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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Arylacylamidase-Enzym sowie
die Herstellung von Arylacylamidase-Enzymen und Mikroorganismen, die diese
Enzyme erzeugen können.
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Die Arylacylamidase-Enzyme, auf die hier Bezug genommen wird, sind
von der International Union of Biochemistry (Enzyme Nomenclature 1978,
Academic Press, New York) als solche Enzyme festgelegt, welche die
Hydrolyse von Aniliden zu Anilinen plus Fettsäureanionen katalysieren.
Diese Enzyme sind durch die Enzymklassifikation E.C. 3.5.1.13 vorgegeben.
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Arylacylamidase-Enzyme können beispielsweise Acetanilide,
Acetaminophen (Paracetamol; p-Hydroxyacetanilid) und Phenacetin
(p-Ethoxyacetalinid) hydrolysieren und können dementsprechend bei Verfahren
zur Bestimmung dieser und anderer N-acylierter, primärer aromatischer Amine
verwendet werden, die als Medikamente, wie beispielsweise Paracetamol,
verwendet werden. Bevorzugt werden Schnellbestimmungen, da derartige
Medikamente oftmals in Überdosen genommen werden und eine prompte und
korrekte Arzneimittelanwendung erforderlich ist, wenn die Erzeugung
toxischer metabolischer Endprodukte vermieden werden soll.
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In einem dieser Analysenverfahren, wie es in der EP-A-53470 (United
Kingdom Public Health Laboratory Service Board, Porton Down) beschrieben
wurde, wird das Anilid durch das Enzym hydrolysiert und die Endprodukte der
Hydrolyse spektrophotometrisch bestimmt. Weitere Einzelheiten zu diesem
Verfahren sind in Hammond et al. (1984) "Development of an enzyme-based
assay for acetaminophen", Analytical Biochemistry 143: 152-157,
beschrieben.
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In einem anderen Verfahren, das in der EP-A-184895 (Genetics
International Inc.) beschrieben wurde, wird eine bei einem geeigneten
Potential ausballancierte Elektrode einer Probe exponiert, von der
angenommen wird, daß sie das Anilid enthält, und die mit dem Enzym
behandelt worden ist. Der an der Elektrode erzeugte Strom ist ein Maß für
die Menge der gebildeten Hydrolyseprodukte.
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Verfahren zur Herstellung der Enzyme, welche die vorstehend genannte
Deacylierung katalysieren, sind seit mehreren Jahren bekannt. Die
EP-A-53890 "Production of aryl acylamidases" (United Kingdom Public Health
Laboratory Service Board, Porton Down) nennt verschiedene Bezugsquellen von
Enzymen, einschließlich Bakterien der Gattung Pseudomonas und der Gattung
Bacillus, sowie Schimmelpilze der Gattung Penicillium.
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Die Herstellung von Arylacylamidase-Enzymen aus Stämmen der
Pseudomonas ist besonders gut beschrieben und Gegenstand des vorstehend
genannten Patents, welches besagt, daß die Enzymaktivität während des
Wachstums bestimmter Pseudomonaden auf Trypton-Soja-Kulturlösung in
Gegenwart eines Anilids angeregt wird. Weitere Einzelheiten zu Verfahren
für die Herstellung von Arylacylamidase finden sich bei Hammond et al.
(1983) "Purification and properties of Aryl Acylamidase form Pseudomonas
fluorescens ATCC 39004", European Journal of Biochemistry, 132: 651-655.
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Die vorliegende Erfindung gewährt ein neuartiges Verfahren zur
Herstellung eines Arylacylamidase-Enzyms. Dieses Verfahren umfaßt die
Kultivierung von Bakterien des Stammes Rhodococcus erythropolis NCIB 12273
oder Arylacylamidase-erzeugender Mutanten oder Varianten davon in einer
Kulturlösung, in der diese Bakterienstämme Arylacylamidase erzeugen können,
sowie das Sammeln des Materials, welches das Arylacylamidase-Enzym enthält.
