KR100701819B1

KR100701819B1 - 알데하이드 탈수소효소

Info

Publication number: KR100701819B1
Application number: KR1019980051902A
Authority: KR
Inventors: 다쓰오 호시노; 다로 미야자키; 데루히데 스기사와
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 1997-12-01
Filing date: 1998-11-30
Publication date: 2007-06-04
Also published as: CN1225390A; DE69821326T2; EP0922759A2; BR9805685A; US6242233B1; KR19990062648A; EP0922759A3; CN1154719C; US20010026933A1; CA2253023A1; EP0922759B1; US6846660B2; DE69821326D1; JPH11225754A; ES2215263T3; IN187978B; DK0922759T3

Abstract

본 발명은 글루코노박터(Gluconobacter)속에 속하는 미생물로부터 유래된, 분자량이 150,000±6,000 또는 230,000±9,000이고; 기질 특이성이 알데하이드 화합물에 대하여 있고; 보조인자가 피롤로퀴놀린 퀴논 및 헴 c이고; 최적 pH가 7.0 내지 8.5이고; 저해제가 Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, 모노요오도아세테이트 및 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)인 물리화학적 특성을 갖는 신규한 알데하이드 탈수소효소에 관한 것이다. 이 알데하이드 탈수소효소는 호기 조건하의 수성 영양배지중에서 상기 특성을 갖는 알데하이드 탈수소효소를 생산할 수 있는 글루코노박터속의 미생물을 배양하고, 이 미생물의 세포를 분쇄하고, 분쇄된 미생물 세포의 세포-비함유 추출물로부터 알데하이드 탈수소효소를 단리 및 정제함으로써 제조될 수 있다. 2-케토-L-굴론산(2-KGA)은, (i) 전자 수용체의 존재하에 L-소르보존을 알데하이드 탈수소효소와 접촉시키거나, 또는 (ii) 호기 조건하의 수성 영양배지중에서 L-소르보존을 알데하이드 탈수소효소를 생산할 수 있는 글루코노박터속에 속하는 미생물과 접촉시키거나, 또는 (iii) L-소르보존을 상기 미생물의 세포-비함유 추출물과 접촉시키고, 각 경우에서 반응 혼합물로부터 생성된 2-KGA를 단리함으로써 L-소르보존으로부터 제조될 수 있다.

Description

알데하이드 탈수소효소{ALDEHYDE DEHYDROGENASE}

본 발명은 신규한 효소, 즉 알데하이드 탈수소효소(ADH), ADH의 제조방법 및 이 효소를 사용하여 L-소르보존으로부터 2-케토-L-굴론산(2-KGA)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 2-KGA는 비타민 C의 제조에 중요한 중간체이다.

몇몇 미생물이 L-소르보존을 2-KGA로 전환시키는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 3,907,639 호에는 아세토박터(Acetobacter)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 에스케리키아(Escherichia)속, 세라티아(Serratia)속, 바실루스(Bacillus)속, 스타필로코쿠스(Staphylococcus)속, 아에로박터(Aerobacter)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 페니실리움(Penicillium)속, 칸디다(Candida)속 및 글루코노박터(Gluconobacter)속에 속하는 미생물이 전환반응을 수행할 수 있는 것으로 보고되었다. 또한, 기타무라(Kitamura) 등(Eur. J. Appl. Microbiol., 2, 1, 1975)은 글루코노박터 멜라노게누스(Gluconobacter melanogenus) IFO 3293에서 발견된 L-소르보존을 산화시키는 효소는 효소 활성의 진행을 위한 조효소나 전자 수용체를 필요로 하지 않음을 보고하였다. 마코버(Makover) 등(Biotechnol. Bioeng. 17, 1485, 1975)은 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) ATCC 21812 및 글루코노박터 멜라노게누스 IFO 3293의 입상 분획물에 L-소르보존 탈수소효소 활성이 존재함을 보고하였다. 이들은 또한 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD) 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트(NADP)가 효소의 조효소로서 작용하지 않음을 지적하였다. 호시노(T. Hoshino) 등(Agric. Biol. Chem., 55, 665, 1991)은 글루코노박터 멜라노게누스 UV10으로부터 L-소르보존 탈수소효소를 정제 및 특징화하였는데, 이는 조효소로서 NAD 또는 NADP를 필요로 하였다.

