DE69735015T2

DE69735015T2 - Neue Creatin-amidinohydrolase, ihre Herstellung und Verwendung

Info

Publication number: DE69735015T2
Application number: DE69735015T
Authority: DE
Inventors: Atsushi Tsuruga-shi Sogabe; Takashi Tsuruga-shi Hattori; Yoshiaki Tsuruga-shi NISHIYA; Yoshihisa Tsuruga-shi Kawamura
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1996-02-13
Filing date: 1997-02-13
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2017-02-14
Also published as: EP1132467A3; EP1132467A2; EP1132467B1; US6080553A; EP0790303A1; JP3075390B2; USRE39352E1; DE69735015D1; JPH09215494A; USRE38687E1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Creatin-Amidinohydrolase, insbesondere eine mutante Creatin-Amidinohydrolase mit einem sehr niedrigen K_m-Wert für Creatin, und auf ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Bestimmung von Creatin oder Creatinin in einer Probe unter Verwendung dieses Enzyms und auf ein Reagens dafür.
Hintergrund der Erfindung
Creatin und Creatinin findet man im Blut und Urin. Eine schnelle und genaue Bestimmung ihrer Mengen ist sehr wichtig bei der Diagnostizierung von Krankheiten wie Urämie, chronische Nephritis, akute Nephritis, Gigantismus, tonische Muskeldystrophie und dergleichen. Zur Diagnostizierung dieser Krankheiten werden häufig Creatin und Creatinin im Blut sowie Urin quantitativ bestimmt.
Creatin kann bestimmt werden, indem man Creatin-Amidinohydrolase und Sarcosin-Oxidase auf Creatin in einer Probe einwirken lässt und die Menge des erzeugten Wasserstoffperoxids nach einem Verfahren zur Messung von Wasserstoffperoxid bestimmt. Creatinin kann bestimmt werden, indem man Creatinin-Amidohydrolase, Creatin-Amidinohydrolase und Sarcosin-Oxidase auf Creatinin in einer Probe einwirken lässt und die Menge des erzeugten Wasserstoffperoxids nach einem Verfahren zur Messung von Wasserstoffperoxid bestimmt.
Creatinin-Amidohydrolase, Creatin-Amidinohydrolase und Sarcosin-Oxidase findet man verbreitet in der Welt der Mikroorganismen; sie werden industriell hergestellt und als Reagentien für klinische Tests verwendet.
Jedoch zeigt die aus verschiedenen bekannten Zelllinien hergestellte Creatin-Amidinohydrolase eine geringere Wärmestabilität und einen größeren K_m-Wert für Creatin. Zum Beispiel ist ein Enzym, das von Bakterien stammt, die zur Gattung Bacillus gehören ( US 4,420,562 ) nur bei einer Temperatur von nicht mehr als 40 °C thermisch stabil. Ein von Pseudomonas putida stammendes Enzym hat einen kleineren scheinbaren K_m-Wert für Creatin von 1,33 mM [Archives Biochemistry and Biophysics 177, 508–515 (1976)], obwohl das Verfahren zur Bestimmung der Aktivität anders ist und der K_m-Wert für Creatin, der durch ein Kopplungsassay unter Verwendung von Sarcosin-Oxidase und Peroxidase, die verbreitet als Reagentien für klinische Tests verwendet werden, bestimmt wird, unbekannt ist. Die Enzyme, die von den Bakterien stammen, die zu den Gattungen Corynebacterium, Micrococcus, Actinobacillus oder Bacillus gehören (Japanische Patentschrift Nr. 76915/1991), ist bei einer Temperatur von nicht mehr als 50 °C thermisch stabil, während der K_m-Wert für Creatin immerhin etwa 20 mM beträgt, und diese Enzyme sind zur Verwendung als Reagentien für klinische Tests nicht geeignet.
Bei einem Versuch, diese Probleme zu lösen, fanden die Erfinder der vorliegenden Erfindung bereits früher heraus, dass die zur Gattung Alcaligenes gehörenden Bakterien eine Creatin-Amidinohydrolase produzieren, die eine überlegene Wärmestabilität und einen kleineren K_m-Wert (K_m-Wert: ca. 15,2) für Creatin hatte (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 63363/1994). Weiterhin haben sie eine Technik entwickelt, um ein Creatin-Amidinohydrolase-Gen, das einen relativ kleinen K_m-Wert für Creatin aufweist, aus der Bakterienzelllinie zu isolieren und das Enzym unter Verwendung von Gram-negativen Bakterien als Wirt in einer großen Menge herzustellen (Japanische Patentanmeldung Nr. 117283/1995). Außerdem wird von einer Creatin-Amidinohydrolase, die in einem hohen pH-Bereich stabil ist und einen kleinen K_m-Wert hat, berichtet, dass sie von einer Zelllinie derselben Gattung Alcaligenes stammt ( US 5,451,520 ). Eine weitere Creatin-Amidinohydrolase von einer Alcaligenes-Spezies mit einem relativ kleinen K_m-Wert (4,83) ist in JP 62091182 beschrieben. Es zeigte sich jedoch, dass dieses Enzym in der Nähe oder unterhalb von 40 °C instabil, d.h. wärmela bil, ist und bei einem niedrigeren pH-Bereich mangelnde Stabilität zeigt. Unter milden Konservierungsbedingungen (5 °C, 48 h) war es nur bei pH 7–8,5 stabil.
