醛脱氢酶
本发明涉及一种新的酶,即醛脱氢酶(ADH),生产ADH的方法,和利用所述酶由L-山梨醛酮(L-sorbosone)生产2-酮-L-古洛糖酸(2-KGA)的方法。2-KGA是生产维生素C的重要中间体。
已知一些微生物可将L-山梨醛酮转变为2-KGA。例如,美国专利说明书No.3907639中报道了属于醋杆菌属,假单胞菌属,埃希氏菌属,沙雷氏菌属,芽孢杆菌属,葡萄球菌属,气杆菌属,产碱菌属,青霉属,假丝酵母属和葡糖杆菌属的微生物能够实现这种转变。另外,Kitamura等人(欧洲应用微生物学杂志,2,1,1975)报道了在生黑葡糖杆菌IFO 3293中发现的氧化L-山梨醛酮的酶,该酶酶活性的展开既不需要辅酶也不需要电子受体。Makover等人(生物技术及生物工程,17,1485,1975)报道了恶臭假单胞菌ATCC 21812和生黑葡糖杆菌IFO 3293的颗粒组分中L-山梨醛酮脱氢酶活性的存在。他们还阐明,该酶的辅酶既不是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),也不是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。T.Hoshino等人(农业生物化学,55,665,1991)从生黑葡糖杆菌UV10中纯化和鉴定了L-山梨醛酮脱氢酶,该酶需要NAD或NADP作为辅酶。
在本发明的上下文中,着重研究了葡糖杆菌属的微生物,结果发现可从所述微生物中得到另一种新的ADH,该酶可催化L-山梨醛酮氧化为2-KGA。另外,已发现本发明所提供的纯化的ADH在电子受体的存在下可将L-山梨醛酮氧化为2-KGA,所述电子受体如2,6-二氯靛酚(DCIP)和吩嗪硫酸甲酯(PMS),铁氰化物或细胞色素c,但NAD,NADP和氧不适于作为电子受体。因此,本发明提供的ADH显然不同于已知的L-山梨醛酮脱氢酶。
本发明的一个目的是提供一种新的ADH,该酶可作用于L-山梨醛酮将之转变为2-KGA,并且具有下列物理-化学特性:
a)分子量:150,000±6,000或230,000±9,000(由两个或三个相似的亚单位组成,每个亚单位的分子量约为75,000±3,000)
b)底物特异性:对醛类化合物具有活性
c)辅因子:吡咯并喹啉醌(PQQ)和血红素c
d)最适pH:7.0-8.5
e)抑制剂:Co2+,Cu2+,Fe2+,Ni2+,Zn2+,一碘乙酸盐和乙二胺四乙酸。
本发明的另一个目的是提供生产上文所定义的本发明的新ADH的方法,所述方法包括在需氧条件下,于含水营养培养基中培养能产生具有上述特性的ADH的葡糖杆菌属微生物,破碎微生物细胞,从破碎的微生物细胞的无细胞提取物中分离和纯化ADH。本发明的又一个目的是提供利用本发明的ADH由L-山梨醛酮产生2-KGA的方法,所述方法包括(ⅰ)在电子受体存在的条件下将L-山梨醛酮与上文所定义的ADH接触,或(ⅱ)在需氧条件下,于含水营养培养基中,将L-山梨醛酮与上文所定义的能产生ADH的葡糖杆菌属微生物接触,或(ⅲ)将L-山梨醛酮与所述微生物的无细胞提取物接触,并且在(ⅰ),(ⅱ)和(ⅲ)的每一种情况下从反应混合物中分离出所得的2-KGA。
图1表示pH对纯化酶活性的影响。其中数据以相对于磷酸钾缓冲液pH为8.0时的活性的百分数表示;
图2表示纯化酶的SDS-PAGE分析;泳道1:分子量标准:磷酸化酶B,97.4k;牛血清白蛋白,66.2k;卵白蛋白,42.7k;牛碳酸酐酶,31.0k;泳道2:用SDS处理过的纯化酶;
图3表示纯化酶蛋白质的还原-减-氧化示差谱。
根据下文所述实施例制备的ADH纯化样品的物理-化学特性如下:
1)酶活性
在电子受体存在的条件下,本发明的ADH可按照下列反应式催化L-山梨醛酮氧化为2-KGA:
L-山梨醛酮+电子受体→2-KGA+还原的电子受体
氧作为电子受体时,该酶不起作用。使用氧作为可能的电子受体不能使该酶将L-山梨醛酮转变为2-KGA可以证实这一事实,另外,用溶解氧探头检测时在反应混合物中未检测到氧的消耗。然而,能用作电子受体的任何常规化合物都可与本发明的酶一起使用。优选的电子受体是DCIP,PMS,铁氰化物和细胞色素c。