본 발명과 관련하여, 글루코노박터속에 속하는 미생물을 더 면밀히 연구하였고, 그 결과 이 미생물로부터 L-소르보존의 2-KGA로의 산화를 촉진하는 신규한 ADH를 얻을 수 있음을 발견하였다. 게다가, 본 발명에 의해 제공된 정제된 ADH는 2,6-디클로로페놀인도페놀(DCIP) 및 페나진 메토설페이트(PMS), 페리시아나이드 또는 사이토크롬 c와 같은 전자 수용체의 존재하에 L-소르보존을 2-KGA로 산화시키고, NAD, NADP 및 산소는 전자 수용체로서 적합하지 않음을 발견하였다. 따라서, 본 발명에 의해 제공된 ADH는 공지의 L-소르보존 탈수소효소와는 분명히 다르다.

본 발명의 목적은 L-소르보존의 2-KGA로의 전환에 작용하고, 하기 a) 내지 e)의 물리화학적 특성을 갖는 신규한 ADH를 제공하는 것이다:

a) 분자량: 150,000±6,000 또는 230,000±9,000(각각 분자량이 약 75,000±3,000인 2개 또는 3개의 동종의 기본단위로 구성됨);

b) 기질 특이성: 알데하이드 화합물에 대하여 활성있음;

c) 보조인자: 피롤로퀴놀린 퀴논(PQQ) 및 헴 c; 및

d) 최적 pH: 7.0 내지 8.5;

e) 저해제: Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, 모노요오도아세테이트 및 에틸렌디아민 테트라아세트산.

본 발명의 또 다른 목적은 호기 조건하의 수성 영양배지중에서 상기 특성들을 갖는 ADH를 생산할 수 있는 글루코노박터속에 속하는 미생물을 배양하고, 이 미생물의 세포를 분쇄하고, 분쇄된 미생물 세포의 세포-비함유 추출물로부터 ADH를 단리 및 정제함으로써 상기 정의한 바와 같은 본 발명의 신규한 ADH를 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 ADH를 이용하여 L-소르보존으로부터 2-KGA를 제조하는 방법을 제공하는 것으로서, 이 방법은 (i) 전자 수용체의 존재하에 L-소르보존을 상기 정의한 바와 같은 ADH와 접촉시키거나, 또는 (ii) 호기 조건하의 수성 영양배지중에서 L-소르보존을 상기 정의한 바와 같은 ADH를 생산할 수 있는 글루코노박터속에 속하는 미생물과 접촉시키거나, 또는 (iii) L-소르보존을 글루코노박터속에 속하는 미생물의 세포-비함유 추출물과 접촉시키고, 상기 (i), (ii) 및 (iii)의 각 경우에서 반응 혼합물로부터 생성된 2-KGA를 단리함을 포함한다.

이후 제시하는 실시예에 따라 제조된 ADH의 정제된 샘플의 물리화학적 특성은 다음과 같다.

1) 효소 활성

본 발명의 ADH는 하기 반응식에 따라 전자 수용체의 존재하에 L-소르보존의 2-KGA로의 산화를 촉진한다:

L-소르보존 + 전자 수용체 → 2-KGA + 환원된 전자 수용체

효소는 전자 수용체로서 산소와는 작용하지 않는다. 이는 가능한 전자 수용체로서 산소를 사용하는 경우 효소가 L-소르보존을 2-KGA로 전환시키지 못하는 것으로부터 확인되었다. 게다가, 용존산소 프로브로 검출하였을 때 반응 혼합물에서 산소 소비가 검출되지 않았다. 그러나, 전자 수용체로서 작용할 수 있는 통상의 화합물이라면 어느 것이나 본 발명의 효소와 함께 사용될 수 있다. DCIP, PMS, 페리시아나이드 및 사이토크롬 c가 바람직한 전자 수용체이다.

다음과 같이 효소 분석을 수행하였다.

