DE3781192T2

DE3781192T2 - Mikroorganismus, esterase und verfahren zu deren herstellung.

Info

Publication number: DE3781192T2
Application number: DE8787303531T
Authority: DE
Inventors: Fumitaka Kishimoto; Kanji Nishizawa; Kazumi Sonoda; Chiaki Sugiki; Masako Sugimoto
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1986-04-22
Filing date: 1987-04-22
Publication date: 1993-02-18
Anticipated expiration: 2007-04-23
Also published as: EP0243167B1; DE3781192D1; EP0243167A1; US4904593A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Mikroorganismus, eine neue, von einem Mikroorganismus stammende, Esterase und ein Verfahren zu deren Herstellung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen neuen Mikroorganismus der Gattung Bacillus, eine neue Esterase, die durch Züchten eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus erhältlich ist, und ein Verfahren zu deren Herstellung.
Mit dem Begriff "Esterase" werden Enzyme bezeichnet, die die Hydrolyse von Substraten mit Esterbindungen katalysieren können. Sie werden nach ihrer Substratspezifität in vier Kategorien eingeteilt, d.h. Wirkung auf Carbonsäureester, auf Thiolester, auf Phosphorsäureester und auf Schwefelsäureester. Im engeren Sinn bedeutet "Esterase" unter den Enzymen, die auf Carbonsäuren einwirken, nur Enzyme, die Ester niedriger Fettsäuren hydrolysieren können, und sind getrennt von den "Lipasen" zu betrachten, die Glycerinester hydrolysieren können. Rohe Lipase besitzt neben der Lipaseaktivität eine Esteraseaktivität, und diese beiden Aktivitäten unterscheiden sich in der Praxis durch Unterschiede in der Wärmebeständigkeit, der Empfindlichkeit gegenüber Trypsin und Alkali, der Substratspezifität, d.h. der Kettenlänge des Fettsäurerestes des Esters, etc.
Der Unterschied in den beiden Aktivitäten wird jedoch eher auf den physikalischen Unterschied im Vorliegen des Substrats in dem Reaktionsgemisch zurückgeführt. Das bedeutet, daß man annimmt, daß die Esterasereaktion durch die Reaktion des Enzyms mit einem Substrat in wässriger Lösung stattfindet, während die Lipasereaktion an der Grenzfläche zwischen Wasser und einem in Wasser unlöslichen Substrat abläuft (Sarda et al., Biochem. Biophys. Acta. 30 (1958), 513. Die in der vorliegenden Erfindung bezeichnete Esterase bedeutet eine Esterase im engeren Sinn, wie vorstehend beschrieben.
In den jüngsten Jahren wurden ausgedehnte Versuche unternommen, Enzyme in der organischen Synthese zu verwenden, einschließlich der Hydrolyse verschiedener Esterverbindungen unter Verwendung einer Esterase, um optisch aktive Verbindungen zu erhalten, oder um chirale Verbindungen aus prochiralen Verbindungen zu bilden. Die meisten dieser Berichte betreffen die Verwendung von Schweineleberesterase (z.B. Laumen et al., Tetrahedron Lett. 26 (1985), 407-410; Schneider et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 23 (1984), 64-66, und Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 106 (1984), 3695).
Diese Verfahren sind ökonomisch nicht praktikabel, weil die Schweineleberesterase teuer und im Handel kaum erhältlich ist. Verfahren zur Verwendung eines Mikroorganismus, der die Esterase erzeugt, anstelle von Schweineleberesterase, wurden ebenfalls vorgeschlagen, aber es gab nur sehr wenige Berichte, in denen die Reinigung und Charakterisierung einer Esterase aus einem Mikroorganismus beschrieben sind (z.B. Kotani et al., Agric. Biol. Chem. 47 (1983), 1363-1365; Fujimoto et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. (1985,) 1333-1334; Brannon et al., J. Antibiot. 29 (1976), 121-124 und Japanische Patentpublikation (Kokai), Nr. 244295/1985).
Es wird berichtet, daß Esterasen aus den folgenden Mikroorganismen gereinigt und charakterisiert wurden:
(1) Bacillus subtilis ATCC 6633 (Biochem. Biophys. Acta 485 (1977), 367-378);
(2) Bacillus subtilis SR22 (Biochem. Biophys. Acta. 429 (1976), 191-197);
(3) Bacillus subtilis NRRL-B-558 (Appl. Microbiol. 30 (1975), 413-419);
(4) Bacillus stearothermophilus (Archiv. Biochem. Biophys. 160 (1974), 504-513);
(5) Pseudomonas aeruginosa (J. Biochem. 86 (1979), 643-656);
(6) Pseudomonas cepacia (J. Bacteriol. 118 (1974), 880-889);
(7) Pseudomonas fluorescens (J. Biochem. 95 (1984), 1047-1054, und Japanische Patentpublikation (Kokai), Nr. 30681/1985);
(8) Escherichia coli K-12 (J. Bacteriol. 149 (1982), 6-14);
(9) Aspergillus niger NRRL337 (Agric. Biol. Chem. 47 (1983),1865-1868); und
(10) Mycobacterium smegmatis ATCC 14468 (J. Bacteriol. 155 (1983) , 1249-1259).
Keine dieser Druckschriften beschreibt überhaupt die Anwendung auf organische Synthesereaktionen, ausgenommen die Anwendung einer Esterase aus B. subtilis NRRL-B-558 auf die Synthese eines Cephalosporinderivates. Nach einer ausgedehnten Untersuchung auf mikrobielle Esterasen, die umfangreich für organische Synthesereaktionen verwendet werden können, wie die Schweineleberesterase, wurde gefunden, daß eine von einem neuen Mikroorganismus, Bacillus sp. DC-1 (FERM BP-1254), der kürzlich aus dem Erdboden isoliert wurde, gebildete Esterase derartig ausgezeichnete Eigenschaften, wie vorstehend erwähnt, besitzt.
Erfindungsgemäß wird eine neue, aus Bacillus sp. DC-1 erhältliche, mikrobielle Esterase bereitgestellt, die bei organischen Synthesen verwendet werden kann, wie für die ökonomische Herstellung von optisch aktiven Verbindungen und die Erzeugung von chiralen Verbindungen aus prochiralen Verbindungen.

