ES2215263T3 - Aldehido deshidrogenasa. - Google Patents
Aldehido deshidrogenasa.Info
- Publication number
- ES2215263T3 ES2215263T3 ES98122223T ES98122223T ES2215263T3 ES 2215263 T3 ES2215263 T3 ES 2215263T3 ES 98122223 T ES98122223 T ES 98122223T ES 98122223 T ES98122223 T ES 98122223T ES 2215263 T3 ES2215263 T3 ES 2215263T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- microorganism
- enzyme
- gluconobacter
- aldehyde dehydrogenase
- dehydrogenase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/58—Aldonic, ketoaldonic or saccharic acids
- C12P7/60—2-Ketogulonic acid
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
UNA NUEVA ALDEHIDO - DESHIDROGENASA QUE TIENE LAS PROPIEDADES FISICO - QUIMICAS SIGUIENTES: PESO MOLECULAR: 150.000 (MAS MENOS) 6.000 O 230.000 (MAS MENOS) 9.000; ESPECIFICIDAD DEL SUBSTRATO: ACTIVO SOBRE COMPUESTOS DE ALDEHIDO; COFACTORES: PIRROLOQUINOLIN - QUINONA Y HEME - C; PH OPTIMO: 7,0 - 8,5; E INHIBIDORES CO 2+ , CU 2+ , FE 2+ , NI 2+ , ZN SU P,2+ , MONOYODOACETATO Y EDTA, QUE SE DERIVA DE UN MICROORGANISMO PERTENECIENTE AL GENERO GLUCONOBACTER. ESTA ALDEHIDO - DESHIDROGENASA PUEDE PRODUCIRSE POR CULTIVO DE UN MICROORGANISMO DEL GENERO GLUCONOBACTER, CAPAZ DE PRODUCIR UNA ALDEHIDO - DESHIDROGENASA QUE TIENE LAS MENCIONADAS PROPIEDADES, EN UN MEDIO NUTRIENTE ACUOSO Y EN CONDICIONES AEROBICAS, ALTERANDOSE LAS CELULAS DEL MICROORGANISMO Y AISLANDOSE Y PURIFICANDOSE LA ALDEHIDO DESHIDROGENASA DEL EXTRACTO DE CELULAS LIBRES DE LAS CELULAS ALTERADAS DEL MICROORGANISMO. EL ACIDO 2 - CETO - L - GULONICO (2 - KGA) PUEDE PRODUCIRSE A PARTIR DE LA L - SORBOSONA PONIENDO LA L - SORBOSONA EN CONTACTO CON (I) LA ALDEHIDO DESHIDROGENASA EN PRESENCIA DE UN ACEPTOR DE ELECTRONES, (II) UN MICROORGANISMO GLUCONOBACTER CAPAZ DE PRODUCIR LA ALDEHIDO DESHIDROGENASA EN MEDIO ACUOSO EN CONDICIONES AEROBICAS O (III) UN EXTRACTO SIN CELULAS DE DICHO MICROORGANISMO Y, EN CADA CASO, AISLANDO EL 2 -KGA RESULTANTE DE LA MEZCLA DE REACCION.
Description
Aldehido deshidrogenasa.
La presente invención se refiere a una nueva
enzima, a saber, la aldehido deshidrogenasa (ADH), a un
procedimiento para producir la ADH y un procedimiento para producir
el ácido
2-ceto-L-gulónico
(2-KGA) a partir de la L-sorbosona
empleando dicha enzima. El 2-KGA es un producto
intermedio importante para la producción de la vitamina C.
Se conocen algunos microorganismos que convierten
la L-sorbosona en 2-KGA. Por ejemplo
en la especificación de la patente U.S. nº 3907639, se informa que
los microorganismos pertenecientes a los géneros Acetobacter,
Pseudomonas, Escherichia, Serratia, Bacillus, Staphylococcus,
Aerobacter, Alcaligenes, Penicillium, Candida y Gluconobacter,
son capaces de efectuar la conversión. Además, Kitamura y
col., (Eur. J. Appl. Microbiol., 2,1, 1975) informan que la
enzima que oxida la L-sorbosona descubierta en el
Gluconobacter melanogenus IFO 3293 no necesita ninguna
coenzima ni ningún receptor de electrones para el desarrollo de la
actividad de la enzima. Makover y col., (Biotechnol. Bioeng.
17, 1485, 1975) informan la presencia de actividad
L-sorbosona deshidrogenasa en la fracción disgregada
del Pseudomonas putida ATCC 21812 y del Gluconobacter
melanogenus IFO 3293. También indican que ni el dinucleótido
nicotinamida adenina (NAD) ni el fosfato dinucleótido nicotinamida
adenina (NADP) actúa como una coenzima para la enzima. T. Hoshino y
col., (Agric. Biol.. Chem., 55, 665, 1991) purificada y
caracterizada L-sorbosona deshidrogenasa a partir
del Gluconobacter melanogenus UV10, el cual requiere NAD ó
NADP como coenzima.
