JPH0748996B2 - 新規なアルカリプロテアーゼとその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、新規なアルカリプロ
テアーゼとその製造方法に関し、更に詳しくはキサント
モナス属の一菌株を培養することによって生産され、ア
ルカリ条件下、比較的低温度（室温〜約40℃）にても酵
素活性を有する細菌アルカリプロテアーゼとその製造方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】アルカリプロテアーゼは、バチルス属、
ストレプトマイセス属、アスペルギルス属等の微生物を
利用して生産されるものが知られている。

【０００３】このアルカリプロテアーゼは、食品加工、
洗浄剤、皮革工業等の分野に利用されているだけでな
く、フィルムからの銀回収、醸造工業等の分野でも広く
使用されている。

【０００４】ところで、近年食肉の軟化剤、洗浄剤を始
めとして低温もしくは室温でアルカリプロテアーゼを使
用する分野が増大しており、これに伴って低温もしくは
室温で使用できるアルカリプロテアーゼと、低温もしく
は室温で有効に増殖するアルカリプロテアーゼ生産菌の
開発が期待されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする問題点】しかし、従来のアル
カリプロテアーゼは至適温度が高く、耐熱性に特徴があ
り、現在、より低温で活性を有するアルカリプロテアー
ゼとして市販されているアルカリプロテアーゼ（商品名
APJ-21:昭和電工製) についても、低温領域における活
性は必ずしも満足できるものでない。

【０００６】この発明は、低温領域において充分な酵素
活性を有するアルカリプロテアーゼとその製造方法を提
供することを目的とする。

【０００７】

【問題点を解決するための手段】本発明者らは、低温領
域で充分な洗浄効果を有するアルカリプロテアーゼの生
産、更に低温培養で効率よくアルカリプロテアーゼを生
産させる方法について鋭意研究を重ね、広く自然界より
アルカリプロテアーゼ生産菌を検索した結果、キサント
モナス属に属する一菌種が、前記性質において優れたア
ルカリプロテアーゼを培地中に生産することを見出し、
この発明を完成するに至ったものである。

【０００８】即ち、従来の菌株では一般に酵素の生産は
30℃以上の培養温度が普通であるが、この発明のキサン
トモナス菌株は10〜25℃の温度領域で培養され、15℃の
培養温度でアルカリプロテアーゼの生産が最大となり、
低温領域で活性を有するアルカリプロテアーゼが得られ
る。

【０００９】この発明のアルカリプロテアーゼを産生す
る分離菌株の菌学的性質について、以下に示す。 Ａ．形態的性質 肉汁寒天培地上で30℃、２日間培養した時、以下の形態
的特徴が観察された。 1) 細胞の形 ：桿菌 大きさ ：− コロニーの大きさ ：直径 0.5mm 2) 運動性 ：有り 3) 胞子 ：形成されない 4) グラム染色 ：陰性

【００１０】Ｂ．生理的性質 1) 硝酸塩の還元 ：− 2) インドール生成 ：− 3) アルギニンデハイドラーゼ：− 4) ウレアーゼ ：− 5) β−ガラクトシダーゼ ：＋ 6) オキシダーゼ ：− 7) カタラーゼ ：＋ 8) ゼラチンの加水分解 ：＋ 9) ツィーン80の加水分解 ：− 10) OFテスト ：− 11) 生育の温度範囲 ：37℃以上 12) グルコースからの酸生成 ：− 13) マルトースからの酸生成 ：− 14) 糖類及び有機酸の消化性 グルコース ：＋ カプロン酸 ：− アラビノース ：− マレイン酸 ：＋ マンニット ：− クエン酸 ：＋ マルトース ：＋ フェニル酢酸 ：− マンノース ：＋ アジピン酸 ：− グルコン酸 ：−

【００１１】以上の菌学的性質からこの菌株は、キサン
トモナス属に属するとみなされる。したがって、本菌株
をキサントモナス・エスピー(Xanthomonas sp.) S-1 と
命名し、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。
寄託番号は微工研寄託 菌寄第12087 号である。