ADH 활성을 분석하기 위한 반응 혼합물은 0.1mM DCIP, 1.0mM PMS, 50mM 인산칼륨 완충제(pH 8.0), 1.0μM PQQ, 2.0mM L-소르보존 및 효소 용액으로 구성되었고(물을 사용하여 최종 체적을 100㎕로 만듦), 이 반응 혼합물은 분석 직전에 제조하였다. 반응은 L-소르보존을 가지고 25℃에서 시작하였고, 효소 활성은 600nm에서 DCIP의 초기 환원속도로서 측정하였다. 1유니트의 효소 활성은 1분당 1μM의 DCIP의 환원을 촉진하는 효소의 양으로서 정의된다. pH 8.0에서의 DCIP의 소멸계수는 15mM^-1이었다. 대조 큐베트(cuvette)에는 L-소르보존을 제외한 상기 모든 성분들이 함유되어 있었다.

단백질 농도는 BCA 단백질 분석 시약(미국 일리노이주 61105 락포드 소재의 피어스 캄파니(Pierce Co.))으로 측정하였다.

2) 기질 특이성

효소의 기질 특이성은, L-소르보존 대신에 각종 기질 용액(100mM)을 사용한 것 이외는, 상기 1)에서 기술한 것과 동일한 효소 분석 방법을 사용하여 결정하였다. D-글루코존, D-글로코즈, D-갈락토즈, D-만노즈, L-글루코즈, D-크실로즈, D-리보즈 및 D-아라비노즈에 대한 ADH의 상대 활성은 L-소르보존에 대한 상대 활성보다 높았다. 그러나, D,L-글리세르알데하이드에 대한 상대 활성은 L-소르보존에 대한 상대 활성의 1% 미만이었다. 이들 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

3) 최적 pH

ADH의 반응속도와 반응 혼합물의 pH 값의 관계는, 다양한 pH와 완충제를 사용한 것 이외는 상기 1)에 기술된 바와 동일한 분석 방법에 의해 결정되었다.

효소는 도 1에 도시된 바와 같이 pH 7.0 내지 8.5에서 상대적으로 높은 활성을 나타내었다.

4) 열안정성

효소의 열안정성은 다양한 온도의 50mM 인산칼륨 완충제(pH 7.0) 중에서 5분동안 효소를 배양함으로써 시험하였다. 잔여 활성은 상기 1)에서 기술한 것과 동일한 효소 분석 방법에 의해 측정하고, 그 후 처리된 효소는 얼음물에서 즉시 냉각시켰다. 효소는 45℃까지는 안정하였으나, 80℃에서 처리한 후에는 활성의 약 30%만이 남았다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

표 2에서, 상대 활성은 0℃에서의 활성의 백분율로서 표현된다.

5) 금속 이온 및 저해제의 영향

효소의 활성에 대한 금속 이온 및 저해제의 영향은 상기 1)에서 전술한 바와 동일한 분석 방법을 사용하여 활성을 측정함으로써 검사하였다. 각 화합물 용액을 기본 반응 혼합물중에 교반해 넣고, 효소를 첨가하면서 반응을 시작하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

각 화합물을 반응 혼합물에 1.0mM의 농도로 첨가하였다(단, EDTA의 농도는 5.0mM이었다).

표 3에 나타난 바와 같이, 효소 활성은 1.0mM의 Ca²⁺의 존재하에 약 2배 촉진되었으며, Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Ni²⁺ 및 Zn²⁺은 효소 활성을 저해하였다. 5mM의 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)을 첨가하면 활성이 매우 저해되었다. 그러나, 1.0mM의 퀴닌 및 1.0mM의 KCN을 첨가하면, 효소 활성은 각각 124% 및 129%로 약간 증가되었다.

6) 분자량

크기 배제 겔 칼럼(TSK-겔 G3000 SWXL; 일본 도쿄도 미나토쿠 아카사카 1-7-7 소재의 도쇼 캄파니(Tosoh Co.) 제품)을 사용하여 효소의 분자량을 측정하였다. 효소는 크로마토그래피에서 150,000±6,000 및 230,000±9,000의 겉보기 분자량에 해당하는 두 피크를 나타내었다. SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 효소를 분석한 결과, 효소는 분자량 75,000±3,000의 동종의 기본단위로 구성된 것으로 나타났다(도 2 참조). 이로써 효소가 2개 또는 3개의 동종의 기본단위로 구성됨을 알 수 있다.

