DE2265121B2 - Enzympräparat zur Bestimmung von Cholesterin und Verfahren zu seiner Herstellung - Google Patents

Enzympräparat zur Bestimmung von Cholesterin und Verfahren zu seiner Herstellung

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Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Enzympräparat zur Bestimmung von Cholesterin, welches Cholesterin mit Sauerstoff zu Cholestenon und HiO2 oxidiert, sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.
Es ist bekannt, daß bestimmte Mikroorganismenstämme der Gattung Nocardia Cholesterinoxidase bilden können, die in Gegenwart von Sauerstoff Cholesterin zu zl4-Cholestenon oxydiert. So wurde von Stadt man et al., »Biol. Chem.«, 206 (1954), Seiten 511 bis 523, gefunden, daß eine Mycobakterienerde in der Lage ist, Cholesterin zu 44-Cholestenon zu oxydieren. Die für diese Umsetzung verantwortlichen Cholesterinoxidase (bzw. Cholesterindehydrogenase) kann in zellfreier Form mit niedriger Aktivität erhalten werden. Die Herstellung dieser Cholesterinoxidase aus Mycobakteriumerde als etwas reineres lösliches Enzympräparat und die Bestimmung der Aktivität des Enzyms wurde von Stadt man in »Methods in Enzymology«, I (1955), Seiten 678 bis 681, beschrieben. Das dabei verwendete lösliche Enzym war jedoch von relativ geringe;· Aktivität, und es konnte auch nicht in befriedigender Weise gereinigt werden.
In der US-PS 36 07 093 ist die grundsätzliche Möglichkeit angesprochen, einen Cholesterintest zu entwickeln, in dem Testmembranen mit geeigneten Oxidaseenzymen imprägniert werden, was dann zu einer Farbreaktion ähnlich der für den Nachweis von Glucose näher beschriebenen Reaktionen führen soll. Für Glucose ist dann die Kombination Glucoseoxidase und Peroxidase gezeigt. Die tatsächliche Bestimmung von Cholesterin sowie vor allem ein für die Bestimmung geeignetes Enzympräparat sind in dieser US-PS nicht gezeigt.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein /ur Bestimmung von Cholesterin geeignetes Enzympräparat und ein Verfahren zu seiner Herstellung anzugeben.
Es wurde gefunden, daß zwei Arten von Mikroorganismen des Genus Nocardia, die zur sogenannten Mycobakterium-rhodocrous-Gruppe gehören, eine Cholesterinoxidaseaktivität besitzen, d. h. Cholesterin ir J4-Cholestenon und Wasserstoffperoxid umwandeln wobei diese Reaktion für die automatische enzymatische Bestimmung von Cholesterin ausgenutzt werden kann, welche die Nachteile der bisher für die Cholesterinbestimmung angewendeten Liebermann-Burchard-Reaktion, bei der stark korrodierende und hochviskose Reagentien verwendet werden und die für die Automatisierung nicht geeignet ist, nicht aufweist.
Die Lösung der genannten Aufgabe besteht somit in einem Enzympräparat der eingangs genannten Art, das gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an aus den1 Stamm Nocardia NCIB 10 554 oder NCIB 10 555 dei Mycobakterium-rhodocrous-Gruppe stammender Cholesterinoxidase als Cholesterin oxydierendem Enzym ir flüssiger oder fester Form.
Ein zur Herstellung des vorstehend beschriebener Enzynipräparats geeignetes Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß m.n den Stamm Nocardia NCIB 10 554 oder NClB 10 555 der Mycobakterium rhodocrous-Gruppe auf einem geeigneten Medium züchtet und das Enzympräparat von den Zellen gewinnt.
