JPH09224660A - アルデヒド脱水素酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｌ−ソルボソンから２−ＫＧＡへの反応を触
媒する酵素を提供すること。 【解決手段】 物理化学的性質：分子量：９１，０００
±５，０００；基質特異性：アルデヒド化合物に活性;
活性阻害物質：Ｃｕ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｎｉ²⁺およびＥＤＴＡ
によって阻害される; 至適pH：６．０〜８．５；至適温
度：２０〜４０℃；そして活性促進物質：Ｃａ²⁺および
ＰＱＱ、を有する新規なアルデヒド脱水素酵素。グルコ
ノバクター属（Gluconobacter)に属する微生物から該酵
素を製造する方法、および該酵素を使用するＬ−ソルボ
ソンから２−ケト−Ｌ−グロン酸を製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なアルデヒド
脱水素酵素（以下ＡＤＨという) 、その製造方法および
そのＡＤＨを利用して、Ｌ−ソルボソンから２−ケト−
Ｌ−グロン酸（以下２−ＫＧＡという）を製造する方法
に関する。２−ＫＧＡは、ビタミンＣの製造のための重
要な中間体である。

【０００２】

【従来の技術】微生物による、Ｌ−ソルボソンの２−Ｋ
ＧＡへの変換反応は公知である。米国特許第３，９０
７，６３９号明細書には、アセトバクター（Acetobacte
r)属、シュードモナス（Pseudomonas)属、エッシェリシ
ア（Escherichia)属、セラチア（Serratia）属、バシラ
ス（Bacillus）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、アエロバクター（Ａｅｒｏｂａ
ｃｔｅｒ）属、アルカリジェネス（Alcaligenes)属、ペ
ニシリウム（Penicillium)属、カンジダ（Candida)属、
およびグルコノバクター（Gluconobacter)属に属する微
生物は、この反応を行い得ることが報告されている。さ
らに北村等は、グルコノバクター メラノゲネス（Gluc
onobacter melanogenes)ＩＦＯ３２９３から見い出した
Ｌ−ソルボソンを酸化する酵素は、その酵素作用を示す
上で、補酵素や電子受容体を必要としないことを報告し
た (Kitamura et al., Eur. J. Appl. Microbiol., 2,
1, 1975)。Makover 等は、シュードモナス プチダ（Ps
eudomonas putida) ＡＴＣＣ２１８１２およびグルコノ
バクター メラノゲネス（Gluconobacter melanogenes)
ＩＦＯ３２９３の顆粒画分中に、Ｌ−ソルボソン脱水素
酵素活性が存在することを報告した（Makover et al.,
Biotechnol. Bioeng., 17, 1,485, 1975）。さらに彼等
は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
Ｄ）、または、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸（ＮＡＤＰ）は、該酵素の補酵素として作用しな
いことを示した。星野等は、ＮＡＤまたはＮＡＤＰの存
在下に、Ｌ−ソルボソンから２−ＫＧＡへの酸化を触媒
する酵素を単離し、その性質を調べた（Hoshino et a
l., Agric. Biol. Chem., 55, 665, 1991)。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、Ｌ−
ソルボソンから２−ＫＧＡへの反応を触媒する酵素を提
供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明においては、グル
コノバクター（Gluconobacter)属に属する微生物を鋭意
研究し、その結果、その微生物からＬ−ソルボソンの２
−ＫＧＡへの酸化を触媒するさらに新規なＡＤＨが得ら
れることを見い出した。さらに、本発明によって提供さ
れたＡＤＨは、２，６−ジクロロフェノールインドフェ
ノール（以下ＤＣＩＰという）、フェナジンメソサルフ
ェイト（以下ＰＭＳという）、フェリシアナイドまたは
チトクロームｃのような電子受容体の存在下で、Ｌ−ソ
ルボソンを２−ＫＧＡに酸化するが、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ
または酸素は、好ましい電子受容体ではないことが見い
出された。このように、本発明のＡＤＨは、既知のＬ−
ソルボソン脱水素酵素とは、明らかに異なっている。