Las solicitudes de Patente Europea EP 0606621 y
EP 0790301 describen dos enzimas ADM a partir del Gluconobacter
oxydans DSM nº 4025 cuyas propiedades
físico-químicas difieren de las de la enzima ADH
proporcionada en la presente solicitud.
En el contexto de la presente invención, los
microorganismos pertenecientes al género Gluconobacter han
sido estudiados más a fondo, y como resultado se ha descubierto que
el nuevo ADH que cataliza la oxidación del
L-sorbosona en 2-KGA puede obtenerse
a partir de dichos microorganismos. Además, se ha descubierto que el
ADH purificado proporcionado por la presente invención oxida la
L-sorbosona en 2-KGA en presencia de
receptores de electrones, tales como el
2,6-diclorofenol-indofenol (DCIP) y
metosulfato de fenazina (PMS), ferricianuro o citocromo c,
pero que NAD, NADP y oxígeno no son adecuados como aceptores de
electrones. Así, la ADH proporcionado por la presente invención es
claramente distinto de la ya conocida L-sorbosona
deshidrogenasa.
Un objeto de la presente invención es el de
proporcionar una nueva ADH que actúa sobre la
L-sorbosona para dar 2-KGA y tiene
las siguientes propiedades físicoquímicas:
- a)
- Peso molecular: 150.000 \pm 6.000 ó 230.000 \pm 9.000 (consiste en dos o tres subunidades homólogas, cada una con un peso molecular de aproximadamente 75.000 \pm 3.000).
- b)
- Especificidad del substrato: activo en compuestos aldehídicos.
- c)
- Cofactores: pirroloquinolina quinona (PQQ) y heme c
- d)
- pH óptimo: 7,0 a 8,5
- e)
- Inhibidores: Co^{2+}, Cu^{2+}, Fe^{2+}, Ni^{2+}, Zn^{2+}, monoyodo-acetato y ácido etilendiamintetracético
pudiendo obtenerse dicho ADH a partir de un
microorganismo perteneciente al género Gluconobacter.
Otro objeto de la presente invención es el de
proporcionar un procedimiento para la producción del nuevo ADH de la
invención, como se ha definido más arriba, mediante el cultivo de un
microorganismo perteneciente al género Gluconobacter, el cual
es capaz de producir el ADH con las propiedades citadas más arriba,
en un medio nutriente acuoso en condiciones aeróbicas, disgregando
las células del microorganismo y aislando y purificando el ADH a
partir del extracto libre de células de las células disgregadas del
microorganismo. Todavía otro objeto de la presente invención es el
de proporcionar un procedimiento para la producción de
2-KGA a partir de la L-sorbosona
empleando la ADH de la presente invención, el cual procedimiento
comprende la puesta en contacto de la L-sorbosona
con la ADH como se ha definido más arriba, en presencia de un
receptor de electrones, y aislando el 2-KGA
resultante a partir de la mezcla de reacción.
Las propiedades fisicoquímicas de la muestra
purificada de ADH, preparada de acuerdo con los ejemplos presentados
a continuación, son como sigue:
El ADH de la presente invención cataliza la
oxidación de la L-sorbosona en 2-KGA
en presencia de un receptor de electrones de acuerdo con la
siguiente ecuación de reacción:
L-sorbosona + receptor de
electrones \rightarrow 2 KGA + receptor de electrones reducido
La enzima no trabaja con el oxígeno como un
receptor de electrones. Esto está confirmado por el fallo de la
enzima en convertir la L-sorbosona en
2-KGA empleando oxígeno como un posible receptor de
electrones. Además no se ha detectado ningún consumo de oxígeno en
la mezcla de reacción como prueba de un oxígeno disuelto. Sin
embargo, puede utilizarse cualquier compuesto convencional que tenga
la capacidad de actuar como un receptor de electrones, juntamente
con la enzima de esta invención. El DCIP, PMS, ferricianuro y
citocromo c son los receptores de electrones preferidos.
El ensayo con la enzima se efectuó como
sigue:
La muestra de reacción para el ensayo de la
actividad del ADH consta de 0,1 mM de DCIP, 1,0 mM de PNS, 50 mM de
tampón de fosfato de potasio (pH 8,0), 1,0 \muM de PQQ, 2,0 mM de
L-sorbosona y solución de enzima en un volumen final
de 100 \mul con agua, la cual mezcla de reacción se preparó justo
antes de empezar el ensayo. La reacción empezó a 25ºC con
L-sorbosona, y la actividad de la enzima se midió
como la proporción de la reducción inicial de DCIP a 600 nm. Una
unidad de la actividad enzimática se definió como la cantidad de
enzima que cataliza la reducción de 1 \mumol de DCIP por minuto.
El coeficiente de extinción del DCIP a pH 8,0 se tomó a 15
mM^{-1}. Una cubeta de referencia contenía todos los
constituyentes anteriores excepto la
L-sorbosona.
