ES2215263T3

ES2215263T3 - Aldehido deshidrogenasa.

Info

Publication number: ES2215263T3
Application number: ES98122223T
Authority: ES
Inventors: Tatsuo Hoshino; Taro Miyazaki; Teruhide Sugisawa
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1997-12-01
Filing date: 1998-11-23
Publication date: 2004-10-01
Anticipated expiration: 2018-11-23
Also published as: DE69821326D1; CN1225390A; EP0922759A3; KR100701819B1; US6846660B2; JPH11225754A; EP0922759B1; BR9805685A; DE69821326T2; US20010026933A1; CA2253023A1; KR19990062648A; CN1154719C; IN187978B; DK0922759T3; US6242233B1; EP0922759A2

Abstract

UNA NUEVA ALDEHIDO - DESHIDROGENASA QUE TIENE LAS PROPIEDADES FISICO - QUIMICAS SIGUIENTES: PESO MOLECULAR: 150.000 (MAS MENOS) 6.000 O 230.000 (MAS MENOS) 9.000; ESPECIFICIDAD DEL SUBSTRATO: ACTIVO SOBRE COMPUESTOS DE ALDEHIDO; COFACTORES: PIRROLOQUINOLIN - QUINONA Y HEME - C; PH OPTIMO: 7,0 - 8,5; E INHIBIDORES CO 2+ , CU 2+ , FE 2+ , NI 2+ , ZN SU P,2+ , MONOYODOACETATO Y EDTA, QUE SE DERIVA DE UN MICROORGANISMO PERTENECIENTE AL GENERO GLUCONOBACTER. ESTA ALDEHIDO - DESHIDROGENASA PUEDE PRODUCIRSE POR CULTIVO DE UN MICROORGANISMO DEL GENERO GLUCONOBACTER, CAPAZ DE PRODUCIR UNA ALDEHIDO - DESHIDROGENASA QUE TIENE LAS MENCIONADAS PROPIEDADES, EN UN MEDIO NUTRIENTE ACUOSO Y EN CONDICIONES AEROBICAS, ALTERANDOSE LAS CELULAS DEL MICROORGANISMO Y AISLANDOSE Y PURIFICANDOSE LA ALDEHIDO DESHIDROGENASA DEL EXTRACTO DE CELULAS LIBRES DE LAS CELULAS ALTERADAS DEL MICROORGANISMO. EL ACIDO 2 - CETO - L - GULONICO (2 - KGA) PUEDE PRODUCIRSE A PARTIR DE LA L - SORBOSONA PONIENDO LA L - SORBOSONA EN CONTACTO CON (I) LA ALDEHIDO DESHIDROGENASA EN PRESENCIA DE UN ACEPTOR DE ELECTRONES, (II) UN MICROORGANISMO GLUCONOBACTER CAPAZ DE PRODUCIR LA ALDEHIDO DESHIDROGENASA EN MEDIO ACUOSO EN CONDICIONES AEROBICAS O (III) UN EXTRACTO SIN CELULAS DE DICHO MICROORGANISMO Y, EN CADA CASO, AISLANDO EL 2 -KGA RESULTANTE DE LA MEZCLA DE REACCION.

Description

Aldehido deshidrogenasa.

La presente invención se refiere a una nueva enzima, a saber, la aldehido deshidrogenasa (ADH), a un procedimiento para producir la ADH y un procedimiento para producir el ácido 2-ceto-L-gulónico (2-KGA) a partir de la L-sorbosona empleando dicha enzima. El 2-KGA es un producto intermedio importante para la producción de la vitamina C.