【００１２】この発明に使用する微生物としては、上記
キサントモナス・エスピー(Xanthomonas sp.) S-1(微工
研寄託 菌寄第12087 号) が挙げられるが、この菌だけ
に限らずキサントモナス属に属し低温領域でアルカリプ
ロテアーゼを生産する菌は全てこの発明において使用す
ることができる。

【００１３】この発明においてアルカリプロテアーゼを
生産する培地としては、通常の微生物の培養に用いられ
るもので、本菌株に利用可能なもので有れば良く、炭素
源としてはデンプン、デキストリン、糖蜜、グルコー
ス、無機塩としてはリン酸２ナトリウム、硫酸マグネシ
ウム等の塩類や炭酸塩を加えてアルカリ性培地が好まし
く、窒素源としては硝酸ナトリウム、尿素、有機窒素源
等が使用される。

【００１４】培養温度は10〜25℃の範囲にあり、好まし
くは12〜17℃である。培養ｐＨ7.0〜9.0 の範囲にあ
り、好ましくはｐＨ8.2 〜8.7 である。但し、この条件
に限定されるものではない。培養は通常48〜96時間培養
することにより、培養液中にアルカリプロテアーゼが蓄
積される。

【００１５】培養終了後、培養液より遠心分離及び濾過
などの一般的な固液分離手段により菌体及び不溶物を除
いて粗酵素液を得る。このようにして得られた粗酵素液
を硫安塩析によりアルカリプロテアーゼを得る。このま
まで使用するか、更に透析、有機溶媒分別法、カラムク
ロマト等公知の精製法により精製しても良い。

【００１６】この発明に係るアルカリプロテアーゼの単
離精製方法の一例を、図１に示す。これによれば先ず、
微生物培養液を遠心分離してその上清を硫安塩析にか
け、得られた沈殿物をリン酸緩衝液（ｐＨ6.0)に溶解
し、同緩衝液にて透析する。

【００１７】次にこの溶液を疎水クロマトグラフィーに
かけ、硫安(14 〜0%) を含むリン酸緩衝液で溶出し、活
性画分を集め、得られた活性画分をリン酸緩衝液（ｐＨ
7.0)にて透析する。

【００１８】この透析液をカチオン交換クロマトグラフ
ィーにかけ、リン酸緩衝液で洗浄後、塩化ナトリウム(0
〜0.3M) を含む同緩衝液で溶出し、活性画分を集め、更
にこの溶液をトリス−塩酸緩衝液( ｐＨ8.0)で透析後、
ゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、同緩衝液で溶出さ
せ、活性画分を集める。

【００１９】最後に、この溶液をＳＤＳ（ドデシル硫酸
ナトリウム）を用いないポリアクリルアミド電気泳動に
かけ、活性画分を切り出し核酸蛋白回収器マックスイー
ルド−ＮＰにて抽出、精製されたアルカリプロテアーゼ
（以下、Ｓ酵素と称す）を得る。

【００２０】得られたアルカリプロテアーゼの物理化学
的性質は次の通りである。 (1) 作用：高アルカリ条件下で各種の蛋白質を分解す
る。 (2) 基質特異性：難溶性蛋白質、特にツエインに対して
特異性を示す。 (3) 至適ｐＨ：ｐＨ10.5〜12である。 (4) 安定ｐＨ範囲：相対活性90% 以上としたときｐＨ７
〜12である。 (5) 至適温度：温度45℃である。 (6) 耐熱性：ｐＨ10.5で30℃迄活性を維持する。 (7) 吸収スペクトル：ｐＨ8.0 の50mMトリス−塩酸緩衝
液中において紫外領域275 nmに極大吸収を示す。 (8) 金属イオンの影響：Caイオンで活性の熱安定性が増
す。 (9) 阻害剤の影響：イソプロピルフルオロン酸（ＤＦ
Ｐ）、フェニルメタンスルフォニルフルオリド（ＰＭＳ
Ｆ）による活性の阻害が、エチレンジアミンテトラアセ
テート-2Na( ＥＤＴＡ−２Ｎａ）、Ｐ−クロロマーキュ
リー安息香酸（ＰＣＭＢ）による活性阻害に比べて高
い。 (10)分子量：36000(ゲル濾過法） (11)等電点：9.1 （エレクトロフォーカシング法）

