CN1659275A - 醛脱氢酶 - Google Patents

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CN1659275A CN038130238A CN03813023A CN1659275A CN 1659275 A CN1659275 A CN 1659275A CN 038130238 A CN038130238 A CN 038130238A CN 03813023 A CN03813023 A CN 03813023A CN 1659275 A CN1659275 A CN 1659275A
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Abstract

本发明涉及具有以下物理化学特性的新型醛脱氢酶：分子量为190,000±15,000Da，所述分子包含两个α亚单位和一个β亚单位的亚单位结构，或分子量为250,000±20,000Da，所述分子包含两个α亚单位和两个β亚单位的亚单位结构，其中α亚单位分子量为75,000±3,000Da，且β亚单位分子量为55,000±2,000Da；对L－山梨糖酮、D－葡糖醛酮、D－葡萄糖和D－木糖有脱氢酶活；利用吡咯并喹啉醌和血红素c作为辅因子；对于从L－山梨糖酮产生维生素C，最适pH为从约6.5到约8.0，且对于从L－山梨糖酮产生2－酮－L－古洛糖酸，最适pH为约9.0；并受Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、一碘乙酸盐和叠氮化钠抑制。

Description

醛脱氢酶
本发明涉及一种名为醛脱氢酶的新型酶(在下文中称作SNDH III)，该酶负责在中性pH时将L-山梨糖酮转换为L-抗坏血酸(在下文中称作维生素C)，以及在碱性pH时将L-山梨糖酮转换为2-酮-L-古洛糖酸(在下文中称作2-KGA)。本发明也提供了用于产生该酶的方法，以及提供利用该酶直接从如L-山梨糖酮的醛糖中产生维生素C和/或2-KGA的方法。
维生素C是人类非常重要且不可缺少的营养素之一。已广泛研究了在多种生物体内产生维生素C的代谢途径。然而，并无有关涉及直接将L-山梨糖酮转换成维生素C的纯化酶的报道。因此，本发明的酶对用维生素C新型生产方法代替当前的如Reichstein方法(Helvetica Chimica Acta 17：311(1934))是非常有用的。
本发明提供了具有以下物理化学特性的纯化醛脱氢酶：
a)分子量为190,000±15,000Da(由两个α亚单位和一个β亚单位的亚单位结构组成)或分子量为250,000±20,000Da(由两个α亚单位和两个β亚单位的亚单位结构组成)，其中α亚单位的分子量为75,000±3,000Da，且β亚单位的分子量为55,000±2,000Da；
b)底物特异性：对醛化合物具有活性；
c)辅因子：吡咯并喹啉醌(PQQ)和血红素c；
d)最适pH：从约6.5到约8.0(对于从L-山梨糖酮生成维生素C)或约9.0(对于从L-山梨糖酮生成2-酮-L-古洛糖酸)；
e)抑制剂：Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、一碘乙酸盐和叠氮化钠。
在一个实施方案中，本发明涉及分子量为190,000±15,000Da的具有如上所述物理化学特性的醛脱氢酶。
在进一步的实施方案中，本发明涉及分子量为250,000±20,000Da的具有如上所述物理化学特性的醛脱氢酶。
本发明SNDH III的来源并不是挑剔性的。因此本发明的SNDH III可例如通过下述方法产生：通过从能够产生具有上述特性的醛脱氢酶的葡糖杆菌(Gluconobacter)或其它微生物中分离，或通过重组或化学合成产生。
本发明的另一目标是提供用于产生上述SNDH III的方法，其包括在需氧条件下于液体营养培养基中培养能够产生具有以上提及特性的醛脱氢酶的属于葡糖杆菌属的微生物、破碎微生物细胞以及从微生物破碎细胞的无细胞提取物中分离醛脱氢酶。
在本发明的一个方面中，用于产生如上所述SNDH III的方法是通过培养能够产生具有以上提及特性的醛脱氢酶的属于葡糖杆菌属的微生物而得以进行，其中反应是在pH从约4.5到约9.0，温度从约20℃到约50℃的条件下进行。这样产生的SNDH III对于维生素C和2-KGA的生产是有用的。
本发明的进一步目标是提供用于从醛糖产生其相应的羧酸和/或其内酯的方法，其包括用具有上面提及特性的纯化SNDH III或用在电子受体存在下能生产具有上面提及特性的醛脱氢酶的属于葡糖杆菌属的微生物中制备的无细胞提取液接触醛。
