JPS585035B2 - ペルオキシダ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物によるペルオキシダーゼの製造法、更に
詳しくは微生物起源のペルオキシダーゼ特に４−アミノ
アンチピリン−フェノール系、４−アミンアンチピリン
−ジメチルアニリン系、又は４−アミンアンチピリン−
ジエチルアニリン系を水素供与体として発色する新しい
ペルオキシダーゼの製造法に関する。

ペルオキシダーゼは、過酸化水素の存在下で種種の化合
物を酸化する酵素であり、近年臨床診断試薬としてグル
コース、総コレステロール、遊離型コレステロール、リ
ン脂質および尿酸の定量に種々のオキシダーゼと共に使
用されると共に、酵素免疫試験法における標識酵素とし
ても使用されている。

従来これら試薬に配合されるペルオキシダーゼとしては
、専らその給源として大根、西洋ワサビ等の植物が用い
られているにすぎない。

微生物起源のペルオキシダーゼも一部知られているが、
之等は植物起源にみられるような非特異的なペルオキシ
ダーゼではなく、特異的な水素供与体に作用するペルオ
キシダーゼである。

即ち２等公知のペルオキシダーゼは細菌および糸状菌の
生産するチトクロームＣペルオキシダーゼやＮＡＤＨ−
ペルオキシダーゼであり、これらは臨床診断試薬に配合
するには特異性からみて不適当である。

又近年Ｏ−ジアニシジンを水素供与体とするペルオキシ
ダーゼが大腸菌及びミロセシウム属に属する微生物から
生産されたがＯ−ジアニシジンは発癌性作用を有するた
め労働衛生上その臨床的使用は回避される傾向にあり、
やはり上記診断試薬としての使用には適していない。

本発明者らは、上記現状に鑑み臨床診断試薬および酵素
免疫試験法に供し得る性質を有するペルオキシダーゼを
、増殖が速く、植物に比し大量生産が可能な微生物中に
見い出し得るならば、産業上有益であるとの見地から鋭
意研究を行ったところ、臨床診断試薬に多く用いられて
いる４−アミノアンチピリン（以降４−ＡＡと記す）−
フェノール系、４−ＡＡ−ジメチルアニリン（ＤＭＡ）
系、４−ＡＡ−ジメチルアニリン（ＤＥＡ）系等の発色
剤により呈色するペルオキシダーゼを生産する菌種があ
る種の微生物に存在することを発見した。

本発明は上記新しい発見に基づいて完成されたものであ
る。

即ち本発明はアルタナリア属、コクリオボラス属、ペリ
キュラリア属およびカーブラリア属に属し、ペルオキシ
ダーゼ生産能を有する微生物を栄養培地に培養し培養物
中にペルオキシダーゼを生成蓄積せしめ、これを採取す
ることを特徴とするペルオキシダーゼの製造法に係る。

本発明者らは広範囲にわたる菌株を固体培養又は振盪培
養して、その培養物につき之等を過酸化水素の存在下に
おける４−ＡＡ−フェノール系又は４−ＡＡ−ＤＭＡ系
での発色の有無を検索した。

すなわち固体培養の場合は、皺に８０％の水を散水し加
圧殺菌後者菌株より１白金耳を植菌し３０゜で４〜６日
間培養し、培養終了後水で酵素を抽出してその抽出液を
試験に供した。

振盪培養においては、グルコース、ペプトンを主栄養源
とした培養液を坂口氏コルベンに入れ加圧殺菌後者菌株
より１白金耳を植菌し３０°で４〜６日間振盪培養しそ
の上清液又はＦ液を試験に供した。

また上記発色の有無は０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ５，
６）１ｍｌ、０．０８％４−ＡＡ溶液０．５ｍ１０．４
％フェノール溶液０．５ｍｌ及び０．１５％過酸化水素
溶液１ｍｌの混合液に上記試験液１ｍｌを加え、３０°
で作用させることにより検討した。

その結果下記第１表に示すように、特定の属に属する公
知の各種微生物に、目的とする発色を示すものが存在し
従って２等微生物の培養によって所望のペルオキシダー
ゼが収得できることを見い出した。

上記アルタナリア属、コクリオボラス属、カーブラリア
属及びペリキュラリア綱に属するペルオキシダーゼ生産
菌の培養は、通常の栄養物及び添加物を含有する合成培
地又は天然培地で行ない得る。

炭素源としてはグルコース、マルトース、サッカローズ
、ガラクトース、フラクトース、キシロース、マンノー
ズ、ラフイノーズ、可溶性澱粉、液化澱粉、糖蜜、グリ
セロール、ソルビトール、クエン酸、コハク酸等の一般
的に使用されるものがいずれも使用できる。

