適宜な配合、大きさ
、形状に造粒した培地などである。このような固体培地
は常法により滅菌あるいは変性処理し、種菌を接種して
固体培養を行う。液体培養は、前記と同様な炭素源、窒
素源、塩類および発育素を適宜添加した液体培地で行う
。また、上記以外の培養法、たとえばスポンジ等の適宜
の担体に液体培地を吸収または被覆し（特開昭４９−１
４６乃号公報参照）、種菌を接種して培養する方法であ
つても使用微生物が繁殖し、ＧＳＯ．を良好に生産する
限り採用できる。培養条件は使用微生物の種類に応じて
最適のＧＳＯ生産条件を選択すればよく、特に限定され
ない。

通常、たとえば２５〜３５℃、ＰＨ５〜９で３〜１５日
培養すればよい。ＧＳＯの採取 使用微生物の培養により生産されたＧＳＯは、適当な抽
出法により培養物、すなわち培地および／または培養菌
体から抽出分離され、そのまま粗酵素液として使用する
か、あるいは前記したと・おり通常の酵素精製法に従つ
て使用目的に応じた精製段階に精製される。

抽出分離法は、特に限定されず、常法により行われる。

たとえば、固体培養物からの抽出は、通常、水または緩
衝液により行われる。液体培養の場合、培養液中のＧＳ
Ｏは、硫安等による塩析法、有機溶媒による沈澱法によ
つてまず分離される。また、菌体内のＧＳＯは常法によ
り菌体を破砕し、可溶化して抽出する。以下、本発明の
使用菌の一例であるペニシリウム・アクレアタムを使用
し、培養法および培養条件ならびにＧＳＯの抽出法およ
び精製法を実施例として例示する。

ただし、本発明はこの実施例に）限定されるものではな
い。実施例３００ｍ１容三角フラスコにフスマ８ｆ１１
水５ｍ１およびもみがら１ｙを入れ、１２０゜Ｃ、３吟
間加圧滅菌して調製した種用フスマ培地にペニシリウム
・・アクレアタムＩＦＯ５７２９を植菌し、２８℃、７
日間培養して種菌を調製した。

５′容三角フラスコ２０本にそれぞれフスマ２００ｑお
よび水１４０ｍ１を入れ、１２０′Ｃｌ３吟間加圧滅菌
した後、前記の種菌を無菌的に接種し、２８℃、７・日
間培養した。

得られた培養物を３０ｅの水に１時間浸漬した後、濾過
し、さらにけいそう土を通過させて粗酵素液約２７ｅを
得た。この粗酵素液に硫酸アンモニウムを６５％まて加
え、生成した不溶物を遠沈除去した。上清液にさらに硫
酸アンモニウムを添加して９５％飽和濃度とし、生成し
た沈澱を遠沈採取して０．０２Ｍりん酸緩衝液（ＰＨ７
．４）１′に溶解し、同一緩衝液で一夜透析した。透析
中に生成した沈澱を遠沈除去し、上清液を同一緩衝液で
平衡化したＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セルロ
ースカラム（５×７０ｃｍ）に通し、吸着した酵素を食
塩０．２Ｍを含む同一緩衝液を用いて溶出した。溶出さ
れた活性区分を集め、透析濃縮後、セフアデツクスＧ−
１００（フアルマシア・フアインケミカルズ社製）カラ
ム（３．５×１００ｃｍ）を用いてゲル濾過を行い、活
性区分を集めて濃縮後、０．０２Ｍりん酸カリウム緩衝
液（ＰＨ７．４）で透析した。この透析内液を遠沈し、
上清液を精密濾過した後、凍結乾燥してＧＳＯの精製標
品（収率４１％、比活性５４０Ｕ１ｍｇ蛋白）４０ｍｇ
を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明酵素の作用ＰＨ範囲を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酸素の存在下、スルフイドリル化合物に作用し、ジ
   スルフィド架橋２分子縮合物と過酸化水素とを生成する
   作用を有し、還元型グルタチオンに対するＫｍ値が低く
   、かつ基質特異性が高いスルフイドリル・オキシターゼ
   であつて、下記（ａ）〜（ｄ）の理化学的性質を有する
   グルタチオン・スルフイドリル・オキシダーゼ。 （ａ）至適ｐＨが６．５〜８．２付近であり、安定ｐＨ
   がｐＨ５〜９の範囲（４５℃、１５分保持）である。 （ｂ）作用適温の範囲が３０〜５０℃付近であり、８０
   ℃（ｐＨ７．４、１５分保持）で完全に失活する。（ｃ
   ）亜鉛イオンにより阻害される。（ｄ）ドデシル硫酸ナ
   トリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳泳
   法で測定した分子量が４７０００±３０００であるサブ
   ユニット２個から構成され、ゲル濾過法で測定した分子
   量が９４０００±５０００である。 ２ 補酵素がフラビン・アデニン・ジヌクレオチドであ
   る特許請求の範囲第１項記載のグルタチオン・スルフイ
   ドリル・オキシダーゼ。 ３ 補酵素であるフラビン・アデニン・ジヌクレオチド
   が、酵素１分子あたり２分子存在する特許請求の範囲第
   ２項記載のグルタチオン・スルフイドリル・オキシダー
   ゼ。 ４ アスペルギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属
   、トリコデルマ属、パエシロミセス属またはグリオクラ
   デイウム属に属し、グルタチオン・スルフイドリル・オ
   キシダーゼ生産能を有する微生物を、該微生物が生育し
   うる培地に培養し、培養物よりグルタチオン・スルフイ
   ドリル・オキシダーゼを採取することを特徴とするグル
   タチオン・スルフイドリル・オキシダーゼの製造法。