Die erfindungsgemäß verwendbaren beiden Mikroorganismenstämme werden nachfolgend als »rauher« bzw. »glatter« Stamm bezeichnet und haben die Bezeichnung NCIB 10 554 bzw. NCIB 10 555 der National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station Aberdeen, erhalten. Die Mikroorganismen, die das erfindungsgemäße Enzympräparat liefern, können auf irgendeinem geeigneten Medium gezüchtet werden die Zellen werden dann geerntet und zerbrochen, uir das Enzym freizusetzen. Die Organismen werden vorzugsweise in dem nachfolgend angegebenen Nährmedium, in das sie durch Inokulieren eingebraehl werden, gezüchtet:
(NH4J2SO4
CaCI2 · 2 H,O
FeSO4 ■ 7 1I2O
K2HPO4
MgSO4 · 7 H2O
Glycerin
Hefeextrakt
0,2 g-% 0,001 g-% 0,001 g-% 0,2 g-% 0,02 g-% 0,5 g-% 2,0 g-%
Um die Ausfällung von schwerlöslichen Salzen zi vermeiden, werden die vorstehend angegebenen Komponenten getrennt gelöst und dann in der angegebener Reihenfolge zu einem genügend großen Volumen ar destilliertem Wasser zugegeben. Dann wird das Mediuir auf das erforderliche Volumen aufgefüllt. Der pH-Weri beträgt etwa 7,5, und die Inkubationstemperatur beträgi etwa 29°C. Nach einer Inkubationszeit von etwa 24 Stunden beträgt der End-pH-Wert nur noch etwa 6,95 Durch Einführung eines Antischaummittels und durch Züchten der Mikroorganismen unter Belüftung könner Ausbeuten an bis zu 9 g Zellen pro Liter erhalte! werden.
Die Zellen können durch Zentrifugieren, beispielswei se bei 2800 UpM und bei 4"C in einer Zentrifuge abgetrennt werden, danach können sie zweimal mi einer Lösung von 0,5% NaCl und 0,5% KCI ir destilliertem Wasser gewaschen werden, wobei dit zugegebenen Salze die Sedimentation erleichtern.
In dieser Stufe weisen die Mikroorganismenzellei selbst eine Cholesterinoxidaseaktivität auf, d. h. sie sine in der Lage, Cholesterin unter Aufnahme von Saucrstof in zl^-Cholestenon und Wasserstoffperoxid uinzuwan dein. Ein Enzympräparat mit einer Cholesterinoxidase
aktivität kann in der Weise hergestellt werden, daß man die Mikroorganismenzellen aufbricht, wobei der Mikroorganismenstamm Nocardia NClB 10 554 bevorzugt ist, weil dieser Stamm eine höhere spezifische Aktivität in bezug auf die Oxydation von Cholesterin aufweist.
Zum Aufbrechen der Mikroorganismenzellen unter Bildung eines wäßrigen Präparats mit einer Cholesterinoxidaseaktivität kann jedes geeignete Verfahren angewendet werden. Bevorzugte Verfahren sind das Mahlen eines Acetonpulvers der Zellen oder die Behandlung der Zellen in einer X-Presse, es können aber auch andere Verfahren angewendet werden, wie z. B. das Mahlen mit festem Kohlendioxid, Zerkleinerung unter Anwendung von Ultraschall und unter Verwendung einer Mickle-Apparatur. Durch Aufrechterhaltung einer niedrigen Temperatur während des Mahlens mit Trockeneis kann die Aktivität des Enzyms aufrechterhalten werden, dieses Verfahren ist jedoch sehr schwerfällig. Bei dor Zerkleinerung unter Anwendung von Ultraschall können variable Ergebnisse erzielt werden, wobei eine Behandlungszeit von bis zu 30 Minuten erforderlich ist, bevor eine Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit auftritt, und sie kann auch zum vollständigen Verlust der Enzymaktivität führen. Die längere Reibwirkung bei Verwendung einer Mickle-Apparatur ist günstig in bezug auf die Abgabe eines hohen Prozentsatzes an Restaktivität an die überstehende Flüssigkeit, auch diese kann aber zu einem gewissen Aktivitätsverlust führen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
Gemäß einem Beispiel für ein Verfahren zum Extrahieren des Enzyms wurden 5 g feuchte Zellen bei -300C in 50 ml Aceton suspendiert. Nach 2stündigem Rühren bei 4°C wurde die Suspension zentrifugiert, und das gesamte Verfahren wurde wiederholt. Die dabei erhaltenen Zellen wurden unter Vakuum bei 4°C getrocknet. Die getrockneten Zellen (1 g) wurden mit 40 ml einer 0,05 M-Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,5) eine Stunde lang bei 4°C extrahiert, und der Extrakt wurde bei 8000 UpM in einer Zentrifuge zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit wurde erneut bei 15 000UpM zentrifugiert. Die dabei erhaltenen Ergebnisse waren die folgenden:
Oxydiertes Gcsaml-
Cholesterin aktivitül
in [Jg pro in %
Stunde pro ml
Unbehandelte Zellen 750 100
Extrakt 395 52
(behandelte Suspension)
Überstehende Flüssigkeit 93,5 12,4
Durch Ultraschallbehandlung für einen Zeitraum von 10, 20 und 30 Sekunden nahm die Menge der Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit nicht wesentlich zu. 1 ml der überstehenden Flüssigkeit (gewonnen aus 125 mg feuchten Zellen, entsprechend einem Trockengewicht von 25 mg) oxydierte pro Stunde 93,5 μg Cholesterin.