Se conocen algunos microorganismos que convierten la L-sorbosona en 2-KGA. Por ejemplo en la especificación de la patente U.S. nº 3907639, se informa que los microorganismos pertenecientes a los géneros Acetobacter, Pseudomonas, Escherichia, Serratia, Bacillus, Staphylococcus, Aerobacter, Alcaligenes, Penicillium, Candida y Gluconobacter, son capaces de efectuar la conversión. Además, Kitamura y col., (Eur. J. Appl. Microbiol., 2,1, 1975) informan que la enzima que oxida la L-sorbosona descubierta en el Gluconobacter melanogenus IFO 3293 no necesita ninguna coenzima ni ningún receptor de electrones para el desarrollo de la actividad de la enzima. Makover y col., (Biotechnol. Bioeng. 17, 1485, 1975) informan la presencia de actividad L-sorbosona deshidrogenasa en la fracción disgregada del Pseudomonas putida ATCC 21812 y del Gluconobacter melanogenus IFO 3293. También indican que ni el dinucleótido nicotinamida adenina (NAD) ni el fosfato dinucleótido nicotinamida adenina (NADP) actúa como una coenzima para la enzima. T. Hoshino y col., (Agric. Biol.. Chem., 55, 665, 1991) purificada y caracterizada L-sorbosona deshidrogenasa a partir del Gluconobacter melanogenus UV10, el cual requiere NAD ó NADP como coenzima.

Las solicitudes de Patente Europea EP 0606621 y EP 0790301 describen dos enzimas ADM a partir del Gluconobacter oxydans DSM nº 4025 cuyas propiedades físico-químicas difieren de las de la enzima ADH proporcionada en la presente solicitud.

En el contexto de la presente invención, los microorganismos pertenecientes al género Gluconobacter han sido estudiados más a fondo, y como resultado se ha descubierto que el nuevo ADH que cataliza la oxidación del L-sorbosona en 2-KGA puede obtenerse a partir de dichos microorganismos. Además, se ha descubierto que el ADH purificado proporcionado por la presente invención oxida la L-sorbosona en 2-KGA en presencia de receptores de electrones, tales como el 2,6-diclorofenol-indofenol (DCIP) y metosulfato de fenazina (PMS), ferricianuro o citocromo c, pero que NAD, NADP y oxígeno no son adecuados como aceptores de electrones. Así, la ADH proporcionado por la presente invención es claramente distinto de la ya conocida L-sorbosona deshidrogenasa.

Un objeto de la presente invención es el de proporcionar una nueva ADH que actúa sobre la L-sorbosona para dar 2-KGA y tiene las siguientes propiedades físicoquímicas:

a): Peso molecular: 150.000 \pm 6.000 ó 230.000 \pm 9.000 (consiste en dos o tres subunidades homólogas, cada una con un peso molecular de aproximadamente 75.000 \pm 3.000).

b): Especificidad del substrato: activo en compuestos aldehídicos.

c): Cofactores: pirroloquinolina quinona (PQQ) y heme c

d): pH óptimo: 7,0 a 8,5

e): Inhibidores: Co^{2+}, Cu^{2+}, Fe^{2+}, Ni^{2+}, Zn^{2+}, monoyodo-acetato y ácido etilendiamintetracético

pudiendo obtenerse dicho ADH a partir de un microorganismo perteneciente al género Gluconobacter.

Otro objeto de la presente invención es el de proporcionar un procedimiento para la producción del nuevo ADH de la invención, como se ha definido más arriba, mediante el cultivo de un microorganismo perteneciente al género Gluconobacter, el cual es capaz de producir el ADH con las propiedades citadas más arriba, en un medio nutriente acuoso en condiciones aeróbicas, disgregando las células del microorganismo y aislando y purificando el ADH a partir del extracto libre de células de las células disgregadas del microorganismo. Todavía otro objeto de la presente invención es el de proporcionar un procedimiento para la producción de 2-KGA a partir de la L-sorbosona empleando la ADH de la presente invención, el cual procedimiento comprende la puesta en contacto de la L-sorbosona con la ADH como se ha definido más arriba, en presencia de un receptor de electrones, y aislando el 2-KGA resultante a partir de la mezcla de reacción.