【０００５】本発明の目的の一つは、Ｌ−ソルボソンに
作用して２−ＫＧＡを生産し、かつ、以下に示す物理化
学的性質を有する新規なＡＤＨを提供することにある： ａ）分子量：９１，０００±５，０００（それぞれ４
４，０００±２，０００の分子量を有する二つの相同の
サブユニットから成る） ｂ）基質特異性：アルデヒド化合物に活性 ｃ）活性阻害物質：Ｃｕ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｎｉ²⁺およびＥＤ
ＴＡによって阻害される ｄ）至適pH：６．０〜８．５ ｅ）至適温度：２０〜４０℃ ｆ）活性促進物質：Ｃａ²⁺およびピロロキノリンキノン
（以下ＰＱＱという）。

【０００６】本発明の他の目的は、前記の性質を有する
ＡＤＨを生産する能力を有するグルコノバクター（Gluc
onobacter)属に属する微生物を、好気的条件下、水性栄
養培地中で培養する工程、その微生物の細胞を破壊する
工程、その微生物の破壊した細胞の無細胞抽出液から酵
素を単離および精製する工程を包含する上記新規ＡＤＨ
の製造方法を提供することにある。本発明のさらに他の
目的は、該ＡＤＨを利用してＬ−ソルボソンから２−Ｋ
ＧＡを製造する方法を提供することであり、その製造方
法は、Ｌ−ソルボソンと、（ｉ）電子受容体存在下で、
前記定義されたＡＤＨを接触させるか、または（ii）好
気的条件下、水性栄養培地中、前記定義されたＡＤＨを
生産する能力を有するグルコノバクター（Gluconobacte
r) 属に属する微生物と接触させるか、または(iii) 該
微生物の無細胞抽出液と接触させる工程、そして
（ｉ）、（ii）および(iii) の各場合において、生じた
２−ＫＧＡを反応混合液から単離する工程を包含する。

【０００７】後述する実施例によって調製したＡＤＨの
精製サンプルの物理化学的性質は、以下の通りである。

【０００８】１）酵素活性：本発明の新規なＡＤＨは、
以下に示す反応に従い、電子受容体の存在下に、Ｌ−ソ
ルボソンの２−ＫＧＡへの酸化を触媒する： Ｌ−ソルボソン ＋ 電子受容体 → ２−ＫＧＡ ＋
還元電子受容体

【０００９】前記酵素は、電子受容体としての酸素と作
用しない。これは、可能性のある電子受容体として酸素
を用いた場合、Ｌ−ソルボソンを２−ＫＧＡに変換する
酵素の触媒活性が認められなかった事実による。さら
に、溶存酸素電極によって検知される酸素消費は、反応
混合液中において検出されなかった。しかしながら、電
子受容体として作用する能力を有する従来のどの化合物
も、本発明の酵素と組み合わせて用いることができる。
そのような電子受容体としては、ＤＣＩＰ、ＰＭＳ、フ
ェリシアナイドまたは、チトクロームｃを用いることが
できる。

【００１０】酵素活性の測定は、以下のようにして測定
した。

【００１１】ＡＤＨ活性測定用の基本となる反応混合液
の組成は、最終容量０．５ml中に、０．１mMＤＣＩＰ、
１．０mMＰＭＳ、５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．
０）、２．０mMＬ−ソルボソン、酵素溶液および水から
成り、測定開始直前に調製した。反応は、Ｌ−ソルボソ
ンの添加により、２５℃で始められ、酵素活性は、６０
０nmにおけるＤＣＩＰの初期還元速度として測定した。
酵素活性は、１分間当たり１μmoleのＤＣＩＰを還元す
るのに要する酵素量を１．０単位と定義した。pH７．０
におけるＤＣＩＰの吸光係数は、１４．５mM^-1とした。
対照用セル中には、Ｌ−ソルボソンを除く上記全ての成
分を含んだ。

【００１２】蛋白質濃度は、ＢＣＡ蛋白質測定試薬（Pi
erce, Rockford, IL) を用いて測定した。

【００１３】２）基質特異性：酵素の基質特異性は、Ｌ
−ソルボソンの代わりに各種の基質溶液（１００mM)を
用いた以外には、上述１）に記載した方法と同様の酵素
活性測定法を用いて測定した。様々な基質に対する精製
酵素の基質特異性を調べた（表１参照）。