Physiko-chemische Eigenschaften der erfindungsgemäßen Esterase

1) Aktivität:

Fähigkeit zur Hydrolyse der Esterbindung eines organischen Carbonsäureesters.

2) Substratspezifität:

reaktionsfähig mit einem Ester aus einem Alkohol und einer organischen Carbonsäure und sehr reaktionsfähig mit einem wasserlöslichen Ester einer Fettsäure mit bis zu vier Kohlenstoffatomen; reaktionsfähig mit einem wasserlöslichen Mono-, und Tri-Acylglycerinester; aber nicht mit einem wasserunlöslichen Mono-, Di- und Tri-Acylglycerinester (C&sub4;- oder kürzere Glycerinester sind im allgemeinen wasserlöslich und C&sub1;&sub0;- oder längere Glycerinester sind im allgemeinen wasserunlöslich; einige C&sub5;&submin;&sub9;-Glycerinester sind wasserlöslich, aber fast alle sind wasserunlöslich); reaktionsfähig mit Palmitoyl-CoA, aber nicht mit Acetyl-CoA, Cholinester und Cholesterinester.

3)pH-Optimum und pH-Stabilität:

das pH-Optimum für die Hydrolyse des p-Nitrophenylesters der 2,2-Dimethyl-3-(2,2-dichlorvinyl) cyclopropancarbonsäure der Formel(I) (die Säure selbst wird im folgenden als DCPI bezeichnet) der Formel (I) als Substrat, beträgt 8,5 - 9,0.
und wenn eine 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0 - 9,0) oder eine 10 mM Phosphatpufferlösung (pH 5,0 - 7,0) verwendet wird, betragen die verbleibenden Aktivitäten nach einer 48-stündiger Behandlung in dieser Pufferlösung bei 4ºC bei einem pH-Wert von 7,0 bis 9,0, 6,0 bzw. 5,0 etwa 100%, etwa 45% bzw. etwa 20%.

4) Temperaturoptimum und Hitzestabilität:

Das Teilperaturoptimum für die Hydrolyse des p-Nitrophenylesters von DCPI als Substrat in 100 mM Tris-HCl- Puffer (pH 9,0) beträgt 50 - 55ºC.
Die verbleibenden Aktivitäten nach 10-minütiger Behandlung in der wie unter (3) vorstehend definierten Pufferlösung betragen bei 35ºC, 40ºC und 50ºC etwa 100%, etwa 80% bzw. etwa 15%.

5) Molekulargewicht:

54 000 ± 2000 (durch Gelfiltration und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese).

6) Isoelektrischer Punkt:

4,8 ± 0,1

7) Inaktivierungsbedingungen:

a)vollständig inaktiviert durch 10-minütige Behandlung fit 100 uM Phenylmethylsulfonylfluorid (PNSF) oder mit 80 uM Diisopropylfluorphosphat (DIFP) bei 37ºC.
b)um etwa 25% und um etwa 70% verringerte Aktivität durch eine 10-minütige Behandlung bei 37ºC mit einer 100 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 9,0), die 1 mM Natriumdesoxycholat bzw. 5 mM Natriumlaurylsulfat enthält.
Die erfindungsgemäße Esterase ist ein einkettiges Peptid ohne Untereinheiten und besitzt ein Molekulargewicht von 54 000 + 2000. Dies unterscheidet sie von allen anderen Esterasen von Bacillis subtilis ATCC 6633 (150 000), Bacillus subtilis NRRL-B-558 (190 000), Bacillus subtilis SR-22 (160 000), Bacillus stearothermophilus (42 000 - 47 000), Pseudomonas cepacia (34 500), Pseudomonas fluorescens (48 000), Aspergillus niger NRRL 337 (23 000, 27 800, 29 500, 127 000) und Mycobacterium smegmatis ATCC 14468 (36 000 - 41 000) in diesen Punkten. Ferner, obwohl die Esterase aus Pseudomonas aeruginosa durch Behandlung mit Diisopropylfluorphosphat oder Natriumlaurylsulfat nicht inaktiviert wird, wird die erfindungsgemäße Esterase um etwa 70% durch Behandlung mit 5 mM Natriumlaurylsulfat und um 100% durch Behandlung mit 80 uM Diisopropylfluorphosphat inaktiviert. Ferner ist die Esterase aus Escherichia coli K-12 als Membran-gebundene Carboxypeptidase zu bezeichnen, während die erfindungsgemäße Esterase im Cytoplasma lokalisiert ist.
Somit ist die erfindungsgemäße Esterase eine neue Esterase, die zuvor nicht bekannt war.

Verfahren zur Erzeugung der Esterase.

Bei dem Verfahren züchtet man Bacillus sp. DC-1 (hinterlegt bei Fermentation Research Institute, Industrial Technology Agency, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1254 (übertragen von der Hinterlegungsnummer FERM P-8719)), bis sich das Enzym in den Bakterienzellen angereichert hat, trennt die Zellen ab und gewinnt die Esterase daraus.