Gemäß einem /weiten Beispiel für ein Verfahren zum Extrahieren des Enzyms wurden etwa 5 ml feuchte Zellen 10 ml bei -25°C durch eine LKB A--Presse geführt.
2,6 g der behandelten Zellen wurden 1 Stunde lang bei 4°C mit 15 ml einer 0,05 M-Kaliumphosphatpufferlösung (pH 7,5) extrahiert. Nach dem Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit zur Entfernung der Zellen und einer Sedimentation bei hoher Geschwindigkeit bei 1000 000 g erhielt man eine klare, bernsteinfarbene, überstehende Flüssigkeit mit einer Proteinkonzentration von 5.6 mg/ml. Während der Behandlung ging keine Aktivität verloren, und 52% der Gesamtaktivitä: wurden in der überstehenden Flüssigkeit gewonnen. Die spezifische Aktivität dieser überstehenden Flüssigkeit
κι betrug 30 mg oxydiertes Cholesterin/mg Protein/Stunde.
Ein eine Cholesterinoxidaseaktivität aufweisendes wäßriges Präparat muß im allgemeinen konzentriert werden, bevor es in der Praxis für die Cholestcrinbe-
|-i Stimmung verwendet werden kann. Das wäßrige Enzympräparat sollte in der Lage sein, mindestens 0,5 g Cholesterin pro ml pro Minute zu oxydieren, wobei innerhalb eines für die praktische Bestimmung ausreichend kurzen Zeitraumes ein Ergebnis erhalten wird,
jo insbesondere wenn die Analyse automalisch durchgefühn wird; das Präparat sollte in der Lage sein, vorzugsweise mindestens 4, insbesondere 8 ng Cholesterin pro ml pro Minute zu oxydieren. Die obere Grenze der Aktivität eines wäßrigen Präparats hängt
j-> von dem Grad ab, bis zu dem das Enzym gereinigt werden kann, es ist aber möglich, Präparate herzustellen, die bis zu 40 ng oder mehr Cholesterin pro ml pro Minute oxydieren können.
Das Enzympräparat mit der Cholesterinoxidaseakti-
iii vität braucht nicht in wäßriger Form vorzuliegen, es kann auch beispielsweise in Form eines gefriergetrockneten Pulvers vorliegen. Ein solches Pulver sollte eine spezifische Aktivität aufweisen, die mindestens so groß ist, daß das Pulver in eine Lösung überführt werden
i", kann, welche die oben angegebenen Mindesteigenschaften in bezug auf ihr Vermögen, Cholesterin bei einer tolerierbaren Proteinkonzentration zu oxydieren, aufweist. Das Präparat kann nicht nur in Form eines löslichen lyophilisierten Pulvers vorliegen, sondern es
κι kann auch in Form einer konzentrierten, gepufferten Lösung oder in Form einer Suspension auf Ammoniumsulfat (mit oder ohne einen zugesetzten Puffer) vorliegen.