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Vorzugsweise wird die Kultivierung chargenweise bei 25º. . .35ºC
für 10 Stunden bis 40 Stunden nach dem Beimpfen in einer Kulturlösung bei
einem pH-Wert von 7 bis 8 durchgeführt. Das Enzym enthaltende Material wird
normalerweise als ein zellfreier Extrakt gesammelt und kann mit
herkömmlichen Verfahren gereinigt werden, einschließlich durch
diskontinuierlichen Ionenaustausch, Säulen-Ionenaustausch,
Hydrophobchromatographie und Aussalzungsverfahren.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird der Stamm
Rhodococcus erythropolis NCIB 12273 oder dessen Arylacylamidase erzeugende
Mutanten oder Varianten gewährt.
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Rhodococcus erythropolis, ein grampositiver Stamm, gehört zu der
Familie Nocardiaceae der Ordnung Actinomycetales.
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Am einfachsten ist der Bakterienstamm in der Lage zur Erzeugung von
Arylacylamidase, wenn er in einer Trypton-Soja-Kulturlösung in Gegenwart
eines Induktors für Arylacylamidase gezüchtet wird, wobei Acetanilid
besonders bevorzugt ist.
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Vorzugsweise wird dem Arylacetylamidase-Produkt Dithiothreitol,
β-Mercaptoethanol oder ein anderes Thiol-schützendes Mittel zugesetzt, um
den Verlust der Enzymaktivität während der Lagerung herabzusetzen.
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Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele
veranschaulicht.
Beispiel 1: Vorbereitende Isolation
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Der Stamm R. erythropolis NCIB 12273 war einer von sechs Organismen,
der aus Gartenerde durch selektive Anreicherung auf dem aromatischen Amid
Acetaminophen (Paracetamol; p-Hydroxyacetanilid) als der einzigen Quelle
für Kohlenstoff und Energie isoliert wurde.
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Es wurde ein Nährmedium mit minimalen Salzen (auch genannt
Minimalmedium) (50 ml, pH 7,0; (Tabelle 1)), mit Acetaminophen (0,1
Gew.-%/Vol.) als einziger Quelle für Kohlenstoff und Energie mit einer
geringfügigen Menge Gartenerde von einem Blumenbeet beimpft.
Tabelle 1
Zusammensetzung des Nährmediums mit minimalen Salzen
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g/l
NaNo&sub3; 0,850
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KH&sub2;PO&sub4; 0,560
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Na&sub2;HPO&sub4; 0,860
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K&sub2;SO&sub4; 0,170
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MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,037
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CaCl&sub2;·2H&sub2;O 0,007
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Fe(III)-EDTA 0,004
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Lösung von Spurenelementen 2,5 ml/l
Lösung von Spurenelementen
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g/l
ZnSO&sub4;·7H&sub2;O 0,232
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MnSO&sub4;·4H&sub2;O 0,178
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H&sub3;BO&sub3; 0,056
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CuSO&sub4;·5H&sub2;O 0,100
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Na&sub2;MoO&sub4;·2H&sub2;O 0,039
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CoCl&sub2;·6H&sub2;O 0,042
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KJ 0,066
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EDTA 0,100
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FeSO&sub4;·7H&sub2;O 0,040
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NiCl&sub2;·6H&sub2;O 0,0004
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H&sub2;SO&sub4; (lm) 8,0 ml
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Die ersten Kulturen wurden für 2 bis 5 Tage auf einer
Umlaufschüttelmaschine (200 U/min) bei 30ºC bebrütet, bevor sie einem
sekundären Isolationsverfahren unterzogen wurden.