Taxonomische Eigenschaften von Bacillus sp. DC-1

(a) Morphologische Eigenschaften

1) Form und Größe der Zellen:
Stäbchen (0,5 - 0,6) um x (1,2 - 1,7) um; einzeln oder in kurzen Ketten auftretend.
2) Polymorphismus:
keiner
3) Beweglichkeit:
beweglich durch peritriche Flagellen
4) Sporenbildung:
Bildung von Endosporen. Sphärisch oder leicht oval mit einem Durchmesser von 0,4 - 0,6um. Bildung von Sporen in einer terminalen Position der vegetativen Zelle, angeschwollen.
5) Gramfärbung:
negativ
6) Säurebeständigkeit:
negativ

b) Kultureigenschaften

1) Nähragarplatte (35ºC, 24 Stunden) Form: zirkuläre und projektierte Form Oberfläche: glatt und glänzend Farbton: durchscheinend und gelblich weiß
2) Schrägnähragar (35ºC, 24 Stunden) Wachstumsgrad: mäßig, Wachstum wie ein ausgebreitetes Tuch oder kugelartig.
Oberfläche: glatt und glänzend
Farbton: durchscheinend und gelblich weiß
3) Nährbrühe (35ºC, 24 Stunden)
Wachstumsgrad: mäßig
Färbung/Entfärbung: keine
Kahmhaut: keine Bildung
Sediment: Bildung
4) Gelatinestab (35ºC, 14 Tage)
keine Verflüssigung
5) Lackmusmilch (35ºC, 14 Tage)
leicht alkalisch, keine Koagulation oder Peptonisierung