Diese Creatin-Amidinohydrolasen haben jedoch als Enzyme, die als Routinereagentien für klinische Tests verwendet werden sollen, noch größere K_m-Werte, und es besteht ein Bedürfnis nach einer Creatin-Amidinohydrolase mit kleinerem K_m-Wert.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine mutante Creatin-Amidinohydrolase, die in ausreichendem Maße für die Verwendung als allgemeines Reagens für klinische Tests einen kleinen K_m-Wert für Creatin, vorzugsweise nicht mehr als etwa 15,0, aufweist, herzustellen und ein Mittel zur Bestimmung von Creatin oder Creatinin in einer Probe unter Verwendung dieses Enzyms bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der erfolgreichen Bereitstellung eines Creatin-Amidinohydrolase-Gens mit einem kleinen K_m-Wert für Creatin durch Einführung einer Mutation durch Gentechnik und Proteintechnik in ein Creatin-Amidinohydrolase-Gen, das von herkömmlicherweise bekannten Bakterien, die zur Gattung Alcaligenes gehören, stammt und eine bekannte Creatin-Amidinohydrolase codiert, die einen ziemlich kleinen K_m-Wert aufweist. Die Creatin-Amidinohydrolase der vorliegenden Erfindung kann in großen Mengen hergestellt werden, indem man einen Mikroorganismus, der das Gen exprimieren kann, in einem Nährmedium kultiviert.
Die mutante Creatin-Amidinohydrolase der vorliegenden Erfindung hat einen sehr niedrigen K_m-Wert für Creatin im Vergleich zu herkömmlicherweise bekannten Enzymen und zeigt eine überlegene Reaktivität gegenüber Creatin, das in Spuren in einer Probe enthalten ist. Es eignet sich also als Reagens für die Bestimmung von Creatin oder Creatinin mit hoher Empfindlichkeit und hoher Genauigkeit.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine mutante Creatin-Amidinohydrolase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften bereit:
Wirkung: katalysiert die folgende Reaktion: Creatin + H₂O → Sarcosin + Harnstoff; Temperaturoptimum 40–50 °C;
Wärmestabilität: nicht mehr als etwa 50 °C (pH 7,5, 30 min);
pH-Optimum = pH 8,0–9,0;
K_m-Werte für Creatin in einem Kopplungsassay unter Verwendung einer Sarcosin-Oxidase und einer Peroxidase: 3,5–10,0 mM;
Molekulargewicht etwa 43 000 (SDS-PAGE);
pH-Stabilität: stabil bei pH 5–8 (40 °C, 18 h Konservierung).
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung der Creatin-Amidinohydrolase bereit, das das Kultivieren eines Mikroorganismus, der eine neue Creatin-Amidinohydrolase mit den obigen physikalisch-chemischen Eigenschaften erzeugt, in einem Nährmedium und Gewinnen der Creatin-Amidinohydrolase aus der resultierenden Kultur umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Reagens zur Bestimmung von Creatin in einer Probe, das eine Creatinin-Amidohydrolase, die oben genannte Creatin-Amidinohydrolase, eine Sarcosin-Oxidase und eine Zusammensetzung zum Nachweis von Wasserstoffperoxid umfasst, sowie ein Verfahren zur Bestimmung von Creatin in einer Probe unter Verwendung dieses Reagens bereit.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt eine physikalische Karte des rekombinanten Plasmids pCRH273.
2 zeigt den zeitlichen Verlauf der Ergebnisse der Bestimmung von Creatinin in einer Probe unter Verwendung der Creatin-Amidinohydrolase der vorliegenden Erfindung und einer Wildtyp-Creatin-Amidinohydrolase.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine mutante Creatin-Amidinohydrolase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
Wirkung: katalysiert die folgende Reaktion: Creatin + H₂O → Sarcosin + Harnstoff; Temperaturoptimum 40–50 °C;
Wärmestabilität: nicht mehr als etwa 50 °C (pH 7,5, 30 min);
pH-Optimum = pH 8,0–9,0;
K_m-Werte für Creatin in einem Kopplungsassay unter Verwendung einer Sarcosin-Oxidase und einer Peroxidase: 4,5 ± 1,0 mM;
Molekulargewicht etwa 43 000 (SDS-PAGE);
pH-Stabilität: stabil bei pH 5–8 (40 °C, 18 h Konservierung).
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine mutante Creatin-Amidinohydrolase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
Wirkung: katalysiert die folgende Reaktion: Creatin + H₂O → Sarcosin + Harnstoff; Temperaturoptimum 40–50 °C;
Wärmestabilität: nicht mehr als etwa 50 °C (pH 7,5, 30 min);
pH-Optimum = pH 8,0–9,0;
K_m-Werte für Creatin in einem Kopplungsassay unter Verwendung einer Sarcosin-Oxidase und einer Peroxidase: 6,5 ± 1,0 mM;
Molekulargewicht etwa 43 000 (SDS-PAGE);
pH-Stabilität: stabil bei pH 5–8 (40 °C, 18 h Konservierung).
Noch eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine mutante Creatin-Amidinohydrolase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
Wirkung: katalysiert die folgende Reaktion: Creatin + H₂O → Sarcosin + Harnstoff; Temperaturoptimum 40–50 °C;
Wärmestabilität: nicht mehr als etwa 50 °C (pH 7,5, 30 min);
pH-Optimum = pH 8,0–9,0;
K_m-Werte für Creatin in einem Kopplungsassay unter Verwendung einer Sarcosin-Oxidase und einer Peroxidase: 9,0 ± 1,0 mM;
Molekulargewicht etwa 43 000 (SDS-PAGE);
pH-Stabilität: stabil bei pH 5–8 (40 °C, 18 h Konservierung).
Ein Verfahren zur Herstellung der Creatin-Amidinohydrolase der vorliegenden Erfindung umfasst das Einführen einer Mutation in ein Gen, das eine Wildtyp-Creatin-Amidinohydrolase codiert, durch ein Gentechnik- und Proteintechnik-Verfahren, das Erzeugen einer mutanten DNA, die eine Creatin-Amidinohydrolase codiert, die einen kleineren K_m-Wert für Creatin als die Wildtyp-Creatin-Amidinohydrolase aufweist, das Exprimieren der DNA in einem geeigneten Wirt und das Gewinnen der so produzierten Creatin-Amidinohydrolase.
