JP2994476B2 - 新規蛋白質改変酵素及びその製造法 - Google Patents
新規蛋白質改変酵素及びその製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、光合成細菌、ロドサイ
クラス ゲラチノサス(Rhodocyclus gelatinosus) が産
生することのできる新規蛋白質改変酵素及びその製造法
に関する。
クラス ゲラチノサス(Rhodocyclus gelatinosus) が産
生することのできる新規蛋白質改変酵素及びその製造法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】本発明者らは、タイ国のバンコク、チェ
ンマイ等の土壌及び水から分離される細菌について探索
していたところ、数種の紅色非硫黄細菌を見出し、その
１種をロドサイクラス ゲラチノサス(Rhodocyclus gel
atinosus) T-20 SBT 3379 株と命名した。そして、この
菌の菌学的性質について検討した結果、今まで知られて
いない蛋白質改変酵素を産生することを見出し、本発明
を完成するに至った。従って、本発明の課題は、細菌、
特に光合成細菌、ロドサイクラス ゲラチノサス(Rhodo
cyclus gelatinosus) 、特にT-20 SBT3379 株から得る
ことのできる新規な蛋白質改変酵素及びその製造法を提
供することにある。
ンマイ等の土壌及び水から分離される細菌について探索
していたところ、数種の紅色非硫黄細菌を見出し、その
１種をロドサイクラス ゲラチノサス(Rhodocyclus gel
atinosus) T-20 SBT 3379 株と命名した。そして、この
菌の菌学的性質について検討した結果、今まで知られて
いない蛋白質改変酵素を産生することを見出し、本発明
を完成するに至った。従って、本発明の課題は、細菌、
特に光合成細菌、ロドサイクラス ゲラチノサス(Rhodo
cyclus gelatinosus) 、特にT-20 SBT3379 株から得る
ことのできる新規な蛋白質改変酵素及びその製造法を提
供することにある。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明の蛋白質改変酵素
は、紅色非硫黄細菌、特にロドサイクラスに属する菌株
ロドサイクラス ゲラチノサス、特にT-20SBT 3379 株
（微工研菌寄第１２０１４号；FERM P-12014）により生
産される。この菌株は、本発明者らによりタイ国バンコ
ク市の土壌から分離・採取された新菌株である。
は、紅色非硫黄細菌、特にロドサイクラスに属する菌株
ロドサイクラス ゲラチノサス、特にT-20SBT 3379 株
（微工研菌寄第１２０１４号；FERM P-12014）により生
産される。この菌株は、本発明者らによりタイ国バンコ
ク市の土壌から分離・採取された新菌株である。
【０００４】この菌株は、タイ国バンコク市の土壌をOr
merod 等の基礎培地〔Arch, Biochem, Biophys. 94, 44
9 (1961)〕を改変した培地で培養し、その培養物から光
照射下に嫌気的平板培養法により培養して分離・採取さ
れたものである。
merod 等の基礎培地〔Arch, Biochem, Biophys. 94, 44
9 (1961)〕を改変した培地で培養し、その培養物から光
照射下に嫌気的平板培養法により培養して分離・採取さ
れたものである。
【０００５】すなわち、第２リン酸カリ０．９ｇ／ｌ、
第１リン酸カリ０．６ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム０．２
ｇ／ｌ、塩化カルシウム７５．０mg／ｌ、硫酸第１鉄１
１．８mg／ｌ、EDTA・２Na２０．０mg／ｌ、ｐ−アミノ
安息香酸１．０mg／ｌ、チアミン−HCl １．０mg／ｌ、
ニコチン酸１．０mg／ｌ、ビオチン１５．０μｇ／ｌ及
び微量金属成分１．０ml／ｌ (ホウ酸２８０．０mg、硫
酸マグネシウム２１０．０mg、モリブデン酸ナトリウム
