JP3245254B2 - 新規微生物及びこれを用いるヌートカトンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヌートカトンの新規な製
造法に関し、更に詳細には、ロドコッカス（Rhodococcu
s）属に属する微生物を利用するヌートカトンの製造法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】次の構造式（I）

【化１】 で表されるヌートカトンは、例えば、グレープフルーツ
果皮に存在するセスキテルペンケトンであり、グレープ
フルーツの特徴的な香味を有するため非常に注目されて
いる光学活性形（＋体）の天然香料物質である。

【０００３】このヌートカトンは香気が非常に強く、ｐ
ｐｂのオーダーで検出可能であるが、天然にはグレープ
フルーツ油成分中に１％以下しか含有されておらず、入
手が難かしく、その使用に際して量的な制限を受けてい
る高価な香料である。従って、ヌートカトンを経済的に
合成する方法の開発が強く要求されており、従来から種
々の合成法が研究されている。

【０００４】例えば、ヌートカトンの全合成反応として
は、４−アセチル−１−エトキシシクロヘキセン（Che
m. Commun. 1152貢、1968年）、４,４−ジエトキシカル
ボニルピメリン酸ジニトリル（Chem. Commun. 26貢、19
69年）、４−オキソピメリン酸ジメチル（J. Org. Che
m. 36巻、594貢、1971年）等から合成する方法が知られ
ている。しかしヌートカトンの全合成はその反応工程が
複雑で、多段階にわたり、収率も低く、学術的には興味
を持たれているが、工業的とは言えない。

【０００５】また、オレンジ油等から得られる次の構造
式（II）

【化２】 で表されるバレンセンの酸化によりヌートカトンを合成
する方法も知られている。例えば、三重項酸素または一
重項酸素を用いて酸化した後、酸化生成物（ヒドロキシ
パーオキシド）を脱水し、ヌートカトンを合成する方法
（特公昭４９−３５２６３号）や、第三級ブチルクロメ
ート（J.Food.Sci.30巻、876項、1965年）、無水クロム
酸ピリジン錯体（J.Org.Chem.34巻、3587貢、1969年）
等の酸化剤を用いて酸化する方法、或いは、有機重金属
触媒を用いて酸素または酸素含有ガスで酸化する方法
（特公昭５９−３１７２８号）等の方法が知られてい
る。

【０００６】しかしこれらの合成法も、中間酸化生成物
（ヒドロキシパーオキシド）が不安定であること、酸化
剤自身が高価であること、種々の副生成物が生じるこ
と、収率が悪いこと等から工業化に適しているとは言え
ない。

【０００７】一方、酵素或いは微生物菌体等の生体触媒
を用いて物質生産に用いる場合、化学合成法の様な副反
応が起こらず、選択的に目的化合物が得られる利点があ
ることが知られている。 特に目的化合物がヌートカト
ンの様に光学活性体である場合（（＋）体は（−）体の
１０００倍の香気を持つと言われている）、生体触媒に
よる生産は非常に有利な方法であると言える。

【０００８】また、酵素的或いは微生物により醗酵で調
製された香料は天然香料として分類され、近年の天然物
志向の面からもその需要は大きい。

【０００９】このような、微生物或いは植物を用い、バ
レンセンをヌートカトンへ変換する方法の例としては、
腸内細菌であるエンテロバクター（Enterobacter）を用
いる方法（Dragoco Rep. 20巻、 251貢、1974年）や、
かんきつ類（Citrus）を用いる方法（Plant Cell Rep.
３巻、37貢、1984年）が報告されている。

【００１０】しかし、これらの方法は、いずれもバレン
センの初発濃度が低く、工業的とは言えない。 また、
エンテロバクター等の腸内細菌を用いる方法には病原性
の心配があり、フレーバーとしての使用に支障をきたし
かねないという欠点もあった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従って、生体触媒を用
いてバレンセンをヌートカトンへ選択的に変換すること
ができ、しかも得られたヌートカトンをフレーバーとし
ての使用する際になんらの問題の無い方法の開発が求め
られていた。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、天然から
分離した種々の微生物についてその性質、作用を検索し
た結果、徳島県内で採取した土壌から得られたロドコッ
カス（Rhodococcus）属に属する微生物がバレンセンを
ヌートカトンに変換することを見い出し、本発明を完成
した。

