DE4445084B4

DE4445084B4 - Neue Kreatinamidinohydrolase und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE4445084B4
Application number: DE4445084A
Authority: DE
Inventors: Keisuke Noda Furukawa; Kyoko Noda Hashimoto; Masaru Noda Suzuki
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1993-12-17
Filing date: 1994-12-16
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2014-12-17
Also published as: DE4445084A1; JPH07170979A; US5451520A; JP2788174B2

Abstract

Kreatinamidinohydrolase erhältlich aus einem Mikroorganismus der Gattung Alkaligenes mit folgenden physikochemischen Eigenschaften:
(a) Wirkung: Hydrolyse von Kreatin, wobei aus 1 Mol Kreatin 1 Mol Sarkosin und 1 Mol Harnstoff entsteht;
(b) Substratspezifität: spezifisch für Kreatin;
(c) pH-Optimum: pH 7 bis 9;
(d) Temperaturoptimum: im Bereich von 35 bis 45°C;
(e) pH-Stabilität: bei 25°C im Bereich von pH 5,0 bis 10,5 17 Stunden stabil;
(f) thermische Stabilität: bei pH 7,5 und einer Temperatur bis etwa 45°C 30 Minuten stabil;
(g) Inhibitoren: AgNO₃, HgCl₂, CuSO₄ und
(h) Molekulargewicht: 80 000 ± 5000 (bestimmt durch Gelfiltration).

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Kreatinamidinohydrolase und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Es ist bekannt, daß in menschlichem Serum und Urin vorkommendes Kreatin und Kreatinin als Indikator bei der Diagnose von Erkrankungen beim Menschen, speziell Nierenerkrankungen, verwendet werden können.

Als wichtiges Verfahren zur chemischen Quantifizierung der obengenannten Substanzen gibt es bis heute die Jáffe-Methode, aber diese ist sehr problematisch und weist z.B. nur eine geringe Spezifität auf. Aus diesen Gründen wurde ein Verfahren zur enzymatischen Quantifizierung von Kreatinin und/oder Kreatin entwickelt. Bei diesem Verfahren wird Kreatinin durch Kreatininamidinohydrolase hydrolysiert, wobei Kreatin gebildet wird, welches anschließend von Kreatinamidinohydrolase zu Sarkosin und Harnstoff hydrolysiert wird; anschließend läßt man Sarkosinoxidase auf das gebildete Sarkosin einwirken. Mit dieser Reaktionsfolge kann Kreatinin quantitativ bestimmt werden. Aufgrund der einfachen Durchführbarkeit und der höheren Spezifität verglichen mit der Jáffe-Methode hat sich dieses Verfahren bei klinischen Untersuchungen in letzter Zeit durchgesetzt.

Die oben erwähnte Kreatinamidinohydrolase ist z.B. aus der japanischen Patentschrift Nr. 76 915/91 bekannt.

Diese herkömmliche Kreatinamidinohydrolase hat jedoch verschiedene Nachteile. So ist z.B. die Aufreinigung bei pH 8,5 oder höher schwierig, da die Hydrolase nur im engen pH-Bereich von pH 4,5 bis 8,5 stabil ist. Außerdem ist die lange Zeit, die für die Untersuchung einer Probe benötigt wird, von Nachteil; Grund hierfür ist der hohe Km-Wert des Enzyms.

DE-OS-21 22 298 beschreibt eine Kreatinamidinohydrolase, die u.a. dadurch gekennzeichnet ist, dass sie bei pH 6 und darunter schnell an Aktivität verliert und bei 25°C einen K_M-Wert von 50 mmol/l aufweist. Dasselbe Enzym wird in DE 21 67 120 C2 beschrieben.

In CA 105:148593 c wird eine Kreatinamidinohydrolase beschrieben, deren Molekulargewicht mit Gelfiltration zu 51000 bestimmt wurde und die nur im Bereich von pH 5 bis 9 stabil ist.

JP-55-034029 offenbart eine Kreatinamidinohydrolase, deren pH-Optimum bei pH 7 bis 8 liegt und für die pH-Stabilität von pH 6 bis 8 gegeben ist.