按下述进行酶的测定:
检测ADH活性的反应混合物由0.1mM DCIP,1.0mM PMS,50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0),1.0μM PQQ,2.0mM L-山梨醛酮和酶溶液组成,用水将终体积定为100μl,在检测之前现制备所述反应混合物。于25℃,用L-山梨醛酮开始反应,酶活性被测定为600nm下DCIP的最初还原速率。1个单位的酶活性被定义为每分钟催化1μmolDCIP还原的酶的用量。pH8.0时DCIP的消光系数取为15mM-1。对照池含有除L-山梨醛酮以外的上述所有组分。
用BCA蛋白质检测试剂(Pierce公司,Rockford,IL61105,美国)测定蛋白质的浓度。
2)底物特异性
使用与上述1)所述相同的酶检测法测定酶的底物特异性,不同的是使用了多种底物溶液(100mM),而不是L-山梨醛酮。ADH对D-葡糖醛酮,D-葡萄糖,D-半乳糖,D-甘露糖,L-古洛糖,D-木糖,D-核糖和D-阿拉伯糖的相对活性高于对L-山梨醛酮的活性。然而,ADH对D,L-甘油醛的相对活性比对L-山梨醛酮活性的1%还低。这些结果示于表1:
表1
纯化酶的底物特异性
底物 |
相对活性(%) |
L-山梨醛酮D,L-甘油醛D-葡糖醛酮D-葡萄糖L-山梨糖D-半乳糖D-甘露糖L-古洛糖D-山梨醇D-木糖D-核糖D-阿拉伯糖 |
100.0<1776.2864.2<1949.11003.3684.5<11259.7803.9298.9 |
3)最适pH
使用与上述1)所述相同的检测法测定ADH的反应速率和反应混合物pH值之间的关系,不同的是使用了不同的pH值和缓冲液。
如图1所示,酶在pH7.0至8.5时显示出相对较高的活性。
4)热稳定性
通过在多种温度下,于50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中将酶保温5分钟以检测酶的热稳定性。使用与上述1)所述相同的酶检测法测定残留的活性,然后将经处理的酶立即置于冰水中冷却。酶在高达45℃的温度下仍然稳定,但在80℃下处理之后仅残留约30%的活性,结果示于表2:
表2
温度对纯化酶稳定性的影响
温度(℃) |
相对活性(%) |
0253545556065707580 |
100.089.298.8100.044.263.662.847.948.828.7 |
在此表中,相对活性被表示为0℃时活性的百分比。
5)金属离子和抑制剂的影响
通过使用与上述1)所述相同的检测法测定活性来检测金属离子和抑制剂对酶活性的影响。在基本的反应混合物中搅拌加入每种化合物溶液,加入酶以开始反应。结果示于表3:
表3
抑制剂和金属对纯化酶活性的影响
化合物 |
相对活性(%) |
无EDTA奎宁KCNNaN3N-乙基马来酰亚胺一碘乙酸盐NaFCaCl2·2H2OCoCl2·6H2OCuSO4Fe2(SO4)3·xH2ONiSO4·6H2OTiCl4ZnCl2MgCl2 |
100.014.6124.4129.4104.6110.852.286.7204.576.00.058.974.9128.040.390.3 |
反应混合物中所加入的每种化合物的浓度为1.0mM,只有EDTA的浓度为5.0mM。
如表3所示,在1.0mM Ca2+存在的条件下,酶活性被刺激了约2倍,而Co2+,Cu2+,Fe2+,Ni2+和Zn2+抑制了酶活性。加入5mM乙二胺四乙酸(EDTA)强烈地抑制了活性。然而,加入1.0mM奎宁和1.0mM KCN分别使酶活性稍微增加至124%和129%。
6)分子量
用大小排阻凝胶柱(TSK-凝胶G3000 SWXL;Tosoh公司,Akasaka1-7-7,Minato-ku,东京,日本)测定酶的分子量。酶在层析中显示出两个峰,其相对应的表观分子量是150,000±6,000和230,000±9,000。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析此酶,显示出此酶由分子量为75,000±3,000的类似的亚单位组成(图2),这表明酶由两个或三个类似的亚单位组成。