Geeignete Verfahren zum Reinigen der übcrstehen-
•n den Flüssigkeit, die beim Kultivieren der Mikroorganismen erhalten wird, sind die Ausfällung mit Ammoniumsulfat und/oder Chromatographische Verfahren. So kann beispielsweise die überstehende Flüssigkeit durch Ammoniumsulfatausfällung oder Polyäthylenglykolaus-
)0 fällung konzentriert, in einer Sephadex-Säule entsalzt und dann einer lonenaustauschchromatographie unterworfen werden. In dieser Stufe kann es erforderlich sein, die Aktivität der überstehenden Flüssigkeit auf etwa das 15- bis 40fache zu konzentrieren. Wenn die gebildete
V) Wasserstoffperoxidmenge bestimmt werden soll, um den Cholesteringehalt zu ermitteln, müssen bestimmte Vorsichtsmaßnahmen ergriffen werden, um zu gewährleisten, daß das Präparat keine Katalaseaktivität aufweist, da dadurch natürlich das Wasserstoffperoxid
on zerstört und die Cholesterinbestimmung gestört würden.
Nachfolgend ist ein Beispiel für die Konzentration und Reinigung der überstehenden Flüssigkeit der durch Aufbrechen der Mikroorganisinenzellcn in einer
h> LKB X-Presse erhaltenen Enzymlösung durch Substrataffinitälschromatographie beschrieben:
Sephadex LH-20, hergestellt durch Hydroxypropylierung von Sephadex G-25, das sowohl hydrophile als
auch lipophile Eigenschaften aufweist und in polaren organischen Lösungsmitteln, Wasser oder Mischungen davon gequollen werden kann, wurde in mit Cholesterin gesättigtem Äthanol (etwa 4,0 g-%) gequollen und damit wurde eine 40 cm χ 1 cm große Säule gefüllt. Die Säule wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, um innerhalb des Gels das Cholesterin gleichmäßig auszufällen, und dann wurde die Säule mit einem 0,05 M-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) Hquilibriert. Das Elutionsvolumcn für blaues Dextran wurde zu 15 mi bestimmt.
Die Chromatographie wurde bei 2°C durchgeführt, wobei 1,3 ml Enzymlösung in den Kopf der Säule eingefüllt wurden, und die Elution wurde mit dem Ausgangspuf'er durchgeführt. Die Durchflußgeschwindigkeit betrug 5 ml pro Stunde (unter der Einwirkung der Schwerkraft) und es wurden 1,5-ml-Fraktioncn gesammelt.
Es wurde festgestellt, daß die Aktivität in den Fraktionen 16 bis 45 scharf anstieg bis zu einem Maximum in den Fraktionen 17 bis 25 und daß sie für die Fraktionen 26 bis 45 wieder abfiel mit einem kleinen zweiten Maximum in der Fraktion 31.
Das /44-Cholestenon und das Cholesterin wurden in niedrigen Konzentrationen aus der Säule ausgewaschen, und diese Verunreinigungen mußten entfernt werden. Die Aktivität wurde durch Dünnschichtchro-
JIl matographie bestimmt und zu diesem Zweck mußten die Cholestenon-Mengen in jeder aktiven Fraktion ermittelt und die Aktivitäten um eine entsprechende Menge korrigiert werden. Die nach diesem Verfahren erzielte Reinigung lag in der Größenordnung des lOOfachen der durchschnittlichen spezifischen Aktivität der aktiven Fraktionen, die 2,9 mg oxydiertes Cholesterin pro ml Protein pro Stunde betrug.
Im folgenden wird ein Beispiel für ein Verfahren zur Bestimmung von Cholesterin in biologischen Flüssigkeiten beschrieben, bei dem man die Flüssigkeit verseift, die verseifte Flüssigkeit mit einem erfindungsgemäßen Enzympräparat inkubiert und die Menge mindestens eines der bei der Cholesterinoxidasereaktion gebildeten Produkte oder die bei der Cholesterinoxidasereaktion verbrauchte Sauerstoffmenge bestimmt.