７５．０mg、硫酸亜鉛２４．０mg及び硝酸銅４．０mgを
１００mlの水に溶解したもの）よりなり、pH６．８に調
整した基礎培地に、３０mM DL−リンゴ酸ナトリウム及
び１０mM硫酸アンモニウムを加えた培地を用い、前記T-
20 SBT 3379 株の分離採取を行った。
第１リン酸カリ０．６ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム０．２
ｇ／ｌ、塩化カルシウム７５．０mg／ｌ、硫酸第１鉄１
１．８mg／ｌ、EDTA・２Na２０．０mg／ｌ、ｐ−アミノ
安息香酸１．０mg／ｌ、チアミン−HCl １．０mg／ｌ、
ニコチン酸１．０mg／ｌ、ビオチン１５．０μｇ／ｌ及
び微量金属成分１．０ml／ｌ (ホウ酸２８０．０mg、硫
酸マグネシウム２１０．０mg、モリブデン酸ナトリウム
７５．０mg、硫酸亜鉛２４．０mg及び硝酸銅４．０mgを
１００mlの水に溶解したもの）よりなり、pH６．８に調
整した基礎培地に、３０mM DL−リンゴ酸ナトリウム及
び１０mM硫酸アンモニウムを加えた培地を用い、前記T-
20 SBT 3379 株の分離採取を行った。
【０００６】得られたロドサイクラスT-20 SBT 3379 株
の菌学的性質は次のとおりである。 (a) 形 態 (1) 細胞の形及び大きさ 桿菌 約０．６×２．３μ (2) 運動性の有無 有り (3) 胞子の有無 無 (4) グラム染色性 陰性
の菌学的性質は次のとおりである。 (a) 形 態 (1) 細胞の形及び大きさ 桿菌 約０．６×２．３μ (2) 運動性の有無 有り (3) 胞子の有無 無 (4) グラム染色性 陰性
【０００７】(b) 生理学的性質 (1) DL−リンゴ酸３０mM及び硫酸アンモニウム１０mMを
含む改変Ormerod 培地(modified Ormerod'smedium）で
嫌気的光合成条件下でよく発育する。 (2) 上記培地で暗所好気的条件下で発育する。 (3) 嫌気的光合成条件下でチオ硫酸塩及び硫化物を利用
できない。 (4) 上記培地で嫌気的条件下で培養を行った菌体懸濁液
の色はピンク乃至紫赤色であり、これを好気的条件にし
てもこの色調は変化しない。 (5) ゼラチン液化性を示す。 (6) 分子状水素を電子供与体として利用できる。 (7) 微量のイースト抽出物が発育を促進する。 (8) チアミン要求性であるが、ビオチン、ｐ−アミノ安
息香酸又はニコチン酸の要求性はない。 (9) 液体パラフィンで密封した上記Ormerod の改変培地
あるいはＧ５複合培地またはアルゴンガス雰囲気下の上
記両培地で４０℃でよく発育する。 ４５℃では上記Ormerodの改変培地では液体パラフィン
密封下で生育しないがＧ５複合培地ではよく発育する。
シュードモナス(Pseudomonas) 22TW-S株を加えると両培
地において、液体パラフィン密封下でもアルゴンガス雰
囲気下でもいずれの嫌気条件下でも４５℃で発育する。
含む改変Ormerod 培地(modified Ormerod'smedium）で
嫌気的光合成条件下でよく発育する。 (2) 上記培地で暗所好気的条件下で発育する。 (3) 嫌気的光合成条件下でチオ硫酸塩及び硫化物を利用
できない。 (4) 上記培地で嫌気的条件下で培養を行った菌体懸濁液
の色はピンク乃至紫赤色であり、これを好気的条件にし
てもこの色調は変化しない。 (5) ゼラチン液化性を示す。 (6) 分子状水素を電子供与体として利用できる。 (7) 微量のイースト抽出物が発育を促進する。 (8) チアミン要求性であるが、ビオチン、ｐ−アミノ安
息香酸又はニコチン酸の要求性はない。 (9) 液体パラフィンで密封した上記Ormerod の改変培地
あるいはＧ５複合培地またはアルゴンガス雰囲気下の上
記両培地で４０℃でよく発育する。 ４５℃では上記Ormerodの改変培地では液体パラフィン
密封下で生育しないがＧ５複合培地ではよく発育する。
シュードモナス(Pseudomonas) 22TW-S株を加えると両培
地において、液体パラフィン密封下でもアルゴンガス雰