【００１４】

【表１】

【００１５】グルコノバクター オキシダンス（Glucon
obacter oxydans)ＤＳＭ No.４０２５（FERM BP-3812）
から得られるＡＤＨの相対活性は、Ｌ−ソルボソンに対
する活性に比べて、Ｄ、Ｌ−グリセルアルデヒドとＤ−
グルコース各々に対しては、各々約８倍ならびに、約２
倍高い値を示した。

【００１６】３）至適pH：ＡＤＨの反応速度と、反応液
中のpHとの相関関係を、各種pH緩衝液を用いた以外は
１）に記載したのと同じ酵素活性測定法を用いて測定し
た（表２参照）。

【００１７】

【表２】

【００１８】４）pH安定性：酵素を、０℃で各種緩衝液
中に６日間放置し、その残存活性を上述した１）と同様
の方法で測定した。測定結果を表３に示す。精製酵素
は、pH７．５付近で比較的安定であった。

【００１９】

【表３】

【００２０】５）温度安定性：酵素の温度安定性は、５
０mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．５）中、様々な温度
で５分間処理し、次いで処理した酵素を冷水で急速に冷
却した後試験した。残存活性を上述した１）と同様の方
法で測定した。この酵素は、３５℃まで安定であり、４
０℃および４５℃でインキュベーションした後の活性
は、各々約５０％ならびに６０％失活した（表４、Ａ欄
参照）。

【００２１】

【表４】

【００２２】６）至適温度：酵素活性を、２０℃から４
５℃の温度で測定した。酵素の至適温度は、２５℃であ
った（表４、Ｂ欄参照）。

【００２３】７）ＡＤＨ活性に対する金属イオン、酵素
阻害剤およびＰＱＱの影響：ＡＤＨ活性に対する金属イ
オン、酵素阻害剤およびＰＱＱの影響を、上述した１）
と同様の方法で活性を測定することにより試験した。各
々の化合物溶液を、基本となる反応混合液に溶かし込
み、その反応は、酵素の添加によって開始した（表５お
よび６参照）。

【００２４】

【表５】

【００２５】表５に示すように、酵素反応は、０．０４
mM〜０．２mMのＣａ²⁺の存在により約３倍〜４．５倍強
く促進された。一方、Ｃｕ²⁺、Ｆｅ³⁺、Ｍｇ²⁺、Ｍ
ｏ⁶⁺、Ｔｉ⁴⁺、Ｚｎ²⁺ならびに、Ｎｉ²⁺は酵素活性を阻
害した。

【００２６】

【表６】

【００２７】表６に示すように、エチレンジアミンテト
ラアセテイト（ＥＤＴＡ）は、酵素活性を強く阻害し
た。Ｎ−エチルマレイミド（１．８７mM）や、モノヨー
ド酢酸（１．８７mM）は、各々その活性を２４％ならび
に１３％阻害した。酵素反応は、フッ化ナトリウム
（１．８７mM）、キニン（０．９５mM〜１．８７mM）、
フルオロ酢酸ナトリウム（０．９５mM〜１．８７mM）な
らびに、Ｎａ₂ ＨＡｓＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ（１．８７mM）の
存在下では、５％〜２７％促進された。ＰＱＱを０．０
１mM添加すると、約５０％その活性は促進された。

【００２８】８）反応速度に対する基質濃度の影響：Ｌ
−ソルボソンに対するミハエリス定数（Ｋｍ）を測定す
るために、０．１５mM〜７．５４mMの種々の濃度のＬ−
ソルボソンで酸化反応速度を測定した。みかけのミハエ
リス定数は、電子受容体としてＤＣＩＰを用いた時に、
その反応速度に基づいて得られたラインウエーバー−バ
ークプロット（Lineweaver-Burk plot）から０．８５mM
と算出された。

【００２９】９）分子量：酵素の分子量は、ゲル濾過カ
ラム（Sephacryl S-400 HR）で測定した。この酵素のみ
かけ分子量は、分子量マーカー蛋白質との比較により、
９１，０００±５，０００であると算出された。ＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動では、分子量４４，
０００±２，０００の位置に単一バンドを示した。

