DE3541242C2

DE3541242C2 -

Info

Publication number: DE3541242C2
Application number: DE3541242A
Authority: DE
Inventors: Satoko Kyoto Jp Noda; Susumu Ootsu Jp Matsui
Original assignee: TAKARA SHUZO CO Ltd KYOTO JP
Current assignee: TAKARA SHUZO CO Ltd KYOTO JP
Priority date: 1984-11-28
Filing date: 1985-11-21
Publication date: 1987-08-06
Also published as: GB8529159D0; GB2167421B; JPS61128887A; GB2167421A; DE3541242A1; US4698306A; FR2573771B1; FR2573771A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peroxidase durch Züchten eines Mikroorganismus und Isolieren der erzeugten Peroxidase aus der erhaltenen Kulturbrühe.

Peroxidase ist in Pflanzen im allgemeinen weit verbreitet und liegt in großen Mengen in Rettich, Feigen, Japanischem Rettich etc. vor. Derzeit wird Peroxidase technisch aus Rettich erzeugt, da der Peroxidasegehalt der Rettichwurzel am höchsten ist. Sie findet breite Anwendung als klinisches Diagnosereagens, beispielsweise zur quantitativen Bestimmung von Glukose, Gesamtcholesterin etc. im Blutserum, und zwar in Kombination mit verschiedenen Oxidasen, oder als markiertes Enzym bei einem Enzymimmunoassay. Als Peroxidase von Mikroorganismenursprung seien Cytochrom-C-Peroxidase, NADH-Peroxidase etc., erzeugt durch Bakterien und Schimmelpilze, erwähnt. Diese Peroxidasen unterscheiden sich jedoch in ihrer Wirkung von solchen pflanzlichen Ursprungs, wie Peroxidase aus Rettich etc., so daß sie nicht als klinisches Diagnosemittel verwendet werden können.

In den vergangenen Jahren wurde bekannt, daß Mikroorganismen, die zu den Genera Alternaria, Cochliobolus, Pellicularia und Curvularia (japanische Patentschrift Kokai Nr. 99 192/1982) und dem Genus Bacillus (ibid. No. 179 488/1983) gehören, Peroxidase erzeugen, die als klinisches Diagnosereagens verwendet werden kann. Diese Stämme erzeugen jedoch nur kleine Mengen an Peroxidase, so daß sie für eine kommerzielle Produktion ungeeignet sind.

Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, einen Mikroorganismus zur Verfügung zu stellen, der Peroxidase zur Verwendung als klinisches Diagnosereagens mit ausgezeichneten Eigenschaften in großer Menge in einer Kulturbrühe herstellt.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 gelöst.

Die Peroxidase, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird, wirkt zur Katalysierung der Farbentwicklung von Wasserstoff liefernden Chromogenen, wie dem 4-Aminoantipyrin (nachfolgend als 4-AA bezeichnet)/Phenol-System, dem 4-AA/Dimethylanilinsystem, dem 4-AA/N-Ethyl-N-hydroxyethyl-m-toluidin (nachfolgend als EHMT)-System und dem 3-Methyl-2-benzothiyzolinonhydrazon (nachfolgend als MBTH bezeichnet)-System, und zwar in Gegenwart von Wasserstoffperoxid. Diese Peroxidase kann daher als klinisches Diagnosereagens verwendet werden.

Der Mikroorganismus Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM BP-648), der zur Klasse der Basidiomyceten gehört, wurde aus dem Fruchtkörper isoliert, der büschelartig auf Kuhmist in Ootsu City, Shiga Prefecture, Japan, wuchs, wobei die physikalischen Eigenschaften des Fruchtkörpers und seiner Sporen wie folgt sind:

Die physikalischen Eigenschaften des Fruchtkörpers und der Sporen dieses Stammes, K-1330, sind wie folgt:
Kappe 2 bis 5 cm breit, 1,5 bis 4,5 cm hoch, im unreifen Zustand zylindrisch bis konisch und dann glockenförmig. Zunächst ist die Oberfläche grau und mit reinweißen weichen Haaren bedeckt, die dann abfallen, worauf die Oberfläche glatt wird. Die Kappe ist radial von der Spitze bis zum Rand gefurcht und am Rand unregelmäßig zerklüftet. Während des Wachstums rollen die Lamellen nach oben und beginnen sich aufzulösen. Die Lamellen sind dicht.
Stängel 3 bis 10 cm hoch, weiß. Das Substratum ist gequollen und verlängert sich fein als eine Pseudorhiza (3 bis 5 cm lang).
Sporenellipsoid, glatt, 11 bis 15 × 6 bis 8 µ.
Sporendruck schwarz. Lebt auf Düngerhaufen und Rindermist.