La concentración de proteína se midió con el
reactivo del ensayo de proteína BCA (Pierce CO., Rockford, IL 61105,
U.S.A.).
La especificidad del substrato de la enzima se
determinó empleando el mismo método de ensayo de la enzima como se
ha descrito en 1) más arriba, excepto que se emplean varios
soluciones de substrato (100 mM) en lugar de la
L-sorbosona. La actividad relativa del ADH para la
D-glucosona, D-glucosa,
D-galactosa, D-manosa,
L-gulosa, D-xilosa,
D-ribosa y D-arabinosa fue mayor que
para la L-sorbosona. Sin embargo, la actividad
relativa para el D,L-gliceraldehido fue menor en un
1% para la L-sorbonosa. Estos resultados están
mostrados en la tabla 1:
| Substrato | Actividad relativa (%) |
| L-sorbosona | 100,0 |
| D,L-gliceraldehido | < 1 |
| D-glucosona | 776,2 |
| D-glucosa | 864,2 |
| L-sorbosa | < 1 |
| D-galactosa | 949,1 |
| D-manosa | 1003,3 |
| L-gulosa | 684,5 |
| D-sorbitol | < 1 |
| D-xilosa | 1259,7 |
| D-ribosa | 803,9 |
| D-arabinosa | 298,9 |
La correlación entre la velocidad de reacción del
ADH y los valores del pH de la mezcla de reacción se determinó
mediante el mismo método de ensayo descrito en 1) más arriba,
excepto que se emplearon varios pH y tampones.
La enzima mostró una actividad relativamente alta
a pH 7,0 a 8,5, como muestra la figura 1.
La termoestabilidad de la enzima se ensayó
incubándola durante 5 minutos a varias temperaturas en 50 mM de
tampón de fosfato de potasio (pH 7,0). La actividad residual se
midió por el mismo método de ensayo enzimático como se ha descrito
en 1) más arriba, después del cual la enzima tratada se enfrió
inmediatamente en agua de hielo. La enzima fue estable hasta los
45ºC, pero a 80ºC sólo quedó después del tratamiento,
aproximadamente un 30% de la actividad. Los resultados están
mostrados en la tabla 2:
| Temperatura (ºC) | Actividad relativa (%) |
| 0 | 100.0 |
| 25 | 89.2 |
| 35 | 98.8 |
| 45 | 100.0 |
| 55 | 44.2 |
| 60 | 63.6 |
| 65 | 62.8 |
| 70 | 47.9 |
| 75 | 48.8 |
| 80 | 28.7 |
En esta tabla las actividades relativas están
expresadas como porcentajes de la actividad a 0ºC.
Se examinaron los efectos de los iones metálicos
e inhibidores sobre la actividad de la enzima, midiendo la actividad
utilizando el mismo método de ensayo que el descrito en 1) más
adelante. Cada solución de compuesto se agitó en la mezcla de
reacción de base, y la reacción dio comienzo con la adición de la
enzima. Los resultados se muestran en la tabla 3:
| Compuesto | Actividad relativa (%) |
| Ninguna | 100.0 |
| EDTA | 14.6 |
| Quinina | 124.4 |
| KCN | 129.4 |
| NaN_{3} | 104.6 |
| N-etilmaleimida | 110.8 |
| Monoyodoacetato | 52.2 |
| NaF | 86.7 |
| CaCl_{2}\cdot2H_{2}O | 204.5 |
| CoCl_{2}\cdot6H_{2}O | 76.0 |
| CuSO_{4} | 0.0 |
| Fe_{2}(SO_{4})_{3}\cdotxH_{2}O | 58.9 |
| NiSO_{4}\cdot6H_{2}O | 74.9 |
| TiCl_{4} | 128.0 |
| ZnCl_{2} | 40.3 |
| MgCl_{2} | 90.3 |
Cada compuesto se añadió a la mezcla de reacción
a una concentración de 1,0 mM, excepto que la concentración de EDTA
fue de 5,0 mM.
Como muestra la tabla 3, la actividad enzimática
se estimuló aproximadamente el doble en presencia de 1,0 mM de
Ca^{2+}, mientras que los Co^{2+}, Cu^{2+}, Fe^{2+},
Ni^{2+} y Zn^{2+} inhibieron la actividad de la enzima. La
adición de 5 mM de ácido etilendiamintetracético (EDTA) inhibió
fuertemente la actividad. Sin embargo, la actividad enzimática
aumentó ligeramente a un 124% y un 129% mediante la adición de 1,0
mM de quinina y 1,0 mM de KCN respectivamente.
El peso molecular de la enzima se midió con una
columna de permeación sobre gel (TSK-gel G3000 SWXL;
Tosoh Co., Akasaka 1-7-7,
Minato-ku, Tokio, Japón). La enzima mostró en la
cromatografía dos picos que correspondían al peso molecular aparente
de 150.000 \pm 6.000 y 230.000 \pm 9.000. Analizando esta enzima
mediante electroforesis sobre gel de
SDS-poliacrilamida, se demostró que la enzima
constaba de una subunidad homóloga de peso molecular 75.000 \pm
3.000 (figura 2). Esto indica que la enzima consta de dos o tres
subunidades homólogas.