【００２１】以上で明らかなように、この発明によれば
比較的低温領域で活性なアルカリプロテアーゼをキサン
トモナス属の菌株より低温培養で効率よく生産すること
ができる。

【００２２】

【実施例】以下、実施例によりこの発明を具体的に説明
する。 実施例１ （ａ）菌株の培養 カゼイン0.5%、グルコース0.5%、酵母エキス0.2%、リン
酸ナトリウム0.6%、塩化カリウム0.1%、硫酸マグネシウ
ム0.01% を120 ℃にて20分間滅菌した後、滅菌済の0.1M
炭酸ナトリウム緩衝液(pH10.5)を最終濃度0.25% となる
ように加え、初発ｐＨを8.5 に合わせ培養液を調整し
た。 該培養液5ml を試験管( Φ18×180mm)に分注し、 キ
サントモナスエスピー(Xanthomonas sp.)S-1株を接種
し、 該培養液を15℃で20時間好気的に振盪培養し、 種培
養液を調整した。該種培養液を同じ組成の培地各100ml
の入った500ml コルベン10本に加え15℃で72時間好気的
に振盪培養した。 得られた培養液1000ml(270PU/ml)を遠
心分離により除菌し、 上清を得た。

【００２３】（ｂ）酵素の精製 このようにして得られた培養上清を冷却攪拌しながら70
% 飽和度になるように硫安を添加すると、アルカリプロ
テアーゼが析出した。該沈殿物を遠心分離により回収
し、該沈殿物を10mMリン酸緩衝液(pH6.0)50ml に溶解
し、該溶液を透析膜に入れ、同緩衝液にて透析した。こ
こに70mlの粗酵素液(270PU/ml,比活性490PU/mg−タンパ
ク）を得た。得られた透析液に硫安を14% 濃度になるよ
うに添加し、硫安14% を含む同緩衝液で平衡化したブチ
ルTOYOPEARL650( 東ソ−社製）を充填したカラムに該溶
液をかけ、疎水クロマトを行い、活性画分を集めたとこ
ろ全量は、310ml、活性は、500PU/ml, 比活性は、2270PU/
mg−タンパクであった。

【００２４】ここまでの精製度は、10倍, 回収率は、60%
であった。次に、該活性画分を20mMリン酸緩衝液(pH7.
0) で透析を行い、同緩衝液で平衡させたＣＭ−セファ
デックスＣ−５０（ファルマシア社製）を充填したカラ
ムに該溶液を展開させ、同緩衝液で比吸着分を溶出させ
吸着分を塩化ナトリウム(0〜0.3M) を含む同緩衝液で溶
出させ、活性画分を集めたところ全量は70ml, 活性は15
00PU/ml,比活性は、2500PU/mg −タンパクであった。こ
こまでの精製度は、11倍、 回収率は、41%であった。

【００２５】更に、該活性画分を濃縮し50mMトリス−塩
酸緩衝液(pH8.0) で透析を行い、該溶液をセファデック
スＧ−７５（ファルマシア社製）のゲル濾過クロマトグ
ラフィーにかけ、同緩衝液で展開させた。得られた活性
画分をＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を用いないポ
リアクリルアミド電気泳動にかけ、活性画分を切り出し
核酸蛋白回収器マックスイールドーＮＰにて抽出し、活
性4400PU/ml,比活性3150PU/mg-タンパクの溶液4ml を得
た。 この精製過程を下記表１に示す。

【００２６】

【表１】

【００２７】次に、精製された酵素を試料としたゲル濾
過クロマトグラフィーの溶出曲線を図２に示す。ここ
で、充填剤としてはセファデックスＧ−７５を用い、溶
出液には50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0) を用いて展開
した。