7) 배합단(prosthetic group)

정제된 효소는 PQQ가 없는 기본 반응 혼합물에서는 L-소르보존을 2-KGA로 전환시키는 촉진 활성을 나타내지 않았다. 그러나, 효소의 활성은 반응 혼합물에 PQQ를 첨가하거나, 효소를 PQQ 및 Ca²⁺와 함께 5분간 배양하면 회복되었다.

정제된 효소의 헴 c의 검출은 UV-VIS 기록 분광광도계(시마즈(Shimadzu) UV-2200; 일본 교토켕 주쿄쿠 니시노쿄 구와하라초 1 소재의 시마즈 캄파니(Shimadzu Co.) 제품)에 의해 얻은 환원-산화 시차 스펙트럼에 의해 수행하였다. 효소를 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)에 50㎍/㎖의 농도로 현탁시키고, 디티오나이트 환원된 형태 및 암모늄 퍼설페이트 산화된 형태의 효소를 제조하여 시차 스펙트럼을 측정하였다. 스펙트럼은 도 3에 도시된 바와 같이 552nm 및 523nm에서 최대 시차를 나타내었다. 이 결과는 효소가 배합단으로서 헴 c를 가짐을 강력하게 시사한다.

8) 기질 농도의 영향

1mM 내지 8mM의 여러 농도의 L-소르보존과의 산화 반응의 속도를 측정하여 L-소르보존에 대한 K_m 값을 결정하였다. DCIP가 반응의 전자 수용체로서 사용된 경우의 반응 속도를 기본으로 하여 라인위버-버크(Lineweaver-Burk) 그래프로부터 미카엘리스(Michaelis) 상수는 17.8mM로 계산되었다.

9) 정제 과정

효소의 정제는 이온교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 염석 및 투석과 같은 공지의 정제방법의 조합에 의해 수행된다.

본 발명에 의해 제공된 효소는 호기 조건하의 수성 영양배지중에서 적당한 미생물을 배양하고, 이 미생물의 세포를 분쇄하고, 분쇄된 미생물 세포의 세포-비함유 추출물로부터 알데하이드 탈수소효소를 단리 및 정제함으로써 제조하였다.

본 발명에 사용된 미생물은 상기 정의한 바와 같은 알데하이드 탈수소효소를 생산할 수 있는 글루코노박터속에 속하는 미생물이다. 이 미생물의 기능적 등가균, 계대배양균, 돌연변이균 및 변이균도 본 발명에 사용될 수 있다.

바람직한 균주는 글루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans)이다. 본 발명에 가장 바람직하게 사용된 균주는 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025번으로서, 부다페스트 조약의 규정에 의거하여 1987년 3월 17일자로 독일 괴팅겐 소재의 도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니스멘에 수탁번호 DSM 4025번으로 기탁되었다. 기탁자는 인스티튜트 오브 마이크로바이올로지, 아카데미아 시니카(Institute of Microbiology, Academia Sinica)를 대신하여 중국 베이징 산-리-헤가 52 소재의 더 오리엔탈 사이언티픽 인스트루먼츠 임포트 앤드 익스포트 코포레이션(The Oriental Scientific Instruments Import and Export Corporation)이었다. 사실상의 기탁자는 인스티튜트 오브 마이크로바이올로지, 아카데미아 시니카로서, 주소는 중국 베이징 100080 존구안쿤 하이디안 소재의 더 인스티튜트 오브 마이크로바이올로지, 아카데미 오브 사이언시스 오브 챠이나(The Institute of Microbiology, Academy of Sciences of China)이다.

게다가, 이 균주의 계대배양균도 또한 부다페스트 조약의 규정에 의거하여 1992년 3월 30일자로 일본 통상산업성공업기술원 미생물공업기술연구소에 수탁번호 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025번(FERM BP-3812번)으로 기탁되었다. 기탁자는 일본 가나가와켕 247 가마쿠라시 가지와라 아자 소토코치 200 소재의 닛폰 롯슈 겡큐쇼(Nippon Roche Research Center)였다. 이러한 계대배양균도 또한 본 발명에 가장 바람직하게 사용된다.