窒素源としてはペプトン、酵母エキス、脱脂大豆、カゼ
イン、肉エキス、カザミノ酸、コーンスチープリカー等
の天然窒素源の他更に硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無機窒素
が使用できる。

この他必要に応じリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄
、硫酸鋼、硫酸亜鉛、塩化鉄、塩化コバルト、塩化マン
ガン等の無機塩およびビタミン等も微量栄養源として使
用できる。

これらの培地成分は培養すべき各微生物の生育を阻害し
ない濃度で用いられ、これは夫々の微生物により若干相
違するが通常の振盪培養又は通気攪拌培養にあっては一
般的に炭素源は０．１〜１０重量％、好ましくは０．５
〜７重量％、窒素源は０．０１〜８重量％、好ましくは
０．１〜５重量％の濃度とするのがよい。

また培地のｐＨは３〜１０、好ましくは４〜８とし、培
養温度は１５〜３８℃、好ましくは２０〜３３℃とする
のがよく、培養は通常約２〜ＩＯ日間で行なわれる。

一方固体培養は５０〜１２０重量％の水を加えた皺や脱
脂大豆粉等を用い、１５〜３８℃、好ましくは２０〜３
５℃以下に約３〜１０日間で行なわれる。

この場合必要に応じて培地中に前記炭素源、窒素源およ
び微量栄養源等を加えることもできる。

上記培養により培養物中に所望のベルオキシダ−ゼが産
生蓄積される。

ここで培養物とは液体増養においては、生産された菌体
および培養上澄液もしくは培養Ｆ液を意味し、固体培養
においては菌体の繁殖した培地を意味する。

これら培養物からペルオキシダーゼを採増する方法は、
常法に従えばよく、例えば液体培養の場合は培養終了後
の培養液より遠心分離および濾過などにより菌体および
不溶物を除去して粗酵素液を得る。

更に菌体中に含まれるペルオキシダーゼは磨砕又は超音
波等の手段により菌体を破壊して酵素を抽出することに
より粗酵素液を得る。

或は菌体を含む培養液をそのまま超音波処理することに
より菌体を破壊したのち不溶物を除去して粗酵素液を得
ることも可能である。

固体培養の場合は培養物の２〜１０倍（重量に対して）
の水で抽出した抽出液を粗酵素液として使用できる。

またこれらの方法により得られた粗酵素液の精製操作も
通常の方法に従えばよく、例えば硫酸アンモニウム分画
沈殿法、透析、吸着剤による分別法、有機溶媒分別法、
等電点沈殿法および各種イオン交換体によるカラムクロ
マトグラフィーなどを単独に或は組合せて利用できる。

かくして精製されたペルオキシダーゼを収得する。

本発明におけるペルオキシダーゼ活性の測定は水素供与
体として臨床診断試薬に用いられる４−ＡＡ−フェノー
ル系を使用して行った。

すなわち０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５，６’） Ｌｒ
ｕｌに０．０８％４−ＡＡ溶液０．５ ｍｌ、０．４％
フェノール溶液０．５ ｍｌ及び０．０１５％過酸化水
素溶液１ｍｌを加え３０℃に予熱後、これに酵素液１ｍ
ｌを加えて１５分間反応させ直ちに５１０ｎｍの波長で
その吸光度を測定する。

別に対照として過酸化水素溶液の代わりに水をｉｍｌ加
え同様の操作によって吸光度を測定する。

上記対照試験と本試験とにおける吸光度の差が０．１増
加する場合を１単位とした。

尚本測定法における反応液の吸収スペクトルを本発明の
微生物起源のペルオキシダーゼ（図中曲線ｌ）と、従来
の植物起源のペルオキシダーゼ（図中曲線２）とにつき
比較した結果、第１図に示す通り最大吸収帯は共に波長
５１０ｎｍであった。