La enzima purificada no mostró ninguna actividad
catalizadora de la conversión de la L-sorbosona en
2-KGA en la mezcla de reacción de base sin PQQ. Sin
embargo, la actividad de la enzima se restauró mediante la adición
de PQQ en la mezcla de reacción o incubando la enzima con PQQ y
Ca^{2+} durante 5 minutos.
La detección del heme c de la enzima
purificada se efectuó mediante el espectro de la diferencia
reducido-menos-oxidado, tomado por
un espectrofotómetro de registro UV-VIS (Shimadzu
UV-2200; Shimadzu Co. Kuwahara-cho
1, Nishinokyo, Chukyo-ku, Kioto, Japón). La enzima
se suspendió en 50 mM de tampón de fosfato de potasio (pH 7,0) a una
concentración de 50 \mug/ml y se preparó la enzima de forma
reducida con ditionito y la enzima de forma oxidada con persulfato
de amonio para la medición del espectro diferencial. El espectro dio
la máxima diferencia a 552 y 523 nm como muestra la figura 3. El
resultado sugiere en gran manera que la enzima tiene el heme
c como grupo prostético.
La velocidad de la reacción de oxidación con
varias concentraciones de L-sorbosona a partir de 1
mM a 8 mM se midió para determinar el valor Km para la
L-sorbosona. La constante de Michaelis se calculó en
17,8 mM a partir de la gráfica Lineweaver-Burk
basada en la velocidad de reacción cuando se utiliza el DCIP como
receptor de electrones para la reacción.
La purificación de la enzima de efectúa mediante
cualquier combinación de los métodos ya conocidos de purificación,
tales como la cromatografía de intercambio iónico, electroforesis
sobre gel, desplazamiento salino y diálisis.
La enzima proporcionada por la presente invención
puede prepararse mediante el cultivo de un microorganismo apropiado
en un medio nutriente acuoso en condiciones aeróbicas, disgregando
las cálulas del microorganismo y aislando y purificando la aldehido
deshidrogenasa a partir del extracto libre de células de las células
disgregadas del microorganismo.
Los microorganismos empleados para la presente
invención son microorganismos pertenecientes al género
Gluconobacter, los cuales son capaces de producir la aldehido
deshidrogenasa definida anteriormente.
Una cepa preferida es el Gluconobacter
oxydans. La cepa más preferida empleada en la presente
invención es el Gluconobacter oxydans DSM 4025, la cual se
depositó en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen ("Colección
alemana de microorganismos") de Göttingen (Alemania), basada en
las estipulaciones del tratado de Budapest, con el DSM nº4025, en
fecha 17 de Marzo de 1987. El depositante fue "The Oriental
Scientific Instruments Import and Export Corporation for Institute
of Microbiology" ("Corporación Oriental de Importación y
Exportación de Instrumentos Científicos para el Instituto de
Microbiología"), Academia Sinica, 52
San-Li-He Rd, Beijing, Pueblos de la
Republica de China. El depositante efectivo fue dicho Instituto, del
cual la dirección completa es The Institute of Microbiology, Academy
of Sciences of China ("Instituto de Microbiología, Academia de
Ciencias de China"), Haidian, Zhongguancun, Beijing 100080
Pueblos de la República de China.
Además, la publicación de la Patente Europea nº 0
278 447 describe las características de esta cepa.
El microorganismo puede cultivarse en un medio
acuoso suplementado con nutrientes apropiados en condiciones
aeróbicas. El cultivo puede efectuarse a un pH de 4,0 a 9,0, de
preferencia de 6,0 a 8,0. El período de cultivo varía en función del
pH, la temperatura y el medio nutriente a emplear, y de preferencia
es de aproximadamente 1 a 5 días. El margen preferido de temperatura
para efectuar el cultivo es desde aproximadamente 13ºC hasta
aproximadamente 36ºC, de preferencia desde 18ºC hasta 33ºC.
Habitualmente es necesario que el medio de
cultivo contenga dichos nutrientes como fuentes de carbono
asimilable, por ejemplo glicerina, D-manitol,
D-sorbitol, eritritol, ribitol, xilitol, arabitol,
inositol, dulcitol, D-ribosa,
D-fructosa, D-glucosa y sucrosa, de
preferencia D-sorbitol, D-manitol y
glicerina; y fuentes de nitrógeno digestible tales como substancias
orgánicas, por ejemplo, peptona, extracto de levadura, levadura de
panadero, urea, aminoácidos y extracto de germen de maíz. Varias
substancias inorgánicas pueden también emplearse como fuentes de
nitrógeno, por ejemplo nitratos y sales de amonio. Además, el medio
de cultivo contiene habitualmente sales inorgánicas, por ejemplo
sulfato de magnesio, fosfato de potasio y carbonato de calcio.