术语“醛糖”意指在除羰基碳原子外的所有碳原子上均带有羟基的醛。
此处应用的醛糖包括但不限于L-山梨糖酮、D-葡糖醛酮、D-葡萄糖及D-木糖。
优选的内酯为维生素C，优选的羧酸为2-KGA，且优选的醛糖为L-山梨糖酮。
在一个实施方案中，从醛糖产生其相应的羧酸和/或其内酯的方法包括用具有以上提及特性的纯化SNDH III或用从如上定义的属于葡糖杆菌属的微生物中制备的无细胞提取物接触醛，其中所述SNDH III的分子量为190,000±15,000Da。
在一个实施方案中，从醛糖产生其相应的羧酸和/或其内酯的方法包括用具有以上提及特性的纯化SNDH III或从如上定义的属于葡糖杆菌属的微生物中制备的无细胞提取物接触醛，其中所述SNDH III的分子量为250,000±20,000Da。
在一个方面中，本发明着力于从醛糖产生其相应的羧酸和/或其内酯的方法，包括用具有以上提及特性的纯化SNDH III或用从属于葡糖杆菌属的微生物中制备的无细胞提取物接触醛，所述微生物属于能够生产具有以上提及特性的醛脱氢酶的葡糖杆菌属，其中的反应在pH从约4.5到约9.0且温度从约20℃到约50℃的条件下进行。在生产维生素C的情形时，反应优选地是在pH约为6.5至约8.0的条件下进行。在生产2-KGA的情形时，反应优选地是在pH约为9.0的条件下进行。
本发明也描述了具有以上提及特性的纯化醛脱氢酶在用于从醛糖生产其相应羧酸和/或其内酯方法中的用途，其包含用所述纯化醛脱氢酶或用从微生物中制备的无细胞提取物接触醛，前述微生物属于在电子受体存在条件下能够产生所述醛脱氢酶的葡糖杆菌属。
根据下文中提及的实施例制备的SNDH III的纯化样本的理化特性如下：
1)酶活性
在电子受体存在下，本发明的SNDH III根据以下反应方程催化L-山梨糖酮氧化为维生素C和/或2-KGA：
L-山梨糖酮+电子受体→维生素C和/或2-KGA+还原的电子受体
SNDH III不以氧作为电子受体。这可以通过使用氧作为可能的电子受体时，SNDH III未能将L-山梨糖酮转换为维生素C和/或2-KGA而得以证实。此外，在反应混和物中用溶解的氧探针进行检测时，未能检测到氧消耗。另外，NAD和NADP不是适宜的电子受体。但是，其它常规电子受体可以与本发明的SNDH III一起应用。优选的电子受体为2，6-二氯酚靛酚(DCIP)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、铁氰化物和细胞色素c。至少对于某些待转换成其相应酸的醛底物而言，不必存在最少量的电子受体。但是，可被氧化的底物量依赖于特定电子受体的量和其电子接受特性。
按以下步骤进行酶试验：
a)确定将L-山梨糖酮转换成每一产物-维生素C或2-KGA的酶活性的试验
在终体积为100μl水中，反应混和物的组成为：1.0mM PMS、25mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、1.0μM PQQ、1.0mM CaCl2、50mM L-山梨糖酮以及酶溶液，在试验开始前即时制备前述反应混和物。除非另作说明，反应条件均为30℃下进行60分钟。应用高效液相色谱(HPLC)系统在波长264nm下检测作为酶活性指标的维生素C的量，所述HPLC系统由UV探测器(TOSOH UV8000；TOSOH Co.，Kyobashi 3-2-4，Chuo-ku，日本东京)、双泵(TOSOH CCPE；TOSOH Co.)、积分仪(Shimadzu C-R6A；Shimadzu Co.，Kuwahara-cho 1，Nishinokyo，Chukyo-ku，日本京都)和柱子(YMC-Pack聚胺II；YMC，Inc.，3233 Burnt Mill Drive Wilimington，NC28403，USA)组成。应用上述的HPLC检测作为酶活性另一指标的2-KGA生成量。对于每种产物，一个单位的酶活性定义为：在反应混和物中分别生成1mg维生素C和2-KGA所需的酶量。
b)SNDH III的光度分析
在终体积为100μl水中，反应混和物的组成为：0.1mM DCIP、1.0mMPMS、50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)、1.0μM PQQ、2-100mM底物(L-山梨糖酮、D-葡糖醛酮、D-葡萄糖等)以及酶溶液。在试验前即时制备前述反应混和物。在25℃下用L-山梨糖酮起始反应，且以600nm处的DCIP初始还原速率检测酶活性。一个单位酶活性定义为：每分钟催化还原1μmolDCIP的酶量。pH7.0时的DCIP消光系数为14.2mM-1。对照比色皿含有除L-山梨糖酮外的所有上述成份。