In JP-62-091182 wird eine Kreatinamidinohydrolase beschrieben, deren mit Gelfiltration bestimmtes Molekulargewicht bei ungefähr 50000 liegt, die ein pH-Optimum um pH 7,0 bis 8,0 aufweist und im Bereich von pH 7,0 bis 8,5 stabil ist.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Kreatinamidinohydrolase bereitzustellen, die einen niedrige ren Km-Wert aufweist und bei hohen pH-Werten stabil ist. Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben bei ihrer Suche nach einem geeigneten Mikroorganismus herausgefunden, daß ein aus Böden isolierter bakterieller Stamm der Gattung Alkaligenes eine Kreatinamidinohydrolase produziert, die dieobengenannten Nachteile nicht aufweist.

Diese neue Kreatinamidinohydrolase erhältlich aus einem Mikroorganismus der Gattung Alkaligenes weist folgende physikochemische Eigenschaften auf:

(a) Wirkung: Hydrolyse von Kreatin, wobei aus 1 Mol Kreatin 1 Mol Sarkosin und 1 Mol Harnstoff entsteht;
(b) Substratspezifität: spezifisch für Kreatin;
(c) pH-Optimum: pH 7 bis 9;
(d) Temperaturoptimum: im Bereich von 35 bis 45°C;
(e) pH-Stabilität: bei 25°C im Bereich von pH 5,0 bis 10,5 17 Stunden stabil;
(f) thermische Stabilität: bei pH 7,5 und einer Temperatur bis etwa 45°C 30 Minuten stabil;
(g) Inhibitoren: AgNO₃, HgCl₂, CuSO₄ und
(h) Molekulargewicht: 80 000 ± 5000 (bestimmt durch Gelfiltration).

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Kreatinamidinohydrolase, welches die Züchtung des Mikroorganismus Alkaligenes sp. KS-85 umfaßt, welcher in der Lage ist, die Kreatinamidinohydrolase in einem Medium herzustellen, und die Gewinnung der Kreatinamidinohydrolase aus der Kultur.

1 ist eine graphische Darstellung des pH-Optimums des vorliegenden Enzyms.

2 ist eine graphische Darstellung des Temperaturoptimums des vorliegenden Enzyms.

3 gibt in graphischer Form die pH-Stabilität des vorliegenden Enzyms wieder.

4 ist eine Darstellung der thermischen Stabilität des vorliegenden Enzyms.

5 ist eine graphische Darstellung des zeitlichen Verlaufs der enzymatischen Reaktion, mit dem Ziel, den Unterschied bezüglich der Substratspezifität und der Reaktivität zwischen dem vorliegenden Enzym und dem herkömmlichen Enzym zu zeigen, wobei bei der Reaktion eine definierte Menge des Substrats von einer definierten Menge des Enzyms umgesetzt wird.

Der bakterielle Stamm, der in der vorliegenden Erfindung zur Herstellung der neuen Kreatinamidinohydrolase (im weiteren als vorliegendes Enzym bezeichnet) verwendet wird, ist der Mikroorganismus Alkaligenes sp. KS-85.

Der Stamm Alkaligenes sp. KS-85, der vor kurzem bei Bodenuntersuchungen in der Kyoto Präfektur gefunden wurde, hat die nachfolgend erläuterten bakteriellen Eigenschaften. Die Versuche zur Bestimmung der bakteriellen Eigenschaften wurden in Anlehnung an "Biseibutusu No Bunrui To Dotei" (Klassifizierung und Identifizierung von Mikroorganismen), herausgegeben von Takeji Hasegawa und veröffentlicht von der Tokyo University Press (1975), durchgeführt. Zur Klassifizierung und Identifizierung wird verwiesen auf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl. (1974).

Bakterielle Eigenschaften von Alkaligenes sp. KS-85:

(A) Morphologische Eigenschaften

Die Untersuchungen wurden unter dem Mikroskop durchgeführt; dabei wurde eine 24 bis 48 Stunden alte Kultur verwendet, die bei 30°C auf Fleisch-Agar-Medium bei pH 9,0 gezüchtet worden ist.

