JPS6013670B2 - ペルオキシダ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はオィディオデンドロン属に属する、ベルオキシ
ダーゼ生産菌を用いてベルオキシダーゼを製造する方法
に関する。

ベルオキシダーゼは過酸化水素の存在下で種々の化合物
を酸化する酵素であり、近年臨床診断試薬としてグルコ
ース、総コレステロール、遊離型コレステロール、リン
脂質および尿酸の定量に種々のオキシダーゼと共に使用
されるほかに、酵素免疫試験法における標識酵素として
も使用されている。

従来これら試薬に配合されるベルオキシダーゼとしては
、専らその給源として大根、西洋ワサビ等の植物が用い
られている。

微生物起源のベルオキシダーゼも一部知られているが、
これらは植物起源のものにみられるような非特異的なべ
ルオキシダーゼではなく、特定の水素供与体にのみ作用
するベルオキシダーゼである。即ちこれらは細菌および
糸状菌の生産するチトク。ームＣベルオキシダーゼやＮ
ＡＤＨーベルオキシダーゼであり、その特異性からみて
臨床診断試薬として利用するには不適当である。又、近
年ｏージアニシジンを水素供与体とするベルオキシダー
ゼが大腸菌及びミロセシウム属に属する微生物から生産
されたが、ｏージアニシジンは発漣性作用を有するため
労働衛生上その臨床的使用は回避される傾向にあり、や
はり上記診断試薬としての使用には適していない。本発
明者らは、上記現状に鑑み臨床診断試薬および酵素免疫
試験法に供し得る性質をするベルオキシダーゼを、増殖
が速く、植物に比し大量生産が可能な微生物中に見出し
得るならば、産業上有益であるとの見地から、該ベルオ
キシダーゼを安定かつ高力価で生産する菌株を広く微生
物界より検索してきた。

その結果先にアルタナリア属、コクリオポラス属、ベル
キュラリア属及びカーブラリア属に属する微生物の培養
物中に上記ベルオキシダーゼが生成蓄積されることを発
見し、これらの微生物を利用したベルオキシダーゼの製
造方法を確立した（特公昭５８−５０３５号参照）。本
発明者らは引き続きベルオキシダーゼ生産菌の検索を進
めた結果、新たにオィデイオデンドロン属に属する菌株
が所望のベルオキシダーゼを安定してかつ大量に生産す
ることを発見し、しかも、このベルオキシダーゼは臨床
診断試薬に多く用いられている４ーアミノアンチピリン
（以降４−ＡＡと記す）−フェノール系及び３−メチル
−２ーベンゾチアゾリノンヒドラゾン（以降Ｍ旧ＴＨと
記す）ージメチルアニリン系などを水素供与体とて発色
するベルオキシダーゼであり、診断試薬等としての利用
に非常に好適であることを発見した。

本発明は上記の新しい知見に基づいて完成されたもので
ある。即ち本発明はオィディオデンドロン属に属し、ベ
ルオキシダーゼ生産能を有する微生物を栄養塔地に培養
し、培養物中にベルオキシダーゼを生成蓄積せしめ、こ
れを採取することを特徴とするベルオキシダーゼ製造法
に係る。本発明に利用するベルオキシダーゼ生産館を有
する微生物は、オィディオデンドロン属に属するものよ
り選択される。