囲気下でもいずれの嫌気条件下でも４５℃で発育する。
【０００８】(c) 次の成分の利用性 チオ硫酸塩 − 硫化物 − グルタール酸ナトリウム − 酪酸ナトリウム − 安息香酸ナトリウム − ギ酸ナトリウム − ギ酸ナトリウム＋酵母エキス ＋ プロピオン酸ナトリウム − マンニトール − ソルビトール − リンゴ酸ナトリウム ＋ 乳酸ナトリウム ＋ Ｌ−グルタミン酸ナトリウム ＋ エタノール − グルコース ＋ フラクトース ＋ クエン酸ナトリウム − マンノース − グリセリン − 酒石酸ナトリウム − Ｌ−ロイシン − ＋は利用することを、−は利用しないことをそれぞれ示
す。
す。
【０００９】これらの菌学的性質をもとにバージェイス
・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロ
ジー（1984）からT-20 SBT 3379 株はロドサイクラス(R
hodocyclus) に属する１菌株と同定され、さらにロドサ
イクラス ゲラチノサス(Rhodocyclus gelatinosus) に
類似している。そして、ロドサイクラス ゲラチノサス
T-20 SBT 3379 株は微工研に微工研菌寄第１２０１４号
(FERM P-12014)として寄託されている。
・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロ
ジー（1984）からT-20 SBT 3379 株はロドサイクラス(R
hodocyclus) に属する１菌株と同定され、さらにロドサ
イクラス ゲラチノサス(Rhodocyclus gelatinosus) に
類似している。そして、ロドサイクラス ゲラチノサス
T-20 SBT 3379 株は微工研に微工研菌寄第１２０１４号
(FERM P-12014)として寄託されている。
【００１０】本発明においてロドサイクラス ゲラチノ
サスT-20 SBT3379 株から蛋白質改変酵素を得るには次
の方法によって行われる。ロドサイクラス ゲラチノサ
スT-20 SBT 3379 株を窒素源、炭素源その他必要な栄養
成分を含む液体培地で培養する。この菌株は、アミラー
ゼ及びプロテアーゼを菌体外に生産する。蛋白質改変酵
素は菌体内膜画分に存在し、特異的にオルガネラに結合
した蛋白である。この菌体を採取し、破砕し、オクチル
グルコシドを加え蛋白質改変酵素を可溶化し、遠心分離
を行う。オクチルグルコシドは２〜４％の範囲で用い、
これに食塩、グルコース、EDTA等を加えて用いるとよ
い。遠心分離は４５，０００〜６０，０００ rpmで１０
〜１５時間かけて行い、３層に分かれた層の中間層を採
取し、これを透析して不純物を除去する。このオクチル
グルコシドによる可溶化、遠心分離及び透析は数回反覆
して行い、蛋白質改変酵素濃度を高めることが望まし
い。このようにして得られた酵素溶液をクロマトグラフ
処理して酵素を精製する。クロマトグラフ処理は、種々
の方法が用いられるが、ヒドロキシアパタイトカラムを
用いてクロマトグラフ処理を行い、濃度勾配のあるリン
酸緩衝液で溶出することが好ましい。リン酸緩衝液とし
てはpH６．８の０．０１M から０．５M のものを使用
し、溶出される画分の酵素活性を測定し、酵素活性の高
いフラクションを採取するとよい。
サスT-20 SBT3379 株から蛋白質改変酵素を得るには次
の方法によって行われる。ロドサイクラス ゲラチノサ
スT-20 SBT 3379 株を窒素源、炭素源その他必要な栄養
成分を含む液体培地で培養する。この菌株は、アミラー
ゼ及びプロテアーゼを菌体外に生産する。蛋白質改変酵
素は菌体内膜画分に存在し、特異的にオルガネラに結合
した蛋白である。この菌体を採取し、破砕し、オクチル
グルコシドを加え蛋白質改変酵素を可溶化し、遠心分離
を行う。オクチルグルコシドは２〜４％の範囲で用い、
これに食塩、グルコース、EDTA等を加えて用いるとよ
い。遠心分離は４５，０００〜６０，０００ rpmで１０
〜１５時間かけて行い、３層に分かれた層の中間層を採
取し、これを透析して不純物を除去する。このオクチル