7)辅基
在不含PQQ的基本反应混合物中,纯化的酶未显示出将L-山梨醛酮转变为2-KGA的催化活性。然而,通过在反应混合物中加入PQQ或将酶与PQQ和Ca2+保温5分钟可恢复酶的活性。
通过由UV-VIS记录分光光度计(Shimadzu UV-2200;Shimadzu公司,Kuwahara-chol,Nishinokyo,Chukyo-ku,Kyoto,日本)记录的还原-减-氧化示差谱来检测纯化酶的血红素c。将酶悬浮于50mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)中至浓度为50μg/ml,制备连二亚硫酸盐-还原形式和过硫酸铵-氧化形式的酶以测定示差谱。如图3所示,谱中552和523nm处差异最大。此结果强烈地暗示酶具有血红素c作为辅基。
8)底物浓度的影响
测定1mM-8mM不同浓度的L-山梨醛酮氧化反应的速度以测定L-山梨醛酮的Km值。当DCIP用作反应的电子受体时,由基于反应速度所作的Lineweaver-Burk图计算出Michaelis常数为17.8mM。
9)纯化方法
可通过已知纯化方法的任何组合实现酶的纯化,所述方法如离子交换层析,凝胶电泳,盐析和透析。
通过在需氧条件下,于含水营养培养基中培养适当的微生物,破碎微生物细胞,从破碎的微生物细胞的无细胞提取物中分离和纯化醛脱氢酶即可制备本发明提供的酶。
用于本发明的微生物是能产生如上文所定义的醛脱氢酶的葡糖杆菌属微生物。本发明中也可使用所述微生物的功能等同物,传代培养物,突变体和变体。
优选的菌株是氧化葡糖杆菌。本发明中最优选的菌株是氧化葡糖杆菌DSM 4025,根据布达佩斯条约的规定,于1987年3月17日将该菌株保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen in Gttingen(德国),保藏号为DSM No.4025。保藏者是中国科学院微生物研究所所属的东方科学仪器进出口公司,北京三里河路52号。实际保藏者是所述的研究所,其详细地址为中国科学院微生物研究所,海淀,中关村,北京100080,中国。
另外,根据布达佩斯条约的规定,于1992年3月30日将该菌株的传代培养物保藏于日本工业科学和技术机构,国立生物科学和人类技术研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology,Agency of Industrial Science and Technology,Japan),保藏号为氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)。保藏者是Nippon Roche研究中心,200 Kajiwara Aza Sotokochi,Kamakura-shi,Kanagawa-ken 247,日本。同样最优选将该传代培养物用于本发明。
另外,欧洲专利公开No.0 278 447中公开了此菌株的特征。
可在需氧条件下,于添加了适当营养成分的含水培养基中培养该微生物。可在pH4.0-9.0,优选在pH6.0-8.0的条件下进行培养。培养的时间根据pH、温度和所用的营养培养基的不同而有所不同,优选约1-5天。进行培养的温度范围优选为约13℃-约36℃,更优选18℃-33℃。
通常需要培养基中含有这类营养成分,如可同化的碳源,如甘油,D-甘露醇,D-山梨醇,赤藓醇,核糖醇,木糖醇,阿糖醇,肌醇,卫矛醇,D-核糖,D-果糖,D-葡萄糖和蔗糖,优选D-山梨醇,D-甘露醇和甘油;和可消化的氮源,如有机物,例如胨,酵母提取物,面包酵母,尿素,氨基酸和玉米浸汁。多种无机物也可用作氮源,例如硝酸盐和铵盐。另外,培养基通常含有无机盐,例如硫酸镁,磷酸钾和碳酸钙。
培养后从微生物中分离和纯化ADH的实施方案简述如下:
(1)通过离心或过滤从液体培养肉汤中收获细胞。
(2)用水、生理盐水或具有适当pH的缓冲溶液洗涤收获的细胞。
(3)将经洗涤的细胞悬浮于缓冲溶液中,利用匀浆器、超声发生器或弗氏压碎器破碎细胞,或通过用溶菌酶等处理得到破碎细胞的溶液。
