JPS62248482A - 新規微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する新
規な微生物に関する。

従来技術及び問題点 下記式（１）で示されるジクロルビニル菊酸の光学活性
体を取得する 方法としては、有機合成化学的分割法および酵素を用い
た分割法が知られ−ているが、前者では、比較的高価な
光学活性試薬および煩雑な工程を必要とすること、後者
では、高価な豚肝エステラーゼを必要とする（例えば５
ｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｗ、　Ｉｎ
ｔ、Ｅｄ。

Ｅｎｇｌ、（１９８４）２３：６４−６６参照）ことな
どの点から、有利な光学分割法の開発が望まれている。

豚肝エステラーゼの代わりに微生物菌体を用いた方法も
試みられている（公開特許公報６Ｏ−２４４２９５）が
、その収量は微生物培養液１００ｍ　ｌ当たり３１．２
ｍｇ程度であり、工業的に使用するには不十分なもので
ある。

本発明の説明 そこで本発明者らは、斯かる現状に臨み、下記式（ｎ）
で示されるジクロルビニル菊酸エチルを白 効率良く、また光学選択性よく、不斉加水分解する能力
を有する微生物を自然界より広く検索した結果、パシラ
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物中に斯かる能
力を有するものがあることを見い出し、本発明を完成す
るに至った。

すなわち、本発明は、バシラス（Ｂａｃ旦％属に属し、
ジクロルビニル菊酸エチルを不斉加水分解して、（＋）
−１−ランス−ジクロルビニル菊酸を生成する能力を有
する新規なバシラス　エスピーＤＣ−１」旦旦１ｕｓ　
ｓｐ、　ＤＣ−１）　　（微工研菌寄第８７１９号）に
関するものである。

次に、本発明者らが、分離・採取した本菌株の菌学的性
質を詳述する。

（ａ）形態 ■）細胞の形態および大きさ：桿状で（０，５〜０．６
）μｆｆ１Ｘ（１，２〜１．７） μｍ、単独または２ 〜３個の連鎖をなす。

２）多形性：なし ３）運動性：あり　　　周鞭毛を有する４）胞子の形成
：あり　球状あるいはやや卵形で、直径０．４〜０．６
μｍ、栄養 細胞の末端に形成されふく らみを有する。

５）ダラム染色：陰性 ６）抗酸性：なし くｂ）各種培地における生育状態 １）肉汁寒天平板培地（３５℃、２４時間）形　状　二
　円形 周　縁　：　なし 隆　起　：　凸状 光　沢　：　あり 表　面　：　平滑 色　調　：　半透明で黄白色 ２）肉汁寒天斜面培養（３５℃、２４時間）生育度　：
　普通　拡布状またはじゆず状に生育 表　面　：　平滑 色　調　二　半透明で黄白色 光　沢　：　あり ３）肉汁液体培養（３５℃、２４時間）生育度　：　普
通 着色・脱色：なし 表面生育：　菌環は形成しない 沈　渣　：　生じる ４）肉汁ゼラチン穿刺培養（３５℃、１４日間）ゼラチ
ンを液化しない ５）リドマスミルク培地（３５℃、１４日間）わずかに
アルカリ化し、凝固およびペプトン化しない。

（Ｃ）生理学的性質 ３５℃、１〜５日間培養。陰性のものは１４日間まで観
察。

１）硫酸塩の還元：陽性 硫酸を還元し、亜硝酸を生成す る。

２）脱窒反応：陰性 ３）ＭＲテスト：陰性 ４）ＶＰテスト：陰性 ５）インドールの生成：陰性 ６）硫化水素の生成：陰性 ７）デンプンの加水分解：陰性 ８）クエン酸の利用 Ｋｏｓｅｒの培地：陰性 Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの培地：陽性 ９）無機・窒素源の利用 山王らによる５ｔａｎｉｅｒらの培地の変法（Ｙａｍａ
ｚａｔｏ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ａｐｐｌ、
　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

（１９８２）　２８：　１９５−２１３）を用い、コハ
ク酸ナトリウムを炭素源として使用した。

硝酸塩　：　利用しない アンモニウム塩：利用する １０）色素の生成　生成しない １１）ウレアーゼ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎの尿素培地：陽性１２）オキシ
ターゼ：陽性 １３）カラターゼ：陽性 １４）生育の範囲 生育温度＝１０〜４５℃（最適３０〜３５℃）生育ｐＨ
：６．ｏ〜９．５（最適８．５〜９．０）１５）酸素に
対する態度：好気的にのみ生育する１６）ＯＦテスト：
陰性 １７）糖類からの酸・ガスの生成 酸　　ガス ■　Ｌ−アラビノース　　−− ■　Ｄ−キシロース　　　−− ■　Ｄ−グルコース　　　−　　　− ■　Ｄ−マンノース　　　−　　　− ■　Ｄ−フラクトース　　−− ■　Ｄ−ガラクトース　　−　　　− ■　麦芽糖　　　　　　　−− ■　シーｆｆ［−− ■　乳糖　　　　　　　　−− ［相］　トレハロース　　　　−− 〇　Ｄ−ソルビトール　　−− ＠　Ｄ−マンニット　　　−− ■　イノシフト　　　　　−□　　　−■　グリセリン
　　　　　−− ■　デンプン　　　　　　−− 以上の菌学的性質を有する菌について、パージエイズ・
マニュアル・オプ・デターミイネイティブ・バタテリオ
ロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅ
Ｌｅｒ−ｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
）第８版（１９７４年）に基づき検索した結果、好気的
条件下に生育する有胞子桿菌であることから、バシラス
（ＢａｃｉＵｍ属に属する菌株と同定した。また、本菌
株を同属中の菌種と比較すると、バシラス・スファエリ
カス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）および
バシラス・バステウリー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ａｓｔ
ｅｕｒｉｉ）に近似しているが、表１に示す点で、これ
らの菌種とは異なっている。