Las propiedades fisicoquímicas de la muestra purificada de ADH, preparada de acuerdo con los ejemplos presentados a continuación, son como sigue:

1) Actividad enzimática

El ADH de la presente invención cataliza la oxidación de la L-sorbosona en 2-KGA en presencia de un receptor de electrones de acuerdo con la siguiente ecuación de reacción:

L-sorbosona + receptor de electrones \rightarrow 2 KGA + receptor de electrones reducido

La enzima no trabaja con el oxígeno como un receptor de electrones. Esto está confirmado por el fallo de la enzima en convertir la L-sorbosona en 2-KGA empleando oxígeno como un posible receptor de electrones. Además no se ha detectado ningún consumo de oxígeno en la mezcla de reacción como prueba de un oxígeno disuelto. Sin embargo, puede utilizarse cualquier compuesto convencional que tenga la capacidad de actuar como un receptor de electrones, juntamente con la enzima de esta invención. El DCIP, PMS, ferricianuro y citocromo c son los receptores de electrones preferidos.

El ensayo con la enzima se efectuó como sigue:

La muestra de reacción para el ensayo de la actividad del ADH consta de 0,1 mM de DCIP, 1,0 mM de PNS, 50 mM de tampón de fosfato de potasio (pH 8,0), 1,0 \muM de PQQ, 2,0 mM de L-sorbosona y solución de enzima en un volumen final de 100 \mul con agua, la cual mezcla de reacción se preparó justo antes de empezar el ensayo. La reacción empezó a 25ºC con L-sorbosona, y la actividad de la enzima se midió como la proporción de la reducción inicial de DCIP a 600 nm. Una unidad de la actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima que cataliza la reducción de 1 \mumol de DCIP por minuto. El coeficiente de extinción del DCIP a pH 8,0 se tomó a 15 mM^{-1}. Una cubeta de referencia contenía todos los constituyentes anteriores excepto la L-sorbosona.

La concentración de proteína se midió con el reactivo del ensayo de proteína BCA (Pierce CO., Rockford, IL 61105, U.S.A.).

2) Especificidad del substrato

La especificidad del substrato de la enzima se determinó empleando el mismo método de ensayo de la enzima como se ha descrito en 1) más arriba, excepto que se emplean varios soluciones de substrato (100 mM) en lugar de la L-sorbosona. La actividad relativa del ADH para la D-glucosona, D-glucosa, D-galactosa, D-manosa, L-gulosa, D-xilosa, D-ribosa y D-arabinosa fue mayor que para la L-sorbosona. Sin embargo, la actividad relativa para el D,L-gliceraldehido fue menor en un 1% para la L-sorbonosa. Estos resultados están mostrados en la tabla 1:

TABLA 1 Especificidad del substrato de la enzima purificada

Substrato	Actividad relativa (%)
L-sorbosona	100,0
D,L-gliceraldehido	< 1
D-glucosona	776,2
D-glucosa	864,2
L-sorbosa	< 1
D-galactosa	949,1
D-manosa	1003,3
L-gulosa	684,5
D-sorbitol	< 1
D-xilosa	1259,7
D-ribosa	803,9
D-arabinosa	298,9

3) pH óptimo

La correlación entre la velocidad de reacción del ADH y los valores del pH de la mezcla de reacción se determinó mediante el mismo método de ensayo descrito en 1) más arriba, excepto que se emplearon varios pH y tampones.

La enzima mostró una actividad relativamente alta a pH 7,0 a 8,5, como muestra la figura 1.

4) Termoestabilidad

La termoestabilidad de la enzima se ensayó incubándola durante 5 minutos a varias temperaturas en 50 mM de tampón de fosfato de potasio (pH 7,0). La actividad residual se midió por el mismo método de ensayo enzimático como se ha descrito en 1) más arriba, después del cual la enzima tratada se enfrió inmediatamente en agua de hielo. La enzima fue estable hasta los 45ºC, pero a 80ºC sólo quedó después del tratamiento, aproximadamente un 30% de la actividad. Los resultados están mostrados en la tabla 2:

TABLA 2 Efecto de la temperatura sobre la estabilidad de la enzima purificada

Temperatura (ºC)	Actividad relativa (%)
0	100.0
25	89.2
35	98.8
45	100.0
55	44.2
60	63.6
65	62.8
70	47.9
75	48.8
80	28.7

En esta tabla las actividades relativas están expresadas como porcentajes de la actividad a 0ºC.