該オィディオデンドロン属に属する微生物としては、例
えばオィディオデンドロ ン ア ム ビグ ウ ム
（〇ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎａｍｂｉ■ｍｍ）、オイデ
イオデンドロン セレアリス（０ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏ
ｎｃｅｒｅａｌｉｓ）、オイデイオデンドロ ン エ
ヒ ニユ ラ タ ム（０側めｅｎｄｒｏｎｅｃｈｉ
ｎ山ａｔｕｍ）、オイデイオデンドロン グリセウム（
０ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎｇｎｓｅｕｍ）、オイデイオ
デンドロン カーライ（０ｉｄｉＭｅｎｄｒ。ｎｋａｌ
ｒａｉ）、オイデイオデンドロン ピリコラ（０ｊｄｉ
ｏｄｅｎｄｒｏｎｐｉｌｉｃｏｌａ）、オイデイオデン
ドロン シタロイデス（０ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎｓｃ
れａｌｏｉｄｅｓ）、オイデイオデンドロン シンデニ
ア（０ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎｓｉ肘ｅｎｉａ）、オイ
デイオデンドロントルンクタム（０ｉｄｉｏｄｅｎｄｒ
ｏｎｔｍｎｃａｔｕｍ）、オイデイオデンドロン クラ
ミドスポリウム（〇ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎｃｈｉａｍ
ｙｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、オイデイオデンドロン シト
リウム（０ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎｃｉＵｉｎｕｍ）、
オイデイオデンドロ ン フ ラ ブム（０ｉｄｉｏ
ｄｅｎｄｒｏｎＨａｖ机ｍ）、オイデイオデンドロン
マイウス（０ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎｍａｉｕｓ）、オ
イデイオデンドロンべリ コ ニ オイデ ス（０うｄ
ｉｏｄｅｎｄｒｏｎｐｅｒｉｃｏｎｉｏｉｄｅｓ）、オ
イデイオデンドロン ロドゲナム（０ｉｄｉｏｄｅｎｄ
ｒｏｎｒｈｏｄｏｇｅｎｍｍ）、オイデイオデンドロン
テヌウイシマム（０ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎにｎｕｉ
ｓｓｉｍ山ｍ）等を例示することがでる。

これらのうちで特にオィディオデンド。ン セレアリス
及びオィディオデンドロン ヱヒニュラタムに属する微
生物は好適である。好ましい代表的微生物を後記第１表
に示す。尚第１表に示す各菌株は、いずれもアメリカン
タイプ カルチャー コレク シ ョ ン （ Ａｍ
ｅｎｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔ川ｅＣｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ）のカタログ（Ｃａｔａｌｏｇ肥ｏｆｓｔｒａｉｎ
ｓｌ、１９８２）に収載された公３句の寄託菌であり、
該コレクションより入手することがでる。また第１表に
は該表記載の各菌株につき、そのベルオキシダーゼ生産
能を、以下の通り検討した結果を併記する。

即ちグルコース、ベプトン又はカゼイン消化物、を主栄
養源とした培養液（その組成は後記する実施例２と同一
である）を坂口コルベンに入れ加圧殺菌後、これに各菌
株より１白金耳量を楯菌し、２６〜２８００で５〜９日
間振顔培養し、その上清液又は炉液を試験液とし、その
各１の‘を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．６）１の‘
、０．０８％４−ＡＡ溶液０．５肌、０．４％フェノー
ル溶液０．５の【及び０．０３％週酸化水素溶液１の‘
の混合液に加え３０ｑｏで作用させ、１８分後の発色度
合を、光電比色計を用いて波長５１仇肌での吸光度（０
．Ｄ．）を測定することにより検討した。尚発色度合に
おける評価は、上記吸光度測定値に従い以下の通り表示
する。発色度合 −・…・・吸光度が０．０１に満たないもの十・・・・
・・吸光度が０．０１以上、０．１未満のもの日・…・
・吸光度が０．１以上、２未満のもの州・・・・・・吸
光度が２以上のもの第１表 上記第１表に示す通り、オィディオデンドロン属に属す
る公知の微生物に目的とする発色が認められ、特にオィ
ディオデンドロン セレアリスＡＴＣＣ２４４０３及び
オイディオデンドロン ェヒニュラタム ＡＴＣＣＩ６
２８７の発色は著しく、従って優れたベルオキシダーゼ
生産能を有することが判る。