グルコシドによる可溶化、遠心分離及び透析は数回反覆
して行い、蛋白質改変酵素濃度を高めることが望まし
い。このようにして得られた酵素溶液をクロマトグラフ
処理して酵素を精製する。クロマトグラフ処理は、種々
の方法が用いられるが、ヒドロキシアパタイトカラムを
用いてクロマトグラフ処理を行い、濃度勾配のあるリン
酸緩衝液で溶出することが好ましい。リン酸緩衝液とし
てはpH６．８の０．０１M から０．５M のものを使用
し、溶出される画分の酵素活性を測定し、酵素活性の高
いフラクションを採取するとよい。
【００１１】本発明の蛋白質改変酵素の理化学的性状を
示すと次のとおりである。 (1) 至適 pH pH１３．５（第２図参照） (2) pH 安定性 pH５．７〜８．０（第３図参照) (3) 基質に対する特異性 (i) 次の基質に対しては基質特異性を示した。カゼイ
ン、リゾチーム、スキムミルク、β−ラクトグロブリ
ン、α−カゼイン、β−カゼイン、大豆蛋白、プロタミ
ン (ii) 次の基質に対しては基質特異性を示さなかった。
ウシ血清アルブミン、ヘモグロビン、サルミンサルフェ
ート、クルペイン (iii) 低分子合成基質として次のペプチジルパラニトロ
アニリド（ｐＮＡ）基質を用い、切断部位近傍のアミノ
酸配列を調べたところ、酵素作用を示さなかった。 ｐＮＡ基質; Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA Suc-Ala-Ala-Ala-pNA Suc-Ala-Pro-Ala-pNA Z-Ala-Ala-Leu-pNA Z-Gly-Gly-Leu-pNA Tos-Gly-Pro-Lys-pNA Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-pNA Bz-Tyr-pNA Leu-pNA 式中、pNA はパラニトロアニリド(p-Nitroanilide)を、
Suc はサクシニル基(Succinyl)を、Z はカルボベンゾキ
シ基(Carbobenzoxy)を、Tos はトシル基(Tosyl) を、Bo
c はターシャルブチルオキシカルボニル基(t-Butyloxyc
arbonyl)を、Bzはベンゾイル基(Benzoyl) を表わす。
示すと次のとおりである。 (1) 至適 pH pH１３．５（第２図参照） (2) pH 安定性 pH５．７〜８．０（第３図参照) (3) 基質に対する特異性 (i) 次の基質に対しては基質特異性を示した。カゼイ
ン、リゾチーム、スキムミルク、β−ラクトグロブリ
ン、α−カゼイン、β−カゼイン、大豆蛋白、プロタミ
ン (ii) 次の基質に対しては基質特異性を示さなかった。
ウシ血清アルブミン、ヘモグロビン、サルミンサルフェ
ート、クルペイン (iii) 低分子合成基質として次のペプチジルパラニトロ
アニリド（ｐＮＡ）基質を用い、切断部位近傍のアミノ
酸配列を調べたところ、酵素作用を示さなかった。 ｐＮＡ基質; Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA Suc-Ala-Ala-Ala-pNA Suc-Ala-Pro-Ala-pNA Z-Ala-Ala-Leu-pNA Z-Gly-Gly-Leu-pNA Tos-Gly-Pro-Lys-pNA Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-pNA Bz-Tyr-pNA Leu-pNA 式中、pNA はパラニトロアニリド(p-Nitroanilide)を、
Suc はサクシニル基(Succinyl)を、Z はカルボベンゾキ
シ基(Carbobenzoxy)を、Tos はトシル基(Tosyl) を、Bo
c はターシャルブチルオキシカルボニル基(t-Butyloxyc
arbonyl)を、Bzはベンゾイル基(Benzoyl) を表わす。
【００１２】(5) 阻害剤の影響 次のプロテアーゼ阻害剤を用いて阻害性を調べたとこ
ろ、阻害性を示さなかった。 阻害剤；アンチパイン, ロイペプチン, ペプスタイン,