5) Efectos de los iones metálicos e inhibidores

Se examinaron los efectos de los iones metálicos e inhibidores sobre la actividad de la enzima, midiendo la actividad utilizando el mismo método de ensayo que el descrito en 1) más adelante. Cada solución de compuesto se agitó en la mezcla de reacción de base, y la reacción dio comienzo con la adición de la enzima. Los resultados se muestran en la tabla 3:

TABLA 3 Efectos de los inhibidores y metales sobre la actividad de la enzima purificada

Compuesto	Actividad relativa (%)
Ninguna	100.0

EDTA	14.6
Quinina	124.4
KCN	129.4
NaN_{3}	104.6
N-etilmaleimida	110.8
Monoyodoacetato	52.2
NaF	86.7

CaCl_{2}\cdot2H_{2}O	204.5
CoCl_{2}\cdot6H_{2}O	76.0
CuSO_{4}	0.0
Fe_{2}(SO_{4})_{3}\cdotxH_{2}O	58.9
NiSO_{4}\cdot6H_{2}O	74.9
TiCl_{4}	128.0
ZnCl_{2}	40.3
MgCl_{2}	90.3

Cada compuesto se añadió a la mezcla de reacción a una concentración de 1,0 mM, excepto que la concentración de EDTA fue de 5,0 mM.

Como muestra la tabla 3, la actividad enzimática se estimuló aproximadamente el doble en presencia de 1,0 mM de Ca^{2+}, mientras que los Co^{2+}, Cu^{2+}, Fe^{2+}, Ni^{2+} y Zn^{2+} inhibieron la actividad de la enzima. La adición de 5 mM de ácido etilendiamintetracético (EDTA) inhibió fuertemente la actividad. Sin embargo, la actividad enzimática aumentó ligeramente a un 124% y un 129% mediante la adición de 1,0 mM de quinina y 1,0 mM de KCN respectivamente.

6) Peso molecular

El peso molecular de la enzima se midió con una columna de permeación sobre gel (TSK-gel G3000 SWXL; Tosoh Co., Akasaka 1-7-7, Minato-ku, Tokio, Japón). La enzima mostró en la cromatografía dos picos que correspondían al peso molecular aparente de 150.000 \pm 6.000 y 230.000 \pm 9.000. Analizando esta enzima mediante electroforesis sobre gel de SDS-poliacrilamida, se demostró que la enzima constaba de una subunidad homóloga de peso molecular 75.000 \pm 3.000 (figura 2). Esto indica que la enzima consta de dos o tres subunidades homólogas.

7) Grupo prostético

La enzima purificada no mostró ninguna actividad catalizadora de la conversión de la L-sorbosona en 2-KGA en la mezcla de reacción de base sin PQQ. Sin embargo, la actividad de la enzima se restauró mediante la adición de PQQ en la mezcla de reacción o incubando la enzima con PQQ y Ca^{2+} durante 5 minutos.

La detección del heme c de la enzima purificada se efectuó mediante el espectro de la diferencia reducido-menos-oxidado, tomado por un espectrofotómetro de registro UV-VIS (Shimadzu UV-2200; Shimadzu Co. Kuwahara-cho 1, Nishinokyo, Chukyo-ku, Kioto, Japón). La enzima se suspendió en 50 mM de tampón de fosfato de potasio (pH 7,0) a una concentración de 50 \mug/ml y se preparó la enzima de forma reducida con ditionito y la enzima de forma oxidada con persulfato de amonio para la medición del espectro diferencial. El espectro dio la máxima diferencia a 552 y 523 nm como muestra la figura 3. El resultado sugiere en gran manera que la enzima tiene el heme c como grupo prostético.

8) Efecto de la concentración del substrato

La velocidad de la reacción de oxidación con varias concentraciones de L-sorbosona a partir de 1 mM a 8 mM se midió para determinar el valor Km para la L-sorbosona. La constante de Michaelis se calculó en 17,8 mM a partir de la gráfica Lineweaver-Burk basada en la velocidad de reacción cuando se utiliza el DCIP como receptor de electrones para la reacción.

