DE3024915C2

DE3024915C2 -

Info

Publication number: DE3024915C2
Application number: DE3024915A
Authority: DE
Inventors: Shigeru Ikuta; Kazuo Shizuoka Jp Matsuura
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1979-07-04
Filing date: 1980-07-01
Publication date: 1989-07-06
Also published as: JPS6117465B2; FR2460328A1; JPS568687A; FR2460328B1; US4420562A; DE3024915A1

Description

Kreatinase ist eine Kreatin-Amidinohydrolase mit der Systemnummer 3.5.3.3., die folgende Reaktion katalysiert:

Kreatin + H₂O→Harnstoff + Sarkosin

Bisher wurde dieses Enzym nur aus Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas oder Flavobacterium isoliert.

Es wurde nun festgestellt, daß ein Mikroorganismus, Stamm B-0618, der zur Gattung Bacillus gehört und aus einer Bodenprobe isoliert worden ist, die einer Auberginenfarm in Shimosasaki, Fukuchiyama, Bezirk Kyoto, Japan, entnommen worden ist, in den Zellen Kreatinase bildet, die dann erfolgreich isoliert werden kann. Dieser Stamm ist beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter der Nr. FERM BP-750 hinterlegt.

Die Eigenschaften einer Kultur des Stammes FERM BP-750 sind nach Beobachtung mit bloßem Auge und Mikroskop in verschiedenen Kulturmedien wie folgt:

A. Kultureigenschaften

(nach der Bebrütung bei 30°C während 18 bis 24 Stunden):

(1) Bouillon-Schrägagar
Gutes Wachstum in Streifen, grauweiß bis hellbraun. Kaum Bildung von löslichem Pigment.
(2) Glucose-Bouillon-Schrägagar
Gutes Wachstum in Streifen, grauweiß bis hellbraun. Bildung geringer Mengen von löslichem Pigment.
(3) Bouillon-Flüssigkultur
Einheitliche Trübung, keine Häutchenbildung, aber Bildung von Niederschlag.
(4) Lackmus-Milchkultur
Wird nach 1 bis 2 Wochen alkalisch.
(5) Bouillon-Gelatine-Lochkultur
Wachstum nur im oberen Teil, schwache Verflüssigung in Trichterform.

B. Morpholische Eigenschaften

(1) Form und Größe der Zellen:
Große und gerade Stäbchen mit einer Größe von 1,0×1,5×2,0-5 µm, mit abgerundeten Enden, im allgemeinen einzeln oder paarweise, gelegentlich kurze Ketten.
(2) Kein Polymorphismus der Zellen.
(3) Beweglichkeit:
Beweglich durch peritriche Begeißelung (kultiviert auf einem Bouillon-Schrägagar bei 26°C während 18 Stunden).
(4) Sporenbildung:
Zylindrische oder ellipsoide Sporen in der Mitte oder am subterminalen Ende der Zelle. Sporangien nicht definitiv geschwollen. Größe der Sporen: 0,8 bis 1,0×1,2 ×1,6 µm.
(5) Gram-positiver Stamm.
(6) Säurefestigkeit: negativ.

C. Physiologische Eigenschaften
Nitratreduktion
-
Denitrifikation	-
Methylrot-Test (MR-Test)	-
Voges-Proskauer-Test (VP-Test)	-
Indol-Bildung	-
Hydrogensulfid-Bildung	+
Stärke-Hydrolyse	-
Gelatine-Hydrolyse	+
Casein-Hydrolyse	-
Esculin-Hydrolyse	-
Cellulose-Hydrolyse	-
Zitronensäure-Verbindung @	im Simons-Kulturmedium	-
im Christensen-Kulturmedium	+
Nitrat-Verwertung	+
Ammoniumsalz-Verwertung	-
Ammoniak-Bildung aus Nitraten	+
pH-Wachstumsbereich	pH 6,4 bis 9,6
Wachstumstemperaturbereich	10 bis 42°C
Halogentoleranz	Wachstum bis 6,0% NaCl
Atmung	aerob
O-F-Test (Hugh Leifson-Kulturmedium)	keine Reaktion
O-F-Test (O-F-Test= Oxidations-Fermentations-Test)	O (Oxydation)