(1) Zellform und Größe: Stäbchenförmiger Bacillus von 0,5 – 1,0 × 0,5 – 4,0 μm.
(2) Motilität: Motil durch umgebende Pili.
(3) Sporen: nicht vorhanden.
(4) Gram-Färbung: negativ.
(5) Säurebeständigkeit: negativ.

(B) Wachstumsverhalten in verschiedenen Medien bei pH 8,0

(1) Fleisch-Agar-Platten-Kultur: Eine bei 30°C über 5 Tage gezüchtete Kultur zeigt die Bildung von blaßgelben runden Kolonien mit 2 – 3 mm Durchmesser. Die Oberfläche ist glatt, weist einen fettartigen Glanz auf und ist durchsichtig (weiß bis blaßgelb).
(2) Fleisch-Schrägagar-Kultur: Eine stationäre bei 30°C über 9 Tage gezüchtete Kultur zeigt verstreutes Wachstum. Die Farbe des Mikroorganismus ist beige; es wurde kein Pigment gebildet.
(3) Fleisch-Flüssigkultur: Eine stationäre Kultur, die bei 30°C über 9 Tage gezüchtet wurde, zeigt ein filmartiges Wachstum auf dem flüssigen Medium mit einem Niederschlag, der sich am Boden gebildet hatte.
(4) Fleisch-Gelatine-Kultur. Eine stationäre Kultur, die bei 20°C 30 Tage lang gezüchtet wurde, zeigt nur auf der Oberfläche des Mediums Wachstum, wobei die Gelatine nicht verflüssigt wurde.
(5) Lackmus-Milch: Eine stationäre Kultur, die bei 30°C über 9 Tage gezüchtet wurde, weist weder eine Verfestigung noch eine weitere Verflüssigung der Lackmus-Milch auf; der pH-Wert des Mediums steigt aufgrund des im Medium produzierten Alkali an.

(C) Physiologische Eigenschaften

Die Untersuchungen wurden in einem Medium durchgeführt, dessen pH-Wert auf etwa 6,5 eingestellt worden war.

(1) Nitratreduktion:	keine Reduktion
(2) Denitrifikation:	nicht vorhanden

(Bildung von Nitrit unter aeroben Bedingungen)

(3) MR-Test:	negativ
(4) VP-Test	negativ
(5) Indolbildung:	keine Bildung
(6) Schwefelwasserstoffbildung:	keine Bildung
(7) Hydrolyse von Stärke:	keine Hydrolyse
(8) Verwertung von Citronensäure:	keine Verwertung
(9) Verwertung von anorganischen Stickstoffquellen:	keine Verwertung

(Es wurden Nitrate und Ammoniumsalze getestet)

(10) Pigmentbildung:	keine Bildung
(11) Ureaseaktivität:	negativ
(12) Oxidaseaktivität:	positiv
(13) Katalaseaktivität:	positiv

(14) Wachstumsbereich:	Temperatur 15-45°C, pH 6,0-9,0
(15) Verhalten gegenüber Sauerstoff:	aerob
(16) O-F-Test (Hugh-Leifson Methode):	weder Oxidation noch Fermentation
(17) Bildung von Säure und Gas aus Zuckern:	keine Bildung

(Es wurden folgende Zucker untersucht: L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Malzzucker, Saccharose, Lactose, Trehalose, D-Sorbitol, D-Mannitol, Inositol, Glycerin und Stärke).

Aufgrund der vorstehenden bakteriellen Eigenschaften wurde der untersuchte bakterielle Stamm der Gattung Alkaligenes zugeordnet und mit Alkaligenes sp. KS-85 bezeichnet. Der vorliegende bakterielle Stamm wurde unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-4487 beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt.

Für die Produktion des vorliegenden Enzyms wurde der vorstehend genannte bakterielle Stamm vorzugsweise in einem flüssigen Medium gezüchtet, das Kreatin oder Kreatinin enthält. Für die Produktion des vorliegenden Enzyms kann jedes herkömmliche Kulturmedium verwendet werden. Als Stickstoffquelle kann jede verwertbare Stickstoffverbindung eingesetzt werden, einschließlich Kreatin, Kreatinin, Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenpulver, Aminosäuren und ähnliches. Als Kohlenstoffquelle kann jede assimilierbare Kohlenstoffverbindung eingesetzt werden, einschließlich Kreatin, Kreatinin, Melasse oder ähnliches. Als weitere Bestandteile kommen eine Vielzahl von Salzen, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Manganchlorid, Eisensulfat, Kaliumphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat usw., Vitamine, Antischaummittel usw. in Frage. Die Nährstoffquellen können einzeln oder kombiniert eingesetzt werden.