【００２８】また、精製された酵素を試料とした高速液
体クロマトグラフィーの溶出曲線を図３に示す。ここ
で、機種はショーデックスKB804 （昭和電工社製）カラ
ムを装着した島津ＬＣ−６Ａを用い、溶出液は50ml塩化
ナトリウムを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0) を用いた。
図２、図３より明らかなように、上記の精製によりこの
発明に係る酵素（Ｓ酵素）は完全に精製された。

【００２９】（１）紫外線スペクトル 50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0) で透析した上記試料の
紫外線吸収スペクトルを図４に示す。これより明らかな
ように、この発明に係る酵素は275nm の波長で極大吸収
を示す。

【００３０】（２）分子量 精製した酵素について分子量をゲル濾過クロマトグラフ
ィーにより測定した。ここで、充填剤としてはセファデ
ックスＧ−７５（ファルマシア社製）を用い、50mMトリ
ス−塩酸緩衝液(pH8.0) を溶出液とした。標準蛋白とし
て、オボアルブミン[ 分子量43000]、キモトリプシノー
ゲンＡ[ 分子量25000]、リボヌクレアーゼＡ[ 分子量13
700]の蛋白を用いて検量線を作成した。この検量線を図
５に示す。この方法によりこの発明に係る酵素の分子量
は36000 と決定した。

【００３１】（３）等電点 この発明に係る酵素の等電点をエレクトロフォーカシン
グ法で調べた。ここで、キャリアアンフォライトにBio-
Lyte3/10アンフォライトを用いた。この方法によりこの
発明に係る酵素の等電点は9.1 と決定した。

【００３２】（４）公知酵素との比較 この発明に係る酵素の各種性状を公知のアルカリプロテ
アーゼと比較して表２に示す。

【００３３】

【表２】

【００３４】実施例２ 普通寒天培地にキサントモナス・エスピー(Xanthomonas
sp.) S-1(微工研寄託菌寄第12087 号) を接種し、15℃
で3 日間培養する。次にミルクカゼイン1%、塩化カリウ
ム0.2%、硫酸マグネシウム0.02% 、グルコース1%、酵母
エキス0.4%、リン酸２ナトリウム1.2%を含む液体培地を
120 ℃にて20分間滅菌した後、別途滅菌した0.1M炭酸ナ
トリウム緩衝液(pH10.5)を容量比0.25% 添加し、pH8.5の
培養液を調製した。この培養液を500ml 容振盪フラスコ
に100ml 分注し、 上記培養した種菌を１白金耳接種し、
10℃、15 ℃、23 ℃、30 ℃の各温度で72時間振盪培養し
た。24時間ごとにpH, 菌体濃度(OD₈₆₀nmの吸光値），酵
素活性を測定し、各培養温度での最大菌体濃度値及び最
大酵素活性値を下記表３に示す。

【００３５】

【表３】

【００３６】なお、アルカリプロテアーゼの酵素活性測
定方法はアンソン−萩原変法を用いる次の方法で行なっ
た。30℃に保温した2%カゼイン溶液(pH10.5)1.0ml に適
宜希釈した酵素1.0ml を加え10分間反応させた後、トリ
クロロ酢酸混液4.0ml を加えて反応を停止させ、30℃20
分間放置し、東洋濾紙No.6で濾別後、濾液1.0ml に0.4M
- 炭酸ナトリウム溶液5.0ml を加え、これに５倍希釈し
たフォリン試薬1.0mlを加えて30℃で20分間放置し、660n
mでの吸光度を測定する。前記条件下で１分間にチロシ
ン1 μg 相当量を遊離させる酵素量を１単位(pu)とす
る。

【００３７】以上表３に示した結果より明らかなよう
に、キサントモナス・エスピー(Xanthomonas sp.) S-1
(微工研寄託菌寄第12087 号) では培養温度10〜15℃程
度の比較的低温の培養温度でアルカリプロテアーゼの最
大活性値が得られた。