Una versión del aislamiento y purificación de la
ADH a partir del microorganismo después del cultivo se describe
brevemente a continuación:
- (1)
- Se cosechan las células a partir del líquido del caldo de cultivo por centrifugación o filtración.
- (2)
- Las células cosechadas se lavan con agua, solución salina fisiológica o una solución tampón que tiene un pH apropiado.
- (3)
- Las células lavadas se suspenden en la solución tampón y se disgregan por medio de un homogeneizador, un ultrasonidos o una prensa de French o por tratamiento con lisozima y similar para dar una solución de células disgregadas.
- (4)
- Se aisla la ADH y se purifica a partir del extracto de células disgregadas, libre de células, de preferencia de la fracción citosol del microorganismo.
La ADH proporcionada por la presente invención es
útil como catalizador para la producción del 2-KGA
de la L-sorbosona. La reacción debe efectuarse a
valores del pH desde aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 9,0
en presencia de un receptor de electrones, por ejemplo DCIP, PMS y
similar en un disolvente tal como el tampón de fosfato, tampón de
Tris y similar. Cuando el pH y la temperatura están ajustados a
aproximadamente 7,5 a 8,5 y aproximadamente 25ºC respectivamente, la
reacción tiene lugar habitualmente con los mejores resultados.
La concentración de L-sorbosona
en un disolvente puede variar en función de otras condiciones de
reacción pero, en general, es aproximadamente 0,5 a 50 g/litro, con
más preferencia desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 30
g/litro.
En la reacción, la ADH puede también emplearse en
un estado inmovilizado con un soporte apropiado. Puede emplearse
cualquier medio de inmovilización de enzimas generalmente conocido
en la técnica. Por ejemplo, la enzima puede estar unida directamente
a una membrana, gránulos o similar, de una resina que tiene uno o
más grupos funcionales, o puede estar unida a la resina a través de
compuestos puente que tienen uno o más grupos funcionales, por
ejemplo el glutaraldehido.
Además de lo antedicho, las células cultivadas
son también de utilidad para la producción de ácidos carboxílicos a
partir de los aldehidos, especialmente para la producción del
2-KGA a partir de la
L-sorbosona.
El siguiente ejemplo ilustra además la presente
invención.
Todas las operaciones se efectuaron a 8ºC, y el
tampón fue el fosfato de potasio 0,05 M (pH 7,0) a no ser que se
estipulara otra cosa.
El Gluconobacter oxydans DSM 4025 (FERM
BP-3812) se hizo crecer en una placa de agar que
contenía 5,0% de D-manitol, 0,25% de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,75% de extracto de germen de maíz,
5,0% de levadura de panadero, 0,5% de urea, 0,5% de CaCO_{3} y
2,0% de agar a 27ºC durante 4 días. Se inoculó un asa de células en
50 ml de un medio de cultivo de siembra que contenía 2% de sorbosa,
0,2% de extracto de levadura, 0,05% de glicerina, 0,25% de
MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 1,75% de extracto de germen de maíz,
0,5% de urea y 1,5% de CaCO_{3} en un matraz Erlenmeyer de 500 ml,
y se cultivó a 30ºC y 180 rpm durante un día en un agitador
rotatorio. Muestras de 10 ml de este cultivo se transfirieron a
matraces Erlenmeyer de 500 ml que contenían 100 ml del mismo medio
de cultivo de siembra y se cultivó de la misma manera a como se ha
descrito más arriba. El cultivo de siembra así preparado se empleó
para la inoculación de 15 litros de medio, el cual contenía 8,0% de
L-sorbosa, 0,05% de glicerina, 0,25% de
MaSO_{4}\cdot7H_{2}O, 3,0% de extracto de germen de maíz, 0,4%
de extracto de levadura y 0,15% de antiespumante, en un recipiente
de fermentación de 30 litros. Los parámetros de la fermentación
fueron 800 rpm para la velocidad de agitación y 0,5 vvm (volumen de
aire/volumen de medio/minuto) para la aireación a una temperatura de
30ºC. El pH se mantuvo a 7,0 con hidróxido de sodio durante la
fermentación. Después de 48 horas de cultivo, se recogieron 30
litros del caldo cultivado conteniendo las células de
Gluconobacter oxydans DSM nº 4025 (FERM
BP-3812) empleando los dos juegos de fermentadores
mediante centrifugación contínua. Las bolas de sedimento conteniendo
las células se recuperaron y se suspendieron en un volumen apropiado
de solución salina. Después de centrifugar la suspensión a 2.500 rpm
(1.000 x g), se recuperó el sobrenadante que contenía las células
ligeramente rojizas para eliminar los materiales insolubles
derivados del extracto de germen de maíz y del extracto de levadura
que habían sido ingredientes en el medio. El sobrenadante se
centrifugó a continuación a 8.000 rpm (10.000 x g) obteniéndose el
sedimento de células. Como resultado, se obtuvieron 123 g de peso
húmedo de células del Gluconobacter oxydans DSM nº 4825 (FERM
BP-3812) a partir de 30 litros de caldo.