キモスタチン, ベスタイン, エチレンジアミンテトラ酢
酸塩，モノヨード酢酸，ヨードアセトアミド，N-エチル
マレイミド，N-ブロモサクシニイミド，ジイソプロピル
フルオロリン，フェニルメタンスルファニルフッ化物，
ジアゾアセチル-DL-ノルロイシンメチルエステル (6) 糖の測定 ネルソン・ソモギー法により測定したところ、糖の反応
は示されなかった。 (7) カゼインは、クマシー染色で染まり難いが、本酵素
反応後染色され易くなる。 (8) グルタミンとアスパラギンよりのアンモニアの測定 グルタミン，アスパラギンを基質に用いて、酵素反応を
行い、ＮＨ3 の生成についてペーパクロマトグラフィー
とNessler の方法で測定したところ、ＮＨ3 の生成は認
められなかった。 (9) 蛋白質アルギニン脱イミノ酵素の測定 基質としてＬ−アルギニン、ベンゾイルアルギニンエチ
ルエステル、プロタミンを用いて活性を測定したが、活
性は認められなかった。 (10)カゼインなどの一部蛋白質は、ＴＣＡでは沈澱しな
くなる。 (11)分子量約６４，０００ (Laemilli法による) 以上の
理化学的性状からみて本発明の酵素は光合成細菌由来と
いう点で新規酵素と判断される。
ろ、阻害性を示さなかった。 阻害剤；アンチパイン, ロイペプチン, ペプスタイン,
キモスタチン, ベスタイン, エチレンジアミンテトラ酢
酸塩，モノヨード酢酸，ヨードアセトアミド，N-エチル
マレイミド，N-ブロモサクシニイミド，ジイソプロピル
フルオロリン，フェニルメタンスルファニルフッ化物，
ジアゾアセチル-DL-ノルロイシンメチルエステル (6) 糖の測定 ネルソン・ソモギー法により測定したところ、糖の反応
は示されなかった。 (7) カゼインは、クマシー染色で染まり難いが、本酵素
反応後染色され易くなる。 (8) グルタミンとアスパラギンよりのアンモニアの測定 グルタミン，アスパラギンを基質に用いて、酵素反応を
行い、ＮＨ3 の生成についてペーパクロマトグラフィー
とNessler の方法で測定したところ、ＮＨ3 の生成は認
められなかった。 (9) 蛋白質アルギニン脱イミノ酵素の測定 基質としてＬ−アルギニン、ベンゾイルアルギニンエチ
ルエステル、プロタミンを用いて活性を測定したが、活
性は認められなかった。 (10)カゼインなどの一部蛋白質は、ＴＣＡでは沈澱しな
くなる。 (11)分子量約６４，０００ (Laemilli法による) 以上の
理化学的性状からみて本発明の酵素は光合成細菌由来と
いう点で新規酵素と判断される。
【００１３】本発明の蛋白質改変酵素は、これを用いて
カゼイン、スキムミルク等の蛋白を改質することができ
る。例えば、カゼイン，スキムミルク等に作用させて酸
で沈澱しない蛋白あるいは凝固しない蛋白を調製するこ
とができ、これを用いてサワータイプの乳飲料を製造で
き、有用である。
カゼイン、スキムミルク等の蛋白を改質することができ
る。例えば、カゼイン，スキムミルク等に作用させて酸
で沈澱しない蛋白あるいは凝固しない蛋白を調製するこ
とができ、これを用いてサワータイプの乳飲料を製造で
き、有用である。
【００１４】次に、本発明の実施例を挙げ、本発明を具
体的に説明する。
体的に説明する。
【実施例】(1) 菌株の採取 ロドサイクラス ゲラチノサスT-20 SBT 3379 株を、Ｇ
５培養液５mlに接種し、３０℃で３日間振盪（１２０ r
pm／min)して前々培養を行った。この培養液を、窒素源
としてポリペプトン０．２５％及び炭素源としてグルコ
ース１％を含んだ培地１００mlに接種し、前々培養と同
じ条件下で前培養を行った。別に、次の培地組成よりな
り、pH７．０に調整した本培養液を調製し、前記前培養
液１０mlをこの本培養液７００mlに接種し、３ｌの坂口
フラスコ中で２日間培養を行った。
５培養液５mlに接種し、３０℃で３日間振盪（１２０ r
pm／min)して前々培養を行った。この培養液を、窒素源
としてポリペプトン０．２５％及び炭素源としてグルコ
ース１％を含んだ培地１００mlに接種し、前々培養と同
じ条件下で前培養を行った。別に、次の培地組成よりな