Beispiel 2: Sekundäre Isolationsverfahren
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Das sekundäre Isolationsverfahren umfaßte das direkte Aufziehen der
ersten Anreicherung und nachfolgende Isolation bis zur Reinheit der
Organismen, die sich auf den Testplatten entwickeln. Die Anreicherungen
wurden auf Agar mit minimalen Salzen aufgezogen, die Acetaminophen mit
einer Konzentration von 0,1% (Gewicht/Volumen) enthielten.
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Am Ende dieser Anreicherungsverfahren wurden sechs reine Kulturen
isoliert. Eines dieser Isolate erwies sich als ein grampositiver
Organismus, der auf Minimalagar mit entweder einem Gehalt von 0,1%
Acetaminophen oder 0,1% Phenacetin wachsen kann. In beiden Fällen trat
eine Verfärbung des Mediums auf. Die Verfärbung des Mediums wurde als ein
Zeichen für die Bildung und Reaktion von substituierten Anilinen verwendet,
das wiederum dafür einen Hinweis gab, daß der Organismus zur Hydrolyse des
Anilidsubstrats in der Lage war und damit eine Aktivität der
Arylacylamidase besaß. Der Organismus wurde als ein Stamm des Rhodococcus
erythropolis auf der Grundlage der nachstehend beschriebenen Merkmale
identifiziert.
Merkmale des Organismus
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Der isolierte Organismus zeigte die folgenden morphologischen und
färbenden Merkmale bei Kultivierung auf Agarnährboden bei 30ºC:
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Form: Stab
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Motilität: negativ
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Sporen: keine
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Gramsche Färbung: positiv
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Die nach einem Wachstum von 3 Tagen bei 30ºC auf Agarnährböden
erzeugten Kolonien waren rund, regelmäßig, vollständig, glatt, konvex, von
weiß abweichend, glänzend, schleimartig und lichtundurchlässig mit einem
Durchmesser von 2 bis 3 mm.
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Nach einem Wachstum von 10 Tagen bei 30ºC hatten die Kolonien eine
blaßrosa Färbung.
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Der Organismus war Katalase-positiv, oxidase-(Kovacs)-negativ und in
dem O-F-Glucosetest schwach oxidativ.
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Der Organismus zeigte in 48-Stunden-Tests bei 25ºC die folgenden
Merkmale:
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NO&sub3;-Reduktion negativ
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Indol-Erzeugung negativ
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Säureproduktion aus Glucose negativ
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Arginin-Dehydrol ase-Aktivität negativ
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Urease positiv
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Aesculin-Hydrolyse positiv (schwach)
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Gelatine-Hydrolyse negativ
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β-Gal actosidase Spuren
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Glucose-Assimilation positiv
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Arabinose-Assimilation negativ
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Mannose-Assimilation negativ
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Mannitol-Assimilation positiv
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N-acetylglucosamin-Assimilation positiv
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Maltose-Assimilation negativ
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Gluconat-Assimilation positiv
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Caprat-Assimilation negativ
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Adipat-Assimilation positiv
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Malat-Assimilation positiv
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Citrat-Assimilation positiv
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Phenylacetat-Assimilation positiv
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Cytochrom-Oxidase negativ
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Der Organismus zeigte in 7-Tage-Tests bei 25ºC die folgenden
Merkmale:
Zersetzung von:
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Adenin positiv
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Tyrosin positiv
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Harnstoff positiv
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Allantoin negativ
Säure von:
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Inositol positiv
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Trehalose positiv
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Mannitol positiv
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Sorbitol positiv
Wachstum auf alleinigen Kohlenstoffquellen:
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Glycerol positiv
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Sorbitol positiv
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Maltose positiv
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Trehalose positiv
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Benzoat negativ
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Citrat positiv
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Lactat positiv
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L-Tyrosin negativ
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p-Hydroxybenzoat positiv
Weitere Merkmale:
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ONPG positiv
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Tween 80 positiv
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Färbung auf Glucoseagar blaßrosa, schleimig
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Phosphatase positiv
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Wachstum bei 10ºC positiv
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Wachstum bei 40 ºC negativ
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Diese Merkmale weisen nach, daß der Organismus ein Stamm der R.
erythropolis ist, der atypisch bei 40ºC kein Wachstum zeigt.