또한, 유럽 특허 공개공보 제 0 278 447 호에는 이 균주의 특징이 개시되어 있다.

상기 미생물은 호기 조건하에 적당한 영양분이 첨가된 수성 배지중에서 배양될 수 있다. 배양은 pH 4.0 내지 9.0, 바람직하게는 6.0 내지 8.0에서 실행될 수 있다. 배양기간은 pH, 온도 및 사용된 영양배지에 따라 달라지며, 바람직하게는 약 1 내지 5일이다. 배양의 실행에 바람직한 온도 범위는 약 13℃ 내지 약 36℃, 바람직하게는 18℃ 내지 33℃이다.

일반적으로 배양배지는 동화할 수 있는 탄소원(예를 들어, 글리세롤, D-만니톨, D-소르비톨, D-에리트리톨, 리비톨, 크실리톨, 아라비톨, 이노시톨, 둘시톨, D-리보즈, D-프럭토즈, D-글루코즈 및 슈크로즈, 바람직하게는 D-소르비톨, D-만니톨 및 글리세롤); 및 분해될 수 있는 질소원(예를 들어, 펩톤, 효모 추출물, 베이커 효모, 우레아, 아미노산 및 옥수수 침지액과 같은 유기 물질)과 같은 영양분을 함유하여야 한다. 질산염 및 암모늄염과 같은 각종 무기 물질도 질소원으로서 사용될 수 있다. 게다가, 배양배지는 일반적으로, 황산마그네슘, 인산칼륨 및 탄산칼슘과 같은 무기 염을 함유한다.

배양 후 미생물로부터 ADH를 단리 및 정제하는 실시양태를 간단히 기술하자면 다음과 같다:

(1) 액체 배양액으로부터 원심분리 또는 여과에 의해 세포를 수획한다.

(2) 수획된 세포를 물, 생리 식염수 또는 적당한 pH를 갖는 완충액으로 세척한다.

(3) 세척된 세포를 완충액에 현탁시키고, 균질화기, 소니케이터(sonicator) 또는 프렌치 프레스(French press)에 의해 분쇄하거나 또는 라이소자임(lysozyme) 등에 의한 처리로 분쇄하여 분쇄된 세포액을 얻는다.

(4) 분쇄된 세포의 세포-비함유 추출물로부터, 바람직하게는 미생물의 사이토졸 분획물로부터 ADH를 단리 및 정제한다.

본 발명에 의해 제공되는 ADH는 L-소르보존으로부터 2-KGA의 제조를 위한 촉매로서 유용하다. 반응은 인산염 완충액, 트리스-완충액 등과 같은 용매중에서 전자 수용체, 예를 들어 DCIP, PMS 등의 존재하에 약 6.5 내지 약 9.0의 pH에서 수행되어야 한다. pH 및 온도가 각각 약 7.5 내지 8.5 및 약 25℃로 설정될 때, 반응은 보통 최상의 결과를 가져온다.

용매중의 L-소르보존의 농도는 다른 반응 조건에 따라 달라질 수도 있지만, 일반적으로 약 0.5 내지 50g/ℓ, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 30g/ℓ이다.

반응에서, ADH는 적당한 담체에 고정화된 상태로 사용될 수도 있다. 당업계에 일반적으로 공지된 임의의 효소 고정화 수단이 사용될 수 있다. 예를 들어, 효소는 하나 이상의 작용기를 갖는 수지의 막, 과립 등에 직접 결합될 수 있거나, 하나 이상의 작용기(예를 들어, 글루타르알데하이드)를 갖는 가교 화합물에 의해 수지에 결합될 수도 있다.

상기 외에, 배양된 세포도 또한 알데하이드로부터 카복실산을 생성하는데, 특히 L-소르보존으로부터 2-KGA를 생성하는데 유용하다.

이하의 실시예는 본 발명을 더 예시한다.

실시예

ADH의 제조

모든 공정은 8℃에서 수행하였고, 달리 기술하지 않는 한 완충액은 0.05M 인산칼륨(pH 7.0)이었다.