Für die Produktion des vorliegenden Enzyms in einem wie oben beschriebenen flüssigen Medium werden aerobe Kulturen wie Submers-Spinner-Kultur unter Belüftung oder Spinner-Kultur bevorzugt. Bei einer solchen aeroben Kultur wird der Ausgangs-pH-Wert des Mediums auf einen Wert im Bereich von 6,5 bis 7,0 eingestellt, und bei einer Temperatur von 25 bis 37°C, vorzugsweise etwa 30°C, wird eine Züchtungszeit von 24 Stunden oder mehr gewählt. Nach dem Abschluß der Mikroorganismuszüchtung kann das vorliegende Enzym aus der Kultur durch jedes bekannte Verfahren gewonnen werden.

Es ist wünschenswert, daß der Mikroorganismus von der Kultur z.B. durch Filtration, Zentrifugation oder ähnliches abgetrennt und danach gewaschen wird, bevor das vorliegende Enzym gewonnen wird, weil ein Hauptanteil des vorliegenden Enzyms in den Bakterienzellen angereichert wird. Es wird in diesem Fall bevorzugt, daß die Bakterienzellen durch Ultraschall, French Press, Dyno-mill oder ähnliches aufgeschlossen werden oder die Zellwand durch zellwandauflösende Enzyme zerstört wird, z.B. durch Lysozym, oder andernfalls das vorliegende Enzym aus den Bakterien mit einem oberflächenaktiven Reagens wie z.B. Triton X-100 oder dgl. extrahiert wird, obgleich das Enzym auch aus intakten Bakterienzellen gewonnen werden kann.

Die Isolierung des vorliegenden Enzyms aus dem so erhaltenen Rohenzym kann durch jedes bekannte Enzymreinigungsverfahren geschehen. Vorzugsweise wird z.B. eine geeignete Kombination von Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Ausfällen mit organischem Lösungsmittel, Ionenaustauscherchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Absorptionschromatographie, Elektrophorese usw. eingesetzt.

Das vorliegende Enzym kann zur quantitativen Bestimmung von Kreatin und/oder Kreatinin in menschlichem Serum oder Urin eingesetzt werden und so bei der Diagnose von einem breitem Spektrum von Krankheiten, einschließlich Nierenerkrankungen, verwendet werden.

Das vorliegende Enzym hat folgende enzymatische und physikochemische Eigenschaften:

(1) Wirkung: Hydrolyse von Kreatin, wobei aus 1 Mol Kreatin 1 Mol Sarkosin und 1 Mol Harnstoff entsteht;
(2) Substratspezifität: spezifisch für Kreatin;
(3) pH-Optimum: Es wurde festgestellt, daß das pH-Optimum des vorliegenden Enzyms im Bereich von pH 7,0 bis 9,0 liegt; dies wird auch aus 1 deutlich, wo die Aktivität des vorliegenden Enzyms für jeden pH-Wert gezeigt ist; die Bestimmung wurde dabei in 50 mmol/L Natriumacetat-HCl-Puffer (für pH 4,0 bis 6,0), 50 mmol/L Phosphatpuffer (für pH 6,0 bis 7,5) bzw. 50 mmol/L Tris-HCl-Puffer (für pH 7,5 bis 9,0) durchgeführt.
(4) Temperaturoptimum: Es wurde festgestellt, daß das Temperaturoptimum des vorliegenden Enzyms im Bereich von 35 bis 45°C liegt; dies ist auch in 2 gezeigt, wo die Aktivität des vorliegenden Enzyms für jede Temperatur gezeigt ist; zur Bestimmung wurde dabei eine Reaktionslösung verwendet, wie sie im folgenden unter dem Punkt "Enzymaktivitätsbestimmung" beschrieben ist.
(5) pH-Stabilität: Wie aus 3 hervorgeht, ist das Enzym im Bereich von pH 5,0 bis 10,5 stabil; die in 3 aufgetragene Restaktivität des vorliegenden Enzyms wurde bestimmt, nachdem das Enzym bei jedem pH-Wert zwischen 4,0 und 11, 0 bei 25°C 17 Stunden lang gestanden hatte. Als Puffer wurden verwendet: 50 mmol/L Natriumacetat-HCl-Puffer (für pH 4,0 bis 6,0), 50 mmol/L Phosphatpuffer (für pH 6,0 bis 8,0), 50 mmol/L Tris-HCl-Puffer (für pH 8,0 bis 9,0), 50 mmol/L Gylcin-NaOH-Puffer (für pH 9,0 bis 10,0) und 50 mmol/L CAPS-Puffer (für pH 10,0 bis 11,0; CAPS steht für 3(Cyclohexylamino)-propansulfonsäure).
(6) Thermische Stabilität: Es wurde festgestellt, daß das vorliegende Enzym bei einer Temperatur um 45°C 30 Minuten stabil ist; bei dieser Untersuchung wurde 50 mmol/L Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) verwendet. Zur thermischen Stabilität siehe auch 4.
(7) Enzymaktivitätsbestimmung: Die Enzymaktivität, die unter den folgenden Bedingungen zur Bildung von 1 μMol gelben Pigments pro Minute führt, wird mit 1 U bezeichnet.