【００３０】この事実から、該酵素は、二つの相同のサ
ブユニットから成っていることを示す。

【００３１】１０）精製方法：ＡＤＨの精製は、基本的
に、例えば、硫酸アンモニウムや、ポリエチレングリコ
ール等の沈殿材による分画、イオン交換クロマトグラフ
ィー、吸着クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、塩析や、透析等の既知の精製方
法の組み合わせによって可能である。

【００３２】上述したように、本発明によって提供され
るＡＤＨは、好ましい微生物を、好気的条件下、水性栄
養培地中で培養し、得られた微生物の細胞を破壊し、破
壊した微生物の細胞の無細胞抽出液からＡＤＨを単離
し、精製することにより提供される。

【００３３】本発明によって提供される好ましいＡＤＨ
は、前記の物理化学的性質を有するＡＤＨを産生する能
力を有するグルコノバクター（Gluconobacter)属に属す
る微生物に由来するものである。

【００３４】本発明に供せられる微生物は、前に定義し
たようにＡＤＨを産生することができるグルコノバクタ
ー（Gluconobacter)属に属する微生物である。この微生
物の機能的同等物、継代培養物、突然変異株およびそれ
らの変種も本発明に用いることが可能である。

【００３５】好ましい微生物株は、グルコノバクター
オキシダンス（Gluconobacter oxydans)である。本発明
に供せられる特に好ましい微生物株は、グルコノバクタ
ーオキシダンス（Gluconobacter oxydans)ＤＳＭ４０２
５であり、１９８７年３月１７日にＤＳＭ No.４０２５
としてドイツ ゲッティンゲン（Goettingen）のDeutsc
he Sammlung von Mikroorganismen に寄託されている。
寄託者は中国 北京San-Li-He Rd. 52 のThe Oriental
Scientific Instruments Import and Export Corporati
on for Institute of Microbiology, Academia Sinica
であった。

【００３６】さらに、その継代培養物は、１９９２年３
月３０日にブタペスト条約に基づいて日本の工業技術院
微生物工業研究所（現在：工業技術院生命工学工業技術
研究所）に、グルコノバクター オキシダンス（Glucon
obacter oxydans)ＤＳＭ No.４０２５(FERM BP-3812)と
して寄託されている。寄託者は、日本国 247 神奈川県
鎌倉市梶原字外耕地２００番地の日本ロシュ研究所であ
った。

【００３７】さらに、ヨーロッパ公開特許第０ ２７８
４４７号に、この菌株の性質が開示されている。

【００３８】この微生物は、好気的条件下で、適当な栄
養分を補った水性培地中で培養することができる。培養
は、pH４．０〜９．０の間で、好ましくは、６．０〜
８．０の間で実施できる。培養期間は、pH、温度、さら
に使用する栄養培地によって様々異なるが、好ましく
は、約１〜５日間である。培養を行うのに好ましい温度
範囲は、約１３℃〜約３６℃であり、好ましくは、１８
℃〜３３℃である。

【００３９】微生物は、グルコノバクター オキシダン
ス（Gluconobacter oxydans)ＤＳＭNo.４０２５（FERM
BP-3812）株と同等の性質を有するグルコノバクター
オキシダンス（Gluconobacter oxydans)であってもよ
い。

【００４０】微生物は、グルコノバクター オキシダン
ス（Gluconobacter oxydans)ＤＳＭNo.４０２５（FERM
BP-3812）であるか、その機能的同等物、継代培養物、
突然変異株または変種であることもできる。

【００４１】培地は、微生物が同化しうる炭素源、例え
ば、グリセロール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトー
ル、エリスリトール、リビトール、キシリトール、アラ
ビトール、イノシトール、ズルシトール、Ｄ−リボー
ス、Ｄ−フラクトース、Ｄ−グルコース、あるいはシュ
ークロース、好ましくは、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マン
ニトールおよびグリセロール；ならびに、有機物質のよ
うな消化し得る窒素源、例えば、ペプトン、酵母抽出
物、パン酵母、肉抽出物、カゼイン、尿素、アミノ酸、
そしてコーンステイープリカー等を通常含んでいること
が必要である。硝酸塩や、アンモニウム塩等の種々の無
機物を窒素源として使用してもよい。さらに、通常、培
地は硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、塩化第一およ
び第二鉄や、炭酸カルシウム等の無機塩を含む。