Das Gen, das eine Wildtyp-Creatin-Amidinohydrolase codiert und in das eine Mutation eingeführt werden soll, unterliegt zwar keiner besonderen Einschränkung, doch handelt es sich in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung um das Creatin-Amidinohydrolase-Gen, das im Sequenzprotokoll unter SEQ ID Nr. 2 abgebildet ist und das von Alcaligenes faecalis TE3581 (FERM P-14237) stammt.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Creatin-Amidinohydrolase, die einen kleineren K_m-Wert für Creatin als eine Wildtyp-Creatin-Amidinohydrolase aufweist, erzeugt, indem man eine Mutation in das Gen einführt, das die Aminosäuresequenz codiert, die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID Nr. 1 abgebildet ist.
Die Mutation kann nach jedem bekannten Verfahren in ein Wildtyp-Creatin-Amidinohydrolase-Gen eingeführt werden. Zum Beispiel wird eine Wildtyp- Creatin-Amidinohydrolase-DNA oder Zellen eines Mikroorganismus, der das Gen aufweist, mit einem Mutagen in Kontakt gebracht, oder ultraviolette Strahlung wird angewendet, oder ein Proteintechnikverfahren, wie PCR und ortsspezifische Mutagenese, wird verwendet. Alternativ dazu kann auch eine Escherichia coli, die aufgrund eines defekten Genreparaturmechanismus mit hoher Häufigkeit einer Genmutation unterliegt, zur in-vivo-Mutation mit einer Wildtyp-Creatin-Amidinohydrolase-Gen-DNA transformiert werden.
Zum Beispiel wird Escherichia coli mit dem oben erhaltenen mutanten Creatin-Amidinohydrolase-Gen transformiert und auf einem Agarmedium zum Nachweis von Creatin-Amidinohydrolase-Aktivität [J. Ferment. Bioeng., Vol. 76, Nr. 2,77–81 (1993)] ausgestrichen, und die Kolonien, die eine klare Farbentwicklung zeigen, werden ausgewählt. Die ausgewählten Kolonien werden in ein Nährmedium (z.B. LB-Medium und 2xYT-Medium) eingeimpft und über Nacht bei 37 °C kultiviert. Die Zellen werden aufgeschlossen, und eine rohe Enzymlösung wird extrahiert.
Das Verfahren zum Aufschließen der Zellen kann jedes bekannte Verfahren sein, wie physikalischer Aufschluss (z.B. Ultraschallbehandlung und Aufschluss mit Glaskügelchen), oder es kann Lysozym verwendet werden. Diese rohe Enzymlösung wird verwendet, um die Creatin-Amidinohydrolase-Aktivität von zwei Arten von Reaktionslösungen zur Aktivitätsbestimmung mit verschiedenen Substratkonzentrationen zu bestimmen. Ein Vergleich der Aktivitätsverhältnisse der beiden Lösungen mit derjenigen, die unter Verwendung einer Wildtyp-Creatin-Amidinohydrolase erhalten wird, führt zur Auffindung der Creatin-Amidinohydrolase, die einen kleineren K_m-Wert aufweist.
Das Verfahren zur Gewinnung der gereinigten Creatin-Amidinohydrolase aus der Zelllinie, die gemäß der obigen Beschreibung ausgewählt wurde, kann nach jedem bekannten Verfahren erfolgen, wie den folgenden.
Nachdem die durch Kultivieren in einem Nährmedium erhaltenen Zellen gewonnen wurden, werden sie mit einem enzymatischen oder physikalischen Verfahren aufgeschlossen und extrahiert, was eine Rohenzymlösung ergibt. Aus der erhaltenen Rohenzymlösung wird durch Ammoniumsulfatfällung eine Creatin-Amidinohydrolase-Fraktion gewonnen. Die Enzymlösung wird einer Entsalzung durch Gelfiltration über Sephadex^® G-25 (Pharmacia Biotech) unterzogen.
Nach diesem Arbeitsschritt wird die resultierende Enzymlösung durch Säulenchromatographie auf Octyl-Sepharose^® CL-6B (Pharmacia Biotech) aufgetrennt und gereinigt, was ein gereinigtes Standardenzymprodukt ergibt. Dieses Produkt wird soweit gereinigt, dass es im SDS-PAGE fast eine einzige Bande zeigt.
Beispiele für die Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, um die neue Creatin-Amidinohydrolase zu produzieren, sind Escherichia coli JM109 (pCRH273M1) (FERM BP-5374), Escherichia coli JM109 (pCRH273M2) (FERM BP-5375) und Escherichia coli JM109 (pCRH273M3) (FERM BP-5376).
Das Verfahren zur Kultivierung dieser Mikroorganismen und Gewinnung der Creatin-Amidinohydrolase der vorliegenden Erfindung aus den entsprechenden Kulturen unterliegt keiner besonderen Einschränkung, und es können herkömmliche Verfahren angewendet werden.
Die mutante Creatin-Amidinohydrolase, die nach dem oben genannten Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
Wirkung: katalysiert die folgende Reaktion: Creatin + H₂O → Sarcosin + Harnstoff; Temperaturoptimum 40–50 °C;
Wärmestabilität: nicht mehr als etwa 50 °C (pH 7,5, 30 min);
pH-Optimum = pH 8,0–9,0;
K_m-Werte für Creatin in einem Kopplungsassay unter Verwendung einer Sarcosin-Oxidase und einer Peroxidase: 3,5–10,0 mM;
Molekulargewicht etwa 43 000 (SDS-PAGE);
pH-Stabilität: stabil bei pH 5–8 (40 °C, 18 h Konservierung).
Der K_m-Wert in der vorliegenden Erfindung ist der Wert relativ zu Creatin in einem Kopplungsassay unter Verwendung einer Sarcosin-Oxidase und einer Peroxidase.