(c) Biochemische Eigenschaften

gezüchtet bei 35ºC für 1 - 5 Tage. Negative wurden bis zu 14 Tage beobachtet.
1) Nitratreduktion: positiv Nitritbildung aus Nitrat
2) Denitrifikation: negativ
3) MR-Test: negativ
4) VP-Test: negativ
5) Indolbildung: negativ
6) Hydrogensulfidbildung: negativ
7) Hydrolyse von Stärke: negativ
8) Verwertung von Citronensäure:
Koser-Medium: negativ
Christensen-Medium: positiv
9) Verwertung von anorganischen Stickstoffquellen:
Modifiziertes Verfahren mit dem Medium von Stanier et al. nach Yamazato et al: (Yamazato et al., J. Gen. Appl. Microbiol. (1982) 28, 195-213)
Natriumsuccinat wurde als einzige Kohlenstoffquelle verwerdet.
Nitrat: keine Verwertung
Ammoniumsalz: Verwertung
10) Pigmentbildung: negativ
11) Urease:
Christensen-Harnstoffmedium: positiv
12) Oxidase: positiv
13) Katalase: positiv
14) Wachstumsbereich:
Wachstumstemperatur: 10-45ºC (Optimun 30 - 35ºC)
Wachstums-pH-Wert : 6,0-9,5 (Optimum 8,5 - 9,0)
15) Anaerobes oder aerobes Wachstum: aerob
16) OF-Test: negativ
17) Säure- oder Gasbildung aus Sacchariden: Säure Gas L-Arabinose D-Xylose D-Glucose D-Mannose D-Fruktose D-Galactose Maltose Saccharose Lactose Trehalose D-Sorbit D-Mannit Inosit Glycerin Stärke
Es wird auf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl. (1974) verwiesen. Der Stamm wurde als der Gattung Bacillus zugehörig identifiziert, da er unter aeroben Bedingungen wachsen kann und Endosporen bildet. Der vorliegende Stamm ist Bacillus sphaericus und Bacillus pasteurii ähnlich, aber unterscheidet sich davon, wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht: erfindungsgemäßer Stamm Bacillus spaericus Bacillus pasteurii Reduktion von Nitrat Erfordernis von Harnstoff oder Ammoniak
Angesichts der obigen Tatsachen erkannten die vorliegenden Erfinder, daß der Stamm neu ist und zu der Gattung Bacillus gehört; sie nannten ihn Bacillus sp. DC-1. Dieser Stamm wurde bei dem Fermentation Research Institute, Industrial Technology Agency, Japan, unter FERM BP-1254 hinterlegt.
Mutanten, die sich durch induzierte Mutation nach einem üblichen Verfahren zur Induktion von Mutationen, wie physikalische Behandlung, z.B. Bestrahlung mit UV- Strahlen, Röntgenstrahlen, Gamma-Strahlen etc. oder chemische Behandlung mit Nitrosoguanidin oder dergleichen oder durch natürliche Mutation als Folge einer natürlichen Ursache, von dem obigen Stamm ableiten, fallen unter den Bereich der vorliegenden Erfindung. Jeder Stamm der Gattung Bacillus, der die vorstehend erwähnte neue Esterase bildet, fällt auch unter die vorliegende Erfindung.
Die Isolierung des erfindungsgemäßen Stammes aus dem Boden wurde nach üblichen Verfahren, die einem Fachmann bekannt sind, durchgeführt, wobei ein Kulturmedium, das den DCPI-Ethylester als einzige Kohlenstoffquelle enthielt, verwendet wurde.
Die Züchtung des isolierten Stammes kann in jedem beliebigen synthetischen oder natürlichen Kulturmedium durchgeführt werden, mit der Maßgabe, daß es geeignete Mengen an assimilierbaren Kohlenstoffquellen, Stickstoff quellen, anorganischen Substanzen und anderen Nährstoffen enthält. Ein flüssiges oder festes Kulturmedium kann verwendet werden. Beispiele für die Kohlenstoffquellen umfassen Saccharide, wie Glucose, Fructose, Maltose, Galactose, Ribose, Saccharose, Stärke, Stärkehydrolysat, Melassen, Abfallmelassen etc.; natürliche Kohlenhydrate, wie Weizen, Reis etc.; Alkohole, wie Glycerin, Mannit, Methanol, Ethanol etc.; Fettsäuren, wie Gluconsäure, Brenztraubensäure, Essigsäure, Citronensäure etc.; Kohlenwasserstoffe, wie Normalparaffin, Kerosin etc.; Aminosäuren, wie Glycin, Glutaminsäure, Glutamin, Alanin, Asparagin, etc.. Eine oder mehrere der vorstehend genannten Kohlenstoffquellen können je nach der Assimilationsfähigkeit des zu züchtenden Stammes verwendet werden.
Beispiele für die Stickstoffquellen umfassen organische Stickstoffverbindungen, wie Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Trockenhefe, Sojabohnenhydrolysat, Sojabohnenpulver, Milchcasein, Casaminosäure, verschiedene Aminosäuren, Maisquellwasser, Fischmehl oder ein Hydrolysat davon, andere Hydrolysate von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen, und anorganische Stickstoffverbindungen wie Ammoniumsalze, z.B. Ammoniak, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumacetat, etc, und Nitrate, z.B. Natriumnitrat, Harnstoff etc.. Eine oder mehrere der vorstehenden Verbindungen können je nach der Assimilationsfähigkeit des zu züchtenden Stammes verwendet werden.
Als anorganisches Salz kann eine geeignete Menge eines oder mehrerer Phosphate, Chloride, Sulfate, Carbonate, Acetate etc. von Magnesium, Mangan, Eisen, Zink, Kupfer, Natrium, Calcium, Kalium, etc. zugesetzt werden. Sofern notwendig, kann ein Entschäumer wie pflanzliches Öl, ein grenzflächenaktives Mittel etc. zugesetzt werden.
Die Züchtung kann nach dem üblichen Verfahren, z.B. eine Schüttelkultur, eine belüftete Kultur unter Rühren, eine statische Kultur, eine kontinuierliche Kultur, etc. durchgeführt werden, wenn die Züchtung in einem flüssigen Kulturmedium, das die vorstehend genannten Verbindungen enthält, durchgeführt wird.
Die Züchtungsbedingungen sind nicht so kritisch, so daß beliebige Bedingungen geeignet gewählt werden können, je nach dem zu verwendenden Kulturmedium und dem Züchtungsverfahren, sofern der erfindungsgemäße Stamm unter Bildung der Esterase wächst. Es ist bevorzugt, den Ausgangs- pH-Wert so zu steuern, daß er 8 - 9 beträgt und bei einer Temperatur von 30-35ºC zu inkubieren. Üblicherweise wird 1-2 Tage inkubiert.
Die Gewinnung oder Extraktion der Esterase, die sich in den bakteriellen Zellen angereichert hat, wird nach den folgenden Verfahren durchgeführt:
Nach beendigter Inkubation, werden die bakteriellen Zellen durch Techniken wie Filtration oder Zentrifugation geerntet, mit Wasser oder Pufferlösung gewaschen und dann aufgebrochen. Zum Aufbrechen kann jede der folgenden Techniken einzeln oder in Kombination angewendet werden: Physikalische Techniken, wie Einfrieren und Auftauen, Ultraschallbehandlung, Druckbehandlung, Behandlung durch osmotische Druckdifferenz, Vermahlen, Lufttrocknen unter Verwendung von Aceton, etc.; biochemische Behandlung, wie Behandlung mit zellwandauflösenden Enzymen unter Verwendung von Lysozym, Cellulase, oder eine chemische Behandlung, wie die Behandlung durch Kontakt mit einem grenzflächenaktiven Mittel, etc.
Im folgenden ist ein Beispiel eines derartigen Prozesses gegeben:
Die bakteriellen Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, mehrere Male mit 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 9,0) gewaschen und in dem gleichen Puffer resuspendiert. Die Zellen werden mit einer "French-Press"-Apparatur durch Druck zur Extraktion der Esterase aufgebrochen. Die aus den Bakterienzellen extrahierte Rohesterase wird durch die einfache oder kombinierte Verwendung der an sich üblichen Mittel auf dem Gebiet der Biochemie, wie Aussalzen, fraktionierte Fällung durch organische Lösungsmittel, Säulenchromatographie, wie Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, hydrophobe Chromatographie, Wasserstoffbrückenchromatographie, Affinitätschromatographie, etc., oder Hochleistungsflüssigchromatographie oder Elektrophorese gereinigt.
Im folgenden ist ein Beispiel des Reinigungsprozesses gegeben:
Die Zellen werden mit einer "French-Press"-Apparatur auf gebrochen und die Zelltrümmer werden durch 10-minütige Zentrifugation bei 10 000 x g entfernt. Der Überstand wird einer 60-minütigen Ultrazentrifugation bei 100 000 x g unterworfen, und der entstandene Überstand wird als Rohextrakt verwendet.
Die Esterase wird bei 40-70%iger Sättigung mit Ammoniumsulfat ausgefällt, und das Präzipitat wird in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,0) aufgelöst. Die entstandene Lösung wird gegen den gleichen Puffer dialysiert und durch eine Säule aus DEAE-Sepharose CL-6B, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist, geleitet, um die Esterase zu adsorbieren. Dann wird die Esterase mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 - 0,5 M NaCl eluiert. Die Fraktion mit Esteraseaktivität, die bei 0,25 M NaCl eluiert, wird konzentriert und dann gegen 50 mM Tris-HCl- Puffer (pH 8,0) dialysiert. Das entstandene Konzentrat wird durch eine Säule aus Sephacryl S-200 superfein, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist, geleitet, und die eluierte Esterasefraktion wird konzentriert und dann durch eine Säule aus Sephadex G-150 superfein, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist, geleitet, um die Esterase zu eluieren. Nach dem Konzentrieren der entstandenen Esterasefraktion, wird sie gegen 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) dialysiert und durch eine Säule aus QAE-Sephadex, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist, geleitet, um die Esterase zu adsorbieren. Dann wird die Esterase mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0-0,5 M NaCl eluiert.
Nach dem Konzentrieren wurde das Eluat einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterworfen. Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Esterase zu einer einzigen Bande in der Elektrophorese gereinigt wurde, und daß sie ein Molekulargewicht von 54 000 hat und ein einkettiges Peptid ohne Untereinheiten ist.
Ein Beispiel für den vorstehend genannten Reinigungsprozeß ist in der nachstehenden Tabelle gegeben. Reinigungsverfahren Gesamtaktivität (Einheiten) Ausbeute (%) Gesamtprotein (mg) Spezifische Aktivität (Einheiten/mg) Reinigung (-fach) Rohextrakt DEAE-Sepharose Sephacryl Sephadex

