JP2993766B2

JP2993766B2 - ｓｅｃ−セドレノールの製造法

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Publication number: JP2993766B2
Application number: JP15954091A
Authority: JP
Inventors: 浩美久保田; 博文滝川; 芳明藤倉; 進伊藤
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1991-04-02
Filing date: 1991-06-04
Publication date: 1999-12-27
Anticipated expiration: 2014-12-27
Also published as: JPH04365488A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、sec−セドレノールの
新規な製造法に関し、更に詳細には、ロドコッカス属に
属する微生物を利用するsec−セドレノールの製造法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】次の構造式（I）

【化１】で表されるsec−セドレノールは、セスキテルペンアル
コールであり、このものは天然には存在せず、これを取
得する方法としては、セダー油中等に存在し、かつ、次
の構造式（II）

【化２】で表されるα−セドレンを、酸化触媒である樹脂酸（ B
lumann etal. Ber. 62,1698(1929))の存在下で、化学変
換することによって合成する方法が知られているにすぎ
ない（加藤、香料 No.123, 31頁(1978)）。

【０００３】しかしながら、この方法は反応に長時間を
要し、また、副生成物が多く、その分離が煩雑であると
いう欠点もあり、工業的な方法とはいえなかった。更
に、酵素あるいは微生物菌体を利用してsec−セドレノ
ールを生産する方法は、従来知られていなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来、化学合成法によ
っては種々の副反応が生じ、選択的に目的化合物が得ら
れない場合、酵素あるいは微生物菌体等の生体触媒を利
用した方法を用いると、選択的反応が可能である場合も
多いことが知られており、上記sec−セドレノールにつ
いても、α−セドレンに生体触媒を作用させることよ
り、これを選択的に製造する方法の開発が求められてい
た。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、α−セド
レンからsec−セドレノールを有利に調製する方法につ
いて鋭意研究をかさねた結果、和歌山県内で採取した土
壌中から得られたロドコッカス属に属する微生物が、α
−セドレンを選択的かつ高収率でsec−セドレノールに
変換することを見出し、本発明を完成した。

【０００６】すなわち本発明は、ロドコッカス（Rhodoc
occus）属に属する微生物をα−セドレンに作用させる
ことを特徴とするsec−セドレノールの製造法を提供す
るものである。

【０００７】ロドコッカス属に属する微生物をα−セド
レンに作用させる方法としては、特に制限はなく、例え
ば、当該微生物をα−セドレンを含む培地中で培養する
方法、当該微生物の休止菌体、固定菌体、破砕菌体等に
α−セドレンを接触させる方法等が挙げられ、かくする
ことにより、sec−セドレノールを得ることができる。
また、菌体を繰り返しα−セドレンに接触させることに
よって、効果的にsec−セドレノールを得ることができ
る。

【０００８】本発明において用いられる、ロドコッカス
属に属する微生物は、α−セドレンのアリル位酸化能を
有するものであり、代表例微生物であるロドコッカス・
エスピーＫＳＭ−７３５８株は、以下に示すような菌
学的性質を有する。

【０００９】菌学的性質：（１）形態的性質菌体の大きさが０.８〜１.０×１.０〜１２μｍの桿菌
で、多形性を有する。すなわち、培養初期には分枝した
菌糸を作り、その後断裂し、短桿菌様となる。また、本
株は非運動性で、鞭毛はない。胞子は認められず、グ
ラム陽性で、抗酸性はない。

【００１０】（２）培養的性質（ａ）肉汁寒天平面培養；良好に生育し、乳白色不透明
の、表面粗造で円錐型隆起のある集落を形成し、培養後
期には、肌色ないしは淡いオレンジ色を呈する。集落
の形状は円形縮毛状で周縁は波状である。（ｂ）肉汁寒天斜面培養；良好に生育し、乳白色を呈す
る。（ｃ）肉汁液体培養；生育は弱いが、培養液の表面上層
であっても下層であっても生育する。（ｄ）肉汁ゼラチン穿刺培養；良好に生育する。液化
は認められない。（ｅ）リトマスミルク；上層のみ液化する。リトマス
色素を紫色からピンク色に変化させ、一部脱色反応が認
められる。