La pasta de células (55 g) se suspendió con 100
ml de tampón y se pasó a través de una prensa French de prensar
células. Después de la centrifugación para eliminar las células
intactas, el sobrenadante recibió el nombre de extracto libre de
células y se centrifugó a 100.000 x g durante 90 minutos. El
sobrenadante resultante (165 ml) recibió el nombre de fracción
soluble del Gluconobacter oxydans DSM nº 4025 (FERM
BP-3812). Después de dializar esta fracción frente
al tampón, se emplearon 126 ml de la fracción dializada que tenía
una actividad específica sobre la L-sorbonosa de
2,26 unidades/mg de proteína, para el próximo paso de
purificación.
El dializado (126 ml) se pasó por una columna de
DEAE-celulosa (Whatman DE-52, 3x50
cm; Whatman BioSystemns Ltd. Springfield MIII, James Whatman Way,
Maidstone, Kent, Reino Unido), se equilibró con el tampón y se lavó
con el tampón para eluir las proteínas de menor importancia. A
continuación se efectuó una elución lineal del gradiente con NaCl
desde 0,3 a 0,8M en el tampón. La actividad de la enzima principal
se eluyó a concentraciones de NaCl variando de 0,32 a 0,36M. Las
fracciones activas (116 ml) se recogieron y se dializaron de nuevo
frente al tampón.
Una porción de 60 ml de la fracción activa
dializada del paso anterior, se introdujo en una columna de
DEAE-sefarosa CL-6B (Pharmacia, 1,5
x 50 cm; Amersham Pharmacia Biotech AB, S-75184
Uppsala, Suecia) y se equilibró con el tampón. Después de lavar la
columna con el tampón conteniendo 0,2M de NaCl, se añadió al tampón
un gradiente lineal de NaCl de 0,2 a 0,6M. Las fracciones activas se
eluyeron a concentraciones de NaCl oscilando de 0,44 a 0,47M.
A una porción (13,5 ml) de las fracciones activas
reunidas (53 ml) a partir del paso anterior, se añadió un volumen
apropiado de tampón para disminuir la concentración de NaCl, y se
introdujo en una columna de Q-sefarosa (Pharmacia,
1,0 a 20 cm) y se equilibró el tampón. Después de lavar la columna
con el tampón conteniendo 0,35M de NaCl, se añadió al tampón un
gradiente lineal de NaCl de 0,35 a 0,5M. Las actividades
correspondientes al ADH se eluyeron a concentraciones de NaCl
oscilando de 0,39 a 0,40M. Las fracciones activas (30 ml) recogidas
se ultrafiltraron por un ultrafiltrador
(Centriprep-10, Amicon; Amicon Inc. Cherry Hill
Drive, Beverly, MA 01915, U.S.A.) para concentrar y eliminar las
sales. Como resultado, se obtuvieron 700 \mul de la fracción
activa concentrada.
Una porción de 600 \mul de la fracción
enzimática del paso anterior, se aplicó sobre un gel de
poliacrilamida natural (10%, pH 9,4, 10 x 10 cm). La electroforesis
se efectuó a 30 mA y 4ºC durante 1,5 horas. La banda de enzimas
correspondiente a la fracción activa se recortó del gel y la enzima
se eluyó eléctricamente del gel en tampón de Tris glicina (pH 8,3)
empleando un concentrador de proteína MAX-YIELD
(Atto Co., Hongo 1-25-23,
Bunkyo-ku, Tokio, Japón) a 10 W y 4ºC durante 3
horas. La solución de la enzima se concentró el cuádruple empleando
un filtro de ultramembrana (Centricon-10, Amicon) y
el tampón se cambió por 50 mM de tampón de fosfato de potasio (pH
7,0). A continuación se guardó la solución de enzima a -30ºC.
En la tabla 4 figura un resumen de los pasos de
purificación de la enzima.
| Paso | Actividad total | Proteína total (mg) | Actividad específica |
| (unidades) | (unidades/mg de proteína) | ||
| Fracción soluble | 5994,2 | 2652,3 | 2,26 |
| DEAE-celulosa DE52 | 4206,9 | 594,2 | 7,08 |
| DEAE-sefarosa CL-6B | 1640,5 | 107,9 | 15,29 |
| Q-sefarosa | 243,3 | 11,84 | 20,55 |
| PAGE natural | 193,8 | 3,59 | 53,98 |
La enzima purificada con una actividad específica
de 54,0 unidades por mg de proteína (0,62 mg/ml) se empleó para el
siguiente análisis:
El peso molecular de la enzima natural se
determinó mediante cromatografía líquida de alta resolución,
empleando una columna de permeación sobre gel (columna TSK gel G3000
SWXL, 7,8 x 300 mm) equilibrada con tampón de fosfato de potasio 0,1
M (pH 7,0) conteniendo 0,3M de NaCl a 280 nm y una velocidad de
flujo de 1,5 ml por minuto. Se emplearon la cianocobalamina (1,35
K), mioglobina (17 K), ovalbúmina (44 K),
\gamma-globulina (158 K) y tiroglobulina (670 K)
como estándares de pesos moleculares. La enzima purificada presentó
dos picos que tenían los pesos moleculares de 150.000 \pm 6.000 y
230.000 \pm 9.000.