Da der vorliegende Stamm aus Glucose keine Säure und aus anderen Sacchariden keine oder nur geringe Mengen an Säure bildet, wird Glycerin als Kohlenhydrat verwendet, in einem Grundkulturmedium mit einem pH-Wert von 7,2 bis 7,4, das 1,0 g NH₄H₂PO₄, 0,2 g KCl, 0,2 g MgSO₄ · 7 H₂O, 1,0 g gepulverten Hefeextrakt, 3,0 g Agar, 10 ml einer wäßrigen 10%igen BTB-Lösung (Bromthymolblau) und 1000 ml destilliertes Wasser enthält.

Bildung von Säure oder Gas aus Sacchariden:
L-Arabinose
-
Cellobiose	-
Dulcit	-
Erythrit	-
Fructose	+ (Säure)
Galactose	-
Glucose	-
Glycerin	+ (Säure)
Inosit	-
Lactose	-
Maltose	-
Mannit	+ (Säure)
Mannose	-
Melezitose	-
Melibiose	-
Raffinose	-
L-Rhamnose	-
Salicin	-
L-Sorbose	-
Sorbit	-
Stärke	-
Saccarose	-
Trehalose	-
Xylose (keine Gasbildung)	-

Bei diesen Versuchen werden 10 g des Kohlenhydrats in das oben angegebene Kulturmedium gegeben.

Nach diesen Befunden ist der vorliegende Stamm Gram-positiv, sporenbildend, aerob, in Form von großen Stäbchen, die mit peritricher Begeißelung mobil sind, und bildet aus Glucose keine Säure. Durch Vergleich dieser Befunde mit der Beschreibung in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Auflage, 1974, gehört dieser Stamm zur Gattung Bacillus.

Der vorliegende Stamm FERM BP-750 wird außerdem mit Stämmen von Bacillus badius ATCC-14 574 (dem bei der "American Type Culture Collection" hinterlegten Stamm), Bacillus freudenreichii ATCC-7053 (weder die hinterlegte Kultur noch der Originalstamm) und Bacillus macroides ATCC-12 905 (der hinterlegte Stamm), die offenbar ähnliche Eigenschaften wie der vorliegende Stamm besitzen, verglichen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengefaßt.

Tabelle

Die Produktivität der Stämme wird in einem Bouillon-Kulturmedium verglichen:

Stamm FERM BP-750
schwaches Wachstum mit geschlechtsreifen Niederschlägen;
14 574,
einheitliche Trübung mit Teilniederschlägen;
7053,
schwaches Wachstum mit geschlechtsreifen Niederschlägen;
12 905,
schwaches Wachstum und einheitliche Trübung mit Teilniederschlägen.

Anhand der Ergebnisse dieser Vergleichsversuche wurde festgestellt, daß der vorliegende Stamm Bacillus sp.FERM BP-750 sich vom Stamm Bacillus badius ATCC-14 574 in der Bildung von Urease, der Bildung von Säure aus Glycerin (wobei die gebildete Säure jedoch später alkalisch wird) und in der Bildung von Säure aus Mannit unterscheidet. Vom Stamm Bacillus freudenreichii ATCC-7053 unterscheidet sich der vorliegende Stamm durch die Hydrolyse des Esculins und die Bildung von Säure aus Fructose, Glycerin und Mannit. Der vorliegende Stamm ähnelt diesem Stamm jedoch mehr als Bacillus badius ATCC-14 574 in bezug auf Wachstum und die Urease-Bildung. Da Bacillus freudenreichii ATCC-7053 nicht die hinterlegte Kultur noch der Originalstamm ist, ist die Identifizierung des vorliegenden Bacillus schwierig; eine Entscheidung, ob dieser Stamm neu ist, ist nicht möglich. Daher wurde der vorliegende Stamm unter der Nr. FERM BP-750 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung von Kreatinase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Bacillus sp. FERM BP-750 in einem Medium kultiviert und aus den Zellen die Kreatinase isoliert.