従って本発明による微生物起源のペルオキシダーゼは植
物性ペルオキシダーゼに代り臨床検査試薬に使用し得る
ことが判明した。

次に本発明で得られたペルオキシダーゼの酵素化学的性
質を示す。

（１）作用特異性； 本酵素は過酸化水素に極めて特異的に作用し、過酸化水
素の存在下で種々の水素供与体として機能する化合物の
酸化を触媒する。

その作用機構は次式に示す通りである。

〔但し式中ＡＨ２は水素供与体を、またＡは酸化された
水素供与体を示す。

〕（２）水素供与体に対する特異性、 下記第２表に示す通りでありフェノールを始めとする数
種の化合物には強力に作用するが、ｏ−トリジン等に対
しては作用し得ない。

（３）至適ｐＨ； ｐＨ４，０〜１０の範囲はブリトンーロビンソンのユニ
バーサル緩衝液（０，０４Ｍリン酸−０，０４Ｍ酢酸−
０，０４Ｍ硼酸と０．２Ｍ苛性ソーダの混合液）を使用
し、ｐＨ３，０〜４．５の範囲はゼーレンゼン緩衝液（
０，１Ｍ第２クエン酸ナトリウムと０．１Ｎ塩酸の混合
液）を使用して、活性測定と同様の配合比率で検討した
。

その結果を第２図および第３図に示す。

但し第２図は実施例３で得たコクリオボラス属ペルオキ
シダーゼの至適ｐＨを、また第３図は実施例５で得たペ
リキュラリア属ペルオキシダーゼの至適ｐＨを夫々示す
ものである。

２等容図に示すように微生物の種類により至適ｐＨは変
動する。

（４）至適作用温度； ２０〜７０℃における酵素活性を測定した結果を第４図
に示す。

（５）ｐＨ安定性； 酵素液１０ｍ１を０．１Ｎ塩酸溶液および０．１Ｎ苛性
ソーダ溶液を用いてｐＨ４，０〜１０．０に調整し水を
加えて１５ｍ１とした後３０℃に１７時間放置した。

酵素活性測定時に０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５，６）
５ｍｌに処理酵素液５ｙｄを加え供試酵素液とした。

その結果は第５図に示す通りである。

（６）温度安定性； ０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５，６）５ｍｌに酵素液
５ｍｌを加えて調製した酵素液を、２０〜８０℃の温度
に３０分間保ち処理後直ちに氷水で１０分間冷却した後
残存酵素活性を測定した。

その結果を第６図に示す。

（７）力価の測定法； 前述した通りである。

（８）分子量； 食塩０．１５Ｍ濃度を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）で平衡化したセアデツクスＧ−７５（スウェ
ーデン、ファルマシア社製）を用いたゲル濾過クロマト
グラフィーにより分子量を測定した。

その結果を第７図に示す。該図より本発明によるペルオ
キシダーゼ５は分子量２８．０００であることがわかる
。

尚図中１はリボヌクレアーゼＡを、２はキモトリグシノ
ーゲンＡを、３はオボアルブミンを及び４はアルブミン
を示す。

（９）等電点 ｐＨ３，５〜ｐＨ１０，０のキャリアーアンホライトを
用い４０時間４００■通電して等電点分画を行なった。

その結果は第８図に示す通りであり、本発明によるペル
オキシダーゼの等電点は、ｐＨ７，２５であった。

尚第８図中１は酵素活性を、また２はｐＨを示す。

尚上記（１）〜（９）に示す酵素化学的性質のうち（１
）は本発明で得られる各菌種の産生するペルオキシダー
ゼに共通の性質であるが、（２）以降の各項の性質は各
菌株により若干相違しており、（３）は前述した通り２
種の微生物起源のペルオキシダーゼにつき表示したが（
２）及び（４）〜（９）に示す性質は実施例５で得られ
たペルオキシダーゼについて示した。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 １ 皺２０ｇに水１６ｍ１を加えよく混合したものを２００
ｍ１容三角フラスコに入れ１２０℃で３０分間殺菌後、
アルタナリア・ソラニＩＦＯ７５１７の１白金耳を植菌
し３０℃で６日間培養を行う。

培養終了後水を加え時々攪拌しながら３０℃に１時間抽
出を行い、濾紙で濾過し粗酵素液を得る。

この場合ペルオキシダーゼの活性は皺１ｇ当り３単位で
あった。

実施例 ２ 実施例１に準じカーブラリア・コイシイスＩＦＯ７２７
９を同様に培養した結果、ペルオキシダーゼの活性は皺
１ｇ当り２．５単位であった。

実施例 ３ 皺３５０ｇに水３８５ｍ１を加えよく混合したものをバ
ット（４５×２５×５ｃｍ）に入れ１２０℃で３５分間
殺菌し、予め１００ｍ１容三角フラスコに同組成の培地
で６日間培養したコクリオボラスミャビアナスＩＦ０４
８７０を中種として植菌し、３０℃で４日間培養し培養
物６００ｇを得る。