Das herkömmliche, von Pseudomonas putida stammende Enzym hat zwar einen kleinen scheinbaren K_m-Wert für Creatin von 1,33 mM [Archives Biochemistry and Biophysics 177, 508–515 (1976)], wobei die Aktivität durch Messen des restlichen Creatins in dem Reaktionsgemisch mit α-Naphthol und Diacetyl bestimmt wird, doch ist der K_m-Wert für Creatin, der durch ein Kopplungsassay unter Verwendung einer Sarcosin-Oxidase und einer Peroxidase, die verbreitet als Reagentien für klinische Tests verwendet werden, bestimmt wird, unbekannt.
Die Creatin-Amidinohydrolase der vorliegenden Erfindung kann nach Kombination mit einer Sarcosin-Oxidase und einer Zusammensetzung zum Nachweis von Wasserstoffperoxid zur Bestimmung von Creatin verwendet werden. Wenn gleichzeitig Creatinin-Amidohydrolase verwendet wird, kann außerdem auch Creatinin bestimmt werden.
Das Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung macht sich die folgenden Reaktionen zu Nutze:
Wenn Creatinin bestimmt wird, wird weiterhin die folgende Reaktion genutzt.
Das hergestellte Chinoniminpigment wird im Allgemeinen einer Bestimmung der Extinktion bei einer Wellenlänge von 500–650 nm unterzogen. Das Verfahren zur Bestimmung von Creatin ist ein Endpunktsverfahren oder ein Geschwindigkeitsverfahren, doch wird im Allgemeinen das Endpunktsverfahren verwendet.
Die erfindungsgemäße Creatin-Amidinohydrolase mit dem kleineren K_m-Wert kann die Menge des Enzyms, die im Testreagens für die Creatin- oder Creatinin-Bestimmung verwendet werden soll, auf etwa 1/3 bis 1/4 im Vergleich zur notwendigen Menge herkömmlicher Enzyme reduzieren und erreicht eine gute Reaktivität in der zweiten Hälfte der Reaktion.
Das Reagens zur Bestimmung von Creatin in einer Probe der vorliegenden Erfindung enthält die oben genannte Creatin-Amidinohydrolase, Sarcosin-Oxidase und eine Zusammensetzung zum Nachweis von Wasserstoffperoxid.
Das Reagens zur Bestimmung von Creatinin in einer Probe der vorliegenden Erfindung enthält eine Creatinin-Amidohydrolase, die oben genannte Creatin-Amidinohydrolase, Sarcosin-Oxidase und eine Zusammensetzung zum Nachweis von Wasserstoffperoxid.
Die zum Nachweis von Creatin oder Creatinin der vorliegenden Erfindung zu verwendende Sarcosin-Oxidase kann aus den Mikroorganismen erhalten werden, die aus den Gattungen Arthrobacter, Corynebacterium, Alcaligenes, Pseudomonas, Micrococcus und Bacillus stammen, und einige davon sind kommerziell erhältlich.
Die Creatinin-Amidohydrolase kann aus den Mikroorganismen erhalten werden, die aus den Gattungen Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes und Penicillium stammen, und einige davon sind kommerziell erhältlich.
Die Zusammensetzung zum Nachweis von Wasserstoffperoxid enthält ein Enzym mit Peroxidase-Aktivität, einen Chromophor und einen Puffer. Beispiele für das Enzym mit der Peroxidase-Aktivität sind Peroxidase, Haloperoxidase, Bromperoxidase, Lactoperoxidase und Myeloperoxidase.
Der Chromophor umfasst einen Wasserstoffakzeptor und einen Koppler. Der Wasserstoffakzeptor kann ein beliebiger sein, solange er bei der Reaktion mit Wasserstoffperoxid, Peroxidase und einem Koppler Wasserstoff aufnimmt, und spezielle Beispiele dafür sind 4-Aminoantipyrin und 3-Methyl-2-benzothiazolin-Hydrazinderivat. Beispiele für den Koppler sind Anilinderivate, wie Anilin und N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin (TOOS) und Phenolderivate, wie Phenol und p-Chlorphenol.
Das Reagens für die Bestimmung von Creatin der vorliegenden Erfindung enthält jeden Bestandteil in einem zu bevorzugenden Anteil von 5–300 E/ml Creatin-Amidinohydrolase, 1–100 E/ml Sarcosin-Oxidase, 0,01–50 E/ml Peroxidase, 0,1–10 mM Wasserstoffdonor und 0,1–50 mM Koppler.
Das Reagens für die Bestimmung von Creatinin der vorliegenden Erfindung enthält jeden Bestandteil in einem zu bevorzugenden Anteil von 10–300 E/ml Creatinin-Amidohydrolase, 10–300 E/ml Creatin-Amidinohydrolase, 1–100 E/ml Sarcosin-Oxidase, 0,01–50 E/ml Peroxidase, 0,1–10 mM Wasserstoffdonor und 0,1–50 mM Koppler.
Das Reagens für die Bestimmung von Creatin oder Creatinin der vorliegenden Erfindung wird im Allgemeinen mit einem Puffer verwendet, der einen pH-Wert von 6–8 hat. Beispiele für den Puffer sind Phosphatpuffer, Good-Puffer und Tris-Puffer.
Falls notwendig, können Ascorbat-Oxidase oder Katalase zu dem Reagens der vorliegenden Erfindung gegeben werden. Es können auch andere Verbindungen für eine glatte Enzymreaktion und Farbentwicklung zu dem Reagens der vorliegenden Erfindung gegeben werden. Solche Verbindungen sind zum Beispiel Stabilisatoren, Tenside und Arzneimittelhilfsstoffe.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird im Einzelnen anhand der folgenden Beispiele beschrieben.