9) Procedimiento de purificación

La purificación de la enzima de efectúa mediante cualquier combinación de los métodos ya conocidos de purificación, tales como la cromatografía de intercambio iónico, electroforesis sobre gel, desplazamiento salino y diálisis.

La enzima proporcionada por la presente invención puede prepararse mediante el cultivo de un microorganismo apropiado en un medio nutriente acuoso en condiciones aeróbicas, disgregando las cálulas del microorganismo y aislando y purificando la aldehido deshidrogenasa a partir del extracto libre de células de las células disgregadas del microorganismo.

Los microorganismos empleados para la presente invención son microorganismos pertenecientes al género Gluconobacter, los cuales son capaces de producir la aldehido deshidrogenasa definida anteriormente.

Una cepa preferida es el Gluconobacter oxydans. La cepa más preferida empleada en la presente invención es el Gluconobacter oxydans DSM 4025, la cual se depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen ("Colección alemana de microorganismos") de Göttingen (Alemania), basada en las estipulaciones del tratado de Budapest, con el DSM nº4025, en fecha 17 de Marzo de 1987. El depositante fue "The Oriental Scientific Instruments Import and Export Corporation for Institute of Microbiology" ("Corporación Oriental de Importación y Exportación de Instrumentos Científicos para el Instituto de Microbiología"), Academia Sinica, 52 San-Li-He Rd, Beijing, Pueblos de la Republica de China. El depositante efectivo fue dicho Instituto, del cual la dirección completa es The Institute of Microbiology, Academy of Sciences of China ("Instituto de Microbiología, Academia de Ciencias de China"), Haidian, Zhongguancun, Beijing 100080 Pueblos de la República de China.

Además, la publicación de la Patente Europea nº 0 278 447 describe las características de esta cepa.

El microorganismo puede cultivarse en un medio acuoso suplementado con nutrientes apropiados en condiciones aeróbicas. El cultivo puede efectuarse a un pH de 4,0 a 9,0, de preferencia de 6,0 a 8,0. El período de cultivo varía en función del pH, la temperatura y el medio nutriente a emplear, y de preferencia es de aproximadamente 1 a 5 días. El margen preferido de temperatura para efectuar el cultivo es desde aproximadamente 13ºC hasta aproximadamente 36ºC, de preferencia desde 18ºC hasta 33ºC.

Habitualmente es necesario que el medio de cultivo contenga dichos nutrientes como fuentes de carbono asimilable, por ejemplo glicerina, D-manitol, D-sorbitol, eritritol, ribitol, xilitol, arabitol, inositol, dulcitol, D-ribosa, D-fructosa, D-glucosa y sucrosa, de preferencia D-sorbitol, D-manitol y glicerina; y fuentes de nitrógeno digestible tales como substancias orgánicas, por ejemplo, peptona, extracto de levadura, levadura de panadero, urea, aminoácidos y extracto de germen de maíz. Varias substancias inorgánicas pueden también emplearse como fuentes de nitrógeno, por ejemplo nitratos y sales de amonio. Además, el medio de cultivo contiene habitualmente sales inorgánicas, por ejemplo sulfato de magnesio, fosfato de potasio y carbonato de calcio.

Una versión del aislamiento y purificación de la ADH a partir del microorganismo después del cultivo se describe brevemente a continuación:

(1): Se cosechan las células a partir del líquido del caldo de cultivo por centrifugación o filtración.

(2): Las células cosechadas se lavan con agua, solución salina fisiológica o una solución tampón que tiene un pH apropiado.

(3): Las células lavadas se suspenden en la solución tampón y se disgregan por medio de un homogeneizador, un ultrasonidos o una prensa de French o por tratamiento con lisozima y similar para dar una solución de células disgregadas.

(4): Se aisla la ADH y se purifica a partir del extracto de células disgregadas, libre de células, de preferencia de la fracción citosol del microorganismo.