Cholesterin kommt in biologischen Flüssigkeiten, beispielsweise im Serum, in Form von Estern vor und muß zuerst in eine solche Form überführt werden, in der es durch Cholesterinoxidase angegriffen werden kann. Dies erfolgt am zwcckmäßigsien durch Verseifen der Ester, beispielsweise durch Umsetzung mit alkoholischem Kaliumhydroxid. Die Umsetzung mit 1,0-n KOH bei 75°C führt zu einer schnellen Verseifung, ohne daß dabei das Protein koaguliert wird. Die verseifte Flüssigkeit wird dann mit Cholesterinoxidase inkubiert. Die folgende Umsetzung
Cholesterin + O1
Cholesterinoxidase C'holest-4-en-3-on + H,O,
läßt man bis zur Vollständigkeit ablaufen und bestimmt dann die in der Flüssigkeit erhaltene Cholesterinmengc durch Messen der Sauerstoffaufnahme oder der Menge, in der mindestens eines der Reaktionsprodukte gebildet wird. Unter geeigneten standardisierten Bedingungen ist es möglich, die in der Flüssigkeit vorhandene Cholesterinmenge abzuschätzen aus der Menge eines der innerhalb eines gegebenen Zeitraumes gebildeten Produkte oder der Menge des verbrauchten Sauerstoffs.
selbst wenn die Reaktion nicht bis zur Vollständigkeil ablaufen gelassen wird.
Die in der Flüssigkeit vorhandene Cholesterinmengc kann bestimmt werden durch Messung der gebildeten Wasscrstoffpcroxidmcngc durch Umsetzung mit 4-Aininophenazon in Gegenwart von überschüssigem Phenol und Peroxidase, wobei die folgende Reaktion abläuft:
H2O, +
HjC-N C=-O
H3C- C=C-NH,
Peroxidase Il I -t- 2H2O
H1C-N C-O
' I i
H1C-C== C- N
Dabei wird der verseifte Extrakt in Gegenwart von Peroxidase, 4-Aminophenazon und Phenol mit Cholesterinoxidase umgesetzt, und die optische Dichte wird bei 510 nm bestimmt. Dabei ergibt sich, daß eine lineare Beziehung zwischen der Differenz der optischen Dichte (Δ OD) zwischen einer Testlösung und einer kein Cholesterin enthaltenden Vergleichslösung und der Menge des gebildeten Cholestenons besteht. Die Cholesterinoxidase, die Peroxidase, das 4-Aminophcnazoη und das Phenol können in einem einzigen Reagens vereinigt und in dieser Form verwendet werden.
Eine typische Bestimmung nach diesem Verfahren wird wie folgt durchgeführt:
0,1 ml Serum werden zu 1,0 ml einer 1-n alkoholischen KOH-Lösung zugegeben und 5 Minuten lang bei 75°C inkubiert. 0,1 ml des verseiften Extraktes werden
zu 2,5 ml eines Cholesterinoxidase/Peroxidase/4-Aminophenazon/Phenol-Reagens zugegeben, und die Mischung wird 5 Minuten lang bei 30 bis 37°C inkubiert und dann wird der Farbwert bei 510 nm abgelesen.
Bei diesem Test kann eine 0,1 °/oige Cholesterinlösung ·ί eine Trübung ergeben, wenn sie dem Enzymreagens zugesetzt wird, wobei eine optische Dichte von etwa 0,05 erhalten wird. Eine 0,l%ige Cholestenonlösung, die auf die gleiche Weise behandelt worden ist, ergibt ebenfalls eine Trübung, die eine optische Dichte von to etwa 0,08 ergibt. Diese Bedingungen treten jedoch nur in einem extrem abnormen Serum auf, das 1000 mg-% Cholesterin enthält, die Anwesenheit eines oberflächenaktiven Mittels, wie beispielsweise von 0,1% IOB (Triton X 100), in dem Enzymreagens verhindert das ι ■> Auftreten dieser Trübung, d. h., weder das Substrat noch das Produkt bilden während der Umsetzung eine kolloidale Suspension, welche die spektrophotometrischen Messungen stören könnte. Zur Bestimmung der Menge des gebildeten Wasserstoffperoxids und damit der Cholesterinmenge in dem Serum kann auch jedes andere geeignete Verfahren angewendet werden. Beispiele für geeignete Verfahren sind nachfolgend mit der Angabe der Literaturstelle, in denen sie beschrieben sind, angegeben.