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Die Einflüsse der Änderungen des pH-Werts der Kulturlösung und der
Temperatur der Kulturlösung auf das Wachstum des Stammes wurden untersucht.
Das Wachstum erfolgt im gesamten untersuchten pH-Bereich von pH 6,6 bis pH
8,4 mit einer optimalen Wachstumsrate zwischen pH 7,0 und pH 8,0. Ein
Vergleich der Wachstumsraten bei 26º, 30º und 35ºC zeigte, daß das
Wachstum bei 30ºC am schnellsten erfolgt.
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Der Stamm wurde nach dem "Budapest Treaty at the National Collection
of Industrial Bacteria" bei der Torry Research Station, PO Box 31, 135
Abbey Rd Aberdeen, AB9 8DG, England am 26. Juni 1986 hinterlegt und erhielt
die Annahme-Nummer NCIB 12273. Die Proben stehen unter dem entsprechenden
Gesetz zur Verfügung.
Beispiel 3: Ermittlung der Arylacylamidase-Aktivität
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Der isolierte Stamm der R. erythropolis wurde in 100 ml 2%iger
Trypton-Soja-Kulturlösung mit einem Gehalt von 0,1% Acetanilid zu einem
von 1,8 (alle in dieser Patentschrift angegebenen A-Werte wurden mit
einem Spektrophotometer Cecil-Modell CE 594 gemessen) kultiviert. Die
Kultur wurde durch Zentrifugieren (10.000 g, 10 Minuten) geerntet und die
Pellets zum Waschen in Tris/HCl-Puffer (50 mMol, pH 8,6) erneut suspendiert.
Nach dem Zentrifugieren wurden die gewaschenen Zellpellets in 5 ml des
gleichen Puffers erneut suspendiert und die erneut suspendierte
Zellensuspension durch Ultraschallbehandlung (4·30 Sekunden-Stöße, 16 mu
Amplitude mit Abkühlperioden von 2 Minuten) zerstört. Die zerstörte
Zellensuspension wurde zur Entfernung der Zelltrümmer zentrifugiert
(10.000 g, 30 Minuten) und der Oberstand sorgfältig entfernt und bis zur
Analyse auf Eis gelagert.
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Die Arylacylamidase-Aktivität wurde nach den zwei folgenden Verfahren
ermittelt.
1) Das diskontinuierliche Bestimmungsverfahren:
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Die Reaktionsmischung setzte sich folgendermaßen zusammen: Zellfreier
Extrakt (100 ul); Acetaminophen (26,5 mMol; 100 ul); Tris/HCl-Puffer
(100 mMol, pH 8,6, 800 ul). Diese wurde gründlich gemischt und bei 30ºC
bebrütet. Nach Ablauf-der erforderlichen Zeit wurde die Reaktion durch
folgenden Zusatz abgeschlossen: o-Kresol (1% Vol./Vol. wäßrige Lösung;
2 ml); Kupfer(II)-sulfat (0,2% Gew./Vol. des wasserfreien Salzes, dem
0,880 Ammoniak zugesetzt wurde (1,6 ml/100 ml), 0,2 ml); destilliertes
Wasser (1,4 ml). Die Bildung eines blauen Pigments bestätigte die
Anwesenheit des Reaktionsprodukts p-Aminophenol, wobei dieses durch Messung
der Absorption bei 615 nm und Vergleich mit einer mit p-Aminophenol
aufgenommenen Eichkurve (Hammond et al 1984) quantitativ bestimmt wurde.