【００１３】すなわち本発明は、ロドコッカス（Rhodoc
occus）属に属する微生物をバレンセンに作用させるこ
とを特徴とするヌートカトンの製造法を提供するもので
ある。

【００１４】本発明のロドコッカス属微生物は、バレン
センのアリル位酸化能を有するものであり、その代表的
微生物であるロドコッカス・エスピー（Rhodococcus s
p.）ＫＳＭ−５７０６株は、以下に示す様な菌学的性質
を有する。

【００１５】菌 学 的 性 質 ： （１）形態的性質 菌体の大きさが０.８〜１μｍ×１〜１０μｍの桿菌で
多形性を有する。 すなわち、培養初期には菌糸を作
り、その後断裂し、短桿菌様となる。 また、本株は非
運動性で、鞭毛は無い。 胞子は認められず、グラム陽
性で抗酸性はない。

【００１６】（２）培養的性質 （ａ）肉汁寒天平面培養 良好に生育し、乳白色不透明、表面滑らかで光沢があ
り、円錐型隆起のある集落を形成する。 集落の形状は
円形である。 （ｂ）肉汁寒天斜面培養 良好に生育し、乳白色を呈する。 （ｃ）肉汁液体培養 表面上層、下層ともに生育する。 （ｄ）肉汁ゼラチン穿刺培養 良好に生育し、ゼラチンを液化した。 （ｅ）リトマスミルク リトマス色素を紫色から青色に変化させる。 ミルクの
変化は認められなかった。

【００１７】（３）生理学的性質 （ａ）硝酸塩の還元； 陽性 （ｂ）脱窒反応； 陰性 （ｃ）ＭＲテスト； 陰性 （ｄ）ＶＰテスト； 陰性 （ｅ）インドールの生成； 陰性 （ｆ）硫化水素の生成； 陰性 （ｇ）澱粉加水分解反応； 陽性 （ｈ）クエン酸の作用； シモンズ培地； 陽性 クリステンセン培地； 陽性

【００１８】（ｉ）硝酸塩の利用； 陽性 （ｊ）アンモニウム塩の利用；陽性 （ｋ）色素の生成； キングＡ培地； 陰性 キングＢ培地； 陰性 （ｌ）ウレアーゼ； 陽性 （ｍ）オキシダーゼ； 陽性 （ｎ）カタラーゼ； 陽性

【００１９】（ｏ）生育ｐＨ範囲； 生育ｐＨ ４.５〜１０ 至適ｐＨ ５〜７ （ｐ）生育温度範囲； 生育温度 ６〜３７℃ 至適温度 ２０〜３０℃ （ｑ）酵素に対する態度；好気的であるが、静置条件下
でも充分生育できる。 （ｒ） ＯＦテスト；無反応 （ＢＴＢ指示薬で反応せ
ず） （ｓ）ＮａＣｌ含有培地における生育；食塩濃度が、５
％及び７％のいずれにおいても生育する。

【００２０】（ｔ）炭素源の利用性； Ｌ−アラビノース − Ｄ−キシロース − Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース − Ｄ−フラクトース ＋ Ｄ−ガラクトース − マルトース ＋（弱い） シュクロース ＋

【００２１】ラクトース − トレハロース ＋ Ｄ−ソルビトール ＋ Ｄ−マンニトール ＋ イノシトール ＋ グリセロール ＋ スターチ ＋（弱い） Ｄ−リボース ＋ ただし、＋は利用する、−は利用しない。

【００２２】（４）化学分類学的性質 （ａ）グリコレートテスト グリコリル型 （ｂ）細胞壁の架橋アミノ酸 メソ（meso）−２,６−ジアミノピメリン酸 （ｃ）アラビノース、ガラクトースが検出されるが、キ
シロースは検出されない。 （ｄ）メナキノンシステム ＭＫ−８（Ｈ₂）

【００２３】以上の菌学的性質を、バージーズ・マニュ
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Be
rgey's Manual of Systematic Bacteriology）、第２巻
（1986）に照らし、本菌株の分類学的位置を調べたとこ
ろ、ＫＳＭ−５７０６株はロドコッカス属に属する微生
物であることが判明した。