【００３８】実施例３ 培養温度を15℃に設定する以外は実施例２と同じ条件で
６本培養し、得られた培養液480ml を遠心分離により徐
菌し、上澄液460ml(350PU/ml) を得た。この上澄液に硫
安を加え70% 飽和とし、アルカリプロテアーゼを析出さ
せ、遠心分離により塩析物を回収した。この塩析物を50
mMトリスーHCl 緩衝液(pH8.0) 5ml に溶解し、該溶液を
透析膜に入れ、該緩衝液にて１夜透析し、15mlの粗酵素
液(8,050PU/ml)を得た。この粗酵素液を上記同様な精製
方法で精製し、この精製された酵素を使用して、以下ア
ルカリプロテアーゼの物理化学的性質を調べた。

【００３９】（１）作用（アルカリ条件下における各種
蛋白質の分解率） 測定条件 ｐＨ ：10.5(10mM ホウ砂-NaOH 緩衝液) 温度 ：30℃ 反応条件：30分間 基質濃度：1% 酵素量 ：30PU/ml 蛋白質分解率の測定は、アンソン−萩原変法に従い、各
基質と所定の条件で反応させた後、直ちにBio-Rad のPr
otein Assay Kit を用い蛋白質量を測定し、未反応分と
の比により分解率を求めた。その結果を下記表４に示す
が、この表よりこの発明に係る酵素は、難溶性蛋白であ
るツエインをよく加水分解することが明らかである。

【００４０】

【表４】

【００４１】（２）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適ｐＨは、カゼイン1%を含む各ｐＨの緩衝液に酵素を
30PU/ml となるように加え、30℃で10分間反応させ、 各
ｐＨにおける活性を測定することにより求めた。図６に
至適ｐＨでの活性を100 とした時の各ｐＨでの相対活性
として示す。

【００４２】また、安定ｐＨ範囲は各ｐＨの緩衝液に酵
素を210PU/mlとなるように加え、15℃で24時間インキュ
ベートした後、30℃,pH10.5 で活性を測定することによ
り求めた。図７にインキュベート前のpH10.5における活
性を100 とした時の相対活性として示す。なお、使用し
た緩衝液及びそのｐＨ範囲は以下の通りである。

【００４３】 ｐＨ範囲 緩衝液 pH 3〜7 McIlvaine pH 7〜9 トリス−HCl pH 9 ホウ砂−HCl pH 10 〜12 ホウ砂−NaOH

【００４４】図６、図７から明らかなように、至適ｐＨ
は10.5〜12である。また、安定ｐＨ範囲は相対活性90%
以上としたときpH7 〜12である。

【００４５】（３）至適温度及び耐熱性 至適温度は、基質として1%カゼインを含むpH10.5の緩衝
液に酵素を加え、10分間各温度で反応させ、活性を測定
することにより求め、至適温度での活性を100とした時
の各温度との相対活性を図８に示す。

【００４６】耐熱性は、50mMトリス−HCl 緩衝液(pH8.
0) に210PU/mlの酵素を加え、各温度で３時間熱処理
し、氷冷した後、30℃,pH10.5 で活性を測定することに
より求め、熱処理前のpH10.5における活性を100 とした
時の相対活性として図９に示す。

【００４７】Ca²⁺塩添加( Ca²⁺塩添加量:5mM) による耐
熱性の向上を下記表５に示す。

【００４８】

【表５】

【００４９】図８、図９から明らかなように至適温度は
４５℃であり、３０℃の温度まで活性が維持される。更
に、表５に示すごとくＣａ^２＋５ｍＭ添加により、耐熱
性は約１０℃向上した。

【００５０】（４）金属イオンの影響 下記測定条件の下で各緩衝液に一定量の本酵素液を加
え、各種金属塩を1mM 添加25℃恒温槽で1 時間保温後、
酵素の残存活性を測定し、金属塩無添加の活性を100 と
したときの相対活性を下記の表６に示す。

【００５１】測定条件 ｐＨ ：7.0(20mMトリス−HCl 緩衝液) ｐＨ ：10.5(10mM ホウ砂-NaOH 緩衝液) 温度 ：30℃ 反応時間：10分間 基質 ： 1% カゼイン溶液（各緩衝液で調整）