(1) 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025번(FERM BP-3812번)의 배양

5.0%의 D-만니톨, 0.25%의 MgSO₄·7H₂O, 1.75%의 옥수수 침지액, 5.0%의 베이커 효모, 0.5%의 우레아, 0.5%의 CaCO₃ 및 2.0%의 아가(agar)를 함유하는 아가 플레이트에서 27℃에서 4일동안 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025번(FERM BP-3812번)을 증식시켰다. 500㎖들이 얼렌메이어 플라스크(Erlenmeyer flask)중에 2%의 L-소르보즈, 0.2%의 효모 추출물, 0.05%의 글리세롤, 0.25%의 MgSO₄·7H₂O, 1.75%의 옥수수 침지액, 0.5%의 우레아 및 1.5%의 CaCO₃을 함유하는 종배양 배지 50㎖에 한 백금이의 세포를 접종하고, 180rpm의 회전식 진탕배양기에서 1일동안 30℃에서 배양하였다. 이 배양물의 10㎖의 배양물을 100㎖의 상기 종배양 배지를 함유하는 500㎖들이 얼렌메이어 플라스크에 옮기고, 전술한 바와 같은 방식으로 배양하였다. 이렇게 준비한 종배양물을, 30ℓ들이 자(jar) 발효기중에 8.0%의 L-소르보즈, 0.05%의 글리세롤, 0.25%의 MgSO₄·7H₂O, 3.0%의 옥수수 침지액, 0.4%의 효모 추출물 및 0.15%의 소포제를 함유하는 15ℓ의 배지에 접종하는데 사용하였다. 발효 변수들은 교반속도 800rpm, 통기량 0.5vvm(공기 체적/배지 체적/분) 및 온도 30℃였다. pH는 발효하는 동안 수산화나트륨에 의해 7.0으로 유지되었다. 배양한지 48시간 후에, 2조의 발효기를 사용하여 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025번(FERM BP-3812번)의 세포를 함유하는 배양액 30ℓ를 연속 원심분리에 의해 수획하였다. 세포를 함유하는 펠렛(pellet)을 회수하여 적당한 체적의 식염수에 현탁시켰다. 현탁액을 2,500rpm(1,000×g)에서 원심분리한 후, 약간 붉은 색의 세포를 함유하는 상청액을 회수하여 배지의 성분들이었던 옥수수 침지액 및 효모 추출물로부터 유래된 불용성 물질을 제거하였다. 그 다음, 상청액을 8,000rpm(10,000×g)에서 원심분리하여 세포 펠렛을 얻었다. 그 결과, 30ℓ의 배양액으로부터 습윤중량 123g의 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025번(FERM BP-3812번)을 얻었다.

(2) 사이토졸 분획물의 제조

세포 페이스트(paste)(55g)를 100㎖의 완충액에 현탁시키고, 프렌치 압력 세포 프레스에 통과시켰다. 손상되지 않은 세포를 원심분리에 의해 제거한 후, 상청액을 세포-비함유 추출물로 지칭하였고, 이 세포-비함유 추출물을 100,000×g에서 90분동안 원심분리하였다. 생성된 상청액(165㎖)을 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025번(FERM BP-3812번)의 가용성 분획물로서 지칭하였다. 이 분획물을 완충액에 대하여 투석한 후, L-소르보존에 대한 비활성(specific activity)이 2.26유니트/㎎단백질인 126㎖의 투석된 분획물을 다음 정제 단계에 사용하였다.

(3) 디에틸아미노에틸(DEAE)-셀룰로즈 칼럼 크로마토그래피

완충액으로 평형화시키고 완충액으로 세척하여 미량의 단백질을 용출시킨 DEAE-셀룰로즈 칼럼(와트만(Whatman) DE-52, 3×50cm; 와트만 바이오시스템즈 리미티드(Whatmann BioSystems Ltd., 영국 켄트주 마이드스톤 제임스 와트만 웨이 소재)에 투석물(126㎖)을 넣었다. 그 다음, 완충액에 0.3 내지 0.8M의 NaCl로 선형 구배 용출을 행하였다. 주된 효소 활성은 0.32 내지 0.36M의 NaCl 농도에서 용출되었다. 활성 분획물(116㎖)을 모아 완충액에 대하여 투석하였다.