Enzymtest

Eine Esteraselösung wird zu 100 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 9,0 gegeben und das Gemisch wird eine Minute bei 40ºC vorinkubiert. Dann wird der DCPI-p-Nitrophenylester der folgenden Formel (I), aufgelöst in Aceton, zugesetzt, so daß eine Endkonzentration von 1 mM vorliegt. Dann wird das Gemisch gerührt. Danach wird das Ansteigen der Absorption bei 405 nm als Folge der Freisetzung von p-Nitrophenol mit einem Spektrophotometer bestimmt. Eine Esteraseeinheit ist als die Menge Enzym definiert, die 1 nmol p-Nitrophenol pro Minute freisetzt.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert. Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß der Umfang der vorliegenden Erfindung in keiner Weise darauf beschränkt ist.

Beispiel 1 (Isolierung des Stammes)

Ein kleiner Löffel (etwa 0,5g) Erdboden, der in Takarazuka City, Hyogo Prefecture, Japan, gewonnen worden war, wurde mit 10 ml Medium, das DCPI-Ethylester als alleinige Kohlenstoffquelle enthielt (vgl. nachstehende Tabelle), versetzt. Das Gemisch wurde unter Schütteln drei Tage lang bei 30ºC inkubiert. 0,1 ml Kultur wurden in ein frisches Medium, wie vorstehend beschrieben, inokuliert und auf ähnliche Weise inkubiert.

Zusammensetzung des Kulturmediums

DCPI-Ethylester 60 mg
KH&sub2;PO&sub4; 0.5 g
K&sub2;HPO&sub4; 0.5 g
(NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 2.0 g
Hefeextrakt 1.0 g
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0.2 g
CuSO&sub4;.5H&sub2;O 5 mg
MnCl&sub2;.4H&sub2;O 5 mg
ZnSO&sub4;.7H&sub2;O 1 mg
FeSO&sub4;.7H&sub2;O 2 mg
Destilliertes Wasser 1 l
pH 9.0 (eingestellt mit 10% Na&sub2;CO&sub3;)
Nach dreimaligem Wiederholen der vorstehenden Operation wurden die Kulturen, in denen Proliferation zu erkennen war, mit sterilisiertem Wasser auf eine geeignete Konzentration verdünnt. Die verdünnte Lösung wurde auf eine Agarplatte ausgestrichen, die durch Zugabe von Agar in das vorstehend beschriebene Medium in einer Konzentration von 2% hergestellt worden war, und vier Tage bei 30ºC inkubiert. Die Überführung auf eine frische, vorstehend beschriebene Agarplatte wurde wiederholt, bis es möglich war, mit dem Auge und mikroskopisch zu bestätigen, daß mehrere gebildete Kolonien sich nicht voneinander unterschieden. Der erfindungsgemäße Stamm Bacillus sp. DC-1 (FERM BP-1254) wurde so erhalten.
Die Wachstumsbedingungen und die physiologischen Eigenschaften des Stammes in verschiednene Medien sind wie hier angegeben.

Beispiel 2

Eine Öse Zellen von Bacillus sp. DC-1 (FERM BP-1254) wurde in 50 ml eines Mediums aus 1% löslicher Stärke, 0,5% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% K&sub2;HPO&sub4;, 0,02% MgSO&sub4;.7H&sub2;O, 5 mg/l CuSO&sub4;.5H&sub2;O, 5 mg/l MnCl&sub2;.4H&sub2;O, 1 mg/l ZnSO&sub4;.7H&sub2;O, 2 mg/l FeSO&sub4;.7H&sub2;O, pH 9,0) inokuliert. Die Züchtung wurde unter Schütteln bei 30ºC 24 Stunden lang durchgeführt. Die Impfkultur wurde in 5 Liter eines frischen Mediums, wie vorstehend beschrieben, inokuliert und bei 35ºC 24 Stunden lang bei einer Belüftungsrate von 5 l/min und einer Rührgeschwindigkeit von 600 UpM inkubiert. Nach beendigter Züchtung wurden die bakteriellen Zellen durch 10-minütige Zentrifugation bei 9000 x g geerntet und zweimal mit 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 9,0) gewaschen. Die 100 ml Kultur entsprechenden Zellen wurden in 4 ml des gleichen Puffers suspendiert und dann mit einer "French Pressure Cell Press"-Apparatur (hergestellt von Aminco) bei 4ºC und einem Druck von 38000 psi aufgebrochen.
Die erhaltenen, so behandelten Bakterienzellen wurden zentrifugiert (10 000 x g, 10 Minuten). Der Überstand davon wurde ultrazentrifugiert (100 000 x g, 60 Minuten), um einen Esteraserohextrakt zu erhalten. Als Ergebnis wurden 6,560 mg Rohenzym mit einer spezifischen Aktivität von 4,86 Einheiten/mg erhalten.