Die Erfindung betrifft auch den Stamm Bacillus sp. FERM BP-750.

Da Mikroorganismen, einschließlich des im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Stamms, durch natürlichen oder künstlichen Einfluß verändert werden können, ist im erfindungsgemäßen Verfahren selbstverständlich jede Variante von Bacillus sp. FERM BP-750 geeignet, vorausgesetzt, sie behält die Fähigkeit zur Kreatinase-Bildung.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird der Bacillus sp. FERM BP-750 in herkömmlicher Weise entweder in Flüssigkultur oder in fester Form kultiviert. Vom wirtschaftlichen Standpunkt aus ist es jedoch günstiger, die Zellen des Kreatinase bildenden Stammes auf ein Kulturmedium in großtechnischem Maßstab zu beimpfen und in Submerskultur unter Belüftung und Bewegung zu kultivieren.

Als Nährstoffquellen kommen alle für die herkömmliche Kultur von Mikroorganismen verwendeten Substanzen in Frage. Als Stickstoffquelle ist jede verfügbare Stickstoffverbindung geeignet, wie Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Pepton, verschiedene Fleischextrakte, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat oder Ammoniumchlorid. Als Kohlenstoffquelle sind Verbindungen, wie Glucose, Melasse, Glycerin oder Stärkehydrolysate, geeignet. Gegebenenfalls kann man dem Kulturmedium Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumdihydrogenphosphat oder Natriummonohydrogenphosphat, zusetzen. Vorzugsweise wird dem Kulturmedium auch Kreatin zugegeben, um die Kreatinase-Produktion während der Kultur zu erhöhen. Kreatin wird vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,5 bis 1% zugesetzt.

Die Bebrütungstemperatur liegt im erfindungsgemäßen Verfahren günstigerweise zwischen 26 bis 33°C. Die Betrübungsdauer hängt von verschiedenen Bedingungen ab, im allgemeinen sind 15 bis 25 Stunden ausreichend. Die Bebrütung wird im allgemeinen dann abgebrochen, wenn die Kreatinase-Aktivität ihr Maximum erreicht. Die Zellen des Produkts enthalten dann angehäuft die Kreatinase.

Zur Gewinnung der rohen Kreatinase-Lösung durch Extraktion oder Eluieren wird das Kulturprodukt zum Beispiel einer Fest/Flüssigtrennung unterworfen, die abgetrennten feuchten Zellen werden entweder in einem Phosphatpuffer oder einem Tris- HCl-Puffer suspendiert. Die Kreatinase wird aus diesen Zellen in herkömmlichen Verfahren zur Enzymextraktion extrahiert, z. B. durch Lysozym, Ultraschall oder Hochdruckpresse.

Diese rohe Kreatinase-Lösung kann man in herkömmlicher Weise reinigen, z. B. durch Zugabe einer wäßrigen Protaminsulfatlösung, um die Nucleinsäuren und durch fraktioniertes Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Methanol, Äthanol oder Isopropanol, oder durch Aussalzen des Enzyms mit einem geeigneten Salz, wie Ammoniumsulfat. Die isolierten Niederschläge können zum Beispiel durch Elektrophorese gereinigt werden, soweit es sich um eine homogene Proteinbildung handelt. Reinigungsverfahren, die die Eigenschaften der Kreatinase ausnutzen, sind günstig. So können die Niederschläge in einem Tris-Salzsäurepuffer gelöst und an einer ionenaustauschenden Substanz chromatographiert werden, z. B. an Diäthylaminoäthylcellulose oder Diäthylaminoäthyldextrangel oder einem Gelfiltrationsmittel, wie Dextran- oder Polyacrylamidgel. Die Reinigung kann aber auch durch Kombination dieser Verfahren durchgeführt werden. Schließlich erhält man ein reines Kreatinase-Pulver durch Trocknen des Produkts, z. B. durch Gefriertrocknen.