Die Reagenzien für die Aktivitätsbestimmung werden wie folgt hergestellt:

Lösung 1 (Substratlösung)

6,63 g Kreatin werden in 500 ml 50 mmol/l Puffer, pH 7,7 gelöst.

Lösung 2 (Färbelösung)

10 g p-Dimethylaminobenzaldeyd wurden in 500 ml extrareinem Ethanol gelöst und dann mit einem Gemisch von 575 ml entionisiertem Wasser und 75 ml konzentrierter Salzsäure gemischt.

Durchführung der Aktivitätsbestimmung:

1) 0,9 ml von Lösung 1 werden bei 37°C 5 Minuten lang vorinkubiert.
2) 0,1 ml der Enzymlösung (eingestellt auf etwa 1 bis 2 U/ml) werden damit gemischt; das Gemisch läßt man bei 37°C 10 Minuten reagieren.
3) Danach wird das Gemisch mit 2 ml von Lösung 2 vermischt.
4) Anschließend läßt man das Gemisch bei 25°C 20 Minuten stehen und bestimmt anschließend die Absorption bei 435 nm (OD-Probe).
5) Für die Blindprobe werden 0,9 ml von Lösung 1 bei 37°C 10 Minuten inkubiert, 2 ml von Lösung 2 zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 0,1 ml Enzymlösung. Man läßt das Gemisch bei 25°C 20 Minuten stehen und mißt die Absorption bei 435 nm (OD-Blindprobe).
Die Aktivität wird wie folgt berechnet: U/ml = ΔOD × 18,06* × Verdünnungsfaktor(* Der Koeffizient wurde aus einer Harnstoff-Kalibrierungskurve berechnet)
(8) Inhibitoren: Wie in Tabelle I gezeigt, wird das vorliegende Enzym von AgNO₃, HgCl₂ und CuSO₄ stark gehemmt. Tabelle I Inhibitorwirkung (Zugabe des Inhibitors zum Substrat)
(9) Km-Wert: Der Km-Wert wurde mit Hilfe einer Lineweaver-Burk-Auftragung zu 1,3 × 10^–2 Mol bestimmt (verwendetes Substrat: Kreatin; pH 7,7; Temperatur 37°C)
(10) Molekulargewicht: Durch Gelfiltration mit einem TSK Gel G3000 SWXL wurde das Molekulargewicht zu 80 000 ± 5000 bestimmt.