Beispiel 3

Der in Beispiel 2 erhaltene Rohesteraseextrakt wurde mit 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 9,0) auf eine Proteinkonzentration von 10-20 mg/ml eingestellt. Zu der Lösung wurde Ammoniumsulfat bis zu 40 %iger Sättigung zugesetzt und das Präzipitat wurde durch Zentrifugation (10 000 x g, 10 Minuten) entfernt. Zu dem Überstand wurde Ammoniumsulfat bis zu 70 %iger Sättigung zugesetzt und das Präzipitat wurde durch Zentrifugation (10 000 x g, 10 Minuten) gewonnen. Das Präzipitat wurde in 40 ml eines 20 mM Tris-HCl-Puffers (pH 7,0) aufgelöst und gegen die gleiche Pufferlösung dialysiert. Als Ergebnis wurden 43,5 ml einer Rohenzymlösung mit der Gesamtaktivität von 17848 Einheiten und der spezifischen Aktivität von 6,80 Einheiten/mg erhalten.
Ein Teil der erhaltenen Esteraselösung (10,2 ml, 4199 Einheiten, 615 mg Protein) wurde durch eine Säule aus DEAE-Sepharose CL-6B (2,6 x 26 cm) mit einem Bettvolumen von 140 ml, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, geleitet, um die Esterase an DEAE-Sepharose CL-6B zu adsorbieren. Danach wurde die Säule mit der gleichen Pufferlösung gewaschen, und die Esterase wurde bei 0,25 M NaCl mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0-0,5 M NaCl eluiert. Als Ergebnis wurden 3734 Aktivitätseinheiten (89%) in der Peakfraktion oder 4115 Einheiten (98%) im Gesamteluat gewonnen. Die spezifische Aktivität zeigte eine Erhöhung um das 8,2-fache. Die Esterase-haltige Fraktion wurde durch eine Ultrafiltrationsmembran konzentriert, gegen 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) dialysiert, und durch eine Säule aus Sephacryl 5-200 Superfein (2,6 x 100 cm), die zuvor mit der gleichen pufferlösung äquilibriert worden war, geleitet, um eine Gelfiltration durchzuführen. Die eluierte Esterasefraktion wurde konzentriert und durch eine Säule aus Sephadex G-150 Superfein (2,6 x 100 cm), die mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) äquilibriert worden war, geleitet, und die Esterase mit dem gleichen Puffer eluiert. Die erhaltene Esterasefraktion wurde konzentriert und durch eine Säule aus QAE-Sephadex (1,6 x 35 cm, Bettvolumen 70 ml), die mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) äquilibriert worden war, geleitet und anschließend mit dem gleichen Puffer gewaschen. Die Esterase wurde mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0-0,5 M NaCl eluiert, wobei die Esterase mit einer Aktivität von 745 Einheiten im Bereich von 0,25-0,3 M NaCl gewonnen wurde.
Die spezifische Aktivität betrug 413,8 Einheiten/mg. Die Wiedergewinnung an Aktivität aus dem Rohextrakt betrug 9,9%.
Die erhaltene Esteraselösung wurde auf etwa das 5-fache konzentriert und dann einer 10%-SDS-Polyacrylamigel- Elektrophorese unterworfen. Darin wurde die Esterase als eine einzige Bande mit einem Molekulargewicht von 54 000 festgestellt. Es ergab sich eine gute Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Gelfiltrationen mit Sephacryl S-200 Superfein und Sephadex G-150 Superfein (52 000 - 56 000) und läßt vermuten, daß die Esterase ein einkettiges Peptid ohne Untereinheitsstruktur ist. In diesem Test wurden Phosphorylase B (Molekulargewicht 92 500), Rinderserumalbumin (66 200), Eialbumin (45 000), Kohlensäureanhydrase (31 000), Sojabohnentrypsininhibitor (21 500) und Lysozym (14 400) als Standardsubstanzen zur Bestimmung des Molekulargewichts der Esterase durch SDS-PAGE, und Blaudextran (200 000), Rinderserumalbumin (66 200), Eialbumin (45 000), Chymotrypsinogen A (25 000) und Ribonuclease A (13 700) als Standardsubstanzen zur Bestimmung des Molekulargewichts der Esterase durch Gelfiltration verwendet.

Beispiel 4

Die in Beispiel 3 erhaltene gereinigte Esterase wurde einer isoelektrischen Elektrophorese (konstante Leistung: 15W) im Bereich von pH 4,0-6,6 unter Verwendung eines Polyacrylamidgels (Konzentration 5%, Vernetzungsgrad 3%, Ampholinkonzentration 2,2%, LKB) 90 Minuten bei 10ºC unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde das Protein durch Anfärben mit Coomassie Brilliant Blau R-250 nachgewiesen. Es ergab sich ein isoelektrischer Punkt der erfindungsgemäßen Esterase von 4,8±0,1. Als Standardsubstanzen wurden in der Elektrophorese die PI-Marker PI 4,65, 5,10, 6,00, 6,50 (Bio Rad) und die PI-Marker PI 4,10, 4,90, 6,40 (Oriental Yeast) verwendet.

Beispiel 5

Die gemäß Beispiel 3 erhaltene Esterase wurde 10 Minuten bei 37ºC zusammen mit den nachstehend beschriebenen Reagenzien inkubiert, und die Restaktivität des Enzyms wurde nach dem vorstehend beschriebenen Testverfahren getestet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt. In der Tabelle ist die Restaktivität als relativer Wert (%), bezogen auf die nichtbehandelte Aktivität als 100 ausgedrückt. Additiv Konzentration Restaktivität (%) Triton X-100 Tween-80 Natriumdesoxycholat Natriumlaurylsulfat * Phenylmethylsulfonylfluorid ** Diisopropylfluorphosphat