【００４２】以下、培養後の微生物からのＡＤＨの単離
と精製の実施様態について、簡潔に述べる。

【００４３】（１）菌体を遠心分離または濾過によって
培養液から回収する。 （２）その回収した菌体を、水、生理食塩水または適当
なpHの緩衝液で洗浄する。 （３）洗浄した菌体を緩衝液に懸濁し、ホモジェナイザ
ー、超音波粉砕機、フレンチプレスまたはリゾチーム処
理等によって、破砕した菌体の溶液を得る。 （４）ＡＤＨを、破砕した菌体の無細胞抽出液、好まし
くは、微生物のサイトゾル画分から単離、精製する。

【００４４】本発明で提供されるＡＤＨは、アルデヒド
類からカルボン酸類を製造するための触媒として有用で
あり、特に、Ｌ−ソルボースからＬ−ソルボソン経由で
２−ＫＧＡを製造するために有用である。

【００４５】反応は、トリスー塩酸緩衝液、リン酸緩衝
液等の溶液中、ＤＣＩＰ、ＰＭＳ、ウルスターズブル
ー、フェリシアナイド、補酵素Ｑやチトクロームｃ等の
電子受容体の存在下で、約６．０〜約９．０のpH範囲に
おいて行う。

【００４６】反応を行うための好ましい温度範囲は、約
１０℃〜約５０℃である。pHと温度を、各々約７．０〜
８．０ならびに２０℃〜４０℃に設定した時、通常最も
好ましい反応結果が得られる。

【００４７】溶液中のＬ−ソルボソンの濃度は、他の反
応条件によって様々異なるが、一般的には約０．５g/L
〜５０g/L 、最も好ましくは、約１g/L 〜３０g/L であ
る。

【００４８】この反応において、ＡＤＨは適当な担体と
共に固定化状態で使用してもよい。当該分野において一
般に知られているいかなる酵素の固定化方法を用いても
よい。例えば、酵素を１つ以上の官能基を有する樹脂膜
や顆粒体等に直接結合してもよいし、またグルタールア
ルデヒド等の１つ以上の官能基を有する架橋剤を介して
樹脂に結合させてもよい。

【００４９】上述した内容に加え、培養して得られた菌
体そのものもアルデヒド類からカルボン酸類を製造する
ために有用であり、特に、Ｌ−ソルボソンから２−ＫＧ
Ａを製造するために有用である。

【００５０】

【実施例】以下の実施例によって本発明をさらに説明す
る。

【００５１】実施例１：ＡＤＨの調製 特に記載しない限り、ここに記載されている操作は８℃
で実施し、緩衝液としては０．０５M リン酸カリウム緩
衝液（pH７．０）を用いた。

【００５２】（１）グルコノバクター オキシダンス
（Gluconobacter oxydans)ＤＳＭ４０２５ (FERM BP-38
12) の培養 グルコノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxyd
ans)ＤＳＭ４０２５ (FERM BP-3812) を、Ｄ−マンニト
ール５．０％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．２５％、コ
ーンステイープリカー１．７５％、パン酵母５．０％、
尿素０．５％、ＣａＣＯ₃ ０．５％および寒天２．０％
を含む寒天斜面培地上、２７℃で４日間生育させた。寒
天斜面培地に生育した本菌の一白金耳を５００ml容の三
角フラスコ中の、Ｌ−ソルボース８．０％、グリセロー
ル０．０５％、尿素０．５％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ
０．２５％、コーンステイープリカー１．７５％、パン
酵母５．０％、および、ＣａＣＯ₃ １．５％を含む種母
培養培地５０mlに接種し、回転型振盪機（１８０rpm)上
で、３０℃で１日培養した。この培養液を、同様の種母
培養培地１００mlの入った５００ml容の三角フラスコ二
本に、各々１０mlずつ移し、前記したのと同様の方法で
培養した。このようにして調製した種母を用いて、１基
の３リットル容発酵槽中の、Ｌ−ソルボース１０％、グ
リセロール０．０５％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．２
５％、コーンステイープリカー３．０％、パン酵母６．
２５％、および、消泡剤０．１５％を含む培地２L に植
菌した。発酵は、撹拌速度８００rpm 、通気量０．５vv
m （空気の容積／培地の容積／分）、温度３０℃で操作
した。pHは、培養中、水酸化ナトリウムで７．０に維持
した。４０時間培養した後、４基の発酵槽を用いてグル
コノバクター オキシダンス（Gluconobacter oxydans)
ＤＳＭ４０２５ (FERM BP-3812) の菌体を含む培養液８
L を回収した。既に培地中に存在しているパン酵母の上
に存在する少し赤みがかった菌体を、８，０００rpm
（１０，０００×ｇ）で遠心することによりペレット化
し、次いでその上層を注意深く薬サジで取り出し、その
菌体を０．８５％の食塩水で一度洗浄した。その結果、
湿菌体重量として、４６ｇのグルコノバクター オキシ
ダンス（Gluconobacter oxydans)ＤＳＭ４０２５（FERM
BP-3812）を培養液８L から得た。