【００５２】

【表６】

【００５３】表６より明らかなように、この発明に係る
酵素液はpH7.0 の条件で３価の鉄イオンに、pH10.5の条
件で水銀イオンに強く活性を阻害される他は、他の金属
イオンには活性を殆ど阻害されることはなかった。

【００５４】（５）阻害剤の影響 下記測定条件の下で20mMトリス-HCl緩衝液(pH7.0) にこ
の発明で得られた酵素液を加え、各阻害剤を所定濃度添
加して25℃で30分間処理した後、酵素の残存活性を測定
し、阻害剤無添加の活性を100 としたときの相対活性を
下記表７に示す。

【００５５】測定条件 ｐＨ ：7.0(20mMトリス−HCl 緩衝液) 温度 ：30℃ 反応時間：10分間 基質 ： 1% カゼイン溶液（上記緩衝液で調整）

【００５６】

【表７】

【００５７】表７から明らかなように、この発明に係る
酵素はセリンプロテアーゼ阻害剤のジイソプロピルフル
オロリン酸（ＤＦＰ）やフェニルメタンスルフォニルフ
ルオリド（ＰＭＳＦ）による活性の阻害が、金属プロテ
アーゼ阻害剤のエチレンジアミンテトラアセテート-2Na
（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）やＳＨプロテアーゼ阻害剤のパラ
クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）による活性の
阻害に比べ高いため、この発明に係る酵素は活性中心に
セリン残基を持つセリンプロテアーゼであると推定され
る。

【００５８】また動物起源のセリンプロテアーゼである
キモトリプシンの阻害剤、トシルフェニルアラニンクロ
ロメチルケトン（ＴＰＣＫ）或はトリプシンの阻害剤、
トシルリシンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）によって
殆ど活性は阻害されないことが明かとなった。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明に係る酵素の精製過程を示すフローシ
ート

【図２】ゲル濾過クロマトグラフィーの溶出曲線を示す
グラフ

【図３】高速液体クロマトグラフィーの溶出曲線を示す
グラフ

【図４】紫外線領域吸収スペクトルを示すグラフ

【図５】分子量決定の際の検量線を示すグラフ

【図６】実施例３で得られた酵素液の至適ｐＨを示す図

【図７】実施例３で得られた酵素液の安定ｐＨ範囲を示
す図

【図８】実施例３で得られた酵素液の至適温度を示す図

【図９】実施例３で得られた酵素液の耐熱性を示す図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山屋 陽子 北海道網走市南５条西４丁目 (56)参考文献 ＣＵＲ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．22 （1991）Ｐ．85−90

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するアルカリプ
   ロテアーゼ （１）作用：高アルカリ条件下で各種の蛋白質を分解す
   る。 （２）基質特異性：難溶性蛋白質のツェインを加水分解
   する。 （３）至適ｐＨ：ｐＨ１０．５〜１２である。 （４）安定ｐＨ範囲：相対活性９０％以上としたときｐ
   Ｈ７〜１２である。 （５）至適温度：温度４５℃である。 （６）耐熱性：ｐＨ１０．５で３０℃活性を維持する。 （７）吸収スペクトル：ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス−
   塩酸緩衝液中において紫外領域２７５ｎｍに極大吸収を
   示す。 （８）金属イオンの影響：Ｃａイオンで活性の熱安定性
   が増す。 （９）阻害剤の影響：エチレンジアミンテトラアセテー
   ト−２Ｎａ（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）、Ｐ−クロロマーキュ
   リー安息香酸（ＰＣＭＢ）による活性阻害が低い。 （１０）分子量：３６０００（ゲル濾過法） （１１）等電点：９．１（エレクトロフォーカシング
   法）
2. 【請求項２】 キサントモナス・エスピー（Ｘａｎｔｈ
   ｍｏｎａｓ ＳＰ．）Ｓ−１（微工研寄託 菌寄１２０
   ８７号）の菌株を培養温度１０〜２５℃、培養ｐＨ７．
   ０〜９．０の範囲で栄養培地にて培養し、培養物から特
   許請求の範囲第１項記載のアルカリプロテアーゼを採取
   することを特徴とするアルカリプロテアーゼの製造方
   法。