Beispiel 6

Die in Beispiel 3 erhaltene gereinigte Esterase wurde auf jedes Substrat (2-20 mM) in 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) angewendet, und ihre Hydrolyseaktivität wurde mit einem pH-Stat (hergestellt von Radiometer) beobachtet. Ebenso wurden die Hydrolyseaktivitäten der erfindungsgemäßen Esterase gegenüber Cholinester, Cholesterinester und Thiolester bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.
In Tabelle 1 ist die Hydrolyseaktivität als relative Aktivität (%), bezogen auf den Wert der Hydrolyseaktivität der erfindungsgemäßen Esterase gegenüber Ethylbutyrat als 100 angegeben. Jedes Substrat wurde nach Emulgierung mit 0,2% Polyvinylalkohol verwendet. Gemäß Tabelle 2 wurden die Hydrolyseaktivitäten gegenüber Cholinester und Cholesterinester unter Verwendung eines Cholinesterase B-Tests (Wako) bzw. Freies-Cholesterin B-Tests (Wako) beobachtet. Die Hydrolyseaktivität gegenüber Thiolester beruhte auf der Erhöhung der Absorption bei 412 nm mit einem Spektrophotometer, wobei Glutathion, eine Standardsubstanz und 5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoesäure) (DTNB) verwendet wurden. Die Aktivität ist als Molzahl an Cholin, Cholesterin und CoA, die pro Minute freigesetzt werden, ausgedrückt. Tabelle 1 Substrat Konzentration (mM) relative Aktivität (%) Ethylbutyrat Isopropylpalmitat 1-Palmitoylglycerin 1,2-Dipalmitoylglycerin 1,3-Dipalmitoylglycerin Triacetin Tributyrin Tripalmitin Tabelle 2 Substrat Konzentration (uM) Aktivität (nmol/min) Acetylcholin Benzoylcholin Cholesterinacetat Cholesterinlinolat Acetyl-CoA Palmitoyl-CoA

Beispiel 7

Das pH-Optimum und der pH-Stabilitätsbereich der gemäß Beispiel 3 erhaltenen Esterase wurden mit dem DCPI-p- Nitrophenylester als Substrat gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 und Fig. 2 dargestellt.
In Fig 1 wurde der Test bei 40ºC durchgeführt, wobei 100 mM Kaliumphosphatpuffer für pH 5-7, 100 mM Tris-HCl- Puffer für pH 7-9 bzw. 100 mM Dikaliumphosphat-Kaliumhydroxidpuffer für pH 9-13 verwendet wurde. Die Aktivität wurde als relative Aktivität (%) bezogen auf den Aktivitätswert bei pH 9,0 als 100 ausgedrückt.
In Fig. 2 wurde die Enzymlösung bei 4ºC in 20 mM Kaliumphosphatpuffer für pH 5-7 bzw. in 20 mM Tris-HCl-Puffer für pH 7-9 aufbewahrt, und die Restaktivität in jeder Zeiteinheit wurde in 100 mM Tris-HCl-Puffer mit pH 9,0 bei 40ºC gemessen. Die Aktivität ist als Restaktivitätsrate (%) bezogen auf den Aktivitätswert bei Stunde 0 als 100 ausgedrückt.

Beispiel 8

Das Temperaturoptimum und die Hitzestabilität der in Beispiel 3 erhaltenen gereinigten Esterase wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Figuren 3 und 4 dargestellt. In Fig. 3 zeigt die Achse der Abszisse den reziproken Wert der absoluten Temperatur, und die Achse der Ordinate den Logarithmus der Anfangsgeschwindigkeit. Die Aktivitäten wurden unter Verwendung von 100 mM Tris-HCl-Puffer mit pH 9,0 gemessen.
In Fig. 4 wurde die Enzymlösung 15 Minuten bei der jeweils auf der Abszisse gezeigten Temperatur aufbewahrt; danach wurde die Aktivität in 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) bei 40ºC gemessen. Die Aktivität ist als Restaktivitätsrate (%) bezogen auf den Aktivitätswert der unbehandelten Esterase als 100 ausgedrückt.

Referenzbeispiel 1

DCPI-Ethylester (DCPE) wurde einer Hydrolysereaktion, wie folgt, unterworfen, wobei die durch die in Beispiel 3 beschriebene Ammoniumsulfatfällung (Fraktion, gesättigt mit 40-70%, spezifische Aktivität 6,80 Einheiten/mg) erhaltene Rohesteraselösung verwendet wurde.
1,0 ml der obigen Rohenzymlösung (410 Einheiten, 60,3 mg) wurden zu 8,0 ml 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0,), der 1,0 ml 2%-igen Polyvinylalkohol enthielt, gegeben, und dann wurde das Gemisch mit (±)-cis, trans DCPE (cis/trans- Verhältnis = 45/55) versetzt, bis die Endkonzentration an DCPE 2 mM erreichte. Das Gemisch ließ man unter Rühren bei 35ºC 96 Stunden reagieren. Nach 96-stündiger Reaktion wurde 0,1 ml 35%-ige HCl dem Reaktionsgemisch zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen. Diethylether wurde dem entstandenen Gemisch zugesetzt, um DCPI und nichtumgesetztes DCPE zu extrahieren.
Der Extrakt wurde gaschromatographiert (Säule: 30% Thermon 3000, 1,1 m, 140ºC) und die Ausbeute (%) wurde aus dem Peakflächenverhältnis von DCPI zu DCPE berechnet. Dann wurden 2,0 ml 1N NaOH dem obigen Extrakt zugesetzt, bis nur DCPI als Natriumsalz in einer wässrigen Schicht extrahiert wurde. Dann wurde die wässrige Schicht auf unter pH 2 mit 35%-iger HCl eingestellt, das abgetrennte DCPI wurde mit Methylisobutylketon extrahiert und konzentriert. Das erhaltene DCPI wurde in 0,5 ml Toluol aufgelöst, dem Thionylchlorid, Pyridin und 3,5-Dichloranilin in äquimolaren Mengen zu DCPI zugesetzt worden waren, und das Gemisch ließ man bei 80ºC unter Bildung des Anilids reagieren. Das entstandene Produkt wurde einer Isomerenanalyse mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Säule: SUMIPAX OA-2100, Elutionsmittel: n-Hexan-Dichlorethan 10:3 Vol./Vol., Flußrate: 1, 0 ml/min) unterworfen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 DCPI Isomerenverhältnis (%) Ausbeute (%) * trans cis * Molausbeute des erhaltenen (+)-trans DCPI zu dem (+)-trans DCPE in der Ausgangsverbindung.
Die assymetrische Hydrolysereaktion von DCPE unter Verwendung des erfindungsgemäßen Stammes ist in Referenzbeispiel 2 angegeben.