I)AIs Sauerstoffakzeptor kann anstelle von 4-Aminophenazon in einer gekoppelten Peroxidasereaktion 2,6-Dichlorphenolindophenol verwendet werden (vgl. Clark & Timms, »Proc. Assoc. Clin. Biochem.«, 1968,5,61);
2) Wasserstoffperoxid kann in Gegenwart von Peroxidase mit Gujakharz umgesetzt werden unter Bildung eines blauen Produktes (vgl. M or Icy, Da w son & Marks, »Proc. Assoc. Clin. Ciochem.«, 1968.5,42);
3) 4wertiges Titan und Xylenol reagieren mit Wasserstoffperoxid unter Bildung einer stabilen roten Farbe (vgl. Ta urn es & Nordschow, »Amer. J. Clin. Path.«, 1968,49,613);
4) Aus Kaliumjodid wird bei Umsetzung mil Wasserstuffperoxid Jod freigesetzt, und das freigesetzte Jod kann mit Diäthyl-p-phenylendiamin umgesetzt werden unter Bildung einer rosa Färbung (vgl. Thompson, »Clin. Chim. Acta.«. 1969,25,415);
5) Aus einem Jodid wird durch Umsetzung mit Wasserstoffperoxid Jod freigesetzt und zur Verschiebung der Absorption des Jods aus dem nahen UV-Bereich in den sichtbaren Bereich von Polyvinylpyrrolidon verwendet, so daß die Absorption bei 470 nm abgelesen werden kann (vgl. Ware and M a r b a c h , >Clin. Chem.«, 1968,14,548);
6) Unter der Einwirkung von Peroxidase oxydiert Wasserstoffperoxid die Homovanillinsäure in alkalischer Lösung zu einem stark fluoreszierenden Produkt (Protein stört diese Reaktion in einer 40fachen Verdünnung des Plasmas nicht). Das Produkt kann fluorimetrisch bestimmt werden (vgl. Philips & Elevitch, »Am. J. Clin. Path.«, 1968, 49,622);
7) Wasserstoffperoxid reagiert mit Jod in Gegenwart eines Molybdän(lV)-Katalysators. Wenn ein bekannter Thiosulfatüberschuß verwendet wird, um das Jod bei seiner Entstehung sofort zu reduzieren, kann das restliche Thiosulfat kolorimetrisch gegen Jod titriert werden (vgl. Simon, Christian & P u r d y, »Clin. Chem.«, 1968,14,463).
Anstelle der Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids kann beispielsweise auch die Sauerstoffaufnahme bei der Cholesterinoxidasereaktion gemessen werden, z. B. unter Verwendung einer Sauerstoffelektrode nach dem von Updike & Hicks in »Nature«, London, 1967, 214, 986, und Makin & Warren in »Clin. Chim. Acta«, 1970, 29, 493, beschriebenen Verfahren. Auch das Oxydationsprodukt 44-Cholestenon kann beispielsweise in Form seines 2,4-Diphenyl-dihydrazons oder seines Isonicotinsäurehydrazons bestimmt werden oder wenn ein gereinigtes Enzym in einer Konzentration verwendet wird, die eine schwache Absorption bei 240 nm aufweist (oder wenn das Enzym unbeweglich gemacht worden ist), kann das Cholesterin anhand der Zunahme der Absorption bei 240 nm, die auf das während der enzymatischen Reaktion gebildete zi4-Choiestenon zurückzuführen ist, bestimmt werden.

Claims (5)

Patentansprüche:
1. Enzympräparat zur Bestimmung von Cholesterin, welches Cholesterin mit Sauerstoff zu Choleste- ■-, non und H2O2 oxidiert, gekennzeichnet durch einen Gehalt an aus dem Stamm Nocardia NCIB 10 554 oder NCIB 10 555 der Mycobacterium rhodocrous Gruppe stammender Cholesterinoxidase als Cholesterin oxidierendes Enzym in flüssiger m oder fester Form.
2. Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es frei von Katalaseaktivität ist.
J. Enzympräparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es neben Cholestern- ι·-, oxidase noch Peroxidase aufweist.
4. Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparates nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Nocardia NCIB 10 554 oder NCIB 10 555 der Mycobacterium rhodocrous Grup- _>o pe auf einem geeigneten Medium züchtet und das Enzympräparat von den Zellen gewinnt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzympräparat durch Ernten der Zellen, Aufbrechen der Zellen und Abzentrifugieren ^ der Zellbruchstücke als Überstand gewonnen wird.
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