Sin embargo, en presencia del dodecil sulfato de
sodio (SDS) la enzima presentó una banda única con un peso molecular
de 75.000 \pm 3.000. Según estos resultados, la enzima purificada
consistía en dos o tres subunidades homólogas.
La mezcla de reacción que contenía la enzima
purificada (1,56 mg), L-sorbosona (0,142 mg), PMS
(0,008 mg) y PQQ (0,3 mg) en 40 ml del tampón se incubó durante 1,5
horas a 30ºC. El producto de reacción se analizó por cromatografía
en capa fina y HPLC. Como resultado, el producto de reacción se
identificó como el 2-KGA en comparación con una
auténtica muestra de 2-KGA.
Claims (5)
1. Una aldehido deshidrogenasa que tiene las
siguientes propiedades fisicoquímicas:
- a)
- Peso molecular: 150.000 \pm 6.000 ó 230.000 \pm 9.000 (consiste en dos o tres subunidades homólogas, cada una con un peso molecular de aproximadamente 75.000 \pm 3.000),
- b)
- Especificidad del substrato: activo en compuestos aldehídicos,
- c)
- Cofactores: pirroloquinolina quinona y heme c,
- d)
- pH óptimo: 7,0 a 8,5,
- e)
- Inhibidores: Co^{2+}, Cu^{2+}, Fe^{2+}, Ni^{2+}, Zn^{2+}, monoyodoacetato y ácido etilendiamintetracético;
siendo dicha aldehido deshidrogenasa obtenible a
partir de un microorganismo perteneciente al género
Gluconobacter.
2. La aldehido deshidrogenasa de acuerdo con la
reivindicación 1, en donde el microorganismo es el Gluconobacter
oxydans que tiene las características de identificación de la
cepa Gluconobacter oxydans DSM nº4025 (FERM
BP-3812).
3. Un procedimiento para la obtención de la
aldehido deshidrogenasa de acuerdo con la reivindicación 1, el cual
comprende el cultivo de un microorganismo perteneciente al género
Gluconobacter el cual es capaz de producir dicha aldehido
deshidrogenasa en un medio nutriente acuoso en condiciones
aeróbicas, disgregando las células del microorganismo, aislando y
purificando la aldehido deshidrogenasa del extracto libre de
células de las células disgregadas del microorganismo.
4. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 3, en donde el microorganismo es el Gluconobacter
oxydans que tiene las características de identificación de la
cepa Gluconobacter oxydans DSM nº 4025(FERM
BP-3812).
5. Un procedimiento para la obtención del ácido
2-ceto-L-gulónico a
partir de la L-sorbosona, el cual comprende la
puesta en contacto de la L-sorbosona con una
aldehido deshidrogenasa de acuerdo con la reivindicación 1, en
presencia de un receptor de electrones, y aislando el ácido
2-ceto-L-gulónico de
la mezcla de reacción.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97121089 | 1997-12-01 | ||
| EP97121089 | 1997-12-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2215263T3 true ES2215263T3 (es) | 2004-10-01 |
Family
ID=8227721
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98122223T Expired - Lifetime ES2215263T3 (es) | 1997-12-01 | 1998-11-23 | Aldehido deshidrogenasa. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6242233B1 (es) |
| EP (1) | EP0922759B1 (es) |
| JP (1) | JPH11225754A (es) |
| KR (1) | KR100701819B1 (es) |
| CN (1) | CN1154719C (es) |
| BR (1) | BR9805685A (es) |
| CA (1) | CA2253023A1 (es) |
| DE (1) | DE69821326T2 (es) |
| DK (1) | DK0922759T3 (es) |
| ES (1) | ES2215263T3 (es) |
| IN (1) | IN187978B (es) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2480639A1 (en) * | 2002-02-22 | 2003-09-04 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Nad phosphite oxidoreductase a novel catalyst from bacteria for regeneration of nad(p)h |
| AU2003229663A1 (en) * | 2002-04-22 | 2003-11-03 | Dsm Ip Assets B.V. | Aldehyde dehydrogenase ii |
| WO2003104445A1 (en) * | 2002-06-06 | 2003-12-18 | Roche Vitamins Ag | Aldehyde dehydrogenase |
| KR101021234B1 (ko) * | 2002-09-27 | 2011-03-11 | 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. | 미생물에 의한 비타민 ｃ의 생성 방법 |
| JP4566000B2 (ja) * | 2002-09-27 | 2010-10-20 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． | ビタミンｃを産生する方法 |