In den Beispielen wurde die Aktivität von Creatin-Amidinohydrolase wie folgt bestimmt. Die Enzymaktivität in der vorliegenden Erfindung ist dadurch definiert, dass die Enzymmenge, die in der Lage ist, unter den folgenden Bedingungen 1 μmol Sarcosin pro min zu produzieren, als eine Einheit (E) angesehen wird. Zusammensetzung des Reaktionsgemischs

0,3 M HEPES pH 7,6

0,005% 4-Aminoantipyrin

0,015% Phenol

1,8% Creatin

6 E/ml Sarcosin-Oxidase

6 E/ml Peroxidase
Das oben genannte Reaktionsgemisch (3 ml) wird in eine Küvette (Dicke = 1 cm) gegeben und im voraus etwa 3 Minuten lang auf 37 °C erhitzt. Eine Enzymlösung (0,1 ml) wird hinzugefügt, und das Gemisch wird sachte gemischt. Unter Verwendung von Wasser als Kontrolle werden 5 Minuten lang Veränderungen in der Extinktion bei 500 nm aufgezeichnet, wobei man ein auf 37 °C temperiertes Spektrophotometer verwendet. Auf der Grundlage des linearen Anteils von 2–5 Minuten davon werden Veränderungen in der Extinktion pro Minute bestimmt (ΔOD_Test).
Der Blindtest wird in derselben Weise wie oben durchgeführt, außer dass eine Lösung (0,1 ml, 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5) zum Verdünnen des Enzyms anstelle der Enzymlösung verwendet wird und Veränderungen in der Extinktion pro Minute bestimmt werden (ΔOD_Blind).
Die Enzymmenge wird berechnet, indem man jeden Messwert in die folgende Gleichung einsetzt.
wobei jede Konstante Folgendes bedeutet:
13,3: millimolarer Extinktionskoeffizient (cm²/μM) unter den obigen Messbedingungen von Chinoniminpigment
1/2: Koeffizient, der anzeigt, dass das aus einem Molekül des bei der Enzymreaktion erzeugten Wasserstoffperoxids gebildete Chinoniminpigment 1/2 Molekül ist
1,0: Lichtweglänge (cm)
0,1: Menge des hinzugefügten Enzyms (ml)
Bezugsbeispiel 1: Isolierung von chromosomaler DNA
Die chromosomale DNA von Alcaligenes faecalis TE3581 wurde nach dem folgenden Verfahren isoliert.
Die Zellen (FERM P-14237) wurden über Nacht einer Schüttelkultur bei 30 °C in einer Nährbrühe (150 ml) unterzogen und dann durch Zentrifugation (8000 U/min, 10 min) gewonnen. Die Zellen wurden in einer Lösung (5 ml), die 10% Saccharose, 50 mM Tris-NCl (pH 8,0) und 50 mM EDTA enthielt, suspendiert, und eine Lysozymlösung (1 ml, 10 mg/ml) wurde hinzugefügt. Das Gemisch wurde 15 min lang bei 37 °C inkubiert. Dann wurde eine 10%ige SDS-Lösung (1 ml) hinzugefügt. Eine äquivalente Menge (1 ml) einer Chloroform-Phenol-Lösung (1:1) wurde zu diesem Gemisch gegeben. Das Gemisch wurde gerührt und durch 3 min Zentrifu gation mit 10 000 U/min in eine wässrige Schicht und eine Lösungsmittelschicht aufgetrennt. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt, und auf diese wässrige Schicht wurde vorsichtig die doppelte Menge Ethanol geschichtet. Der Inhalt wurde langsam mit einem Glasstab gerührt, damit sich die DNA um den Stab wickeln konnte.
Diese DNA wurde in 10 mM Tris-HCl-Lösung (pH 8,0, im Folgenden als TE abgekürzt), die 1 mM EDTA enthielt, gelöst. Diese Lösung wurde mit einer äquivalenten Menge Chloroform-Phenol-Lösung behandelt. Die wässrige Schicht wurde durch Zentrifugation abgetrennt, und die doppelte Menge Ethanol wurde hinzugefügt. Die DNA wurde wiederum nach dem oben beschriebenen Verfahren abgetrennt und in 2 ml TE gelöst.
Bezugsbeispiel 2: Herstellung eines DNA-Fragments, das ein Gen enthält, welches Creatin-Amidinohydrolase codiert, und eines rekombinanten Vektors, der das DNA-Fragment enthält
Die in Bezugsbeispiel 1 erhaltene DNA (20 μg) wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Toyo Boseki Kabushiki Kaisha) partiell gespalten, und Fragmente von 2–10 kbp wurden durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation gewonnen. Inzwischen wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Toyo Boseki Kabushiki Kaisha) gespaltenes pBluescript KS(+) mit bakterieller Alkalischer Phosphatase (Toyo Boseki Kabushiki Kaisha) dephosphoryliert. Dann wurden die beiden DNAs 12 h lang bei 16 °C mit T4-DN-Ligase (1 Einheit, Toyo Boseki Kabushiki Kaisha) behandelt, um die DNA zu ligieren. Kompetente Escherichia-coli-JM109-Zellen (Toyo Boseki Kabushiki Kaisha) wurden mit der ligierten DNA transformiert und auf einem Agarmedium zum Nachweis von Creatin-Amidinohydrolase-Aktivität [0,5% Hefeextrakt, 0,2% Fleischextrakt, 0,5% Polypepton, 0,1% NaCl, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄/7·H₂O, 1,15% Creatin, 10 E/ml Sarcosin-Oxidase (Toyo Boseki Kabushiki Kaisha), 0,5 E/ml Peroxidase (Toyo Boseki Kabushiki Kaisha), 0,01% o-Dianisidin, 50 μg/ml Ampicillin und 1,5% Agar] ausgestrichen. Die Aktivität von Creatin-Amidinohydrolase wurde nachgewiesen, indem man als Indices die Kolonien verwendete, die in dem oben genannten Medium wuchsen und braun angefärbt waren. Die Kolonien (ca. 1 × 10⁵) der Transformante wurden pro 1 μg verwendete DNA erhalten.