またオィディオデンドロン属に属する寄託菌としては、
上記第１表に示すほかにも例えばオィデイオデンドロ
ン シタ ロイデス ＡＴＣＣ総２１０、オイデイ
オデンドロン クラミドスポリウム ＡＴＣＣ １８４
４８、オイデイオヂンドロン フラブム ＡＴＣＣ３２
３５以 オイデイオデンドロンべリコニオイデス ＡＴ
ＣＣ１８４４９ オイデイオデンドロン ロドゲナム
ＡＴＣＣ ２４４０４ オイデイオデンドロン シトリ
ナム ＩＦＯ９３斑、オイデイオデンドロン テヌウイ
シマム ｍ０６７鞠、オイデイオデンドロン トルンク
タム ＩＦＯ９９５１等が知られている。本発明は上記
各菌株又はそれらの変異株を利用して以下の通り実施さ
れる。

即ち、まず上記徴生物を栄養塔地に培養する。培養は通
常の栄養物及び添加物を含有する合成培地又は天然塔地
で行ない得る。炭素源としてはグルコース、マルトース
、サツ力ローズ、ガラクトース、フラクトース、キシロ
ース、マンノーズ、ラフィ／−ズ、可溶性澱粉、液イＱ
殿粉、糠蜜、グリセロール、ソルビトール、クエン酸、
コハク酸等の一般的に使用されるものをいずれも使用で
きる。

窒素源としてはべプトン、酵母エキス、脱脂大豆、カゼ
イン、肉エキス、カザミ／酸、コーンスチーブリカー等
の天然窒素源の他更に硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素等の無
機窒素を使用できる。この池必要に応じリン酸塩、炭酸
塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸鋼、硫酸亜鉛、塩
化カルシウム、塩化鉄、塩化コバルト、塩化マンガン等
の無機塩およびビタミン等も微量栄養源として使用でき
る。これらの培地成分は培養すべき各微生物の生育を阻
害しない濃度で用いられる。本発明方法は、好ましくは
通常の振函培養又は通気縄梓培養により実施される。

これらの培養にあっては一般的に炭素源は０．１〜１０
重量％、好ましくは０．５〜８重量％、窒素源は０．０
１〜８重量％、好ましくは０．１〜５重量％の濃度とす
るのがよい。また培地のｐＨは２〜９、好ましくは４〜
７とし、培養温度は１５〜３５ｑｏ、好ましくは２０〜
３チ０とするのがよく、培養は通常２〜１０日間で行な
われる。上記培養により培養物中に所望のベルオキシダ
ーゼが産生蓄積される。

液体培養における培養物とは、生産された菌体及び培養
上燈液もし〈は培養炉液を意味する。これら培養物から
ベルオキシダーゼを採取する方法は、常法に従えばよく
、例えば培養終了後の培養液より遠心分離および炉過な
どにより菌体および不溶物を除去することにより粗酵素
液を得る。更に菌体中に含まれるベルオキシダーゼは磨
砕又は超音波等の手段により菌体を破壊後酵素を抽出す
ることによっても粗酵素液として収得できる。更に菌体
を含む培養液をそのまま超音波処理することにより菌体
を破壊したのち不溶物を除去することによっても粗酵素
液を得ることが可能である。本発明方法はまた通常の固
体培養によっても行ない得るものであり、この場合常法
に従い固体培地に菌体を繁殖させたのち、所望酵素を水
で抽出することにより粗酵素液（抽出液）を得ることが
できる。

これらの方法により得られた粗酵素液の精製操作は通常
の方法に従って行なうことができる。

該操作としては例えば硫酸アンモニウム分画沈澱法、透
析、吸着剤による分別法、有機溶媒分別法、等竜点沈澱
法および各種イオン交換体によるカラムクロマトグラフ
ィーなどを単独に或いは紐合せて利用する操作を例示で
きる。かくして精製されたベルオキシダーゼを収得する
。本発明におけるベルオキシダーゼ活性の測定は、水素
供与体として臨床診断試薬に用いられる４一ＡＡ−フェ
ノール系を使用して行なった。