(4) DEAE-세파로즈 칼럼 크로마토그래피

선행 단계로부터 얻은 투석된 활성 분획물중 60㎖ 분량을 완충액으로 평형화시킨 DEAE-세파로즈 CL-6B 칼럼(파마시아(Pharmacia), 1.5×50cm; 스웨덴 에스-75184 웁살라 소재의 아머샴 파마시아 바이오테크 아베(Amersham Pharmacia Biotech AB) 제품)에 도입하였다. 칼럼을 0.2M NaCl을 함유하는 완충액으로 세척한 후, 완충액에 0.2 내지 0.6M의 NaCl의 선형 구배를 가하였다. 활성 분획물을 0.44 내지 0.47M의 NaCl 농도에서 용출하였다.

(5) Q-세파로즈 칼럼 크로마토그래피

선행 단계에서 모아진 활성 분획물(53㎖)중 일정 분량(13.5㎖)에 적당한 체적의 완충액을 가하여 NaCl의 농도를 감소시키고, 이를 완충액으로 평형화시킨 Q-세파로즈 칼럼(파마시아, 1.0×20cm)에 도입하였다. 칼럼을 0.35M의 NaCl을 함유하는 완충액으로 세척한 후, 완충액에 0.35 내지 0.5M의 NaCl의 선형 구배를 가하였다. ADH에 해당하는 활성을 0.39 내지 0.40M의 NaCl 농도에서 용출하였다. 활성 분획을 모아(30㎖) 한외여과기(센트리프레프-10(Centriprep-10), 아미콘(Amicon); 미국 매사츄세츠주 01915 비벌리 체리 힐 드라이브 소재의 아미콘 인코포레이티드(Amicon Inc.) 제품)에 의해 한외여과하였다. 그 결과, 700㎕의 농축된 활성 분획물을 얻었다.

(6) 천연 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(천연 PAGE)

선행 단계에서 얻은 효소 분획물중 600㎕ 분량을 천연 폴리아크릴아미드 겔(10%, pH 9.4, 10×10cm)에 걸었다. 전기영동은 4℃에서 1.5시간동안 30mA에서 수행하였다. 활성 분획물에 해당하는 효소 밴드를 겔로부터 잘라내고, 4℃에서 3시간동안 10W에서 맥스-일드(MAX-YIELD) 단백질 농축기(일본 도쿄도 붕쿄쿠 홍고 1-25-23 소재의 아토 캄파니(Atto Co.) 제품)를 사용하여 겔로부터 효소를 트리스 글리신 완충액(pH 8.3)으로 전기 용출시켰다. 효소 용액을 울트라멤브레인(ultra membrane) 여과기(센트리콘-10(Centricon-10), 아미콘 제품)를 사용하여 4배 농축시키고, 완충액을 50mM 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 바꿨다. 그 다음, 효소 용액을 -30℃에서 보관하였다.

효소 정제 단계를 요약하자면 하기 표 4와 같다.

(7) 단리된 효소의 순도

비활성이 54.0단위/㎎단백질인 정제된 효소(0.62㎎/㎖)를 다음의 분석에 사용하였다.

0.3M NaCl을 함유하는 0.1M 인산칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨 크기 배제 겔 칼럼(TSK 겔 G3000 SWXL 칼럼, 7.8×300mm)을 280nm에서 사용하고, 유속이 1분당 1.5㎖인 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 천연 효소의 분자량을 결정하였다. 분자량 표준물질로서 시아노코발라민(1.35K), 미오글로빈(17K), 오발부민(44K), γ-글로불린(158K) 및 티로글로불린(670K)을 사용하였다. 정제된 효소는 분자량 150,000±6,000 및 230,000±9,000의 두 피크를 나타내었다.

그러나, 소디움 도데실 설페이트(SDS)의 존재하에서, 효소는 분자량 75,000±3,000을 갖는 단일 밴드를 나타내었다. 이러한 결과로부터, 정제된 효소는 2개 또는 3개의 동종의 기본단위로 구성되었음을 알 수 있다.