Etwa 12 000 Kolonien wurden durchmustert, und 6 Kolonien wurden gefunden, die braun angefärbt waren. Diese Stämme wurden in LB-Flüssigmedium (1% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, 50 μg/ml Ampicillin) kultiviert, und die Creatin-Amidinohydrolase-Aktivität wurde bestimmt, und als Ergebnis wurde bei jedem Stamm Creatin-Amidinohydrolase-Aktivität nachgewiesen. Das Plasmid des Stammes, der die höchste Creatin-Amidinohydrolase-Aktivität zeigte, enthielt ca. 5 kbp an eingefügtem DNA-Fragment, und dieses Plasmid wurde pCRH17 genannt.
Dann wurde die eingefügte DNA von pCRH17 mit den Restriktionsenzymen EcoRV (Toyo Boseki Kabushiki Kaisha) und PstI (Toyo Boseki Kabushiki Kaisha) gespalten und mit pBluescript KS(+), das mit diesen Restriktionsenzymen gespalten worden war, ligiert, wobei pCRH173 hergestellt wurde.
Beispiel 1: Herstellung des rekombinanten Plasmids pCRH273 durch Einführen einer Mutation in das Creatin-Amidinohydrolase-Gen
Der Bereich von dem vom Vektor abgeleiteten β-Galactosidase-Strukturgen bis zum Bereich stromaufwärts des Creatin-Amidinohydrolase-Strukturgens der eingefügten DNA wurde aus dem rekombinanten Plasmid pCRH173 von Bezugsbeispiel 2 entfernt, wobei man die in SEQ ID Nr. 3 gezeigte synthetische DNA und einen kommerziell erhältlichen Mutationseinführungskit (Transformer TM; Clontech) verwendete, wobei das rekombinante Plasmid pCRH173M hergestellt wurde. Das ausführliche Verfahren zur Einführung der Mutation war in den Anweisungen angegeben, die dem Kit beilagen.
Das pCRH173M wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI (Toyo Boseki Kabushiki Kaisha) gespalten und einer Selbstligation unterzogen, wobei pCRH273 hergestellt wurde (1).
Beispiel 2: Auswahl von in Frage kommenden Zelllinien, die die gewünschte mutante Creatin-Amidinohydrolase produzieren
Kommerziell erhältliche kompetente Escherichia-coli-Zellen (E. coli XLI-Red; Clontech) wurden mit dem in Beispiel 1 hergestellten pCRH273 transformiert, und die gesamte Menge wurde in 3 ml LB-Flüssigmedium (1% Polypepton, 0,5% Hefeextrakt, 1,0% NaCl), das Ampicillin (50 μg/ml; Nakarai Tesque) enthielt, eingeimpft, und dann erfolgte eine Schüttelkultur über Nacht bei 37 °C. Aus der gesamten Menge dieser Kultur wurde nach einem herkömmlichen Verfahren ein Plasmid gewonnen. Die kommerziell erhältlichen kompetenten Escherichia-coli-Zellen (E. coli JM109; Toyo Boseki Kabushiki Kaisha) wurden wiederum mit diesem Plasmid transformiert und auf Agarmedium zum Nachweis von Creatin-Amidinohydrolase-Aktivität ausgestrichen, das dann über Nacht bei 37 °C inkubiert wurde. Die Zelllinien, die eine starke Expression der Creatin-Amidinohydrolase-Aktivität zeigten, d.h. die Stämme, die eine tiefe Farbentwicklung zeigten, wurden aus der so erhaltenen Bibliothek von mutanter Creatin-Amidinohydrolase ausgewählt.
Beispiel 3: Durchmustern nach einer Creatin-Amidinohydrolase produzierenden Zelllinie mit einem reduzierten K_m-Wert
Die in Beispiel 2 ausgewählten, in Frage kommenden Zelllinien wurden in 3 ml TB-Medium (1,2% Polypepton, 2,4% Hefeextrakt, 0,4% Glycerin, 0,0231% KH₂PO₄, 0,1254% K₂HPO₄), das Ampicillin (200 μg/ml) enthielt, eingeimpft, und über Nacht einer Schüttelkultur bei 37 °C unterzogen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation aus 1 ml der Kultur gewonnen, und durch Aufschluss mit Glaskügelchen wurde eine Rohenzymlösung daraus hergestellt. Unter Verwendung der so erhaltenen Rohenzymlösung und unter Befolgung des oben genannten Aktivitätsbestimmungsverfahrens wurde Creatin-Amidinohydrolase bestimmt. Inzwischen wurde die Creatin-Amidinohydrolase-Aktivität in derselben Weise unter Verwendung eines Aktivitätsbestimmungsreagens bestimmt, das 1/10 der Substratkonzentration aufwies. Die Zelllinie, bei der das Verhältnis der beiden Arten der gemessenen Aktivität (Aktivität mit 1/10 Substratkonzentration/in herkömmlicher Weise erhaltene Aktivität) über den Wert einer Wildtyp-Creatin-Amidinohydrolase hinaus stieg, wurde als Mutante mit reduziertem K_m-Wert ausgewählt.
Etwa 20 000 Zelllinien wurden nach dem obigen Verfahren durchmustert, und es wurden drei mutante Zelllinien mit einem kleineren K_m-Wert für Creatin erhalten, und die jeweiligen rekombinanten Plasmide davon wurden pCRH273M1 (FERM BP-5374), pCRH273M2 (FERM BP-5375) und pCRH273M3 (FERM BP-5376) genannt.
Beispiel 4: Herstellung von Creatin-Amidinohydrolase aus Escherichia coli JM109 (pCRH273M1)
TB-Medium (6 l) wurde in 10-Liter-Flaschenfermenter ausgegeben und 15 min lang bei 121 °C autoklaviert. Nach dem Abkühlenlassen wurden 50 mg/ml Ampicillin (Nakarai Tesque) und 200 mM IPTG (Nippon Seika Corp.), die getrennt sterilfiltriert worden waren, in einer Menge von jeweils 6 ml hinzugefügt. Nach vorheriger Schüttelkultur bei 30 °C während 24 h wurden 60 ml der Kultur von Escherichia coli JM109 (pCRH273M1) (FERM BP-5374) zu diesem Medium gegeben, und dann erfolgte eine Belüftungskultur bei 37 °C während 24 h. Die Aktivität der Creatin-Amidinohydrolase nach Beendigung der Kultur betrug 8,7 E/ml.