2) Das kontinuierliche Bestimmungsverfahren:
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Die Reaktionsmischungen waren folgendermaßen zusammengesetzt:
Tris/HCl-Puffer (100 mMol, pH 8,6; 0,6 ml); p-Nitroacetanilid (1 mMol,
zubereitet durch Auflösen der festen Substanz in Ethanol vor dem Verdünnen,
um eine Endkonzentration des Ethanols von 10% Vol./Vol. zu erhalten). Die
Reaktion wurde durch Zusatz von zellfreiem Extrakt (400 ul) eingeleitet
und
die Reaktionsmischung bei 30ºC bebrütet. Das Reaktionsprodukt
p-Nitroanilin zeigte eine starke Absorption bei 405 nm und hatte unter
diesen Bedingungen einen molaren Extinktionskoeffizienten von 10.000
1/mol cm.
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Die nach dem kontinuierlichen Bestimmungsverfahren gemessene
Arylacylamidase-Aktivität des zellfreien Extrakts betrug 0,34 uMol pro
Minute pro mg Protein hydrolisiertes p-Nitroacetanilid.
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Das kontinuierliche Bestimmungsverfahren wurde als Grundlage für die
Festlegung einer Einheit der Aktivität des Enzyms verwendet. Speziell wurde
eine Einheit der Enzymaktivität als 1 pMol zu p-Nitroanilin pro Minute
hydrolysiertes p-Nitroacetanilid unter den Bedingungen der kontinuierlichen
Bestimmung definiert.
Beispiel 4: Enzym-Lagerung
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Zellfreie Extrakte des isolierten Stammes R. erythropolis, die unter
Verwendung von 50 mMol Tris/HCl-Puffer (pH 8,6) hergestellt wurden,
verloren den größten Teil ihrer Arylacylamidase-Aktivität, wenn sie für
eine Dauer von 18 Stunden bei 4ºC gelagert wurden. Die Stabilität des
Enzyms wurde durch Zusatz von 1 mMol Dithiothreitol zum Extrakt wesentlich
verbessert. In Anwesenheit von 1 mMol Dithiothreitol ging nach 18stündiger
Lagerung bei 4ºC in zellfreien Extrakten lediglich ein gewisser Teil der
Anfangsaktivität der Arylacylamidase verloren.
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Ebenfalls wurde der Proteaseinhibitor Phenylmethylsulphonylfluorid
auf seinen Einfluß auf die Stabilität der Arylacylamidase in zellfreiem
Extrakt getestet, wobei jedoch festgestellt wurde, daß die
Arylacylamidase-Aktivitäten relativ zu den Vergleichsproben herabgesetzt
wurden.
Beispiel 5: 15 Liter-Scale-up-Kultur von R. erythropolis
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Der Stamm von R. erythropolis wurde in einem 20 Liter-Fermenter
gezüchtet, der bei 30 ºC und einem pH von 7,2 15 Liter 2%ige
Trypton-Soja-Kulturlösung plus 0,1% Acetanilid (als ein
Arylacylamidase-Induktor) plus 0,33% (Vol./Vol.) Polypropylenglycol P2000
enthielt. Der Fermenter wurde mit 5 Litern Luft pro Minute belüftet. Die
verwendete Impfkultur war eine 500 ml-Kultur, die für 32 Stunden auf dem
gleichen Medium gezüchtet wurde. Das Wachstum war nach 24 Stunden im
wesentlichen beendet, zu welchem Zeitpunkt die Kultur einen Wert für A&sub6;&sub0;&sub0;
von 7,0 erreicht hatte. Die in zellfreien Extrakten der Kulturproben
gemessene spezifische Aktivität der Arylacylamidase war in der letzten
exponentiellen Phase des Wachstums (nach etwa 18 Stunden Wachstum) mit
einem Wert von 0,59 Einheiten pro mg Protein am größten.