La ADH proporcionada por la presente invención es útil como catalizador para la producción del 2-KGA de la L-sorbosona. La reacción debe efectuarse a valores del pH desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 9,0 en presencia de un receptor de electrones, por ejemplo DCIP, PMS y similar en un disolvente tal como el tampón de fosfato, tampón de Tris y similar. Cuando el pH y la temperatura están ajustados a aproximadamente 7,5 a 8,5 y aproximadamente 25ºC respectivamente, la reacción tiene lugar habitualmente con los mejores resultados.

La concentración de L-sorbosona en un disolvente puede variar en función de otras condiciones de reacción pero, en general, es aproximadamente 0,5 a 50 g/litro, con más preferencia desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 30 g/litro.

En la reacción, la ADH puede también emplearse en un estado inmovilizado con un soporte apropiado. Puede emplearse cualquier medio de inmovilización de enzimas generalmente conocido en la técnica. Por ejemplo, la enzima puede estar unida directamente a una membrana, gránulos o similar, de una resina que tiene uno o más grupos funcionales, o puede estar unida a la resina a través de compuestos puente que tienen uno o más grupos funcionales, por ejemplo el glutaraldehido.

Además de lo antedicho, las células cultivadas son también de utilidad para la producción de ácidos carboxílicos a partir de los aldehidos, especialmente para la producción del 2-KGA a partir de la L-sorbosona.

El siguiente ejemplo ilustra además la presente invención.

Ejemplo Preparación del ADH

Todas las operaciones se efectuaron a 8ºC, y el tampón fue el fosfato de potasio 0,05 M (pH 7,0) a no ser que se estipulara otra cosa.

(1) Cultivo del Gluconobacter oxydans DSM nº 4025 (FERM BP-3812)

El Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM BP-3812) se hizo crecer en una placa de agar que contenía 5,0% de D-manitol, 0,25% de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,75% de extracto de germen de maíz, 5,0% de levadura de panadero, 0,5% de urea, 0,5% de CaCO_{3} y 2,0% de agar a 27ºC durante 4 días. Se inoculó un asa de células en 50 ml de un medio de cultivo de siembra que contenía 2% de sorbosa, 0,2% de extracto de levadura, 0,05% de glicerina, 0,25% de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,75% de extracto de germen de maíz, 0,5% de urea y 1,5% de CaCO_{3} en un matraz Erlenmeyer de 500 ml, y se cultivó a 30ºC y 180 rpm durante un día en un agitador rotatorio. Muestras de 10 ml de este cultivo se transfirieron a matraces Erlenmeyer de 500 ml que contenían 100 ml del mismo medio de cultivo de siembra y se cultivó de la misma manera a como se ha descrito más arriba. El cultivo de siembra así preparado se empleó para la inoculación de 15 litros de medio, el cual contenía 8,0% de L-sorbosa, 0,05% de glicerina, 0,25% de MaSO_{4}\cdot7H_{2}O, 3,0% de extracto de germen de maíz, 0,4% de extracto de levadura y 0,15% de antiespumante, en un recipiente de fermentación de 30 litros. Los parámetros de la fermentación fueron 800 rpm para la velocidad de agitación y 0,5 vvm (volumen de aire/volumen de medio/minuto) para la aireación a una temperatura de 30ºC. El pH se mantuvo a 7,0 con hidróxido de sodio durante la fermentación. Después de 48 horas de cultivo, se recogieron 30 litros del caldo cultivado conteniendo las células de Gluconobacter oxydans DSM nº 4025 (FERM BP-3812) empleando los dos juegos de fermentadores mediante centrifugación contínua. Las bolas de sedimento conteniendo las células se recuperaron y se suspendieron en un volumen apropiado de solución salina. Después de centrifugar la suspensión a 2.500 rpm (1.000 x g), se recuperó el sobrenadante que contenía las células ligeramente rojizas para eliminar los materiales insolubles derivados del extracto de germen de maíz y del extracto de levadura que habían sido ingredientes en el medio. El sobrenadante se centrifugó a continuación a 8.000 rpm (10.000 x g) obteniéndose el sedimento de células. Como resultado, se obtuvieron 123 g de peso húmedo de células del Gluconobacter oxydans DSM nº 4825 (FERM BP-3812) a partir de 30 litros de caldo.