【００２４】そしてＫＳＭ−５７０６株の上記菌学的性
質は、公知のロドコッカス属微生物の何れとも異なって
いるので、本発明者らはこれを新規な菌株と判断し、工
業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した（受託番号
ＦＥＲＭ Ｐ−１３４５０）。

【００２５】上記のようにして得られる本発明のロドコ
ッカス属微生物は、バレンセンのアリル位を特異的に酸
化し、これをヌートカトンに変換する能力を有するの
で、当該微生物をバレンセンに作用させることにより有
利にヌートカトンを得ることが出来る。

【００２６】本発明において、バレンセンへのロドコッ
カス属微生物の作用方法については特に制限に無く、バ
レンセンを含有する培地にて当該微生物を培養する方
法、当該微生物の培養菌体にバレンセンを添加する方
法、当該微生物の休止菌体または固定化菌体、破砕菌体
等にバレンセンを接触させる方法によりヌートカトンを
得ることが出来る。

【００２７】本発明微生物を培養させるために用いる培
地としては、炭素源として、フラクトース、マルトー
ス、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、グリ
セロール、グルコース、シュクロース、リボース、イノ
シトール等、窒素源としてペプトン、酵母エキス、尿
素、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、アミノ酸等
を、無機塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化カルシウム等や、また必要に応じてＭｎ²⁺、Ｚ
ｎ²⁺、Ｎｉ²⁺等の金属塩、ビオチン、チアミン等のビタ
ミン類等を適宜加えたものが用いられる。

【００２８】また、培養条件には特に制限はないが、一
般的に２０〜３０℃程度の温度、５〜７程度のｐＨで振
盪撹拌または通気撹拌を行いつつ実施すれば良い。

【００２９】このようにして得られた本発明微生物の培
養菌体を休止菌体とする方法としては、通常の方法を用
いれば良く、例えば、培養菌体を適当な緩衝液または脱
イオン水で洗浄する方法が挙げられ、具体的には、遠心
分離或いは濾過等により培養液から分離した菌体を緩衝
液もしくは脱イオン水に再懸濁させる方法が挙げられ
る。

【００３０】上述のようにして得られた微生物菌体をバ
レンセンに作用させるには、菌体数を増加させた培養液
にバレンセンを加えた後、または休止菌体を適当な緩衝
液または脱イオン水に懸濁させこれにバレンセンを加え
た後、振盪撹拌または通気撹拌し、変換反応を行わしめ
れば良い。

【００３１】変換反応において用いる菌体の数には制限
はないが、一般には、菌体懸濁液の濃度が６００ｎｍ
における吸光度で２０〜８０程度になるように調整すれ
ば良い。 また、この反応における撹拌は、１００〜４
００ｒｐｍ程度、懸濁液の温度は２０〜３０℃程度と
し、約７２〜１２０時間程度反応させれば良い。

【００３２】上述のようにして得られた変換反応物から
目的物であるヌートカトンを分離、採取するには公知の
精製手段、例えば、カラムクロマトグラフィー、高速液
体クロマトグラフィー等の精製手段を単独または組み合
わせて用いれば良い。

【００３３】

【発明の効果】本発明によれば、化学合成反応に見られ
るような種々の副反応を生起させることなくバレンセン
からヌートカトンを選択的に製造することができる。
また、これまでに報告されている腸内細菌によるヌート
カトンへの変換反応と異なり、病原性の懸念のないヌー
トカトンの製造が可能となる。

【００３４】

【実施例】次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるも
のではない。

【００３５】実 施 例 １ 徳島県の土壌を薬匙１杯（約０.５〜１ｇ）取り、これ
を１０ｍｌの滅菌脱イオン水に懸濁後、適当に希釈す
る。 後記培地Ａ、１０ｍｌを含む大型試験管にこの希
釈物を添加し、３０℃で５日間、振盪培養することによ
り集積培養を行った。 この培養物を培地Ａに５％寒天
を加えて調製した平板培地に塗布し、バレンセン質化能
を有する菌株を分離した。

【００３６】分離したバレンセン質化性菌株を再度、下
記培地Ａ １０ｍｌを含む大型試験管に接種し、３０℃
で５日間、振盪培養を行った。 得られた培養液を酢酸
エチルで抽出した後、酢酸エチル可溶画分をガスクロマ
トグラフィーに付し、生産物の定量を行った（図１）。
その結果、バレンセンを資化し、ヌートカトンを生産
する菌株としてＫＳＭ−５７０６株を得た。