表１ 以上のことから、本菌株をバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
）属に属する新菌種と認め、バシラス　エスピーＤ　Ｃ
−１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　ＤＣ−１）と命名し
た。なお、本菌株は、工業技術院　微生物工業技術研究
所に受託番号　微工研菌寄第８７１９号として寄託され
ている。

また、前記の菌株から紫外線、Ｘ線、Ｔ線の照射などの
物理的処理、もしくはニトロソグアニジンなどによる薬
剤処理など、一般的変異誘導法によ゛る誘発突然変異ま
たは自然の原因に起因する自然突然変異によって誘導さ
れた変異株も本発明の範囲内である。

分離源の土壌からの本菌株の分離は、ジクロルビニル菊
酸エチルエステル含有培地を用い、醗酵学の分野で公知
の常法に従って行った。

本菌株の培養は、醗酵学の分野で公知の常法に従って行
う事ができる。培地としては、この菌株が資化可能な炭
素源及び窒素源を適当量含有し、必要に応じて無機塩、
微量発育促進物質、消泡剤などを添加したものが使用さ
れる。具体的には、炭素源としてはグルコース、フラク
トース・マルトース、ガラクトース、リボース、サッカ
ロース、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜、廃１ｊｉ蜜など
の１！類、麦、米などの天然炭水化物、グリセロール、
マンニトール、メタノール、エタノールなどのアルコー
ル類、クルコン酸、ピルビン酸、酢酸、クエン酸などの
脂肪酸類、ノルマルパラフィン、ケロシンなどの炭化水
素類、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、アラニン
、アスパラギンなどのアミノ酸類など一般的な炭素源よ
り使用する微生物の資化性を考慮して、一種または二種
以上を適宜選択して使用すれば良い。

窒素源としては、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、乾
燥酵母、大豆加水分解物、大豆粉、ミルクカゼイン、カ
ザミノ酸、各種アミノ酸、コーンステイープリカー、フ
ィツシュミールないしその加水分解物、その他の動物、
植物、微生物の加水分解物などの有機窒素化合物、アン
モニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウムな
どのアンモニウム塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿
素など無機窒素化合物より使用微生物の資化性を考慮し
、一種または二種以上を適宜選択して使用する。

さらに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、
鉄、亜鉛、銅、ナトリウム、カルシウム、カリウムなど
のリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、酢酸塩などの一
種または二種以上を適宜添加し、必要に応じて植物油、
界面活性剤などの消泡剤を添加しても良い。

培養は、前記培地成分を含有する液体培地中で振盪培養
、通気攪拌培養、静置培養、連続培養などの通常の培養
法より使用微生物に適した培養法を選択して行う。

培養条件は、培地の種類、培養法により適宜選択すれば
良く、本菌株が増殖し、ジクロルビニル期成エチルを不
斉加水分解できる条件であれば特に制限はない。通常は
、培養開始のｐＨを８〜９に調製し、３０〜３５℃の温
度条件下で培養することが好ましい。

培養日数は通常１〜２日が適当である。

以上のように、本菌株を培養した後、得られた培養物、
培養物から遠心分離、沈降分離、凝集分離などの通常の
方法によって集菌した生菌体、または生菌体に適宜な処
理を施して得られる菌体処理物を前記のようなジクロル
ビニル期成エチルの不斉加水分解反応に使用することが
できる。

ここで、培養物とは培養後の培地と培養菌体が未分離の
状態のものをいい、菌体処理物とは、乾燥菌体、細胞膜
および／または壁変性菌体、固定化菌体などをいう 菌体処理物を得るための方法を例示すれば以下の通りで
ある。すなわち、（１）生菌体に対し、たとえば凍結融
解処理、アセトン乾燥処理、磨砕処理、超音波処理、浸
透圧差処理などの物理的処理手段、もしくはたとえば、
リゾチーム、細胞壁溶解酸素などの酸素処理、界面活性
剤との接触処理などの化学的ないし生物化学的処理を単
独もしくは組み合わせて施すことにより、また、（２）
生菌体、乾燥菌体、細胞膜および／または壁変性菌体な
どに包括処理、架橋処理、担体への吸着処理などの固定
化手段を施すことにより、菌体処理物を得ることができ
る。