Beispiel 6: 75 Liter-Scale-up-Kultur von R. erythropolis
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Eine 250 ml-Schüttelflasche, die 100 ml 2%ige
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Trypton-Soja-Kulturlösung (Oxoid) plus 0,1% Acetanilid (BDH) in
deionisiertem Wasser enthielt, wurde aus einem Nähragaraufzug von R.
erythropolis mit der Öse beimpft. Die Kultur wurde bei 30ºC auf einer
Orbital-Schüttelvorrichtung (150 U/min) für 72 Stunden aufgezogen, wonach
20 ml-Teilmengen zur Beimpfung von vier 2 Liter-Schüttelflaschen verwendet
wurden, die jeweils 500 ml des gleichen Mediums enthielten. Diese Kulturen
wurden für 16 Stunden unter den gleichen Bedingungen aufgezogen und danach
zur Beimpfung von 75 Litern des gleichen Mediums (plus 0,1%
Polypropylenglycol P2000) in einem Fermenter (Bioengineering, Switzerland)
einer 100 Liter-Pilotanlage verwendet. Die Wachstumsbedingungen waren:
Temperatur 30ºC, Belüftung 25 Liter pro Minute, pH 7,2 (aufrechterhalten
durch automatische Zugabe von 0,2 m HCl). Die Rührgeschwindigkeit betrug
400 U/min. Die Kultur erreichte nach 18stündiger Bebrütung einen A&sub6;&sub0;&sub0; von
7,2 und wurde zu diesem Zeitpunkt unter Verwendung einer kontinuierlichen
Zentrifuge nach Sharples abgeerntet, um 550 g Feuchtgewicht der Zellen zu
ergeben.
Beispiel 7: Verfahren zur Reinigung des Enzyms
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Es wurde eine Kultur von R. erythropolis nach dem im Beispiel 5
beschriebenen Verfahren aufgezogen. Nach einem Wachstum von 17 Stunden
erzielte die Kultur einen A&sub6;&sub0;&sub0; von 6 und wurde unter Verwendung einer
kontinuierlichen Zentrifuge nach Sharples abgeerntet und Zellen mit einem
Feuchtgewicht von 150 g gewonnen. Die Zellen wurden gewaschen, indem sie
nochmals in etwa 300 ml 50 mMol Tris/HCl-Puffer mit pH 7,5 suspendiert und
die Suspension danach bei 11.000 g für 90 Minuten bei 4ºC zentrifugiert
wurde, um einen Überstand zu erzeugen, der verworfen wurde, sowie ein
Zellpellet. Das Zellpellet wurde erneut zu 300 ml in 50 mMol Tris/HCl-Puffer
mit einem pH 7,5 suspendiert und die resultierende Suspension bis zu ihrer
Verwendung bei minus 20ºC gelagert.
A1: Diskontinuierliches Ionenaustauschverfahren
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In dem Ionenaustauschverfahren zur Reinigung wurden 4 g
DE52-Ionenaustauscherharz (Whatman), das zuvor mit 50 mMol Tris/HCl-Puffer
bei pH 7,5 eingestellt wurde, zu 56 ml zellfreiem Extrakt zugesetzt. Der
zellfreie Extrakt wurde erhalten, indem 60 ml der bei minus 20ºC
gelagerten abgeernteten Suspension genommen und aufgetaut und zu 10 ml
50 mMol Tris/HCl-Puffer bei pH 7,5 zusammen mit Dithiothreitol (DTT) auf
1 mMol zugesetzt wurden. Die Suspension wurde in 2 Chargen aufgeteilt, von
denen jede mit Ultraschall behandelt wurde (10·45 Sekunden Dauer, 16 um
Amplitude mit Abkühlperioden von 2 Minuten). Das beschallte Material wurde
so dann gekühlt und für 70 Minuten bei 31.000 g und 4ºC zentrifugiert, um
57 ml zellfreien Extrakt zu liefern.