应用Protein Assay CBB Solution(Nacalai tesque，Inc.日本京都)测试蛋白质浓度。
2)底物特异性
通过用与上面1b)下所述的除了用100mM磷酸钾(pH7.5)或100mMTris-HCl(pH9.0)作为缓冲液外相同的酶分析法检测酶底物特异性。在pH7.5和pH9.0时，SNDH III对D-葡糖醛酮(2mM)、D-葡萄糖(100mM)和D-木糖(100mM)的相对活性高于对L-山梨糖酮(2mM)的相对活性。但在pH7.5和pH9.0时，对L-山梨糖(100mM)、D-山梨醇(100mM)和L-古洛糖酸-γ-内酯(100mM)的相对活性低于对L-山梨糖酮相对活性的1％。结果见表1A。
                   表1A
          纯化SNDH III的底物特异性
底物     相对活性％
    pH7.5     pH9.0
 L-山梨糖酮     100     100
 D-葡糖醛酮     1262     391
 D-葡萄糖     4236     522
 L-山梨糖     ＜1     ＜1
 D-山梨醇     ＜1     ＜1
 D-木糖     5545     633
 L-古洛糖酸-γ-内酯     ＜1     ＜1
                   表1B
       表1A中显示的底物氧化的还原产物
底物 产物
L-山梨糖酮 维生素C/2-KGA
D-葡糖醛酮 D-异-抗坏血酸/2-酮-D-葡糖酸
D-葡萄糖 D-葡糖酸
D-木糖 D-木糖酸
3)最适pH
通过用与上面1a)下所述的除应用多种pH值和浓度为100mM的缓冲液外相同的分析法检测SNDH III的反应速度和反应混和物的pH值间的相互关系。
本发明的SNDH III在从约pH6.5到约pH8.0时显示出产生维生素C的相对高活性，且在约pH9.0时显示出产生2-KGA的高活性。
4)温度的影响
通过用与上面1a)下所述的除应用多种温度外相同分析法检测温度对于酶反应的影响。在生成维生素C和2-KGA时，酶反应在高达至少50℃时能稳定地进行。
5)金属离子和抑制剂的影响
通过用与上面1b)下所述相同的试验方法测定金属离子和抑制剂对酶的L-山梨糖酮脱氢酶活性的影响。将每一化合物溶液搅拌入基础反应混和物中，并加入本发明的SNDH III开始反应。结果见表2。
                  表2
抑制剂和金属对纯化SNDH III的活性的影响
化合物     相对活性％
无EDTANaN3一碘乙酸盐CaCl2·2H2OCoCl2·6H2OCuSO4Fe2(SO4)3·xH2ONiSO4·6H2OTiCl4ZnCl2MgCl2     100.083.974.311.9101.567.9＜161.068.587.963.374.1
除EDTA、NaN3和一碘乙酸盐的浓度为5.0mM之外，加入反应混和物中的每一化合物浓度均为1.0mM。
如表3所示，Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+和Mg2+抑制酶活性。加入的5mM一碘乙酸盐强烈抑制酶活性。加入的5mM叠氮化钠微弱抑制酶活性。
6)分子量
应用大小排阻凝胶柱(TSK-gel G3000 SWXL；TOSOH Co.，Akasaka1-7-7，Minato-ku，日本东京)测定SNDH III的分子量。柱层析上，酶显示有与约190,000±15,000Da和约250,000±20,000Da的表观分子量对应的两个峰。应用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后周CBB-染色对2％SDS处理的纯化SNDH III进行分析时，结果显示SNDH III由两种不同的亚单位组成，其分子量分别为75,000±3,000(α亚单位)和55,000±2,000Da(β亚单位)。这表明SNDH III包含两个α和一个β亚单位或两个α和两个β亚单位的两种亚单位结构，其中α亚单位的分子量为75,000±3,000Da且β亚单位的分子量为55,000±2,000Da。
SNDH III的三聚体和四聚体形式均具有活性。
7)辅基
50μl 100mM NaH2PO4-HCl(pH约1.0)的纯化SNDH III(0.1mg)加入等体积的甲醇并充分混合。离心样本，去除沉淀物。产生的上清液用于辅基分析。萃取液的吸收光谱与PQQ的真实样本(Mitsubishi Gas Chemical，日本)基本相同。发现其吸收峰位于251和348nm处。此外，通过应用反相柱(YMC-Pack Pro C18 AS-312；YMC Co.，Ltd)在波长313nm处进行的HPLC分析显示，带有甲醇的SNDH III的萃取液与真实PQQ具有相同的保留时间。