Fig. 1 zeigt die Abhängigkeit der Kreatinase-Aktivität vom pH-Wert.

Fig. 2 zeigt die pH-Stabilität der Kreatinase.

Fig. 3 zeigt die thermische Stabilität der Kreatinase.

Fig. 4 zeigt die Abhängigkeit der Kreatinase-Aktivität von der Temperatur.

Die Enzymaktivität sowie die physiko-chemischen Eigenschaften der im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Kreatinase werden bestimmt:

1. Enzymaktivität

0,5 ml eines Reaktionsgemisches, das aus 0,05 ml 0,2 m Phosphatpuffer, pH 7,5 und 0,45 ml einer 0,05 m Kreatin-Lösung besteht, werden mit 10 µl einer Enzymlösung versetzt und 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von 0,5 ml einer 0,0005 PCMB-Lösung wird die Reaktion beendet. Das in der Reaktion gebildete Sarcosin wird mittels Sarcosin-Oxidase (EC 1.5.3.1) bestimmt. Das Reaktionsgemisch wird mit 0,5 ml einer Lösung, die 0,1 ml 0,2 m Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 0,05 ml einer 0,3-prozentigen 4-Aminoantipyrin-Lösung, 0,05 ml einer 0,2-prozentigen Phenollösung, 0,05 ml einer 0,05 g/100 ml enthaltenden Peroxidase-Lösung, 0,1 ml einer Sarcosin-Oxidase-Lösung (30 U/ml) und 0,15 ml destilliertes Wasser enthält, versetzt und 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 1,5 ml destillierten Wassers wird die Menge an freigesetztem Wasserstoffperoxid im Reaktionsgemisch kolorimetrisch bei 500 nm bestimmt. Daraus errechnet sich die durch die Kreatinase gebildete Menge an Sarcosin.

Die Menge an Enzym, die nach 1 Minute bei 37°C aus Kreatin 1 µMol Sarcosin bildet, ist als eine Einheit (1 U) definiert.

2. Reaktion

Das Enzym katalysiert die Reaktion, in der aus 1 Mol Kreatin unter Verbrauch von 1 Mol Wasser, 1 Mol Harnstoff und Sarcosin entsteht.

3. pH-Optimum

Das Optimum des pH-Wertes der Kreatinase liegt bei etwa 7,5 bis 9,0 (siehe Fig. 1).

Als Puffer werden dafür Dimethylglutarat-Natriumhydroxid-Puffer, pH 5,0 bis 7,0, Phosphatpuffer, pH 6,0 bis 7,5, Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 bis 9,0, und Glycin-Natriumhydroxid-Puffer, pH 9,0 bis 10,0, verwendet.

4. pH-Stabilität

Das Enzym wird zu jedem dieser Puffer zugesetzt, 60 Minuten bei 37°C inkubiert und die Restaktivität bestimmt. Die Kreatinase ist in einem pH-Bereich von etwa 6,0 bis 9,0 stabil (siehe Fig. 2).

5. Thermische Stabilität

Je 1 ml Kreatinase-Lösung in 0,01 m Phosphatpuffer, pH 7,5, wird bei verschiedenen Temperaturen 10 Minuten inkubiert, die Restaktivität wird bestimmt. Die Kreatinase ist bei einer Temperatur unterhalb etwa 40°C stabil (siehe Fig. 3).

6. Optimale Reaktionstemperatur

Die optimale Reaktionstemperatur der Kreatinase liegt bei etwa 40°C (Fig. 4).