すなわち０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．６）１私に０
．０８％４−ＡＡ溶液０．５の‘、０．４％フェノール
溶液０．５の【及び０．０３％週酸化水素溶液１の‘を
加え３０℃に予熱後、これに酵素液１の【を加えて１５
分間反応させ、直ちに５１仇凧の波長でその吸光度を測
定する。別に対照として過酸化水素溶液の代りに水を１
の‘加え同様の操作によって吸光度を測定する。上記対
照試験と本試験とにおける吸光度の差が１．０増加する
場合を１単位とした。次に本発明で得られたベルオキシ
ダーゼの酵素化学的性質を示す。

‘１’ 作用特異性； 本酵素は過酸化水素に極めて特異的に作用し、過酸化水
素の存在下で種々の水素供与体として機能する化合物の
酸化を触媒する。

その作用機構は次式に示す通りである。比ｏ２十ＡＨ２
ベルオキシダ−準拠ｏ十Ａ（但し式中ＡＨ２は水素供与
体を、またＡは酸化された水素供与体を示す。

）【２｝ 水素供与体に対する特異性 各種水素供与体に対する作用の強さを第２表に、また、
臨床診断試薬用として使用されている発色剤系における
発色度を第３表に示した。

第２表水素供与体 作用の強さフエノ
ール １００フエノール
ナトリウム ７８・ハイドロキノン
１４力テコール
１１５ピロガロール
１４Ｑーナフトール １
３ｏージアニシジンン ８ｏートリジン
６ グアヤコール １８チロジン
６レゾルシノール
２但し第２表中作用の強さは、それぞれ０．
０１Ｍ濃度における発色で、フェノールの値を１００と
した場合の発色度の相対値を示す。

第３表 発色剤組成 測定波長 発色度 くｎｍ）（吸光度） ４−ＡＡ〜フェノ−ル系 ５１０ ０．４３８４
−ＡＡ−ンメチルア ５６０ ０．０２０ニリン系
８−ハイドロキノリン ６００ ０．０２６一Ｐ−
アニシジン系ＭＢＴＨージメチルア ５９ｏ ｏ
．１７４ニリン系但し第３表中発色度は、発色剤および
測定波長として表記したものを利用し、前記ベルオキシ
ダーゼ活性の測定法と同一条件下に測定された吸坑光度
（０．Ｄ．）にて表示する。

｛３’ 作用至薄ｐＨ 本酵素はｐＨ３．５〜８で作用し、その作用至適ｐＨ‘
ま５〜６付近にある。

｛４｝ 至鹿作用温度 本酵素は２０〜６０ｏｏで作用し、その至適作用温度は
３５〜４５ｏｏである。

｛５｝ ｐＨ安定性 本酵素は母３．５〜７．５の範囲で安定であり、特にｐ
Ｈ５．０〜７の範囲で安定である。

｛６｝ 温度安定性 本酵素は０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．６）溶液中で
は４５００で３■ご間完全に安定である。

（７｝ 分子量食塩０．１Ｍ濃度を含む０．０２Ｍ酢酸
緩衝液（母５．６）で平衝化したトョパールＨＷ−５＄
（東洋曹達工業社製）を用いたゲル炉過クロマトグラフ
ィーにより分子量を測定した。

分子量測定用標準蛋白質キット（スウェーデン、ファル
マシア社製）で得られた分子量検量線にあてはめて、本
酵素の分子量は約４００００であった。ｔ８｝ 活性の
測定法前述した通りである。

尚、上記‘１｝〜｛机こ示す酵素化学的性質のうちｍは
本発明で得られる各菌株の産生するベルオキシダーゼに
共通の性質であるが、｛２｝以降の各項の性質は利用す
る各菌株により若干相違しており、上記■〜‘７｝に示
す性質は実施例５で得られたベルオキシダーゼについ示
したものである。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 １ 数１０のこ水道水１０叫を加えよく混合したものを２０
０の‘客三角フラスコに入れて１２０００で３粉ご間殺
菌後、オィディオデンドロン セレアリス（ぴｄｉｏｄ
ｅｎｄｒｏｎｃｅｒｅａｌｉｓ）ＡＴＣＣ２４４０３の
１白金耳量を櫨菌し、２４ｑｏで８日間培養を行なう。