通过还原光谱减氧化光谱而产生的差异光谱尝试进行纯化SNDH III的血红素c的检测，所述差异光谱通过UV-VIS自记分光光度计(ShimadzuUV-2200；Shimadzu Co.)进行。SNDH III以50μg/ml的浓度悬浮于50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，并制备连二亚硫酸盐还原型和过硫酸铵氧化型的SNDH III以进行差异光谱的测定。光谱在552和523nm处给出差异最大值。
这些结果强烈提示SNDH III具有用作辅基的PQQ和血红素c。
8)底物浓度的影响
测定从1mM到8mM的多种浓度L-山梨糖酮的氧化反应速度以确定L-山梨糖酮的Km值。当DCIP用作该反应的电子受体时，基于反应速度的双倒数作图法计算得出pH为7.5和9.0时的米氏常数分别为6.5mM和16.8mM。
9)纯化步骤
如离子交换柱层析、疏水柱层析、盐析和透析的已知纯化方法的任意组合实现SNDH III的纯化。
可通过在需氧条件下用液体营养培养基培养适宜的微生物、破碎微生物细胞并从微生物破碎细胞的无细胞提取物中分离并纯化醛脱氢酶来制备本发明提供的SNDH III。
用于本发明方法的微生物为能够产生如在此前定义的醛脱氢酶的属于葡糖杆菌属的微生物。
优选菌株是氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)。用于本发明的最优选的菌株是氧化葡糖杆菌DSM 4025，根据布达佩斯条约，于1987年3月17日保藏于德意志微生物保藏中心(德国)，保藏号为DSM No.4025。保藏者为中华人民共和国北京三里河路52号，中国科学院微生物所东方科学仪器进出口公司。有效保藏者为该研究所，其地址全称是：中华人民共和国，北京，海淀中关村，中国科学院微生物所，100080。
此外，菌株的传代培养菌也保藏于日本产业技术综合研究所(AIST)，也是基于布达佩斯条约，在1992年3月30日保藏，保藏号为氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)。保藏者是日本罗氏K.K.(NipponRoche K.K.)，位于日本东京，港区，芝2丁目6-1。该传代培养菌也最优选地用于本发明。
因而，本发明的一个目标是提供此前定义的醛脱氢酶，其源自具有氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)菌株、它的传代培养物或突变体的鉴定特性的氧化葡糖杆菌。
可以通过如紫外或X射线照射或如氮芥或通过N-甲基-n′-硝基-N-亚硝基胍的化学诱变剂处理细胞而获得氧化葡糖杆菌DSM 4025(FERMBP-3812)的突变体或属于葡糖杆菌属并具有氧化葡糖杆菌DSM 4025(FERM BP-3812)鉴别特性的微生物。
可应用微生物的任意类型如静止细胞、丙酮处理的细胞、冷冻干燥细胞、固定细胞等直接作用于底物。在可采用任意本身已知的与通过通风微生物培养技术有关的方法，且特别优选搅拌深层发酵罐。用于进行反应的优选细胞浓度范围为从约0.01g湿细胞/ml到0.7g湿细胞/ml，更优选地为从0.03g湿细胞/ml到0.5g湿细胞/ml。
微生物“氧化葡糖杆菌”也包括具有相同理化特性的该物种的同物异名或基原异名，其由原核生物命名法的国际编码所定义。
氧化葡糖杆菌No.4025(FERM BP-3812)的特性如下：
a)由山梨糖生成2-KGA；
b)将乙醇氧化成乙酸；
c)将D-葡萄糖氧化成D-葡糖酸和2-酮-D-葡糖酸；
d)多元醇的生酮作用；
e)在pH4和pH5的甘露醇肉汤(培养24小时)中生长菌膜和环，且在pH4.5的葡萄糖肉汤内生长菌膜；
f)将甘油不充分氧化成二羟丙酮；
g)由山梨醇和葡糖二酸但不由葡萄糖、果糖、葡糖酸、甘露醇或2-酮-D-葡糖酸生成2-酮-D-葡糖二酸；
h)多态，明显无鞭毛；
i)从果糖生产褐色素；
j)当在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或其细胞提取物存在条件下进行共培养时，生长良好；
k)链霉素敏感。
在通气条件下，可在补充以适当营养物的液体培养基中培养微生物。可在pH从约4.0到约9.0，更优选地从约6.0到约8.0条件下进行培养。培养时间根据所应用的pH、温度和营养培养基而有所不同，且优选地为约1到5天。进行培养的优选温度范围为从约13℃到约36℃，更优选地从约18℃到约33℃。高达约50℃的温度也可适于微生物的培养。