Die oben genannten Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, suspendiert.
Die Zellen in dieser Suspension wurden mit einer French Press aufgeschlossen und einer Zentrifugation unterzogen, was einen Überstand ergab. Die erhaltene Rohenzymlösung wurde einer Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Entsalzung durch Gelfiltration über Sephadex^® G-25 (Pharmacia Biotech) und Reinigung durch Säulenchromatographie auf Octyl-Sepharose^® CL-6B (Pharmacia Biotech) unterzogen, was ein gereinigtes Enzymprodukt ergab. Das nach diesem Verfahren erhaltene Standard-Creatin-Amidinohydrolase-Produkt zeigte im SDS-PAGE fast eine einzige Bande und hatte dann eine spezifische Aktivität von 18,4 E/mg Protein.
Tabelle 1 zeigt die bisher durchgeführte Reinigung. Tabelle 2 zeigt die physikalischchemischen Eigenschaften der nach den obigen Verfahren erhaltenen Caeatin-Amidinohydrolase.
Tabelle 1 Reinigung von Creatin-Amidinohydrolase aus Escherichia coli JM109 (pCRH273M1)
Tabelle 2 Physikalisch-chemische Eigenschaften der aus Escherichia coli JM109 (pCRH273M1) gereinigten Creatin-Amidinohydrolase
Beispiel 5: Herstellung von Creatin-Amidinohydrolase aus Escherichia coli JM109 (pCRH273M2)
TB-Medium (6 l) wurde in 10-Liter-Flaschenfermenter ausgegeben und 15 min lang bei 121 °C autoklaviert. Nach dem Abkühlenlassen wurden 50 mg/ml Ampicillin (Nakarai Tesque) und 200 mM IPTG (Nippon Seika Corp.), die getrennt sterilfiltriert worden waren, in einer Menge von jeweils 6 ml hinzugefügt. Nach vorheriger Schüttelkultur bei 30 °C während 24 h wurden 60 ml der Kultur von Escherichia coli JM109 (pCRH273M2) (FERM BP-5375) zu diesem Medium gegeben, und dann erfolgte eine Belüftungskultur bei 37 °C während 24 h. Die Aktivität der Creatin-Amidinohydrolase nach Beendigung der Kultur betrug 5,6 E/ml.
Die oben genannten Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, suspendiert.
Die Zellen in dieser Suspension wurden mit einer French Press aufgeschlossen und einer Zentrifugation unterzogen, was einen Überstand ergab. Die erhaltene Rohenzymlösung wurde einer Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Entsalzung durch Gelfiltration über Sephadex^® G-25 (Pharmacia Biotech) und Reinigung durch Säulenchromatographie auf Octyl-Sepharose^® CL-6B (Pharmacia Biotech) unterzogen, was ein gereinigtes Enzymprodukt ergab. Das nach diesem Verfahren erhaltene Standard-Creatin-Amidinohydrolase-Produkt zeigte im SDS-PAGE fast eine einzige Bande und hatte dann eine spezifische Aktivität von 14,3 E/mg Protein.
Tabelle 3 zeigt die bisher durchgeführte Reinigung. Tabelle 4 zeigt die physikalischchemischen Eigenschaften der nach den obigen Verfahren erhaltenen Creatin-Amidinohydrolase.
Tabelle 3 Reinigung von Creatin-Amidinohydrolase aus Escherichia coli JM109 (pCRH273M2)
Tabelle 4 Physikalisch-chemische Eigenschaften der aus Escherichia coli JM109 (pCRH273M2) gereinigten Creatin-Amidinohydrolase
Beispiel 6: Herstellung von Creatin-Amidinohydrolase aus Escherichia coli JM109 (pCRH273M3)
TB-Medium (6 l) wurde in 10-Liter-Flaschenfermenter ausgegeben und 15 min lang bei 121 °C autoklaviert. Nach dem Abkühlenlassen wurden 50 mg/ml Ampicillin (Nakarai Tesque) und 200 mM IPTG (Nippon Seika Corp.), die getrennt sterilfiltriert worden waren, in einer Menge von jeweils 6 ml hinzugefügt. Nach vorheriger Schüttelkultur bei 30 °C während 24 h wurden 60 ml der Kultur von Escherichia coli JM109 (pCRH273M3) (FERM BP-5376) zu diesem Medium gegeben, und dann erfolgte eine Belüftungskultur bei 37 °C während 24 h. Die Aktivität der Creatin-Amidinohydrolase nach Beendigung der Kultur betrug 8,3 E/ml.
Die oben genannten Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, suspendiert.
Die Zellen in dieser Suspension wurden mit einer French Press aufgeschlossen und einer Zentrifugation unterzogen, was einen Überstand ergab. Die erhaltene Rohenzymlösung wurde einer Ammoniumsulfat-Fraktionierung, Entsalzung durch Gelfiltration über Sephadex^® G-25 (Pharmacia Biotech) und Reinigung durch Säulenchromatographie auf Octyl-Sepharose^® CL-6B (Pharmacia Biotech) unterzogen, was ein gereinigtes Enzymprodukt ergab. Das nach diesem Verfahren erhaltene Standard-Creatin-Amidinohydrolase-Produkt zeigte im SDS-PAGE fast eine einzige Bande und hatte dann eine spezifische Aktivität von 14,8 E/mg Protein.
Tabelle 5 zeigt die bisher durchgeführte Reinigung. Tabelle 6 zeigt die physikalischchemischen Eigenschaften der nach den obigen Verfahren erhaltenen Creatin-Amidinohydrolase.