【００１１】（３）生理学的性質（ａ）硝酸塩の還元；陰性（硝酸塩
肉汁培地）（ｂ）脱窒反応；陰性（ｃ）ＭＲテスト；陰性（ｄ）ＶＰテスト；陰性（ｅ）インドール生成；陰性（ｆ）硫化水素の生成；弱い陽性（ｇ）澱粉加水分解；陰性（ｈ）クエン酸の利用；コーサー培地：陽性クリステンセン培地：陽性（ｉ）硝酸塩の利用；陽性（ｊ）アンモニウム塩の利用；陽性（ｋ）色素の生成；キングＡ培地：陰性キングＢ培地：陰性（ｌ）ウレアーゼ；陽性（ｍ）オキシダーゼ；陰性（ｎ）カタラーゼ；陽性（ｏ）生育ｐＨ範囲；生育ｐＨ３〜１０生育至適ｐＨ５〜９.０（ｐ）生育温度範囲；生育温度１０〜３７℃ 至適生育温度２５〜３０℃ （ｑ）酸素に対する態度；好気的であるが、静置条件
下でも充分生育できる。（ｒ）ＯＦテスト；弱い酸化型（アンドレード指示薬
では判別できるが、ＢＴＢ指示薬を用いた場合は、７日
培養しても変化は認められない）（ｓ）ＮａＣｌ含有培地における生育食塩濃度が、５％および７％のいずれにおいても生育す
る。

【００１２】（ｔ）炭素源の利用性：Ｌ−アラビノース − Ｄ−キシロース − Ｄ−グルコース＋Ｄ−マンノース＋（弱い）Ｄ−フラクトース＋Ｄ−ガラクトース − マルトース＋（弱い）シュクロース＋ラクトース − トレハロース＋（弱い）Ｄ−ソルビトール＋Ｄ−マンニトール＋イノシトール＋グリセロール＋（弱い）スターチ − Ｄ−リボース＋ただし、＋；利用する、−；利用しない。

【００１３】（４）化学分類学的性質（ａ）グリコレートテストグリコリル型（ｂ）細胞壁の架橋アミノ酸meso −２,６−ジアミノピメリン酸（ｃ）細胞壁構成糖アラビノース、ガラクトースが検出されるが、キシロー
スは検出されない。（ｄ）メナキノンシステムＭＫ−８（Ｈ₂）

【００１４】以上の菌学的性質を、バージーズ・マニュ
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（Berge
y's Manual of Systematic Bacteriology）、第２巻（1
986）に照らし、本菌株の分類学的位置を求めたとこ
ろ、ＫＳＭ−７３５８株はロドコッカス属に属する微生
物であることが判明した。そして、ＫＳＭ−７３５８株
の上記菌学的性質は、公知のロドコッカス属微生物の何
れとも異なっているので、本発明者らはこれを新規な菌
株と判断し、１９９１年２月２５日付で工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託した（受託番号微工研菌寄第12
039号；FERM P-12039)。

【００１５】上記のようにして得られる微生物を用い、
本発明方法を実施するには、まず、当該微生物を培養し
てその菌体数を増加せしめることが有利である。

【００１６】本発明で用いる微生物の培養に用いる培地
としては、炭素源として、フラクトース、マルトース、
トレハロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロ
ール、グルコース、シュクロースなどの糖類、セダー
油、セドレンなどのセスキテルペンまたはｎ−アルカン
など、窒素源としてペプトン、酵母エキス、尿素、硝酸
ナトリウム、硫酸アンモニウム、アミノ酸などを、無機
塩としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化
カルシウムなどや、また必要に応じてＭｎ²⁺、Ｚｎ²⁺、
Ｎｉ²⁺等の金属塩、ビオチン、チアミンなどのビタミン
類等を適宜加えたものが用いられる。

【００１７】また、培養の条件には、特に制限はない
が、一般には、２５〜３０℃程度の温度、５.０〜９.
０程度のｐＨで、振盪攪拌または通気攪拌を行ないつつ
実施すればよい。

【００１８】叙上のごとくして得られた微生物菌体をα
−セドレンに作用させるには、菌体数を増加させた培養
液にα−セドレンを加えた後培養するか、あるいはこの
菌体を休止菌体とし、これを適当な緩衝液または脱イオ
ン水に懸濁させた後、α−セドレンを加え、振盪攪拌ま
たは通気攪拌して変換反応をおこなわしめれば良い。