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Die Mischung des zellfreien Extrakts und das DE52-Harz wurden bei
4ºC für 3 Stunden gerührt, wonach man das DE52-Harz absetzen ließ. Der
Überstand wurde dekantiert und das DE52-Harz durch Zusatz von 80 ml 20 mMol
Tris/HCl-Puffer bei pH 7,5 (mit einem Gehalt von 1 mMol DTT) gewaschen und
die Suspension für 5 Minuten bei 4ºC gerührt. Das DE52-Harz ließ man
wiederum absetzen und dekantierte den Überstand, um das
Ionenaustauscherharz suspendiert in etwa 4 ml Puffer (Gesamtvolumen etwa
7 ml) zurückzulassen. Hierzu wurden 21 ml 20 mMol Tris/HCl-Puffer mit pH 7,5
und einen Gehalt von 0,4 m Natriumchlorid plus 1 mMol DTT zugesetzt, um eine
Endkonzentration des Salzes von etwa 0,35 m zu erzeugen. Die Suspension
wurde für 2 Stunden gerührt und danach durch ein 0,4 um-Filter zur
Entfernung des Ionenaustauscherharzes filtriert, wobei das Filtrat die
Arylacylamidase enthielt. Es wurde eine 1,8fache Proteinreinigung erzielt,
d. h. eine Zunahme der spezifischen Aktivität der Arylacylamidase von 0,58
Einheiten pro mg Protein auf 1,05 Einheiten pro mg Protein. Die Ausbeute
des Enzyms betrug 77%.
A2: Säulen-Ionenaustauschverfahren
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Das durch das diskontinuierliche Reinigungsverfahren mit DE52-Harz
erzeugte Material wurde durch Ionenaustausch-Chromatographie an einer Säule
der Pharmacia Q-Sepharose Fast Flow-Gel (ein vernetztes Agarose-Gel, das
quaternäre funktionelle Amin-Gruppen enthält) weiter gereinigt. Eine
5 ml-Probe des DE52-Harz-gereinigten Materials wurde mit 1 ml 20 mMol
Tris/HCl-Puffer mit pH 7,5 gemischt, um die NaCl-Konzentration der Probe
auf weniger als 0,3 m zu verdünnen. Eine Menge von 5 ml der verdünnten
Probe wurde auf eine 48 ml-Q-Sepharose-Säule (9·2,6 cm) gegeben, die
zuvor mit 20 mMol Tris/HCl-Puffer mit pH 7,5 und einem Gehalt von 0,3 m
NaCl plus 1 mMol Dithiothreitol (DTT) eingestellt wurde. Das Protein wurde
mit 240 ml des gleichen Puffers eluiert, gefolgt von 240 ml 20 mMol
Tris/HCl-Puffer mit pH 7,5 plus 0,4 m NaCl (und 1 mMol DTT). Die
Durchflußrate betrug 240 ml pro Stunde, wobei 10 ml-Fraktionen des Eluats
aufgenommen wurden. Die Arylacylamidase wurde eluiert, nachdem zwischen 60
und 150 ml des 0,4m-NaCl-Puffers auf die Säule gegeben wurden. Es wurde
eine Reinigung des Proteins von 4,9fach mit einer Ausbeute von 90%
erzielt.
A3: Hydronhobchromatoqraphie
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Es wurde eine Probe der Enzymlösung, die durch das
Reinigungsverfahren mit der Q-Sepharose-Säule hergestellt wurde, durch
Diafiltration entsalzen und konzentriert, indem eine
Ionenaustauschermembran-Patrone mit einem Rückhaltevermögen eines
Molekulargewichts von 30.000 nach Amicon und ein 1 mMol Dithiothreitol
(DTT) enthaltender 20 mMol Tris/HCl-Puffer mit pH 7,5 verwendet wurden. Ein
weiteres Konzentrieren der Probe wurde durch Verwendung einer mit einer
Ionenaustauschermembran für ein Molekulargewicht von 30.000 ausgestatteten
Ultrafiltrationszelle nach Amicon erzielt. Dieses Verfahren führte zu einer
Proteinreinigung des Enzyms von etwa 2fach.