培养基通常需含有可同化的碳源和可消化的氮源营养物，所述碳源营养物如甘油、D-甘露醇、D-山梨醇、赤藓醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌醇、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖和蔗糖，优选地为D-山梨醇、D-甘露醇和甘油，所述氮源营养物如有机物，如蛋白胨、酵母抽提物、发面酵母、尿素、氨基酸和玉米浆。多种无机物如硝酸盐和铵盐也可用作氮源。此外，培养基通常含有无机盐，如硫酸镁、磷酸钾和碳酸钙。
以下简要描述了培养后从微生物中分离并纯化SNDH III的一个实施方案：
(1)通过离心或过滤从肉汤液体培养基中收集细胞；
(2)用水、生理盐水或具有适宜pH的缓冲液洗涤收集的细胞；
(3)将洗涤的细胞悬浮于缓冲液中，并用匀浆器、超声仪或法式压滤仪破碎或通过溶菌酶等处理以形成破碎细胞的溶液。
(4)从破碎细胞的无细胞提取物中，更优选地从微生物的可溶级分中分离并纯化SNDH III。
可以通过任意的常规技术，包括但不限于离心，从破碎的细胞中获得无细胞提取物。
本发明提供的SNDH III可用作由L-山梨糖酮生成维生素C和/或2-KGA的催化剂。可在如DCIP和PMS等的电子受体存在条件下于如磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液等的溶液中以pH值约4.5到约9.0产生维生素C和2-KGA。生产维生素C时，若pH设置为从约6.5到约8.0且温度设置为从约20℃到约40℃，通常可获得最佳结果。生产2-KGA时，若pH设置为约9.0且温度设置为从约20℃到约50℃，通常可获得最佳结果。
反应混合物中L-山梨糖酮的浓度依赖于其它反应条件而变化，但通常为约0.5～50g/l，最优选地从约1g/l到约30g/l。
反应中，也可在具有适当载体的固定状态下应用SNDH III。可应用本领域内通常已知的固定酶的任何方法。例如，可将酶直接固定于具有一种或多种官能团的树脂的膜、微粒等上，或可通过具有一种或多种官能团的如戊二醛的桥联化合物将酶固定于树脂上。
除此之外，培养的细胞也可用于从醛糖生产其相应羧酸和/或其内酯，特别是用于从L-山梨糖酮生产2-KGA和/或维生素C。在与上述L-山梨糖酮转变成2-KGA和/或维生素C相同的条件下，包括底物浓度，从其它醛糖生产其相应羧酸和/或其内酯。
以下实施例进一步阐明本发明。
实施例1：SNDH III的制备
除非另作说明，所有操作均在8℃进行，且缓冲液为0.05M磷酸钾(pH7.0)。
(1)氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)的培养
在琼脂平板上于27℃培养氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERMBP-3812)4天，所述琼脂平板含有5.0％D-甘露醇、0.25％MgSO4·7H2O、1.75％玉米浆、5.0％发面酵母、0.5％尿素、0.5％CaCO3和2.0％琼脂。将一铂环细胞接种于500ml锥形烧瓶内的50ml种子培养基中，并在180转/分钟的旋转摇床上30℃培养一天，所述种子培养基含有2％L-山梨糖、0.2％酵母抽提物、0.05％甘油、0.25％MgSO4·7H2O、1.75％玉米浆、0.5％尿素和1.5％CaCO3。由此制备的种子培养物用于接种30升广口瓶发酵罐中的15升培养基，所述培养基含有8.0％L-山梨糖、0.05％甘油、0.25％MgSO4·7H2O、3.0％玉米浆、0.4％酵母抽提物和0.15％消泡剂。发酵参数为30℃的温度、800转/分钟的搅拌速率和0.5vvm(空气体积/培养基体积/分钟)的通风。发酵期间，用氢氧化钠将pH维持在7.0。培养48小时后，通过连续离心收集经两套发酵罐获得的30升含有氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)的培养肉汤。回收含有细胞的沉淀块，并悬浮于适当体积的盐水中。2,500转/分钟(1,000xg)离心悬浮物后，回收含有微红色的细胞上清液以移除源自玉米浆和酵母抽提物的不溶物，所述不溶物为培养基成分。然后以8,000转/分钟(10,000xg)离心上清液以获得细胞沉淀快。结果，从30升肉汤中获得123g氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)湿细胞。