(4)从破碎细胞的无细胞提取物,优选从微生物的胞质溶胶组分中分离和纯化ADH。
本发明所提供的ADH可用作由L-山梨醛酮生成2-KGA的催化剂。反应应在如DCIP、PMS等的电子受体存在下,在pH值为约6.5-约9.0的条件下进行,所述电子受体溶于如磷酸盐缓冲液、Tris-缓冲液等的溶剂中。当将pH和温度分别设置为约7.5-8.5和约25℃时,反应通常会产生最佳效果。
溶剂中L-山梨醛酮的浓度可随其它反应条件的不同而不同,但通常约为0.5-50g/l,最优选约1-约30g/l。
在反应中,ADH也可以固定于适当载体上的固定化形式被使用。本领域通常已知的任何固定酶的方式都可使用。例如,酶可直接与具有一个或多个官能团的树脂膜、颗粒或类似物结合,或可通过具有一个或多个官能团的桥连化合物,如戊二醛与树脂结合。
除此以外,经培养的细胞也可用于由醛生产羧酸,尤其是由L-山梨醛酮生产2-KGA。
下列实施例将进一步地阐明本发明。
实施例
ADH的制备
除非另有说明,所有的操作在8℃下进行,缓冲液是0.05M的磷酸钾(pH7.0)。
(1)培养氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)
于27℃,在琼脂平板上使氧化葡糖杆菌DSM 4025(FERM BP-3812)生长4天,所述琼脂平板中含有5.0%D-甘露醇,0.25%MgSO4·7H2O,1.75%玉米浸汁,5.0%面包酵母,0.5%尿素,0.5%CaCO3和2.0%琼脂。将1环细胞接种到500ml三角瓶中的50ml种子培养基中,该培养基中含有2%L-山梨糖,0.2%酵母提取物,0.05%甘油,0.25%MgSO4·7H2O,1.75%玉米浸汁,0.5%尿素和1.5%CaCO3,于30℃下在旋转振荡器上用180rpm的转速培养1天。将10ml此培养物的样品转移到500ml三角瓶中的100ml相同种子培养基中,按与上述相同的方式进行培养。使用如此制备的种子培养物接种30升发酵罐中的15升培养基,该培养基中含有8.0%L-山梨糖,0.05%甘油,0.25%MgSO4·7H2O,3.0%玉米浸汁,0.4%酵母提取物和0.15%消泡剂。发酵参数是温度为30℃,搅拌速度为800rpm,通气速度为0.5vvm(空气体积/培养基体积/分钟)。
发酵过程中用氢氧化钠将pH维持在7.0。培养48小时后,通过持续离心收获使用两套发酵罐培养得到的30升含有氧化葡糖杆菌DSMNo.4025(FERM BP-3812)的细胞的肉汤。回收含有细胞的沉淀物,将该沉淀物悬浮于适当体积的盐水中。将悬浮液在2500rpm(1000×g)下离心之后,回收含有稍微发红的细胞的上清液以除去得自培养基组分玉米浸汁和酵母提取物的不溶性物质。然后在8000rpm(10,000×g)下离心上清液以得到细胞沉淀物。结果从30升肉汤中得到湿重为123g的氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)细胞。
(2)制备胞质溶胶组分
将细胞糊状物(55g)悬浮于100ml缓冲液中,并穿过弗氏细胞压碎器。离心以除去完整的细胞之后,即可称上清液为无细胞提取物,以100,000×g将此无细胞提取物离心90分钟。可称所得上清液(165ml)为氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)的可溶性组分。将此组分对缓冲液透析之后,使用126ml经透析的组分进行下一步的纯化步骤,该组分对L-山梨醛酮的比活为2.26单位/mg蛋白质。
(3)二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素柱层析
将透析液(126ml)上样于用缓冲液平衡过的DEAE-纤维素柱(Whatman DE-52,3×50cm;Whatmann BioSystems有限公司,Springfield MⅢ,James Whatman Ways,Maidstone,Kent,U.K.)并用缓冲液洗涤以洗脱次要的蛋白质。然后使用于缓冲液中的0.3-0.8M的NaCl进行线性梯度洗脱。NaCl浓度为0.32-0.36M时洗脱出主要的酶活性。收集活性组分(116ml)并对缓冲液透析。