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Eine 0,5 ml-Probe mit 0,42 mg Protein pro ml, 12,5 Einheiten
Arylacylamidase pro mg Protein einer konzentrierten Lösung, die durch das
vorstehende Verfahren hergestellt wurde, wurde auf eine 4 ml-Säule (2·1,6 cm) mit Pharmacia-Phenyl-Sepharose-Gel (ein phenylsubstituiertes,
vernetztes Agarose-Gel) gegeben, die zuvor mit 0,5 m Ammoniumsulfat in
20 mMol Tris/HCl mit pH 7,5 plus 1 mMol DTT eingestellt wurde. Die Säule
wurde mit 10 ml der gleichen Lösung gewaschen und das Enzym in mit einem
20 ml linear von 0,5 . . . 0,0 m abfallenden Gradienten Ammoniumsulfat in
20 mMol Tris/HCl mit pH 7,5 plus 1 mMol DTT eluiert, gefolgt von 20 ml des
20 mMol Tris/HCl-Puffers mit pH 7,5 plus 1 mMol DTT. Die Durchflußrate
betrug 0,33 ml pro Minute, wobei 1 ml-Fraktionen aufgenommen wurden. Das
Enzym wurde gegen Ende des absteigenden Gradienten des Ammoniumsulfats
eluiert. Es wurde eine 1,9fache Reinigung erreicht, d. h. die spezifische
Aktivität der Arylacylamidase wurde von anfangs 12,5 Einheiten pro mg
Protein auf 23,2 Einheiten pro mg Protein erhöht und eine Ausbeute von 85%
erzielt.
B: Ausfällung von Ammoniumsulfat
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Es wurde festgestellt, daß der überwiegende Anteil (86%) der
Arylacylamidase in einem rohen zellfreien Extrakt von R. erythropolis
zwischen 20 und 40% Ammoniumsulfat-Sättigung ausfällt. (Der rohe zellfreie
Extrakt enthielt 10 mg pro ml Protein und hatte eine Aktivität der
Arylacylamidase von 0,48 Einheiten pro mg Protein. Der Extrakt war in
50 mMol Tris/HCl-Puffer mit pH 7,0 mit einem Gehalt von 1 mMol
Ethylendiamintetraessigsäure und 1 mMol Dithothreitol).
Beispiel 8: Weitere Enzymeigenschaften
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Es wurden weitere Eigenschaften des Enzyms untersucht.
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Unter Anwendung eines Enzyms, das in einem diskontinuierlichen
Ionenaustauschverfahren gereinigt wurde, gefolgt von dem
Säulen-Ionenaustauschverfahren wurde zur Bestimmung des Einflusses des
pH-Werts auf die Aktivität der Arylacylamidase von R. erythropolis die
p-Nitroacetanilid-Bestimmung verwendet. Das Enzym hatte ein breites
pH-Optimum mit maximaler Aktivität bei etwa pH 8,0.
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Unter Anwendung einer Enzymprobe, die durch
Säulen-Ionenaustauschchromatographie gereinigt wurde und danach unter
Verwendung der Filtrationssäule mit Pharmacia PD-10-Gel entsalzen worden
ist, wurde der isoelektrische Punkt der Arylacylamidase von R. erythropolis
durch Gel-Elektrophorese mit isoelektrischer Fokussierung bestimmt. Das
Enzym wurde auf dem Gel mit Hilfe einer p-Nitroacetanilid-Aktivitätsfärbung
für Arylacylamidase-Aktivität sichtbar gemacht und seine Position auf dem
pH-Gradienten in bezug auf die gefärbten Proteinmarkierungen der bekannten
isoelektrischen Punkte bestimmt. Das Enzym zeigte eine Fokussierung in
einer Position in der Mitte zwischen den Proteinmarkierungen mit
isoelektrischen Punkten von pH 6,45 und pH 7,3, was darauf hinwies, daß der
isoelektrische Punkt der Arylacylamidase von R. erythropolis näherungsweise
pH 7,0 war.