Tabelle 5 Reinigung von Creatin-Amidinohydrolase aus Escherichia coli JM109 (pCRH273M3)
Tabelle 6 Physikalisch-chemische Eigenschaften der aus Escherichia coli JM109 (pCRH273M3) gereinigten Creatin-Amidinohydrolase
Die folgende Tabelle 7 fasst die K_m-Werte für Creatin der neuen Creatin-Amidinohydrolasen der vorliegenden Erfindung und von Wildtyp-Creatin-Amidinohydrolase zusammen. Wie aus Tabelle 7 hervorgeht, hatten die Creatin-Amidino hydrolasen der vorliegenden Erfindung reduzierte K_m-Werte im Vergleich zur Wildtyp-Creatin-Amidinohydrolase. Tabelle 7
Beispiel 7

Unter Verwendung der in Beispiel 5 hergestellten gereinigten Creatin-Amidinohydrolase und von Wildtyp-Creatin-Amidinohydrolase wurde ein Creatinin-Bestimmungsreagens mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt, und die Mengen an Creatin-Amidinohydrolase, die notwendig waren, um ein Creatinin-Bestimmungsreagens zu erhalten, wurden miteinander verglichen.

Creatin-Amidinohydrolase von Beispiel 5
oder Wildtyp-Creatin-Amidinohydrolase	20, 40, 60 E/ml
Creatinin-Amidohydrolase	150 E/ml
Sarcosin-Oxidase	7 E/ml
Peroxidase	3 PE/ml
MOPS-Puffer	0,1 M, pH 8,0
Triton^® X-100	0,1%
4-Aminoantipyrin	0,15 mM
TOOS (Anilinderivat)	0,2 mM

Die oben genannte Lösung (3 ml) wurde zu einer Probe (60 μl) gegeben, die Creatinin enthielt (100 mg/dl), und Veränderungen in der Extinktion wurden bei 37 °C bei einer Wellenlänge von 546 nm bestimmt. Die Ergebnisse des zeitlichen Verlaufs sind in 2 gezeigt. In der Figur zeigt "Wild" eine Wildtyp-Creatin-Amidinohydrolase, und "pCRH273M2" ist die Creatin-Amidinohydrolase der vorliegenden Erfindung.
Wie aus 2 hervorgeht, ermöglichte die Creatin-Amidinohydrolase der vorliegenden Erfindung, wenn die Bestimmung in 5 Minuten beendet sein sollte, eine Bestimmung mit einer geringeren Enzymmenge (ca. 1/3 der Menge) im Vergleich zur Wildtyp-Creatin-Amidinohydrolase. Es wurde auch bestätigt, dass die Reaktivität während der zweiten Hälfte der Bestimmung, d.h. als das Creatin in der Probe abgenommen hatte, gut war. Sequenzprotokoll

Claims

Mutante Creatin-Amidinohydrolase mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften: Wirkung: katalysiert die folgende Reaktion: Creatin + H₂O → Sarcosin + Harnstoff; Temperaturoptimum 40–50 °C; Wärmestabilität: nicht mehr als etwa 50 °C (pH 7,5, 30 min); pH-Optimum = pH 8,0–9,0; K_m-Werte für Creatin in einem Kopplungsassay unter Verwendung einer Sarcosin-Oxidase und einer Peroxidase: 3,5–10,0 mM; Molekulargewicht etwa 43 000 (SDS-PAGE); pH-Stabilität: stabil bei pH 5–8 (40 °C, 18 h Konservierung).
Verfahren zur Herstellung der Creatin-Amidinohydrolase gemäß Anspruch 1, umfassend das Kultivieren eines Mikroorganismus, der die Creatin-Amidinohydrolase erzeugt, in einem Nährmedium und Gewinnen der Creatin-Amidinohydrolase aus der resultierenden Kultur.
Reagens zur Bestimmung von Creatin in einer Probe, umfassend die Creatin-Amidinohydrolase gemäß Anspruch 1, eine Sarcosin-Oxidase und eine Zusammensetzung zum Nachweis von Wasserstoffperoxid.
Verfahren zur Bestimmung von Creatin in einer Probe, umfassend das Messen der Extinktion eines Pigments, das durch die Reaktion des Reagens gemäß Anspruch 3 mit der Probe erzeugt wird.
Reagens zur Bestimmung von Creatinin in einer Probe, umfassend eine Creatinin-Amidohydrolase, die Creatin-Amidinohydrolase gemäß Anspruch 1, eine Sarcosin-Oxidase und eine Zusammensetzung zum Nachweis von Wasserstoffperoxid.
Verfahren zur Bestimmung von Creatinin in einer Probe, umfassend das Messen der Extinktion eines Pigments, das durch die Reaktion des Reagens gemäß Anspruch 5 mit der Probe erzeugt wird.
Creatin-Amidinohydrolase gemäß Anspruch 1, die von einer Nucleinsäuresequenz codiert wird, welche dadurch erhältlich ist, dass man in die Nucleinsäuresequenz, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 codiert, eine Mutation einführt.
Creatin-Amidinohydrolase gemäß Anspruch 1, die von einer Nucleinsäuresequenz codiert wird, welche dadurch erhältlich ist, dass man in die Nucleinsäuresequenz, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 codiert, eine Mutation einführt, und die nach einem Verfahren erzeugt werden kann, das die folgenden Schritte (a) und (b) umfasst: (a) Einführen einer Mutation in die Nucleinsäuresequenz, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 codiert; (b) Auswählen einer Mutante, die einen besseren K_m-Wert hat als die Creatin-Amidinohydrolase, die durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 codiert wird.
Verfahren zur Herstellung der Creatin-Amidinohydrolase gemäß Anspruch 1, das die folgenden Schritte (a) und (b) umfasst: (a) Einführen einer Mutation in die Nucleinsäuresequenz, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 codiert; (b) Auswählen einer Mutante, die einen besseren K_m-Wert hat als die Creatin-Amidinohydrolase, die durch die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 1 codiert wird.