【００１９】培養微生物の菌体を休止菌体とするには、
公知の方法を利用すればよく、例えば、培養菌体を適当
な緩衝液または脱イオン水で洗浄する方法が挙げられ、
具体的には、遠心分離あるいは濾過等により培養液から
分離した菌体を緩衝液もしくは脱イオン水に再懸濁させ
る方法が挙げられる。

【００２０】本発明の反応において、用いる菌体の数に
は特に制限はないが、一般には、菌体懸濁液の濃度が、
６００ｎｍにおける吸光度で約２０〜８０程度となる
ように調製すれば良い。また、この反応における攪拌
は、１００〜４００ｒｐｍ程度、懸濁液の温度は、２５
〜３０℃程度とし、約２４〜９６時間程度反応を実施す
れば良い。

【００２１】叙上の如くして得られた変換反応物から目
的物であるsec−セドレノールを分離、採取するには、
公知の精製手段、例えば、カラムクロマトグラフィー、
高速液体クロマトグラフィー、再結晶等の精製手段を単
独または組み合わせて用いれば良い。

【００２２】

【発明の効果】本発明方法によれば、従来の方法では長
時間を要し、かつ、副生成物を含んだ状態でしか得られ
なかったsec−セドレノールを効率よく、しかも短時間
で副生成物をほとんど含まずに製造することが可能とな
る。また従来、生体触媒反応では得ることのできなかっ
たsec−セドレノールを温和な条件で製造することが可
能となる。

【００２３】

【実施例】次に実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明す
る。実施例１和歌山県勝浦市の土壌を薬匙１杯（約０.５〜１ｇ）取
り、これを１０ｍｌの滅菌脱イオン水に懸濁後、適当に
希釈する。後記培地Ａ、１０ｍｌを含む大型試験管に
この希釈物を添加し、３０℃で、５日間振盪培養するこ
とにより集積培養を行なった。この培養物を、培地Ａ
に１.５％寒天を加えて調製した平板培地に塗布し、α
−セドレン資化能を有する菌株を分離した。分離したα
−セドレン資化性菌株を、再度培地Ａ１０ｍｌを含む
大型試験管に接種し、３０℃で５日間振盪培養を行なっ
た。得られた培養液をヘキサンで抽出した後、ヘキサ
ン可溶画分をガスクロマトグラフィーに付し、生産物の
定量を行なった。その結果、α−セドレンを資化し、s
ec−セドレノールを生産する菌株としてＫＳＭ−７３５
８株を得た。

【００２４】［培地Ａ］Ｎａ₂ＳＯ₄ ０.７１ｇＮＨ₄ＮＯ₃ ３.５ｇＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ０.０１ｇ（別滅菌）ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ０.１７ｇ（別滅菌）ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂ＯＯ.１ｇ（別滅菌） α−セドレン１０ｇ（無菌的に別添加） ───────────────────────────── ５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で全量を１ｌ
とする。

【００２５】実施例２実施例１で得た生成物を精製した後、分析、同定を行な
い、これをsec−セドレノールであると決定した。分
析、同定データのうち、ＥＩ−ＭＳスペクトルを図１
に、ＩＲスペクトル（ＫＢｒ）を図２に、¹Ｈ-ＮＭＲス
ペクトル（ＣＤＣｌ₃, ４００ＭＨｚ）を図３に、¹³Ｃ-
ＮＭＲスペクトルを図４にそれぞれ示す。

【００２６】実施例３（１）３本の５００ｍｌ容坂口フラスコに、下記培地Ｃ
１００ｍｌを各々取り、これに下記培地Ｂ中で、３０
℃の条件下、３日間斜面培養したＫＳＭ−７３５８株を
それぞれ接種した。３０℃で２日間振盪培養を行なった
後、得られた培養液３００ｍｌを５℃で１０分間遠心分
離し（１２,０００×ｇ）、得られた菌体を冷却した３
００ｍｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７.０）で２回
洗浄し、同緩衝液に適当な濃度（６００ｎｍにおける吸
光度で約４０に相当）となる様に懸濁させ、休止菌体懸
濁液を得た。

【００２７】［培地Ｂ］ポリペプトン（カゼインペプトン）１７ｇポリペプトンＳ（大豆ペプトン）３ｇＫ₂ＨＰＯ₄ ２.５ｇグルコース２.５ｇＮａＣｌ５ｇ寒天１５ｇ ───────────────────────────── 精製水で全量を１ｌとする（滅菌後のｐＨは７.
１〜７.５）。