培養終了後、水を加え時々蝿拝しながら３０午０で１時
間抽出を行ない、炉紙で炉過し粗酵素液を得る。この場
合ベルオキシダーゼの活性は蓬１夕当り１．５単位であ
った。実施例 ２ グルコース６％、ベプトン３％、尿素０．３％、コーン
ステイプリカー０．２５％、リン酸第一カリウム０．１
％、硫酸マグネシウム０．０５％、硫酸第二鉄２脚、炭
酸カルシウム１％の組成の液体培養液（ｐＨ６．０）を
５００の【容坂口氏コルベンに５０の【入れ、１２ぴ０
３０分間殺菌後、オィディオデンドロン ェヒニユラタ
ム（０ｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ ｅｃｈｉｎ山ａｔｕｍ
）ＡＴＣＣＩ６２８７の１白金耳量を植菌し、２４〜２
６℃で７日間振盤培養した後、炉紙で炉過し粗酵素液を
得た。

この場合のベルオキシダーゼ活性は斑．４単位／泌であ
った。実施例 ３ グルコース６％、カゼイン（プロテアーゼ消化物）３％
、尿素０．３３％、コーンステイプリカー０．２５％、
酵母エキス０．１％、リン酸第一カリウム０．１％、硫
酸マグネシウム０．０５％、塩化カリウム０．０２５％
、硫酸第二鉄２脚、炭酸カルシウム１％の組成の液体培
養液（ｐＨ６．０）を５００の【客坂口氏コルベンに５
０凧【宛入れ、１２０ｑ０４０分間蒸気殺菌した。

これに下記オィデイオデンドロン属菌体株の１白金耳量
を楯菌し、２４〜２が０で６日間振濠培養した後、炉紙
で炉過し粗酵素液を得た。このもののベルオキシダーゼ
活性を測定し下記第４表の結果を得た。第４表 菌株名 菌株番号 活性 （単位イ微） オイデイオデンドロン ＡＴＯＯ セレアリス ２４４０３ ５．１オイ
デイオデンドロンＡＴＯＯエヒニユラタム １６２
８７ １６４．００オイデイオデンドロン ＡＴＯＯエ
ヒニユラタム ３２４２４ １．８オイデイオ
デンドロン ＡＴＯＯシトリナム ３８２０７
１．２オイデイオデンドロンＡＴＯＯマイウス
３８２０８ １．４実施例 ４実施例２
と同組成の液体培養液（ｐＨ６０）１２そを３０そ客ジ
ャーファーメンターに仕込み、１２０００４び分間殺菌
後、オィディオデンドロン ェヒニュラタム ＡＴＣＣ
Ｉ６２８７の前培養液３００の上を楯菌し、２６ｑｏ通
気量０．２５ｖ．ｖ．ｍ．の条件で３日間通気縄梓培養
を行なった。

培養液を吸引炉適し、菌体と炉液に分ける。菌体は水洗
後よくいまり、その一部１０夕をとって０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ５．６）２０の‘と海砂とを加え冷却下で
磨砕した後、同緩衝液を加え全容１００のとし、１００
０仇．ｐ．ｍ．１５分間の遠心分離を行なって上燈液を
得た。この場合ベルオキシダーゼ活性は使用菌体１夕当
り２．７単位であった。一方炉液のベルオキシダーゼ活
性は、７７単位／叫であった。実施例 ５ 実施例４と同様にして１０その培養炉液を得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ オイデイオデンドロン（Ｏｉｄｉｏｄｅｎｄｒｏｎ
   ）属に属し、ペルオキシダーゼ生産能をする微生物を栄
   養培地に培養し、培養物中にペルオキシダーゼを生成蓄
   積せしめ、これを採取することを特徴とするペルオキシ
   ダーゼの製造法。