り、pH７．０に調整した本培養液を調製し、前記前培養
液１０mlをこの本培養液７００mlに接種し、３ｌの坂口
フラスコ中で２日間培養を行った。
【表１】 硫酸マグネシウム・７Ｈ2 Ｏ ０．０２％ 第２燐酸カリ ０．０９ 第１燐酸カリ ０．０６ 酵母エキス ０．２ ポリペプトン ０．２５ グルコース １．０ 得られた培養液を遠心分離 (８０００×ｇ．１０分）
し、生成する沈澱物を粗酵素として使用した。
し、生成する沈澱物を粗酵素として使用した。
【００１６】（２）酵素活性の測定 酵素液（試料）０．５mlを試験管に入れ、３０℃の恒温
槽中に５分間保ち、これに予め３０℃に保った基質（基
質は、０．０５M Na2HPO4 溶液にカゼイン０．６％を加
え加温溶解し、pH７．０に調整したもの）２．５mlを加
え、１０分間酵素反応を行わせた。その後、ＴＣＡ液
（０．１１M トリクロル酢酸、０．２２M 酢酸ナトリウ
ム、０．３３M 酢酸の混液）２．５mlを加えて酵素反応
を停止させた。一方、対照として、試験管に、ＴＣＡ溶
液２．５mlを入れ、続いて基質溶液２．５mlを加え振盪
後放置した。両試験管を３０分放置し、沈澱の生成が完
了した後、２０００rpm 、５分間遠心分離を行って沈澱
物を除去した。この各液１mlを試験管に採取し、０．５
５M Na2CO3 ２．５ml及び１／３に希釈したFolin 試薬
０．５mlを加え、直ちに振盪し、３０℃で３０分間放置
し、分光々度形で６６０nmにおける吸光度を測定し、そ
の測定値から酵素活性を求めた。
槽中に５分間保ち、これに予め３０℃に保った基質（基
質は、０．０５M Na2HPO4 溶液にカゼイン０．６％を加
え加温溶解し、pH７．０に調整したもの）２．５mlを加
え、１０分間酵素反応を行わせた。その後、ＴＣＡ液
（０．１１M トリクロル酢酸、０．２２M 酢酸ナトリウ
ム、０．３３M 酢酸の混液）２．５mlを加えて酵素反応
を停止させた。一方、対照として、試験管に、ＴＣＡ溶
液２．５mlを入れ、続いて基質溶液２．５mlを加え振盪
後放置した。両試験管を３０分放置し、沈澱の生成が完
了した後、２０００rpm 、５分間遠心分離を行って沈澱
物を除去した。この各液１mlを試験管に採取し、０．５
５M Na2CO3 ２．５ml及び１／３に希釈したFolin 試薬
０．５mlを加え、直ちに振盪し、３０℃で３０分間放置
し、分光々度形で６６０nmにおける吸光度を測定し、そ
の測定値から酵素活性を求めた。
【００１７】(3) 酵素の採取及び精製 上記のようにして本培養した培養液１０ｌを遠心分離
（８０００ rpm、１０分）し、生成する菌体を２mM酢酸
カルシウムを含む５０mM Tris-HCl 緩衝液（pH７．０）
で３回洗滌して菌体１１６ｇを得た。この菌体を上記の
緩衝液２００mlに懸濁し、French Pressure で１５００
kg／cm3 で処理し、遠心分離（９０００rpm 、２０分）
した。得られた上清と沈澱物とについて酵素活性を求め
たところ、上清（２５５ml）に酵素活性が認められ、沈
澱には認められなかった。上清の蛋白量は９９５０mg、
酵素量は２７５４unit（酵素液１ml当たり１μg のチロ
シンを遊離するものを１unitとする）、比活性は０．２
９unit／mgであった。
（８０００ rpm、１０分）し、生成する菌体を２mM酢酸
カルシウムを含む５０mM Tris-HCl 緩衝液（pH７．０）
で３回洗滌して菌体１１６ｇを得た。この菌体を上記の
緩衝液２００mlに懸濁し、French Pressure で１５００
kg／cm3 で処理し、遠心分離（９０００rpm 、２０分）
した。得られた上清と沈澱物とについて酵素活性を求め
たところ、上清（２５５ml）に酵素活性が認められ、沈
澱には認められなかった。上清の蛋白量は９９５０mg、
酵素量は２７５４unit（酵素液１ml当たり１μg のチロ
シンを遊離するものを１unitとする）、比活性は０．２
９unit／mgであった。
【００１８】上清を遠心分離（４５，０００rpm 、１２
時間）して３層に分離させた。上層には活性がなく、中