(2) Preparación de la fracción de citosol

La pasta de células (55 g) se suspendió con 100 ml de tampón y se pasó a través de una prensa French de prensar células. Después de la centrifugación para eliminar las células intactas, el sobrenadante recibió el nombre de extracto libre de células y se centrifugó a 100.000 x g durante 90 minutos. El sobrenadante resultante (165 ml) recibió el nombre de fracción soluble del Gluconobacter oxydans DSM nº 4025 (FERM BP-3812). Después de dializar esta fracción frente al tampón, se emplearon 126 ml de la fracción dializada que tenía una actividad específica sobre la L-sorbonosa de 2,26 unidades/mg de proteína, para el próximo paso de purificación.

(3) Cromatografía de columna de dietilaminoetil(DEAE)-celulosa

El dializado (126 ml) se pasó por una columna de DEAE-celulosa (Whatman DE-52, 3x50 cm; Whatman BioSystemns Ltd. Springfield MIII, James Whatman Way, Maidstone, Kent, Reino Unido), se equilibró con el tampón y se lavó con el tampón para eluir las proteínas de menor importancia. A continuación se efectuó una elución lineal del gradiente con NaCl desde 0,3 a 0,8M en el tampón. La actividad de la enzima principal se eluyó a concentraciones de NaCl variando de 0,32 a 0,36M. Las fracciones activas (116 ml) se recogieron y se dializaron de nuevo frente al tampón.

(4) Cromatografía con columna DEAE-sefarosa

Una porción de 60 ml de la fracción activa dializada del paso anterior, se introdujo en una columna de DEAE-sefarosa CL-6B (Pharmacia, 1,5 x 50 cm; Amersham Pharmacia Biotech AB, S-75184 Uppsala, Suecia) y se equilibró con el tampón. Después de lavar la columna con el tampón conteniendo 0,2M de NaCl, se añadió al tampón un gradiente lineal de NaCl de 0,2 a 0,6M. Las fracciones activas se eluyeron a concentraciones de NaCl oscilando de 0,44 a 0,47M.

(5) Cromatografía con columna de Q-sefarosa

A una porción (13,5 ml) de las fracciones activas reunidas (53 ml) a partir del paso anterior, se añadió un volumen apropiado de tampón para disminuir la concentración de NaCl, y se introdujo en una columna de Q-sefarosa (Pharmacia, 1,0 a 20 cm) y se equilibró el tampón. Después de lavar la columna con el tampón conteniendo 0,35M de NaCl, se añadió al tampón un gradiente lineal de NaCl de 0,35 a 0,5M. Las actividades correspondientes al ADH se eluyeron a concentraciones de NaCl oscilando de 0,39 a 0,40M. Las fracciones activas (30 ml) recogidas se ultrafiltraron por un ultrafiltrador (Centriprep-10, Amicon; Amicon Inc. Cherry Hill Drive, Beverly, MA 01915, U.S.A.) para concentrar y eliminar las sales. Como resultado, se obtuvieron 700 \mul de la fracción activa concentrada.

(6) Electroforesis sobre gel de poliacrilamida nativa (PAGE nativa)

Una porción de 600 \mul de la fracción enzimática del paso anterior, se aplicó sobre un gel de poliacrilamida natural (10%, pH 9,4, 10 x 10 cm). La electroforesis se efectuó a 30 mA y 4ºC durante 1,5 horas. La banda de enzimas correspondiente a la fracción activa se recortó del gel y la enzima se eluyó eléctricamente del gel en tampón de Tris glicina (pH 8,3) empleando un concentrador de proteína MAX-YIELD (Atto Co., Hongo 1-25-23, Bunkyo-ku, Tokio, Japón) a 10 W y 4ºC durante 3 horas. La solución de la enzima se concentró el cuádruple empleando un filtro de ultramembrana (Centricon-10, Amicon) y el tampón se cambió por 50 mM de tampón de fosfato de potasio (pH 7,0). A continuación se guardó la solución de enzima a -30ºC.

En la tabla 4 figura un resumen de los pasos de purificación de la enzima.