(2)胞质溶胶级分的制备
将湿细胞(64.2g)悬浮于280ml缓冲液中，并通过法式细胞压滤仪压滤。离心以移除完整细胞后，将上清液称为无细胞提取物，并于100,000xg离心无细胞提取物60分钟。产生的上清液(227ml)称为氧化葡糖杆菌DSMNo.4025(FERM BP-3812)的可溶级分。用缓冲液透析该级分后，将浓度为0.107单位/mg蛋白质的具有从L-山梨糖酮产生维生素C特异活性的105ml透析级分，用于下一纯化步骤。
(3)二乙氨乙基(DEAE)纤维素柱层析
将透析液(150ml)装于经缓冲液平衡的DEAE-纤维素柱(WhatmanDE-52，3×50cm；Whatman BioSystems Ltd.，Springfield MIII，JamesWhatman Way，Maidstone，Kent，U.K.)上，并用缓冲液洗涤以洗脱较小的蛋白质。然后，将结合于树脂上的蛋白质用0.28、0.32、0.36M NaCl缓冲液逐步洗脱。0.36M NaCl洗脱出主要的酶活性。收集活性级分(143ml)。
(4)羧甲基纤维素柱层析
用超滤器(Centriprep-10，Amicon；Amicon Inc.Cherry Hill Drive，Beverly，MA01915，U.S.A.)过滤浓缩来自上一步骤的活性部分(127ml)。用缓冲液透析浓缩样本(28ml)后，将透析级分(31ml)中的28ml装于用缓冲液平衡的羧甲基纤维素柱(Whatman CM-52，3×23cm；WhatmanBioSystems Ltd.)上。收集通过柱子而没有结合在树脂上的蛋白质。
(5)Q-琼脂糖凝胶柱层析(第一步)
用超滤器(Centriprep-10)过滤浓缩收集的活性级分(43ml)。将源自上一步的浓缩活性级分(10ml)的一部分(9.5ml)装在经缓冲液平衡的Q-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia，1.5×50cm)上。用含0.3M NaCl的缓冲液洗柱子后，将0.3到0.6M的NaCl以线性梯度加到缓冲液中。NaCl浓度为0.55～0.57M范围内洗脱出活性级分。
(6)Q-琼脂糖凝胶柱层析(第二步)
用超滤器(Centriprep-10)过滤浓缩上一步收集的活性级分(22ml)。然后用缓冲液透析浓缩样本(3.0ml)。将透析样本(3.5ml)装于经缓冲液平衡的Q-琼脂糖凝胶柱(Pharmacia，1.5×50cm)上。用含0.35M NaCl的缓冲液洗柱子后，将0.35到0.7M的NaCl以线性梯度加入到缓冲液中。在NaCl浓度为0.51～0.53M范围内洗脱出活性级分。
(7)凝胶过滤柱层析
将上一步收集的活性级分(20ml)用超滤器过滤以进行浓缩和脱盐。将浓缩脱盐(低于0.1M NaCl)样本(2.0ml)的一部分(1.5ml)装在含有经0.1M NaCl缓冲液平衡的Sephacryl S-300 High Resolution柱(Pharmacia，1.5×120cm)上。用缓冲液透析并收集活性级分(12ml)。
(8)疏水柱层析
用超滤器(Centriprep-10)过滤浓缩上一步的透析活性级分。将浓缩样本(1.75ml)中的一部分(1.5ml)加到等体积(1.5ml)的含3M硫酸铵的缓冲液中(终浓度：1.5M)。离心(15,000xg)样本后，将上清液装在经含有1.5M硫酸铵的缓冲液平衡的RESOURCE ISO柱(Pharmacia，1.0ml)上。用含有1.5M硫酸铵的缓冲液洗涤柱子后，用含有从1.5到0.75M线性梯度硫酸铵的缓冲液洗脱蛋白质。在从1.15到1.13M硫酸铵的浓度范围内洗脱出对应于SNDH III的活性级分。应用透析杯(Dialysis-cupMWCO 8000，Daiichi pure chemicals，Nihonbashi 3-13-5，Chuo-ku，日本东京)以缓冲液透析活性级分。然后，收集级分并存储于-20℃。
酶纯化步骤的总结见表3。
                            表3
来自氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)的SNDH III的纯化
步骤   总活性(单位)   总蛋白质(mg)     比活度(单位*/mg蛋白质)
可溶级分DEAE-纤维素DE52CM-纤维素CM52Q-琼脂糖凝胶(第一步)Q-琼脂糖凝胶(第二步)Sephacryl S-300HRRESOURCE-ISO     343.026.1028.8638.9410.779.094.07     3205.2120.67105.7012.563.470.710.12     0.1070.2160.2733.1003.10212.8134.53