【００５３】（２）サイトゾル画分の調製 得られたペースト状の菌体（４６ｇ）を緩衝液１３８ml
に懸濁し、フレンチプレス菌体破壊機で処理した。完全
な細胞を遠心分離して除いた後、その無細胞抽出液と称
する上清を１００，０００×ｇで、６０分間遠心分離し
た。得られた上清（１５０ml）を、グルコノバクター
オキシダンス（Gluconobacter oxydans)ＤＳＭ４０２５
（FERM BP-3812）の可溶性画分とした。この画分を緩衝
液中で透析した後、１．４２ユニット／mg−蛋白質の比
活性を持つ画分１００mlを、次の精製工程に供した。

【００５４】（３）ジエチルアミノエチル（以下ＤＥＡ
Ｅと略す）−セルロースカラムクロマトグラフィー 透析物（１００ml）を、緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥ
−セルロースカラム（Whatman DE-52, 3 x 50 cm) にか
け、目的としない蛋白質を除去するために緩衝液で洗浄
した。次に、０．０M から０．８M のＮａＣｌを直線勾
配的に緩衝液に加えた。主な酵素活性は、ＮａＣｌ濃度
０．４５〜０．５５M の範囲で溶出した。次いでこの活
性画分を集め、緩衝液中で透析した。

【００５５】（４）ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロ
マトグラフィー 前記工程で透析して得られた活性画分（５８ml）を、緩
衝液で平衡化させたＤＥＡＥ−セファロースカラム（Ph
armacia, 1.5 x 50 cm) にかけた。０．２M ＮａＣｌを
含む緩衝液でカラムを洗浄した後、０．２M から０．８
M のＮａＣｌを直線勾配的に緩衝液に加えた。酵素活性
は、ＮａＣｌ濃度０．３８〜０．４２Mの範囲で溶出し
た。ＡＤＨ活性に相当する画分を集めた。

【００５６】（５）Ｑ−セファロースカラムクロマトグ
ラフィー 前記工程で集めた活性画分（１５．８ml) を緩衝液中で
透析し、緩衝液で平衡化させたＱ−セファロースカラム
（Pharmacia, 1.0 x 20 cm) にかけた。カラムを緩衝液
で洗浄し、０．０M から０．６M のＮａＣｌを直線勾配
的に緩衝液に加えた。ＡＤＨに相当する活性は、ＮａＣ
ｌ濃度０．３４〜０．３７M の範囲で溶出した。

【００５７】この酵素の精製工程の概要を表７に示す。

【００５８】

【表７】

【００５９】（６）分離した酵素の純度 ９８．２units/mg−蛋白質の比活性をもつ精製酵素
（０．２mg/ml)を、以下に示す分析に用いた。天然のＡ
ＤＨの分子量を、０．３M ＮａＣｌを含む０．１M リン
酸カリウム緩衝液（pH７．０）で平衡化したサイズ排除
ゲルカラム（TSK gel, G3000SWXLカラム、7.8 mm x 30
cm) を用いる高速液体クロマトグラフィーで、波長２５
４nm、流速１．０ml/ 分で測定した。分子量の標準とし
て、シアノコバラミン（１．３５K)、ミオグロビン（１
７K)、卵白アルブミン（４４K)、ガンマーグロブリン
（１５８K)、およびチログロブリン（６７０K)を用い
た。この精製酵素は、単一ピークを示し、分子量は、約
９１，０００±５，０００であることが測定された。