これに１２００ｍ１の水を加え３０℃で２時間抽出した
後吸引濾過を行って抽出液１０１００Ｏを得た。

次いで抽出液に対して硫酸アンモニウム２０〜６５重量
％を添加して生ずる沈殿を濾過助剤を加えて吸引濾過し
て塩析し沈殿物を捕集する。

この区分を通風乾燥し、粉末４０ｇを得た。

この粉末の活性は９０単位／ｇであった。

実施例 ４ グルコース３％、ペプトン２％、コーンステイブリカー
０．３％、塩化第二鉄Ｍ／２０００の組成の液体培養液
（ｐＨ６，０）を５００ｍ１容坂口氏コルベンに５０ｍ
１入れ、１２０℃、３０分間殺菌後コクリオボラス・ゲ
ニキュラタＩＦＯ６２８３の１白金耳を植菌し、３０℃
で６日間振盪培養した後濾紙で濾過し粗酵素を得た。

この場合のペルオキシダーゼ活性は６単位／ｍｌであっ
た。

実施例 ５ 実施例４と同組成の液体培養液（ｐＨ６，０）１０１を
３０１容ジヤーフアメンターに仕込み、１２０℃４０分
間殺菌後、ペリキュラリア・フィラメントサＩＦＯ６５
２３を予め同組成で４日間振盪培養を行った培養液５０
ｍ１を植菌し、３０℃通気量０．２５ｖ、ｖ、ｍの条件
で通気攪拌培養を行った。

培養液を吸引濾過し菌体と濾液に分ける。

菌体は水洗後その１部１０ｇをとり０．０１ＭＩＪン酸
緩衝液（ｐＨ６，０）２０ｍｌと海砂とを加え冷却下で
磨砂した後同緩衝液を加え全容１００ｍ１とし、１００
００ｒ、ｐ、ｍ、１５分の遠心分離を行って上澄液を得
た。

この場合ペルオキシダーゼ活性は使用菌体１ｇ当り２単
位であった。

一方濾液９１は限外濾過（ダイヤフィルターＧ−１０Ｔ
膜を使用）を行い２１に濃縮した後、硫酸アンモニウム
４５重量％を加え生ずる塩析物を濾過助剤を加えて吸引
濾過で捕集し、塩析物は０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
６，０）２００ｍｌに溶解しセロファンチューブを用い
て０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）に対して透析
し硫酸アンモニウムを除去する。

この透析内液を予め０．０２Ｍリン酸緩衝液（声６．０
）で平衡化したＳＰ−セファデックスＣ−５０（スウェ
ーデン ファルマシア社製）のカラムに通じペルオキシ
ダーゼを吸着せしめ、同緩衝液で洗浄した後食塩濃度０
〜１．０Ｍの範囲でイオン強度を連続的に変化させて溶
出しペルオキシダーゼ活性の強い画分を集めてセロファ
ンチューブを用いて純水に対し透析し、透析内液をコロ
ジオン膜で濃縮した。

次いでバイオゲルＰ２（米国、バイオラド社製）カラム
（１，８×１４０ｃｍ）につめ、展開溶媒として食塩０
．１４Ｍを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）
を用いてゲル濾過を行った。

その結果の１例を第９図に示す。

該図において１は各分画における酵素活性／ｍｌを、２
は蛋白量（Ｅ２８０ｎｍ）を夫々示す。

上記ゲル濾過操作を繰り返しペルオキシダーゼ活性の認
められる分画区分２００ｄを採取し、セロファンチュー
ブを用いて純水に対し透析した。

透析内液をコロジオン膜で濃縮した後凍結乾燥し、ペル
オキシダーゼ粉末を得た。

培養濾液からの活性収率は３５％であり、１ｍｇ当り３
２８．９単位であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明ペルオキシダーゼの発色試験における各
波長での吸光度を調べたグラフ、第２図及び第３図は夫
々コクリオボラス属及びペリキュラリア属起源の本発明
ペルオキシダーゼの至適−を示す図、第４図は本発明ペ
ルオキシダーゼの至適温度を示す図、第５図及び第６図
は本発明ペルオキシダーゼのｐＨ安定性及び熱安定性を
示す図、第１図はゲル濾過クロマトグラフィーによる本
発明ペルオキシダーゼの分子量を求めた図、第８図は等
電点分画による本発明ペルオキシダーゼの等電点を求め
た図及び第９図はバイオゲルＰ２を用いたゲル濾過によ
るペルオキシダーゼの活性分画を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アルタナリア属、コクリオボラス属、ペリキュラリ
   ア属およびカーブラリア属に属し、ペルオキシダーゼ生
   産能を有する微生物を栄養培地に培養し培養物中にペル
   オキシダーゼを生成蓄積せしめ、これを採取することを
   特徴とするペルオキシダーゼの製造法。