層と下層との活性は１：１であった。この中層を採取
し、前記緩衝液中で一夜透析し、不純物を除去し、透析
された液３２mlを得た。この溶液の蛋白量は７３６mg、
酵素量は１８３０unit、比活性２．５unit／mg、純度
８．６倍で回収率６７％であった。これを、２％（Ｗ／
Ｖ）オクチルグルコシド、６０mM食塩、２０mMグルコー
ス及び４mM EDTA よりなる水溶液中に加えて１８℃で３
０分間放置し、第一次可溶化を行い、遠心分離（６０，
０００rpm、１２時間）を行って３層に分離させた。各
層の酵素活性を測定したところ、上層及び下層には酵素
活性がほとんど見出されず、中層にのみに見出された。
この中層を採取し、前記緩衝液中で透析後不純物を除
き、透析された液９．４mlを得た。この溶液の蛋白量は
１８０mg、酵素量は３２８２unit、比活性１８．４unit
／mg、純度６３．５倍で、回収率１１９％であった。こ
れを４（ｗ／ｖ）％オクチルグルコシド、１．２M 食
塩、２０mMグルコース及び１０mM EDTA よりなる水溶液
９．４mlに加え１８℃で１時間放置して第２次可溶化を
行い、遠心分離(225,000×ｇ、１２時間）した。
時間）して３層に分離させた。上層には活性がなく、中
層と下層との活性は１：１であった。この中層を採取
し、前記緩衝液中で一夜透析し、不純物を除去し、透析
された液３２mlを得た。この溶液の蛋白量は７３６mg、
酵素量は１８３０unit、比活性２．５unit／mg、純度
８．６倍で回収率６７％であった。これを、２％（Ｗ／
Ｖ）オクチルグルコシド、６０mM食塩、２０mMグルコー
ス及び４mM EDTA よりなる水溶液中に加えて１８℃で３
０分間放置し、第一次可溶化を行い、遠心分離（６０，
０００rpm、１２時間）を行って３層に分離させた。各
層の酵素活性を測定したところ、上層及び下層には酵素
活性がほとんど見出されず、中層にのみに見出された。
この中層を採取し、前記緩衝液中で透析後不純物を除
き、透析された液９．４mlを得た。この溶液の蛋白量は
１８０mg、酵素量は３２８２unit、比活性１８．４unit
／mg、純度６３．５倍で、回収率１１９％であった。こ
れを４（ｗ／ｖ）％オクチルグルコシド、１．２M 食
塩、２０mMグルコース及び１０mM EDTA よりなる水溶液
９．４mlに加え１８℃で１時間放置して第２次可溶化を
行い、遠心分離(225,000×ｇ、１２時間）した。
【００１９】得られた上清１７mlと沈澱物とについて酵
素活性を測定したところ、上清のみに酵素活性が認めら
れた。この上清を前記緩衝液で透析した。透析された液
は、蛋白含量５２mg、酵素量１３５５unit、比活性２６
unit／mg、純度８９．７倍で回収率４９％であった。こ
の溶液をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにか
け、０．０１M から０．５M のリン酸緩衝液（pH６．
８）の直接濃度勾配にかけて溶出した。その結果を図１
に示す。
素活性を測定したところ、上清のみに酵素活性が認めら
れた。この上清を前記緩衝液で透析した。透析された液
は、蛋白含量５２mg、酵素量１３５５unit、比活性２６
unit／mg、純度８９．７倍で回収率４９％であった。こ
の溶液をヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにか
け、０．０１M から０．５M のリン酸緩衝液（pH６．
８）の直接濃度勾配にかけて溶出した。その結果を図１
に示す。
【００２０】この結果、フラクション番号２０〜３０に
おいて酵素活性の高い溶出液が得られ、このフラクショ
ンは蛋白量も高くなっていたので、このフラクションは
酵素蛋白を含有するものと判断した。このフラクション
の蛋白量は１２mg、酵素量は８１０unit、比活性は６
７．５unit／mg、純度２３３倍であって回収率は２９％
であった。この酵素液の理化学的性状を測定したところ
前記の理化学的性状と一致した。
おいて酵素活性の高い溶出液が得られ、このフラクショ