【００６０】ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在
下で、この酵素は、分子量約４４，０００±２，０００
の位置に単一バンドを示した。これらの結果から、精製
されたＡＤＨは、二つの相同のサブユニットから成って
いることが判った。

【００６１】（７）反応生成物の同定 精製酵素（０．０２mg）、Ｌ−ソルボソン（２mg）およ
びＰＭＳ（０．１mg）を０．５mlの緩衝液中に含む反応
液を、３０℃で１．５時間インキュベートした。その結
果、２−ＫＧＡの標準品と比較して、その反応の生成物
は、２−ＫＧＡであることが確かめられた。

【００６２】実施例２：精製酵素による２−ＫＧＡの生
産 この精製ＡＤＨ（０．０４mg、実施例１に従って調製し
たもの) 、Ｌ−ソルボソン（４mg）およびＰＭＳ（０．
２mg）を１．０mlの０．５M リン酸カリウム緩衝液（pH
７．０）に含む反応液を、２５℃で１．０時間ゆっくり
と振盪しながらインキュベーションした。その結果、約
２．３mg/ 時間の速度で２−ＫＧＡが生産された。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の物理化学的性質を有するアルデヒ
   ド脱水素酵素： ａ）分子量：９１，０００±５，０００（それぞれ４
   ４，０００±２，０００の分子量を有する二つの相同の
   サブユニットから成る） ｂ）基質特異性：アルデヒド化合物に活性 ｃ）活性阻害物質：Ｃｕ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｎｉ²⁺およびＥＤ
   ＴＡによって阻害される ｄ）至適pH：６．０〜８．５ ｅ）至適温度：２０〜４０℃ ｆ）活性促進物質：Ｃａ²⁺およびＰＱＱ
2. 【請求項２】 以下の物理化学的性質： ａ）分子量：９１，０００±５，０００（それぞれ４
   ４，０００±２，０００の分子量を有する二つの相同の
   サブユニットから成る） ｂ）基質特異性：アルデヒド化合物に活性ｃ）活性阻害
   物質：Ｃｕ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｎｉ²⁺およびＥＤＴＡによって
   阻害される ｄ）至適pH：６．０〜８．５ ｅ）至適温度：２０〜４０℃ ｆ）活性促進物質：Ｃａ²⁺およびＰＱＱ を有するアルデヒド脱水素酵素の製造法であって、 上記の性質を有するアルデヒド脱水素酵素を生産する能
   力を有するグルコノバクター属（Gluconobacter)に属す
   る微生物を、好気的条件下、水性栄養培地中で培養する
   工程、該微生物の細胞を破壊する工程、該破壊した微生
   物の細胞の無細胞抽出液から該アルデヒド脱水素酵素を
   単離および精製する工程を包含する、製造法。
3. 【請求項３】 Ｌ−ソルボソンから２−ケト−Ｌ−グロ
   ン酸を製造する方法であって、Ｌ−ソルボソンと （ｉ）以下の物理化学的性質： ａ）分子量：９１，０００±５，０００（それぞれ４
   ４，０００±２，０００の分子量を有する二つの相同の
   サブユニットから成る） ｂ）基質特異性：アルデヒド化合物に活性 ｃ）活性阻害物質：Ｃｕ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｎｉ²⁺およびＥＤ
   ＴＡによって阻害される ｄ）至適pH：６．０〜８．５ ｅ）至適温度：２０〜４０℃ ｆ）活性促進物質：Ｃａ²⁺およびＰＱＱ を有するアルデヒド脱水素酵素とを、電子受容体存在下
   に接触させるか、または （ii）好気的条件下、水性栄養培地中、前記（ｉ）に記
   載された性質を有するアルデヒド脱水素酵素を生産する
   能力を有するグルコノバクター（Gluconobacter)に属す
   る微生物と接触させるか、または (iii) 該微生物の無細胞抽出液と接触させる工程、およ
   び生じた２−ケト−Ｌ−グロン酸を反応混合液から単離
   する工程を包含する、方法。