7. Molekulargewicht

Es beträgt etwa 74 000 (bestimmt durch Gel-Filtration).

8. Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt der Kreatinase liegt bei etwa pH 4,9 (bestimmt durch isoelektrische Fokuselektrophorese mit einem Trägerampholyten).

Die im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Kreatinase ist somit eine Kreatin-Amindino-Hydrolase mit der systematischen Nummer 3.5.3.3. Dieses Enzym kann auf verschiedene Weisen verwendet werden, z. B. als enzymatisches Reagens für die klinische Diagnostik. So kann man die Kreatinase in Kombination mit Sarcosin-Oxidase zur Bestimmung von Kreatinin in Serum oder Urin oder allein zur Bestimmung der Kreatininase verwenden.

Das Beispiel erläutert die Erfindung.

Ausführungsbeispiel

100 ml eines Kulturmediums, pH 7,0, das aus 0,5% Kreatin, 0,5% löslichem Fischextrakt, 0,2% Hefeextrakt, 0,3% Kaliumchlorid, 0,1% Kaliumhydrogenphosphat und 0,05% Magnesiumsulfat (MgSO₄ · 7 H₂O) besteht, werden in einem 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben 20 Minuten bei 120°C sterilisiert, dann mit Bacillus sp. FERM-750 beimpft und einen Tag bei 30°C bebrütet. Mit dieser Impfkultur werden in einem 30 l fassenden Fermentator 20 l eines Kulturmediums der angegebenen Zusammensetzung, die vorher sterilisiert worden sind, beimpft und bei einer Temperatur von 30°C, unter Rühren bei 200 UpM und einer Belüftung mit 20 l steriler Luft/Minute 20 Stunden bebrütet. Die Kulturbrühe wird dann zentrifugiert, man erhält 12 g Naßzellen, die mit einem 0,01 m Phosphatpuffer, pH 7,5, gewaschen und dann in dem gleichen Puffer suspendiert werden, mit Lysozym (Endkonzentration 0,2 mg/ml) versetzt, bei 37°C während 30 Minuten inkubiert und schließlich bei 5000 UpM 15 Minuten zentrifugiert werden. Man erhält einen Überstand mit einer Kreatinase-Aktivität von 800 U, der mit 2,5 ml einer wäßrigen 2-prozentigen Protaminsulfatlösung versetzt und zur Entfernung der Nucleinsäuren zentrifugiert wird. Die Lösung wird mit einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung versetzt; die bei einer Ammoniumsulfatkonzentration von 50 bis 70% ausgefallenen Fraktionen werden abgetrennt und in 20 ml 0,01 m Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, gelöst. Die entstandene Lösung wird durch eine Säule (3,5×30 cm), die mit vernetztem Dextran gefüllt ist, anschließend durch eine Säule (2,0×18 cm), die mit Diäthylaminoäthylcellulose gefüllt ist und mit 0,01 m Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, äquilibriert worden ist, geleitet. Die Säule wird mit 0,01 m Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, der 0,1 m Kaliumchlorid enthält, gewaschen und mit wäßriger Kaliumchloridlösung mit einem Konzentrationsgradienten von 0,1 bis 0,5 m eluiert. Die bei 0,3 m Kaliumchlorid eluierten aktiven Fraktionen werden gewonnen, durch Ultrafiltration eingeengt, 10 Stunden gegen 0,01 m Phosphatpuffer, pH 7,5, dialysiert und lyophilisiert. Das erhaltene Kreatinase-Pulver hat eine Gesamtaktivität von 220 U, einen Proteingehalt von 38 mg, eine spezifische Aktivität von 5,8 U/mg. Die Ausbeute beträgt 27,5%.

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung von Kreatinase, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus sp. FERM BP-750 in einem Medium kultiviert und aus den Zellen die Kreatinase isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Medium einsetzt, dem 0,5 bis 1% Kreatin zugesetzt worden sind.

3. Bacillus sp. FERM BP-750.