Beispiel 1
100 ml eines Mediums (pH 6,7), welches 1,6 % Kreatin, 2,0 Polypepton, 0,8 % Hefeextrakt, 0,03 % KH₂PO₄, 0,07 % K₂HPO₄, 0,02 % MgSO₄·7H₂O, 0,02 % MnSO₄·4H₂O und Leitungswasser enthält, wurde in einen Sakaguchi-Kolben eingebracht und 10 Minuten bei 120°C sterilisiert. Nachdem sich der Ausgangs-pH-Wert eingestellt hatte, wurde mit Alkaligenes sp. KS-85 (FERM BP-4487) aus einer Schrägkultur angeimpft. Der Mikroorganismus wurde unter Schütteln bei 30°C 24 Stunden lang gezüchtet. Diese Kultur, nämlich die 100 ml Inhalt des Sakaguchi-Kolbens, wurde in einen 30 Liter Glaszylinder eingefüllt, der 20 Liter eines auf pH 6,7 eingestellten Mediums enthielt; die Sterilisierung wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Der Mikroorganismus wurde bei 30°C ungefähr 24 Stunden bei 450 UpM gezüchtet, während Luft mit einem Durchsatz von 20 Liter/min durchgeleitet wurde.
Nach Abschluß der Anzüchtung wurde der Mikroorganismus mit Hilfe von Microza (PW-303, ein Produkt von Asahi Kasei Co., Ltd.) aus 20 Litern der Kultur gesammelt, mit 20 mmol/L Phosphatpuffer, pH 7, 5 gewaschen und in etwa 10 Litern des Puffers suspendiert.
Enzymgewinnung

1. Schritt (Herstellung der Rohenzymlösung): Zu der obengenannten bakteriellen Suspension (10 Liter) wurden 20 g Lysozym (in 100 ml 50 mmol/L Phosphatpuffer mit pH 8,0) und 1 Liter 0,55 mmol/L EDTA mit pH 8,0 gegeben und anschließend gemischt; das Gemisch ließ man bei 30°C über Nacht stehen. Um Nucleinsäuren zu entfernen, wurden unter Rühren 500 ml einer 5%igen wäßrigen Protaminlösung mit pH 8,0 tropfenweise zugegeben. Der Überstand wurde mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran gegen 10 mmol/L CAPS-NaOH-Puffer mit pH 10,0 (im weiteren als "Puffer A" bezeichnet) dialysiert.
2. Schritt (DEAE-Cellulose): Zu ungefähr 28 Litern der dialysierten Lösung wurden etwa 9 kg (Feuchtgewicht) DEAE-Cellulose gegeben. Anschließend wurde gemischt, so daß das vorliegende Enzym auf dem Harz adsorbiert wurde. Das DEAE-Cellulose-Harz wurde mit Puffer A gewaschen, der 5 % Glycerin und 0,005 % 2-Mercaptoethanol enthielt. Danach wurde das vorliegende Enzym mit Puffer A, der 0,5 mol/L KCl enthielt, daraus eluiert und durch Ultrafiltration aufkonzentriert
3. Schritt (DEAE-Sepharose CL-4B): Zu dem im 2. Schritt erhaltenen Konzentrat (ungefähr 1 Liter) wurde ungefähr 1,0 kg (Feuchtgewicht) der DEAE-Sepharose CL-4B, welche mit Puffer A äquilibriert war, gegeben; anschließend wurde gerührt, so daß das vorliegende Enzym auf dem Harz adsorbiert wurde. Das DEAE-Sepharose Cl-4B-Harz wurde mit Puffer A gewaschen, der 0,05 Mol KCl enthielt; das vorliegende Enzym wurde mit Puffer A eluiert und anschließend das Eluat durch Ultrafiltration aufkonzentriert.
4. Schritt (Sephacryl S-200): Ungefähr 1 Liter des im 3. Schritt erhaltenen Konzentrats wurde mit Hilfe einer Sephacryl S-200 Säule fraktioniert, wobei 2,2 g aktive Fraktion erhalten wurde. Die aktive Fraktion hatte eine spezifische Aktivität von 9,0 U/OD 280 nm.