【００３７】（ 培 地 Ａ ） ＦｅＣｌ₃ ６ ｍｇ ＭｇＣｌ₂ ８０ ｍｇ ＣａＣｌ₂ ７５ ｍｇ ＮＨ₄ＮＯ₃ ３.５ ｍｇ Ｎａ₂ＳＯ₄ ０.７１ｍｇ チアミン塩酸塩 １ ｍｇ ビオチン ０.０１ｍｇ バレンセン １０ ｇ ５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７）で全量を１リットル
とする。

【００３８】実 施 例 ２ 実施例１で得られた生成物を溶媒抽出後、分析、同定を
行い、これをヌートカトンであると決定した。 分析デ
ータのうち、ＧＣ−ＭＳ スペクトルを図２に、生成物
とヌートカトンとのＭＳスペクトルの比較を図３に示
す。

【００３９】実 施 例 ３ 実施例１で得られたＫＳＭ−５７０６株を下記培地Ｂの
寒天斜面培地で３日間、３０℃で培養した。 これを前
記培地Ａ、１０ｍｌを含む大型試験管に接種した。 ３
０℃で２日間振盪培養し、これを前培養液とした。 こ
の前培養液０.５ｍｌ を前記培地Ａを５０ｍｌ含む５０
０ｍｌ 容坂口フラスコに接種し、３０℃で４日間振盪
培養を行った。 得られた培養液を酢酸エチルで抽出
し、その酢酸エチル可溶画分をガスクロマトグラフィー
で定量した結果、ヌートカトン ０.５ｍｇが得られた。

【００４０】（ 培 地 Ｂ ） ポリペプトン（カゼインペプトン） １７ｇ ポリペプトンＳ （大豆ペプトン） ３ｇ Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２.５ｇ グルコース ２.５ｇ ＮａＣｌ ５ｇ 寒 天 １５ｇ 精製水で全量を１リットルとする。

【００４１】実 施 例 ４ 前記培地Ｂの寒天斜面培地で３日間、３０℃で培養した
ＫＳＭ−５７０６株を下記培地Ｃ１０ｍｌを含む大試験
管に接種した。 ３０℃で２日間振盪培養し、これを前
培養液とした。 この前培養液１.０ｍｌを後記培地Ｃを
それぞれ１００ｍｌ含む２本の５００ｍｌ容坂口フラス
コに接種し、３０℃で２日間振盪培養行った。

【００４２】得られた培養液２００ｍｌを遠心分離（１
２,０００×ｇ、１０分間）し、得られた菌体を５０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）で２回洗浄し、同緩衝液
５０ｍｌに懸濁し、休止菌体懸濁液とした。 この休止
菌体懸濁液５０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコにと
り、これにバレンセン５００ｍｇを加え、３０℃で４日
間ロータリーシェーカーで振盪培養を行った。 得られ
た培養液を５０ｍｌ酢酸エチルで抽出し、その酢酸エチ
ル可溶画分をガスクロマトグラフィーで定量した結果、
ヌートカトン２.５ｍｇが得られた（図４）。

【００４３】（ 培 地 Ｃ ） ポリペプトン（カゼインペプトン） １７ｇ ポリペプトンＳ（大豆ペプトン） ３ｇ Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２.５ｇ グルコース ２.５ｇ ＮａＣｌ ５ｇ 精製水で全量を１リットルとする。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１の生成物についてのガスクロマトグ
ラフィー（ＧＣ）を示す図面。