以下、実施例をもって本発明をより具体的に説明するが
、これらはいずれも実施の一態種を示すものであって、
本発明の範囲をなんら制限するものではない。

実施例１ 兵庫県宝塚市で採取した土壌の小スパーチル１杯分（約
０．５ｇ）をジクロルビニル期成エチルを唯一の炭素源
とする分離用培地（表１）１０ａ＋１に添加し、３０℃
で３日間振とう培養した後、培養液０．１ｍｌを新しい
分離用培地に接種し、同様に培養した。

表１　分離用培地組成 ジクロルビニル期成エチル　　６０　　ｍｇＫＨ，ＰＯ
，、０，５ｇ ＫｚＨＰ０４０．５　ｇ （Ｎ■ａ）ｔｓＯａ　　　　　　　　　　２．０　ｇ酵
母エキス　　　　　　　　　１．０　ｇＭｇＳＯａ　　
・７Ｈｚ０　　　　　　　　０．２　ｇＣｕＳＯｎ　　
・５Ｈｚ０　　　　　　　　５　　ｍｇＭｎＣｌｇ　　
・４Ｈｚｏ　　　　　　　　　５　　ｍｇＺｎＳＯａ　
　・７Ｈｚ０　　　　　　　　１　　ｍｇＦｅＳＯ４・
７Ｈｚ０　　　　　　　　２　　ｍｇ蒸留水　　　　　
　　　　　　１１ ｐＨ９，０（ＩＯＸ　ＮａｚＣＯｓで調整）この操作を
３回繰り返した後、増殖を示した培養液を滅菌水により
適度に希釈し、分離用培地に寒天を２％濃度になるよう
に加えた分離用寒天平板培地に塗抹し、３０℃で４日間
培養した。生じた複数のコロニーが相互に相違しないこ
とを肉眼的および顕微鏡的に確認できるまで、分離用寒
天平板培地への移植を繰り返し、本菌株を得た。

この菌株の各種培地における生育状態および生理学的性
質は、前述した通りである。

次いで、本菌株を利用して、ジクロルビニル期成エチル
の不斉加水分解反応を実施した例を参考例として挙げる
。

参考例１ 酵母エキス５ｇ、ポリペプトン５ｇ、リン酸−カリウム
１ｇ、硫酸マグネシウム（７水塩）　０．２　ｇを蒸留
水１１に梳かし、１０％炭酸ナトリウム水溶液でｐＨを
９．０に調整した。この液体培地１０ｍ１を直径２４ｍ
ｍの試験管に入れ、１２０℃で１５分間高圧蒸気滅菌し
た後、バシラス　エスピーＤＣ−１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　ｓｐ。

ＤＣ−１）を１白金目接種し、３０℃で２４時間振とう
培養し、前培養とした。

上記と同じ組成の培地１００ｍ　ｌを５００ｍ　ｌ容の
三角フラスコに入れ、同様に滅菌した後、前培養液１ｍ
ｌを接種し、３０℃で２４時間振とう培養した後、ラセ
ミ−ジクロルビニル期成エチル（シス／トランス比＝４
５１５５）　０．６ｇを添加し、さらに３０℃で９６時
間振とうし、反応させた。

この反応液に３５％ＩＣＩ　１ｍｌを加え、メチルイソ
ブチルケトン５０ｍ１で生成したジクロルビニル期成と
未反応のジクロルビニル期成エチルを抽出した。

抽出物をガスクロマトグラフィー （カラム：３０％Ｔｈｅｒｍｏｎ　３０００．１．１ｍ
、　１４０℃）で分析し、ジクロルビニル期成とジクロ
ルビニル期成エチルのピーク面積比より、比率を算出し
た。

上記の抽出液に、ＩＮ　ＮａＯＨ２０ａ＋１を加え、ア
ルカリ抽出を行い、遊離のジクロルビニル期成を単離し
た。

得られたジクロルビニル期成のうち５■をトルエン１ｍ
ｌに溶解し、等モルの塩化チオニル、ピリジン、ジクロ
ニアニリンを加えて反応させ、アニリドとし高速液体ク
ロマトグラフィー（カラム：　　ＳＵＭＩＰＡＸＯＡ−
２１２００、移動相ｎ−ヘキサン−ジクロロエタン（１
７：３．　ｖ／ｖ）流速：　１．０ｍｌ／ｍ１ｎ）で異
性体分析を行った。以上の結果を表２に示す。

表２ ＊）収率は原料中の（＋）−１−ランス−ジクロルビニ
ル期成エチルに対する得られた（＋）−）ランス−ジク
ロルビニル期成のモル収率をｉｔ。

完 手続補正書（自発） 昭和６１年６月３０日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. バシラス　エスピー　ＤＣ−１（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥
   　ｓｐ．ＤＣ−１）株（微工研菌寄第８７１９号）