(8) 반응 생성물의 동정

40㎖의 완충액중에 정제된 효소(1.56㎎), L-소르보존(0.142㎎), PMS(0.008㎎) 및 PQQ(0.3㎎)를 함유하는 반응 혼합물을 30℃에서 1.5시간동안 배양하였다. 반응 생성물을 박층 크로마토그래피 및 HPLC에 의해 분석하였다. 그 결과, 반응 생성물은 2-KGA의 기준 샘플과 비교하였을 때 2-KGA로 확인되었다.

본 발명에 의하면, 글루코노박터속에 속하는 미생물로부터 L-소르보존의 2-KGA로의 산화를 촉진하는 신규한 알데하이드 탈수소효소를 생산할 수 있다.

도 1은 정제된 알데하이드 탈수소효소(ADH) 활성에 대한 pH의 영향을 도시하는 도면이다.

도 2는 정제된 ADH 효소의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분석 결과를 도시하는 도면이다.

도 3은 정제된 ADH 효소의 환원-산화 시차 스펙트럼(reduced minus oxidized difference spectrum)을 도시하는 도면이다.

Claims

전자 수용체의 존재하에 하기 a) 내지 e)의 물리화학적 특성을 갖는 알데하이드 탈수소효소와 L-소르보존을 접촉시키고, 이의 반응 혼합물로부터 생성된 2-케토-L-굴론산을 단리함을 포함하는, L-소르보존으로부터 2-케토-L-굴론산을 제조하는 방법으로서,

이때 알데하이드 탈수소효소가 알데하이드 탈수소효소를 생산할 수 있는 미생물인 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025번의 동정 특성을 갖는 글루코노박터 옥시단스로부터 유래되고; 상기 미생물을 호기 조건하의 수성 영양배지중에서 배양하고, 미생물의 세포를 분쇄하고, 분쇄된 미생물 세포의 세포-비함유 추출물로부터 알데하이드 탈수소효소를 단리 및 정제하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되는 방법:

a) 분자량은 150,000±6,000 또는 230,000±9,000(각각 분자량이 75,000±3,000인 2개 또는 3개의 동종의 기본단위로 구성됨)임;

b) 기질 특이성은 알데하이드 화합물에 대하여 있음;

c) 보조인자는 피롤로퀴놀린 퀴논 및 헴 c임;

d) 최적 pH는 7.0 내지 8.5임; 및

e) 저해제는 Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, 모노요오도아세테이트 및 에틸렌디아민 테트라아세트산임.
호기 조건하의 수성 영양배지중에서 배양된, 하기 a) 내지 e)의 물리화학적 특성을 갖는 알데하이드 탈수소효소를 생산할 수 있는 미생물인 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025번의 동정 특성을 갖는 글루코노박터 옥시단스 또는 그의 세포-비함유 추출물과 L-소르보존을 접촉시키고, 이의 반응 혼합물로부터 생성된 2-케토-L-굴론산을 단리함을 포함하는, L-소르보존으로부터 2-케토-L-굴론산을 제조하는 방법으로서,

이때 알데하이드 탈수소효소가 상기 미생물로부터 유래되고; 상기 미생물을 호기 조건하의 수성 영양배지중에서 배양하고, 미생물의 세포를 분쇄하고, 분쇄된 미생물 세포의 세포-비함유 추출물로부터 알데하이드 탈수소효소를 단리 및 정제하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조되는 방법:

a) 분자량은 150,000±6,000 또는 230,000±9,000(각각 분자량이 75,000±3,000인 2개 또는 3개의 동종의 기본단위로 구성됨)임;

b) 기질 특이성은 알데하이드 화합물에 대하여 있음;

c) 보조인자는 피롤로퀴놀린 퀴논 및 헴 c임;

d) 최적 pH는 7.0 내지 8.5임; 및

e) 저해제는 Co²⁺, Cu²⁺, Fe²⁺, Ni²⁺, Zn²⁺, 모노요오도아세테이트 및 에틸렌디아민 테트라아세트산임.
제 1 항에 있어서,

미생물이 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025번 또는 그의 계대배양균(FERM BP-3812)인 방법.
제 2 항에 있어서,

미생물이 글루코노박터 옥시단스 DSM 4025번 또는 그의 계대배양균(FERM BP-3812)인 방법.