酶的一个单位*定义为：在以上提及的1a)中所述的反应混和物中每小时生产1mg维生素C所需的酶量。
(9)分离酶的纯化
应用用于产生维生素C时，比活度为34.5单位/mg蛋白质，且用于产生2-KGA时，比活度为7.82单位/mg蛋白质的纯化酶进行以下的分析：
通过高效液相色谱对天然SNDH III的分子量进行评估，其中所述色谱应用280nm且流速为1.5ml/分钟的经含有0.3M NaCl的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)平衡的大小排阻凝胶柱(TSK凝胶G3000 SWXL柱，7.8×300mm)。应用维生素B12(1.35kDa)、肌球蛋白(17kDa)、卵清蛋白(44kDa)、γ-球蛋白(158kDa)和甲状腺球蛋白(670kDa)作为分子量标准。纯化的SNDHIII显示出分子量分别为190,000±15,000Da和250,000±20,000Da的两个峰。
根据十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，SNDH III由两种亚单位组成，其中之一的分子量为75,000±3,000Da，且另一个的分子量为55,000±2,000Da。
(10)反应产物鉴定
将溶于100μl缓冲液中的含有纯化SNDH III(1.21μg)、L-山梨糖酮(50mM)、PMS(1mM)、CaCl2(1mM)和PQQ(1μM)的反应混和物，在30℃下培养1小时。用薄层色谱法(硅胶60F254，MERCK，64271达姆施特塔，德国)和HPLC分析反应产物。从酶反应中获得两种产物，即维生素C和2-KGA。分析维生素C时，通过HPLC系统上的氨基柱(YMC-Pack Polyamine-II，YMC，Inc.)对样本进行测试。分析2-KGA时，通过HPLC系统上的C-18柱(YMC-Pack Pro C18，YMC，Inc.)对样本进行测试。
实施例2：pH对应用SNDH III从L-山梨糖酮生成维生素C或2-KGA的影响
检测pH对酶反应的影响。将溶于100μl缓冲液(100mM)中的含有纯化SNDH III(607ng)、L-山梨糖酮(50mM)、PMS(1mM)、CaCl2(1mM)和PQQ(1μM)的反应混和物，在30℃下温育1小时。反应产物通过HPLC进行分析。结果见表4。
                          表4
pH对应用SNDH III从L-山梨糖酮生成维生素C或2-KGA的影响
    缓冲液  pH 产生的维生素C(mg/l) 产生的2-KGA(mg/l)
柠檬酸盐-NaOH柠檬酸盐-NaOH柠檬酸盐-NaOH磷酸钾磷酸钾磷酸钾磷酸钾磷酸钾Tris-HClTris-HClTris-HCl  4.475.436.426.647.057.447.848.207.918.418.91     3.26.283.232.277.8240.9137.986.6103.829.40.0     0.013.915.16.511.119.28.214.9126.9126.0187.7
实施例3：温度对应用SNDH III从L-山梨糖酮生成维生素C或2-KGA的影响
检测温度对酶活性的影响。将溶于100μl 25mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中的含纯化的SNDH III(607ng)、L-山梨糖酮(50mM)、PMS(1mM)、CaCl2(1mM)和PQQ(1μM)的反应混合物，在多种温度(20-60℃)下温育1小时。反应产物通过HPLC进行分析。结果见表5。
                        表5
温度对应用SNDH III从L-山梨糖酮生成维生素C或2-KGA的影响
  温度(℃) 产生的维生素C(mg/l) 产生的2-KGA(mg/l)
    202530     229.6267.9232.2     50.953.849.9
    35405060     295.4264.6202.024.4     53.445.954.433.2

Claims (13)

1.具有如下物理化学特性的经纯化醛脱氢酶：
a)分子量为190,000±15,000Da(由两个α亚单位和一个β亚单位的亚单位结构组成)或分子量为250,000±20,000Da(由两个α亚单位和两个β亚单位的亚单位结构组成)，其中α亚单位的分子量为75,000±3,000Da，且β亚单位的分子量为55,000±2,000Da；