(4)DEAE-琼脂糖凝胶柱层析
将前一步骤得到的60ml经透析的活性组分部分上样于用缓冲液平衡过的DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B柱(Pharmacia,1.5×50cm;Amersham Pharmacia Biotech AB,S-75184 Uppsala,Sweden)上。用含有0.2M NaCl的缓冲液洗涤柱之后,在缓冲液中加入0.2-0.6M的NaCl线性梯度。NaCl浓度为0.44-0.47M时洗脱出活性组分。
(5)Q-琼脂糖凝胶柱层析
在前一步骤得到的总活性组分(53ml)的一部分(13.5ml)中加入适当体积的缓冲液以降低NaCl的浓度,将所得溶液上样于用缓冲液平衡过的Q-琼脂糖凝胶(Pharmacia,1.0×20cm)上。用含有0.35M NaCl的缓冲液洗涤柱之后,在缓冲液中加入0.35-0.5M的NaCl线性梯度。NaCl浓度为0.39-0.40M时洗脱出相当于ADH的活性。通过超滤器(Centriprep-10,Amicon;Amicon公司,Cherry Hill Drive,Beverly,MA01915,美国)超滤收集到的活性组分(30ml)以浓缩和脱盐。结果得到700μl浓缩的活性组分。
(6)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(非变性的PAGE)
将前一步骤得到的600μl酶组分部分上样于非变性的聚丙烯酰胺凝胶(10%,pH9.4,10×10cm)。于4℃,30mA下电泳1.5小时。从凝胶上切下对应于活性组分的酶带,于4℃,10W下使用MAX-YIELD蛋白质浓缩仪(Atto公司,Hongo 1-25-23,Bunkyo-ku,东京,日本)将凝胶中的酶电洗脱至Tris甘氨酸缓冲液(pH8.3)中达3小时。使用超薄膜滤器(Centricon-10,Amicon)将酶溶液浓缩4倍,将缓冲液换成50mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)。然后将酶溶液储存于-30℃下。
酶纯化步骤的概要示于表4:
表4得自氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)的醛脱氢酶的纯化
步骤 |
总活性(单位) |
总蛋白质(mg) |
比活(单位/mg蛋白质) |
可溶性组分DEAE-纤维素DE52DEAE-琼脂糖凝胶CL-6BQ-琼脂糖凝胶非变性PAGE |
5994.24206.91640.5243.3193.8 |
2652.3594.2107.911.843.59 |
2.267.0815.2920.5553.98 |
(7)分离出的酶的纯度
使用比活为54.0单位/mg蛋白质的纯化酶(0.62mg/ml)进行下列分析:
于280nm下通过高效液相层析测定天然酶的分子量,所述层析使用用含有0.3M NaCl的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡过的大小排阻凝胶柱(TSK凝胶G3000 SWXL柱,7.8×300cm),流速为1.5ml/分钟。氰钴氨素(1.35K),肌红蛋白(17K),卵白蛋白(44K),γ-球蛋白(158K)和甲状腺球蛋白(670K)被用作分子量标准。纯化的酶显示出分子量为150,000±6,000和230,000±9,000的两个峰。
然而,在十二烷基硫酸钠(SDS)存在时,酶显示出分子量为75,000±3,000的单个带。从这些结果看:纯化的酶由两个或三个类似的亚单位组成。
(8)反应产物的鉴定
于30℃,40ml的缓冲液中含有纯化酶(1.56mg)、L-山梨醛酮(0.142mg)、PMS(0.008mg)和PQQ(0.3mg)的反应混合物被保温1.5小时。在薄层层析和HPLC上分析反应产物。结果,与2-KGA真正的样品比较将反应产物鉴定为2-KGA。