| KR20050053699A (ko) * | 2002-09-27 | 2005-06-08 | 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. | Ｌ-알도노락톤의 제조방법 |
| JP4528624B2 (ja) * | 2002-09-27 | 2010-08-18 | ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． | アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子 |
| KR101031380B1 (ko) | 2002-09-27 | 2011-04-25 | 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이. | Ｌ-아스코브산의 제조방법 |
| AU2004246027A1 (en) * | 2003-06-11 | 2004-12-16 | Biotechnology Research And Development Corporation | Phosphite dehydrogenase mutants for nicotinamide cofactor regeneration |
| WO2005017172A1 (en) * | 2003-08-14 | 2005-02-24 | Dsm Ip Assets B.V. | Microbial production of l-ascorbic acid |
| JP5459531B2 (ja) * | 2009-02-13 | 2014-04-02 | アイシン精機株式会社 | アルドース脱水素酵素の活性化方法 |
| WO2011145518A1 (ja) * | 2010-05-18 | 2011-11-24 | 国立大学法人東北大学 | アルデヒド除去組成物 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3907639A (en) | 1972-08-31 | 1975-09-23 | Hoffmann La Roche | Method for producing 2-keto-L-gulonic acid |
| US4935359A (en) | 1987-02-07 | 1990-06-19 | Institute Of Microbiology | Fermentation process |
| US5437989A (en) * | 1992-12-30 | 1995-08-01 | Hoffmann-La Roche Inc. | Alcohol/aldehyde dehydrogenase from Gluconobacter oxydans DSM 4025 FERM BP-3812 |
| WO1995023220A1 (fr) * | 1994-02-25 | 1995-08-31 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Procede de production d'acide 2-ceto-l-gulonique |
| US5776742A (en) * | 1996-02-19 | 1998-07-07 | Roche Vitamins Inc. | Aldehyde dehydrogenase enzyme |
-
1998
- 1998-11-23 DE DE1998621326 patent/DE69821326T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-23 ES ES98122223T patent/ES2215263T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-23 EP EP98122223A patent/EP0922759B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-23 DK DK98122223T patent/DK0922759T3/da active
- 1998-11-30 CA CA002253023A patent/CA2253023A1/en not_active Abandoned
- 1998-11-30 KR KR1019980051902A patent/KR100701819B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-11-30 IN IN2699MA1998 patent/IN187978B/en unknown
- 1998-12-01 JP JP10340867A patent/JPH11225754A/ja not_active Ceased
- 1998-12-01 CN CNB981229859A patent/CN1154719C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-01 US US09/203,628 patent/US6242233B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-01 BR BR9805685-9A patent/BR9805685A/pt not_active Application Discontinuation
-
2001
- 2001-03-23 US US09/815,695 patent/US6846660B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100701819B1 (ko) | 2007-06-04 |
| IN187978B (es) | 2002-08-03 |
| JPH11225754A (ja) | 1999-08-24 |
| US6242233B1 (en) | 2001-06-05 |
| EP0922759B1 (en) | 2004-01-28 |
| BR9805685A (pt) | 2000-04-11 |
| DE69821326D1 (de) | 2004-03-04 |
| EP0922759A3 (en) | 2000-01-19 |
| EP0922759A2 (en) | 1999-06-16 |
| US20010026933A1 (en) | 2001-10-04 |
| CN1154719C (zh) | 2004-06-23 |
| CN1225390A (zh) | 1999-08-11 |
| CA2253023A1 (en) | 1999-06-01 |
| US6846660B2 (en) | 2005-01-25 |
| KR19990062648A (ko) | 1999-07-26 |
| DK0922759T3 (da) | 2004-06-01 |
| DE69821326T2 (de) | 2004-11-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2215263T3 (es) | Aldehido deshidrogenasa. | |
| US7544494B2 (en) | Vitamin C from sorbosone | |
| ES2284162T3 (es) | D-sorbitol dehidrogenasa. | |
| US5298411A (en) | Glucose dehydrogenase from pseudomonas | |
| JP3086301B2 (ja) | Ｌ−グロノ−ガンマ−ラクトン脱水素酵素 | |
| EP0790301B1 (en) | Aldehyde Dehydrogenase | |
| JPH0335B2 (es) | ||
| US4902617A (en) | Enzyme and process for producing the same | |
| EP1509599A1 (en) | Aldehyde dehydrogenase | |
| US20050153412A1 (en) | Aldehyde dehydrogenase II | |
| JP2726826B2 (ja) | 酵素およびその製造方法 | |
| EP1026257B1 (en) | Manufacture of L-ascorbic acid and D-erythorbic acid | |
| KR20000053496A (ko) | 엘-아스코브산 및 디-에리토브산의 제조방법 | |
| JP2006503551A5 (es) |