ンは蛋白量も高くなっていたので、このフラクションは
酵素蛋白を含有するものと判断した。このフラクション
の蛋白量は１２mg、酵素量は８１０unit、比活性は６
７．５unit／mg、純度２３３倍であって回収率は２９％
であった。この酵素液の理化学的性状を測定したところ
前記の理化学的性状と一致した。
【図１】本発明の酵素をヒドロキシアパタイトクロマト
グラフィにかけ、これを０．０１〜０．５M リン酸緩衝
液（pH６．８）の直線濃度勾配によって溶出したときの
溶出状態を示した図である。
グラフィにかけ、これを０．０１〜０．５M リン酸緩衝
液（pH６．８）の直線濃度勾配によって溶出したときの
溶出状態を示した図である。
【図２】本発明の酵素の活性とpHとの関係を示した図で
ある。
ある。
【図３】酵素の安定性とpHとの関係を示した図である。
Claims (4)
- 【請求項１】 光合成細菌ロドサイクラス ゲラチノサ
ス(Rhodocyclus gelatinosus) から分離され得る次の性
質を示す蛋白質改変酵素。 (1) 作用及び基質特異性：pH７でカゼイン、リゾチー
ム、β−ラクトグロブリンに作用してトリクロロ酢酸
（ＴＣＡ）で沈澱しない画分を生成する。 (2) 至適 pH：１３．２ (3) 安定 pH：３０℃において５．７〜８．０ (4) 阻害剤：プロテアーゼ阻害剤で阻害されない。 (5) 糖の遊離：検出されない（ソモギーネルソン法及び
ペーパークロマトグラフィーによる）。 (6) 分子量：約６４，０００(SDS・PAGE Laemilli 法に
よる） - 【請求項２】 光合成細菌がロドサイクラス ゲラチノ
サス(Rhodocyclusgelatinosus)T-20 SBT 3379 株（微工
研菌寄第１２０１４号）である請求項１記載の蛋白質改
変酵素。 - 【請求項３】 ロドサイクラス ゲラチノサスT-20 SBT
3379 株を培養し、菌体を破砕し、オクチルグリコシド
を加えて遠心し、３層に分かれた中層を透析し、クロマ
トグラフ処理することによって採取することを特徴とす
る請求項１記載の性質をもった蛋白質改変酵素の製造
法。 - 【請求項４】 光合成細菌がロドサイクラス ゲラチノ
サスT-20 SBT3379 株（微工研菌寄第１２０１４号）で
ある請求項３記載の蛋白質改変酵素の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5083091A JP2994476B2 (ja) | 1991-02-22 | 1991-02-22 | 新規蛋白質改変酵素及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5083091A JP2994476B2 (ja) | 1991-02-22 | 1991-02-22 | 新規蛋白質改変酵素及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04267877A JPH04267877A (ja) | 1992-09-24 |
| JP2994476B2 true JP2994476B2 (ja) | 1999-12-27 |
Family
ID=12869683
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5083091A Expired - Lifetime JP2994476B2 (ja) | 1991-02-22 | 1991-02-22 | 新規蛋白質改変酵素及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2994476B2 (ja) |
-
1991
- 1991-02-22 JP JP5083091A patent/JP2994476B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04267877A (ja) | 1992-09-24 |
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