Dieser Stamm wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-648 hinterlegt.

Die Erfindung wird nachfolgend näher unter teilweiser Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert.

Es zeigt

Fig. 1 eine graphische Darstellung, welche die Aktivitäts-pH-Beziehung der erfindungsgemäß erhaltenen Peroxidase wiedergibt.

Fig. 2 die Aktivität-pH-Beziehung dieses Enzyms nach einer Behandlung bei 37°C während 60 Minuten sowie bei verschiedenen pH-Werten.

Fig. 3 die Aktivität-Temperatur-Beziehung dieses Enzyms.

Fig. 4 die Aktivität-Temperatur-Beziehung dieses Enzyms nach einer Behandlung bei pH 7 während 10 Minuten sowie bei verschiedenen Temperaturen.

Fig. 5 das sichtbare Absorptionsspektrum dieses Enzyms (Enzymkonzentration 0,057%; pH 7,0).

Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren näher beschrieben. Jede bekannte Nährmittelquelle kann dem Kulturmedium zugesetzt werden, wenn der verwendete Stamm diese zur Erzeugung von Peroxidase verbrauchen kann. Als Kohlenstoffquelle kommen beispielsweise Glukose, Stärke, Rohrzucker, Maltose, Lactose, Glyzerin, Dextrin, Öle und Fette oder dergleichen in Frage. Als Stickstoffquelle kann man Hefeextrakt, Pepton, entfettete Sojabohnen, Maisflüssigkeit, Fleichextrakt oder dergleichen verwenden. Auch anorganische Substanzen und Metallsalze, wie Phosphate, Kaliumsalze, Magnesiumsalze oder dergleichen, können zugesetzt werden. Besonders geeignet ist die Zugabe von Eisensalzen (beispielsweise Eisensulfat, Eisenchlorid, Eisennitrat etc.), da dabei die Erzeugung der Peroxidase merklich gesteigert wird. Die Menge an derartigen Eisensalzen liegt gewöhnlich zwischen 0,01 und 0,50% (Gew./Vol.), vorzugsweise zwischen 0,08 und 0,20% (Gew./Vol.).

Beim Züchten des zu dem Genus Coprinus gehörenden Stammes hängt der Ausstoß von Peroxidase weitgehend von den Züchtungsbedingungen ab. Im allgemeinen beträgt die Züchtungstemperatur vorzugsweise 20 bis 30°C, der pH des Kulturmediums vorzugsweise 4 bis 8 und die Erzeugung der Peroxidase erreicht ein Maximum im Falle einer Belüftungs/Rühr-Kultur während einer Zeitspanne von 4 bis 12 Tagen. In diesem Falle sollten natürlich die Züchtungsbedingungen so eingestellt werden, daß ein maximaler Ausstoß an der Peroxidase entsprechend dem jeweiligen Stamm und der Mediumzusammensetzung erzielt wird. Die durch den erfindungsgemäßen Mikroorganismus erzeugte Peroxidase liegt hauptsächlich in dem Filtrat der Kulturbrühe vor und wird als Niederschlag durch Zugabe von 20 bis 80% (Gew./Vol.) eines Ausfällungsmittels abgetrennt, beispielsweise Ammoniumsulfat oder 50 bis 80% (Gew./Vol.) eines organischen Lösungsmittels, wie Alkohol oder Azeton, zu dem Filtrat der Kulturbrühe. Der erhaltene Niederschlag wird durch Ultrafiltration, Dialyse oder Sephadexbehandlung unter Gewinnung einer rohen Enzymlösung entsalzt. Zur Reinigung der erhaltenen rohen Enzymlösung wird die Lösung wie folgt behandelt: Die Lösung wird an einer DEAE-Sepharose CL-6B-Kolonne, die zuvor mit 0,01M Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert worden ist, adsorbiert und das adsorbierte Material wird mit 0,02M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,0) zum Sammeln einer aktiven Fraktion eluiert. Diese aktive Fraktion wird dann durch Ultrafiltration konzentriert und entsalzen, erneut an einer DEAE-Sepharose CL-6B-Säule, die mit 0,01M Phosphatpuffer (pH 7) gepuffert worden ist, adsorbiert und das adsorbierte Material wird mit 0,02M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 0,05M Phosphatpuffer (pH 7) zur Sammlung einer aktiven Fraktion eluiert. Diese aktive Fraktion wird dann gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet zur Gewinnung eines gereinigten Enzympulvers. Dieses Enzympulver zeigt bei einer Polyacrylamidgelscheibenelektrophorese eine einzige Bande.