【００２８】［培地Ｃ］ポリペプトン（カゼインペプトン）１７ｇポリペプトンＳ（大豆ペプトン）３ｇＫ₂ＨＰＯ₄ ２.５ｇグルコース２.５ｇＮａＣｌ５ｇ ────────────────────────────── 精製水で全量を１ｌとする（滅菌後のｐＨは７.
１〜７.５）。

【００２９】（２）上記（１）で得られた休止菌体懸
濁液５０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに取り、これ
にα−セドレン２５０ｍｇを添加後、３０℃で２日
間、ロータリーシェーカーを用いて１３０ｒｐｍで振盪
を行なった。得られた反応液を５０ｍｌのヘキサンで
抽出し、この抽出物についてガスクロマトグラフィーを
行ない、sec−セドレノールの生成を確認した。（図
５）このヘキサン抽出物をシリカゲルでクロマト濾過
し、低温下で再結晶することにより精製して、sec−セ
ドレノール２００ｍｇを得た。

【００３０】実施例４実施例１で得られたＫＳＭ−７３５８株を前記培地Ｂの
斜面培地で、３日間、３０℃で培養した。これを５０
０ｍｌ容坂口フラスコ中の、０.５％ α−セドレンを含
有する前記培地Ａ５０ｍｌに接種した。３０℃で２日
間培養を行ない、これを前培養とした。この前培養液
０.５ｍｌを０.５％ α−セドレンを含む培地Ａ５０ｍ
ｌ（５００ｍｌ坂口フラスコ中）に接種し、３０℃で４
日間振盪培養を行なった。得られた培養物をヘキサンで
抽出し（図６）、そのヘキサン可溶画分をガスクロマト
グラフィーで定量した結果、sec−セドレノール２５ｍ
ｇが得られた。

【００３１】実施例５実施例１で得られたＫＳＭ−７３５８株を前記培地Ｂの
斜面培地で、３０℃の温度で３日間培養した。これを
５００ｍｌ容坂口フラスコ中の５０ｍｌの培地Ｃに接種
した。３０℃で１日間培養を行ない、これにα−セド
レノールを０.５％になるように添加し、更に２日間培
養を行なった。得られた培養液をヘキサンで抽出し、そ
のヘキサン可溶画分をガスクロマトグラフィーで定量し
た。この結果、sec−セドレノール８０ｍｇが得られ
た。

【００３２】実施例６実施例１で得られたＫＳＭ−７３５８株を前記培地Ｂの
斜面培地で、３０℃の温度で３日間培養後、５００ｍｌ
容坂口フラスコ中の１００ｍｌの培地Ｃに接種し、２日
間、３０℃で振盪培養した。この培養液２５ｍｌを、
予め滅菌した５リットル容ジャーファーメンター中の培
地Ｃ２.５ｌに接種し、通気量１ｖｖｍ、回転数４０
０ｒｐｍで通気撹拌した。２４時間後、実施例３と同様
な手順で休止菌体懸濁液１.４ｌを調製した。この懸
濁液に、α−セドレン７ｇを添加し、４００ｒｐｍ、
１ｖｖｍ、３０℃の条件で通気撹拌した。その後、２
４時間ごとにα−セドレンを７ｇずつ逐次添加し、計３
５ｇのα−セドレンより２４ｇのsec−セドレノールを
取得した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 sec−セドレノールのＥＩ−ＭＳスペクトル

【図２】 sec−セドレノールのＩＲスペクトル

【図３】 sec−セドレノールの¹Ｈ-ＮＭＲスペクトル

【図４】 sec−セドレノールの¹³Ｃ-ＮＭＲスペクトル

【図５】 sec−セドレノールのガスクロマトグラフ
（休止菌体反応）

【図６】 sec−セドレノールのガスクロマトグラフ
（培養４日）以上

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 7/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ロドコッカス（Rhodococcus）属に属す
る微生物をα−セドレンに作用させることを特徴とする
sec−セドレノールの製造法。
【請求項２】ロドコッカス属に属する微生物が、ロド
コッカス・エスピーＫＳＭ−７３５８株である請求項第
１項記載のsec−セドレノールの製造法。