Referenzbeispiel 2

Eine Lösung aus 5 g Hefeextrakt, 5 g Polypepton, 1 g Kaliumdihydrogenphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfat (Septahydrid) in 1 l destilliertem Wasser wurde auf pH 9,0 mit einer wässrigen Lösung aus 10% Natriumcarbonnat eingestellt. 10 ml dieses flüssigen Mediums wurden in ein Reagenzglas (24 mm Durchmesser) gegeben und 15 Minuten in einem Autoclaven bei 120ºC dampfsterilisiert. Es wurde eine Öse Zellen von Bacillus sp. DC-1 inokuliert. Es wurde bei 30ºC 24 Stunden unter Schütteln bebrütet, um eine Impfkultur zu erzeugen.
100 ml Medium mit der gleichen Zusammensetzung wie vorstehend angegeben wurden in ähnlicher Weise sterilisiert und 1 ml der Impfkultur wurde dazu inokuliert. Es wurde bei 30ºC 24 Stunden lang unter Schütteln bebrütet. Danach wurden 0,6 g racemische DCPE (cis/trans-Verhältnis = 45/55) der Kultur zugesetzt, und es wurde 96 Stunden bei 30ºC inkubiert.
Zu dem entstandenen Reaktionsgemisch wurde 1 ml 35%-ige HCl zugesetzt und dann wurden DCPI und nicht-veränderte DCPE mit 50 ml Methylisobutylketon extrahiert.
Der Extrakt wurde gaschromatographiert und die Ausbeute wurde wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben berechnet. Dem obigen Extrakt wurden 20 ml 1 N NaOH zugesetzt und DCPI wurde wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben extrahiert. Das entstandene DCPI (5 mg) wurde in 1 ml Toluol aufgelöst, und Thionylchlorid, Pyridin und Dichloranilin wurden in äquimolaren Mengen zu DCPI zugesetzt, um das Anilid zu ergeben. Die Isomerenanalyse mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (Säule: SUMIPAX OA-21200, Elutionsmittel: n-Hexan-Dichlorethan 17.3, Vol./Vol., Flußrate: 1,0 ml/min) ergab die in Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse Tabelle 4 Isomerenverhältnis von DCPI (%) Ausbeute (%) * trans cis * Molausbeute der entstandenen (+)-trans-DCPI zu dem (+)-trans-DCPI, das in der Ausgangsverbindung enthalten ist.

Claims

1. Esterase, erhältlich aus Bacillus Sp. DC-1 (FERM BP-1254), mit folgenden physikochemischen Eigenschaften;

1) Aktivität:

Fähigkeit zur Hydrolyse der Esterbindung eines organischen Carbonsäureesters;

2) Substratspezifität:

reaktionsfähig mit einem Ester aus einem Alkohol und einer organischen Carbonsäure und sehr reaktionsfähig mit einem wasserlöslichen Ester einer Fettsäure mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen; reaktionsfähig mit einem wasserlöslichen Mono- oder Triacylglycerinester, aber nicht mit einem wasserunlöslichen Mono-, Di- oder Triacylglycerinester; reaktionsfähig mit Palmitoyl-CoA, aber nicht mit Acetyl-CoA, Cholinester oder Cholesterinester;

3) pH-Optimum und pH-Stabilität:

das pH-Optimum für die Hydrolyse des p-Nitrophenylesters der 2,2-Dimethyl-3-(2,2-dichlorvinyl)cyclopropancarbonsäure der Formel (I) als Substrat beträgt 8,5 bis 9,0

und wenn eine 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0 bis 9,0) oder eine 10 mM Phosphatpufferlösung verwendet wird, betragen die verbleibenden Aktivitäten nach einer 48stündigen Behandlung in der Pufferlösung bei 4ºC bei einem pH-Wert von 7,0 bis 9,0, 6,0 bzw. 5,0, etwa 100 %, etwa 45 % bzw. etwa 20 %;

4) Temperaturoptimum und Hitzestabilität:

das Temperaturoptimum für die Hydrolyse des p-Nitrophenylesters der 2,2-Dimethyl-3-(2,2-dichlorvinyl)cyclopropancarbonsäure als Substrat in 100 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) beträgt 50 bis 55ºC;

und die verbleibenden Aktivitäten nach einer 10minütigen Behandlung in den wie in (3) vorstehend definierten Pufferlösungen betragen bei 35ºC, 40ºC bzw. 50ºC etwa 100 %, etwa 80 % bzw. etwa 15 %;

5) Molekulargewicht:

54 000 + 2000 (durch Gelfiltration und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese);

6) Isoelektrischer Punkt:

4,8 ± 0,1;

7) Inaktivierungsbedingungen:

a) vollständig inaktiviert durch eine 10minütige Behandlung mit 100 uM phenylmethylsulfonylfluorid oder mit 80 uM Diisopropylfluorphosphat bei 37ºC; b) um etwa 25 % bzw. etwa 70 % verringerte Aktivität durch eine 10minütige Behandlung mit einer 1 mM Natriumdeoxycholat bzw. 5 mM Natriumlaurylsulfat enthaltenden 100 mM Tris-HCl Pufferlösung (pH 9,0) bei 37ºC.

2. Verfahren zur Herstellung einer Esterase nach Anspruch 1, das die Züchtung von Bacillus sp. DC-1 (FERM BP-1254) und die Gewinnung der Esterase aus den Zellen umfaßt.

3. Bacillus sp. DC-1 (FERM BP-1254) oder eine Mutante davon, die die Esterase nach Anspruch 1 erzeugt.

4. Kultur von Bacillus sp. DC-1 (FERM BP-1254) oder einer Mutante davon in einem Kulturmedium, das eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Substanzen enthält und im wesentlichen frei von anderen Mikroorganismen ist.