Die enzymologischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Peroxidase sind wie folgt:

1. Wirkung

Dieses Enzym wirkt auf Wasserstoffperoxid sehr spezifisch zur Katalysierung der Oxidation von verschiedenen Verbindungen, die Wasserstoffdonatoren in Gegenwart von Wasserstoffperoxid werden können.

Der Reaktionsmechanismus ist wie folgt:

H₂O₂ + AH₂ → 2 H₂O + A

worin AH₂ einen Wasserstoffdonator bedeutet und A einen oxodierten Wasserstoffdonator darstellt.

Spezifität für Wasserstoffdonatoren

Die Spezifität dieses Enzyms für Wasserstoffdonatoren, hergestellt durch Kombination von 4-AA mit verschiedenen Verbindungen, wurde untersucht (Tabelle 1).

Tabelle 1

Ferner wurde die Spezifität dieses Enzyms für Wasserstoffdonatoren, hergestellt durch Vereinigung von MBTH mit Dimethylanilin, Diethylanilin oder EHMT, untersucht (Tabelle 2). Bei diesem Test wurde der Aktivitätswert von 4-AA/Phenol, dem als Vergleich verwendeten Wasserstoffdonator, zu 100 genommen.

Tabelle 2

3. Optimaler pH und pH-Stabilität

Dieses Enzym besitzt eine sehr hohe Aktivität in der Nähe eines pH von 7,0, wie aus der Fig. 1 hervorgeht. Eine Azetatpufferlösung wird für einen pH von 3 bis 3,5 verwendet, eine Phosphatpufferlösung für einen pH von 6 bis 8,5 und eine Boratpufferlösung für einen pH von 9 bis 9,5. Diese pH-Stabilität dieses Enzyms geht, falls dieses Enzym bei 37°C während 60 Minuten sowie bei verschiedenen pH-Werten behandelt wird, aus Fig. 2 hervor. Wie aus Fig. 2 ersichtlich ist, ist dieses Enzym stabil zwischen einem pH von 6,0 und 7,5.

4. Optimale Temperatur und Thermostabilität

Dieses Enzym besitzt eine optimale Temperatur in der Nähe von 35 bis 40°C, wie aus der Fig. 3 hervorgeht. Die Thermostabilität dieses Enzyms geht dann, wenn es 10 Minuten lang bei einem pH von 7,0 sowie bei verschiedenen Temperaturen behandelt wird, aus Fig. 4 hervor. Dieses Enzym ist stabil bis 45°C.

5. Molekulargewicht

Das Molekulargewicht dieses Enzyms beträgt ungefähr 37 000, ermittelt durch die Gelfiltrationsmethode mit Sephacryl S-200 (erzeugt von der Pharmacia), und ungefähr 41 000, ermittelt durch die SDS-Polyacrylamidgelelektrophoresemethode.

6. Homogenität

Eine Scheibenelektrophorese wurde unter Verwendung eines 7,5% Polyacrylamidgels (pH 9,4) durchgeführt und das Protein angefärbt. Eine gefärbte Bande des Proteins wird festgehalten. Eine einzelne Bande wird ebenfalls durch die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese ermittelt.

7. Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt dieses Enzyms, gemessen durch die isoelektrische Fokussierungsmethode mit Pharmalyte (pH 3 bis 10, erzeugt von Pharmacia), beträgt 3,4 bis 3,5.

8. Wirkungen von Inhibitoren, Metallionen und Metallchelierungsmitteln

Dieses Enzym wird durch Hg²⁺, Kaliumcyanid, Natriumazid, Thioharnstoff etc. (Tabelle 3) inhibiert.