【図２】 実施例１の生成物中、ヌートカトンを含む画
分のＧＣ−ＭＳスペクトルを示す図面。

【図３】 実施例１の生成物中、ヌートカトンを含む画
分と、ヌートカトン標品のＭＳスペクトルの比較を示す
図面。

【図４】 実施例４の生成物についてのＧＣを示す図
面。 以 上

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 太島 勝比古 千葉県千葉市美浜区高浜４−10−25− 108 (72)発明者 伊藤 進 栃木県宇都宮市東峰町3441−64 (56)参考文献 特開 昭55−45649（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−346925（ＪＰ，Ａ) Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｓ，Ｖｏｌ．３（1984），Ｎｏ．１, ｐ．37−40 Ｊ．Ａｇｒｌｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅ ｍ．，Ｖｏｌ．41（1993 Ｏｃｔ．）, Ｎｏ．10，ｐ．1566−1569 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 1/20 C12P 7/26 C12R 1:01 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バレンセンのアリル位酸化能を有し、下
   記の菌学的性質を有するロドコッカス（Rhodococcus)
   属に属する微生物。（１）形態的性質 菌体の大きさが０.８〜１μｍ×１〜１０μｍの桿菌で
   多形性を有する。 すなわち、培養初期には菌糸を作
   り、その後断裂し、短桿菌様となる。 また、本株は非
   運動性で、鞭毛は無い。 胞子は認められず、グラム陽
   性で抗酸性はない。 （２）培養的性質 （ａ）肉汁寒天平面培養 良好に生育し、乳白色不透明、表面滑らかで光沢があ
   り、円錐型隆起のある集落を形成する。 集落の形状は
   円形である。 （ｂ）肉汁寒天斜面培養 良好に生育し、乳白色を呈する。 （ｃ）肉汁液体培養 表面上層、下層ともに生育する。 （ｄ）肉汁ゼラチン穿刺培養 良好に生育し、ゼラチンを液化した。 （ｅ）リトマスミルク リトマス色素を紫色から青色に変化させる。 ミルクの
   変化は認められなかった。 （３）生理学的性質 （ａ）硝酸塩の還元； 陽性 （ｂ）脱窒反応； 陰性 （ｃ）ＭＲテスト； 陰性 （ｄ）ＶＰテスト； 陰性 （ｅ）インドールの生成； 陰性 （ｆ）硫化水素の生成； 陰性 （ｇ）澱粉加水分解反応； 陽性 （ｈ）クエン酸の作用； シモンズ培地； 陽性 クリステンセン培地； 陽性 （ｉ）硝酸塩の利用； 陽性 （ｊ）アンモニウム塩の利用；陽性 （ｋ）色素の生成； キングＡ培地； 陰性 キングＢ培地； 陰性 （ｌ）ウレアーゼ； 陽性 （ｍ）オキシダーゼ； 陽性 （ｎ）カタラーゼ； 陽性 （ｏ）生育ｐＨ範囲； 生育ｐＨ ４.５〜１０ 至適ｐＨ ５〜７ （ｐ）生育温度範囲； 生育温度 ６〜３７℃ 至適温度 ２０〜３０℃ （ｑ）酵素に対する態度； 好気的であるが、静置条件下でも充分生育できる。 （ｒ） ＯＦテスト； 無反応 （ＢＴＢ指示薬で反応せず） （ｓ）ＮａＣｌ含有培地における生育； 食塩濃度が、５％及び７％のいずれにおいても生育す
   る。 （ｔ）炭素源の利用性； Ｌ−アラビノース − Ｄ−キシロース − Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−マンノース − Ｄ−フラクトース ＋ Ｄ−ガラクトース − マルトース ＋ （弱い）シュクロース ＋ ラクトース − トレハロース ＋ Ｄ−ソルビトール ＋ Ｄ−マンニトール ＋ イノシトール ＋ グリセロール ＋ スターチ ＋（弱い） Ｄ−リボース ＋ ただし、＋は利用する、−は利用しない。 （４）化学分類学的性質 （ａ）グリコレートテスト グリコリル型 （ｂ）細胞壁の架橋アミノ酸 メソ（meso）−２,６−ジアミノピメリン酸 （ｃ）アラビノース、ガラクトースが検出されるが、キ
   シロースは検出されな い。 （ｄ）メナキノンシステム ＭＫ−８（Ｈ ₂ ）
2. 【請求項２】 ロドコッカス・エスピーＫＳＭ−５７０
   ６株（生命工学工業技術研究所 受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ
   −１３４５０）である請求項第１項記載の微生物。
3. 【請求項３】 請求項第１項記載のロドコッカス属に属
   する微生物をバレンセンに作用させることを特徴とする
   ヌートカトンの製造法。
4. 【請求項４】 ロドコッカス属に属する微生物が、ロド
   コッカス・エスピーＫＳＭ−５７０６株（生命工学工業
   技術研究所 受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１３４５０）であ
   る請求項第３項記載のヌートカトンの製造法。