b)底物特异性：对醛化合物具有活性；
c)辅因子：吡咯并喹啉醌(PQQ)和血红素c；
d)最适pH：从约6.5到约8.0(对于从L-山梨糖酮生成维生素C)或约9.0(对于从L-山梨糖酮生成2-酮-L-古洛糖酸)；
e)抑制剂：Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、一碘乙酸盐和叠氮化钠。
2.根据权利要求1的醛脱氢酶，其源自能够产生所述醛脱氢酶的属于葡糖杆菌属的微生物。
3.根据权利要求2的醛脱氢酶，其中微生物为具有菌株氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)的鉴定特性的氧化葡糖杆菌、其传代培养物或突变体。
4.根据权利要求3的醛脱氢酶，其中微生物是氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)、其传代培养物或突变体。
5.用于产生具有如下物理化学特性的醛脱氢酶的方法：
a)分子量为190,000±15,000Da(由两个α亚单位和一个β亚单位的亚单位结构组成)或分子量为250,000±20,000Da(由两个α亚单位和两个β亚单位的亚单位结构组成)，其中α亚单位的分子量为75,000±3,000Da，且β亚单位的分子量为55,000±2,000Da；
b)底物特异性：对醛化合物具有活性；
c)辅因子：吡咯并喹啉醌(PQQ)和血红素c；
d)最适pH：从约6.5到约8.0(对于从L-山梨糖酮生成维生素C)或约9.0(对于从L-山梨糖酮生成2-酮-L-古洛糖酸)；
e)抑制剂：Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、一碘乙酸盐和叠氮化钠，
所述方法包括在液体营养培养基中于通气条件下培养能产生具有上述特性醛脱氢酶的属于葡糖杆菌属的微生物、破碎微生物细胞以及从破碎的微生物细胞的无细胞提取物中分离并纯化醛脱氢酶。
6.根据权利要求5的方法，其中反应是在pH约4.5到约9.0且温度约20℃到约50℃的条件下进行。
7.用于从醛糖生成其相应羧酸和/或其内酯的方法，其包括用醛与具有以下物理化学特性的经纯化醛脱氢酶接触：
a)分子量为190,000±15,000Da(由两个α亚单位和一个β亚单位的亚单位结构组成)或分子量为250,000±20,000Da(由两个α亚单位和两个β亚单位的亚单位结构组成)，其中α亚单位的分子量为75,000±3,000Da，且β亚单位的分子量为55,000±2,000Da；
b)底物特异性：对醛化合物具有活性；
c)辅因子：吡咯并喹啉醌(PQQ)和血红素c；
d)最适pH：从约6.5到约8.0(对于从L-山梨糖酮生成维生素C)或约9.0(对于从L-山梨糖酮生成2-酮-L-古洛糖酸)；
e)抑制剂：Co2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Mg2+、一碘乙酸盐和叠氮化钠，
或将醛与在电子受体存在下能够产生具有上述特性的醛脱氢酶的属于葡糖杆菌属的微生物中制备的无细胞提取物接触。
8.根据权利要求5到7中任意一项所述的方法，其中微生物为具有菌株氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)鉴定特性的氧化葡糖杆菌、其传代培养物或突变体。
9.根据权利要求8的方法，其中微生物为氧化葡糖杆菌DSM No.4025(FERM BP-3812)、其传代培养物或突变体。
10.权利要求7的方法，其中内酯为维生素C，羧酸为2-酮-L-古洛糖酸，且醛糖为L-山梨糖酮。
11.根据权利要求7到10中任意一项所述的方法，其中用于产生维生素C和2-酮-L-古洛糖酸的反应分别是在从约4.5到约9.0的pH值和从约20℃到约50℃的温度下进行。
12.根据权利要求7到11中任意一项所述的方法，其中用于产生维生素C的反应是在从约6.5到约8.0的pH值下进行，且用于产生2-酮-L-古洛糖酸的反应是在pH值约为9.0的条件下进行，且用于这两种生产方法的温度均为从约20℃到约50℃。
13.权利要求1的经纯化醛脱氢酶的用途，用于从醛糖产生其相应羧酸和/或其内酯的方法中，所述方法包括用所述纯化醛脱氢酶或在电子受体存在下能够产生所述醛脱氢酶的属于葡糖杆菌属的微生物中制备的无细胞提取物接触醛。
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