Tabelle 3

9. Sichtbares Absorptionsspektrum

Dieses Spektrum geht aus Fig. 5 hervor.

10. Messung der enzymatischen Aktivität

Die Peroxidaseaktivität wird an dem 4-AA/Phenolsystem gemessen, das in der klinischen Diagnose als Wasserstoffdonator eingesetzt wird. Dies bedeutet, daß die Reaktion bei 37°C während 60 Sekunden unter Verwendung von 0,3 ml einer Reaktionslösung aus 0,1 ml einer 5 mM Wasserstoffperoxidlösung, 1,0 ml einer 0,3 M-Phosphatpufferlösung (pH 7,0), 0,1 ml einer 24,6 mM 4-AA-Lösung, 0,1 ml einer 0,42 M- Phenollösung, 1,6 ml Wasser und 0,1 ml der Enzymlösung in entsprechender Verdünnung durchgeführt wird, wobei die Absorption bei 500 nm gemessen wird (OD _Probe). Getrennt werden 0,1 ml Wasser als Vergleich anstelle der Wasserstoffperoxidlösung zugesetzt und die Absorption in der gleichen Weise wie vorstehend (OD _blind) gemessen, wobei der Unterschied zwischen OD _Probe und OD _blind, Δ OD₅₀₀, erhalten wird. Die Peroxidaseaktivität wird durch die folgende Gleichung errechnet:

Vt:Volumen der Reaktionslösung (3,0 ml)Vs:Volumen der Enzymlösung (0,1 ml) 6,17:Molekularextinktionskoeffizient pro Millimol eines Chinoniminfarbstoffs
bei 500 nm (cm²/Mokromol) t:Reaktionszeit (1 Minute) df:Verdünnungsrate

Experimentelles Beispiel Wirkung von Eisensalzen auf die Erzeugung von Peroxidase

100 ml eines Mediums, das 2% Glucose, 0,3% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,3% KH₂PO₄, 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O enthält, werden in jeweils 500 ml-Erlenmeyerkolben gegeben und FeSO₄ · 7 H₂O wird den Kolben zugesetzt, so daß die jweiligen Konzentrationen 0%, 0,04%, 0,08%, 0,12%, 0,16%, 0,20%, 0,24% und 0,32% betragen. Nach einer Sterilisation bei 120°C während 20 Minuten werden die Kolben abgekühlt, mit Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM BP-648) beimpft, bei 26°C während 5 bis 10 Tagen unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 100 Upm gezüchtet, wobei gelegentlich Proben gesammelt werden. Die dabei erhaltenen Kulturbrühen werden zur Entfernung von Myzeln filtriert und die Peroxidaseaktivität (maximale Aktivität) eines jeden erhaltenen Filtrats gemessen. Das Ergebnis geht aus der Tabelle 4 hervor.

Tabelle 4

Wie aus der Tabelle 4 hervorgeht, wird der Ausstoß an Peroxidase merklich durch Zugabe des Eisensalzes zu dem Medium erhöht. Die optimale Konzentration an FESO₄ · 7 H₂O beträgt 0,12 bis 0,20%.

Ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Peroxidase wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert, wobei jedoch die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.

Beispiel 1

Ein Schräg-Medium, das 2% Glukose, 0,5% Ebios und 1,5% Agar (Ebiosmedium) enthält, wird mit Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM BP-648) beimpft und gezüchtet, während es noch auf 25°C während einer Woche gehalten wird, wobei eine Impfkultur gewonnen wird. Getrennt davon werden 100 ml eines Mediums, das 2% Glucose, 0,3% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,3% KH₂PO₄ und 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O enthält, einem 500-ml-Erlenmeyerkolben zugesetzt. Nach einer Sterilisation bei 120°C während 20 Minuten wird abgekühlt und mit der vorstehend beschriebenen Impfkultur beimpft. Anschließend wird das Züchten bei 27°C während 10 Tagen unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 100 Upm durchgeführt. Nach Beendigung dieser Züchtung werden die Myzeln durch Filtration entfernt, wobei ein Filtrat erhalten wird. Die Peroxidaseaktivität dieses Filtrats beträgt 20,0 Einheiten/ml.