TABLA 4 Purificación de la aldehido deshidrogenasa a partir del Gluconobacter oxydans DSM nº 4025 (FERM BP-3812)

Paso	Actividad total	Proteína total (mg)	Actividad específica
	(unidades)		(unidades/mg de proteína)
Fracción soluble	5994,2	2652,3	2,26
DEAE-celulosa DE52	4206,9	594,2	7,08
DEAE-sefarosa CL-6B	1640,5	107,9	15,29
Q-sefarosa	243,3	11,84	20,55
PAGE natural	193,8	3,59	53,98

(7) Pureza de la enzima aislada

La enzima purificada con una actividad específica de 54,0 unidades por mg de proteína (0,62 mg/ml) se empleó para el siguiente análisis:

El peso molecular de la enzima natural se determinó mediante cromatografía líquida de alta resolución, empleando una columna de permeación sobre gel (columna TSK gel G3000 SWXL, 7,8 x 300 mm) equilibrada con tampón de fosfato de potasio 0,1 M (pH 7,0) conteniendo 0,3M de NaCl a 280 nm y una velocidad de flujo de 1,5 ml por minuto. Se emplearon la cianocobalamina (1,35 K), mioglobina (17 K), ovalbúmina (44 K), \gamma-globulina (158 K) y tiroglobulina (670 K) como estándares de pesos moleculares. La enzima purificada presentó dos picos que tenían los pesos moleculares de 150.000 \pm 6.000 y 230.000 \pm 9.000.

Sin embargo, en presencia del dodecil sulfato de sodio (SDS) la enzima presentó una banda única con un peso molecular de 75.000 \pm 3.000. Según estos resultados, la enzima purificada consistía en dos o tres subunidades homólogas.

(8) Identificación del producto de reacción

La mezcla de reacción que contenía la enzima purificada (1,56 mg), L-sorbosona (0,142 mg), PMS (0,008 mg) y PQQ (0,3 mg) en 40 ml del tampón se incubó durante 1,5 horas a 30ºC. El producto de reacción se analizó por cromatografía en capa fina y HPLC. Como resultado, el producto de reacción se identificó como el 2-KGA en comparación con una auténtica muestra de 2-KGA.

Claims

1. Una aldehido deshidrogenasa que tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas:

a): Peso molecular: 150.000 \pm 6.000 ó 230.000 \pm 9.000 (consiste en dos o tres subunidades homólogas, cada una con un peso molecular de aproximadamente 75.000 \pm 3.000),

b): Especificidad del substrato: activo en compuestos aldehídicos,

c): Cofactores: pirroloquinolina quinona y heme c,

d): pH óptimo: 7,0 a 8,5,

e): Inhibidores: Co^{2+}, Cu^{2+}, Fe^{2+}, Ni^{2+}, Zn^{2+}, monoyodoacetato y ácido etilendiamintetracético;

siendo dicha aldehido deshidrogenasa obtenible a partir de un microorganismo perteneciente al género Gluconobacter.

2. La aldehido deshidrogenasa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el microorganismo es el Gluconobacter oxydans que tiene las características de identificación de la cepa Gluconobacter oxydans DSM nº4025 (FERM BP-3812).

3. Un procedimiento para la obtención de la aldehido deshidrogenasa de acuerdo con la reivindicación 1, el cual comprende el cultivo de un microorganismo perteneciente al género Gluconobacter el cual es capaz de producir dicha aldehido deshidrogenasa en un medio nutriente acuoso en condiciones aeróbicas, disgregando las células del microorganismo, aislando y purificando la aldehido deshidrogenasa del extracto libre de células de las células disgregadas del microorganismo.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el microorganismo es el Gluconobacter oxydans que tiene las características de identificación de la cepa Gluconobacter oxydans DSM nº 4025(FERM BP-3812).

5. Un procedimiento para la obtención del ácido 2-ceto-L-gulónico a partir de la L-sorbosona, el cual comprende la puesta en contacto de la L-sorbosona con una aldehido deshidrogenasa de acuerdo con la reivindicación 1, en presencia de un receptor de electrones, y aislando el ácido 2-ceto-L-gulónico de la mezcla de reacción.