Beispiel 2
Um die Überlegenheit des vorliegenden Enzyms in bezug auf Reaktivität und Substratspezifität gegenüber dem herkömmlichen Enzym zu demonstrieren, ließ man eine bestimmte Menge der neuen und der herkömmlichen Kreatinamidinohydrolase (CRH-211, ein Produkt von Toyobo Co., Ltd.) jeweils mit einer bestimmten Menge eines Substrates reagieren und beobachtete den zeitlichen Verlauf der Reaktion bei beiden Enzymen. Bei dieser Bestimmung wurde Kreatin durch Kreatinamidinohydrolase abgebaut, wobei Sarkosin gebildet wurde; dieses wiederum wurde anschließend durch Sarkosinoxidase (SOD) abgebaut, wobei Wasserstoffperoxid gebildet wurde. Das Wasserstoffperoxid wurde mit Hilfe eines Farbreagens angefärbt und durch Absorptionsmessung bei 510 nm quantitativ bestimmt. Das Kreatin wurde hierbei so verdünnt eingesetzt, daß es innerhalb von 10 bis 20 Minuten vollständig abgebaut war; innerhalb dieser Zeit erreichte die Absorption bei 510 nm einen konstanten Wert. Bei diesem Experiment zeigt ein kürzeres Zeitintervall, innerhalb dessen die Absorption bei 510 nm einen konstanten Wert erreicht, die Überlegenheit des Enzyms bezüglich Reaktivität und Substratspezifität an.
1. Herstellung der Reagenzien

Tabelle II zeigt die in diesem Beispiel verwendeten Reagenzien zusammen mit der jeweiligen Konzentration. Tabelle II

Reagenzien	Konzentration
Kreatinlösung (Substrat)	10 mg/100 ml
2,4-Dichlorphenol	2 %
4-Aminoantipyrin	70 mg/100 ml
Sarkosinoxidase	30 U/ml
Peroxidase	70 U/ml
Kreatinamidinohydrolase	20 U/ml

2. Durchführung der Bestimmung
0,2 ml Kreatinlösung, 0,1 ml 2,4-Dichlorphenol, 0,1 ml 4-Aminoantipyrin, 0,4 ml Sarkosinoxidase (SOD) und 0,2 ml Peroxidase (POD) wurden gemischt und 3 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Danach wurde 1 ml der Kreatinamidinohydrolase (20 U/ml) dazugegeben; das Gemisch ließ man 15 Sekunden stehen.
Danach wurde die Absorption der Probe bei 510 nm mit einem Spektrophotometer (Hitachi U-2000) bei 37°C in Abständen von 30 Sekunden gemessen.
Wie 5 zu entnehmen ist, erreichte das vorliegende Enzym bereits nach 400 Sekunden einen konstanten Wert, während die herkömmliche Kreatinamidinohydrolase nicht einmal nach etwa 600 Sekunden Reaktionszeit einen konstanten Wert erreichte. Dieses Ergebnis zeigt die Überlegenheit des vorliegenden Enzyms gegenüber der herkömmlichen Kreatinamidinohydrolase in bezug auf die Substratspezifität und Reaktivität mit dem Substrat.

Claims

Kreatinamidinohydrolase erhältlich aus einem Mikroorganismus der Gattung Alkaligenes mit folgenden physikochemischen Eigenschaften: (a) Wirkung: Hydrolyse von Kreatin, wobei aus 1 Mol Kreatin 1 Mol Sarkosin und 1 Mol Harnstoff entsteht; (b) Substratspezifität: spezifisch für Kreatin; (c) pH-Optimum: pH 7 bis 9; (d) Temperaturoptimum: im Bereich von 35 bis 45°C; (e) pH-Stabilität: bei 25°C im Bereich von pH 5,0 bis 10,5 17 Stunden stabil; (f) thermische Stabilität: bei pH 7,5 und einer Temperatur bis etwa 45°C 30 Minuten stabil; (g) Inhibitoren: AgNO₃, HgCl₂, CuSO₄ und (h) Molekulargewicht: 80 000 ± 5000 (bestimmt durch Gelfiltration).
Verfahren zur Herstellung der Kreatinamidinohydrolase nach Anspruch 1, umfassend die Züchtung des Mikroorganismus Alkaligenes sp. KS-85, der in der Lage ist, die Kreatinamidinohydrolase herzustellen, und die Gewinnung der Kreatinamidinohydrolase aus der Kultur.
Verwendung der Kreatinamidinohydrolase nach Anspruch 1 für die quantitative Bestimmung von Kreatin und/oder Kreatinin.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Kreatin und/oder Kreatinin in menschlichem Serum oder Urin bestimmt wird.