Beispiel 2

100 ml eines Mediums, das 2% Glucose, 0,3% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,3% KH₂PO₄ und 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O enthält, wie zuvor einem 500-ml-Erlenmeyerkolben zugesetzt und bei 120°C während 20 Minuten sterilisiert, werden mit Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM BP-648) beimpft, gezüchtet in dem Ebiosmedium von Beispiel 1, worauf ein Züchten bei 26°C während 7 Tagen zur Gewinnung einer Impfkulturbrühe erfolgt. Getrennt davon werden 20 l eines Mediums, das 2% Glucose, 0,3% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,3% KH₂PO₄, 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O, 0,005% CuSO₄ · 5 H₂O und 0,02% eines Entschäumungsmittels (CB-442, erzeugt von Nippon Yushi Co.) enthält, einem 30-l- Fermentationsgefäß zugesetzt und bei 120°C 20 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das Medium mit 100 ml der vorstehend beschriebenen Impfkulturbrühe beimpft und bei 26°C während 6 Tagen unter solchen Bedingungen gezüchtet, daß die Belüftungsgeschwindigkeit 13 l pro Minute beträgt. Die Rührgeschwindigkeit beträgt 270 Upm. Nach Beendigung des Züchtens werden die Myzeln durch Filtration zur Gewinnung eines Filtrats entfernt. Die Peroxidaseaktivität dieses Filtrats beträgt 41,5 Einheiten/ml. Ammoniumsulfat wird dann zu 17 l dieses Filtrats zur Gewinnung einer 80%igen Sättigung zugesetzt. Nach einem Stehenlassen während eines ganzen Tages und einer Nacht wird der erhaltene Niederschlag in ungefähr 500 ml eines 0,01 M-Phosphatpuffers (pH 7,0) aufgelöst. Die rohe Enzymlösung, die auf diese Weise erhalten worden ist, wird konzentriert und durch Ultrafiltration entsalzen und an einer Säule (Durchmesser 5,0 cm und Länge 4 cm) aus DEAE-Sepharose CL-6B, zuvor gepuffert mit 0,01 M-Phosphatpuffer (pH 7,0), adsorbiert. Die Säule wird mit 0,02 M-Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 0,1 M-Phosphatpuffer (pH 7,0) zur Sammlung einer aktiven Fraktion eluiert. Diese aktive Fraktion wird dann konzentriert und durch Ultrafiltration entsalzen und erneut an einer Säule (Durchmesser 2,5 cm und Länge 4 cm) aus DEAE- Sepharose CL-6B, gepuffert mit einer 0,01 M-Phosphatpufferlösung (pH 7,0), adsorbiert. Die Säule wird mit 0,02 M-Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 0,05 M- Phosphatpuffer (pH 7,0) zum Sammeln einer aktiven Fraktion eluiert. Die aktive Fraktion, die auf diese Weise erhalten wird, wird gegen destilliertes Wasser dialysiert und zur Gewinnung von 494 mg eines gereinigten Enzympulvers gefriergetrocknet. Die spezifische Aktivität dieses Pulvers beträgt 1180 Einheiten/mg. Dieses Enzympulver zeigt eine einzige Bande bei der Polyacrylamidgelscheibenelektrophorese. Die vorstehend beschriebenen Reinigungsstufen gehen aus der Tabelle 5 hervor.

Tabelle 5

Beispiel 3

100 ml eines Mediums, das 2% Glucose, 0,3% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,3% KH₂PO₄, 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,16% FeSO₄ · 7 H₂O enthält und in der vorstehend beschriebenen Weise einem 500-ml-Erlenmeyerkolben zugesetzt und bei 120°C während 20 Minuten sterilisiert worden ist, wird mit Coprinus macrorhizus K-1330 (FERM BP-648), gezüchtet in dem Ebiosmedium von Beispiel 1, beimpft. Die neue Kultur wird bei 26°C während 10 Tagen unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 100 Upm gezüchtet. Nach Beendigung des Züchtens werden die Myzeln durch Filtration zur Gewinnung eines Filtrats entfernt. Die Peroxidaseaktivität dieses Filtrats beträgt 79,4 Einheiten/ml.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Peroxidase durch Züchten eines Mikroorganismus und Isolieren der erzeugten Peroxidase aus der erhaltenen Kulturbrühe, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Coprinus macrorhizus FERM BP-648 züchtet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus in einem Kulturmedium züchtet, welches ein Eisensalz enthält.