JPS6143987A - ペルオキシダ−ゼ及びその製造法 - Google Patents
ペルオキシダ−ゼ及びその製造法Info
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- JPS6143987A JPS6143987A JP59165400A JP16540084A JPS6143987A JP S6143987 A JPS6143987 A JP S6143987A JP 59165400 A JP59165400 A JP 59165400A JP 16540084 A JP16540084 A JP 16540084A JP S6143987 A JPS6143987 A JP S6143987A
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- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
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- Y10S435/8215—Microorganisms
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は微生物によるペルオキシダーゼの製造法、更に
詳しくは新菌属のアルスロマイセスに属する微生物によ
って生産され、４−アミノアンチピリン（以下ｒ４−Ａ
ＡＪと略す）−フェノール系、３−メチル−２−ベンゾ
チアゾリノンヒドラゾン（以下ｒＭＢＴＨＪ と略す
）−ジエチルアニリン（以下ｒＤＥＡＪと略す）系、及
び２，２′−アジノージ−（３−エチルベンソチアソリ
ン）−６−スルホン酸（以下ｒ ＡＢＴＳ Ｊ と略す
）を水素供与体として発色する新規なペルオキシダーゼ
の製造法に関する。
詳しくは新菌属のアルスロマイセスに属する微生物によ
って生産され、４−アミノアンチピリン（以下ｒ４−Ａ
ＡＪと略す）−フェノール系、３−メチル−２−ベンゾ
チアゾリノンヒドラゾン（以下ｒＭＢＴＨＪ と略す
）−ジエチルアニリン（以下ｒＤＥＡＪと略す）系、及
び２，２′−アジノージ−（３−エチルベンソチアソリ
ン）−６−スルホン酸（以下ｒ ＡＢＴＳ Ｊ と略す
）を水素供与体として発色する新規なペルオキシダーゼ
の製造法に関する。
（従来技術）
ペルオキシダーゼは、過酸化水素の存在下で種々の化合
物を酸化する酵素であり、近年臨床診断用試薬トシテ、
クルコース、コレステロール、リン脂質及び尿酸の定量
に種々のオキシダーゼと共に使用されており、又、酵素
免疫試験法における標識酵素としても使用されているが
、その供給源としては、西洋ワサビ、大根等の植物が用
いられているＫすぎない。しかしながら、これらの植物
由来のペルオキシダーゼには、性質が僅かづつ異なるア
イソザイムが含まれるため、診断試薬に用いる純粋な酵
素を得るには、アイソザイムを分離する必要があり、非
常に手間を要するという問題がある。
物を酸化する酵素であり、近年臨床診断用試薬トシテ、
クルコース、コレステロール、リン脂質及び尿酸の定量
に種々のオキシダーゼと共に使用されており、又、酵素
免疫試験法における標識酵素としても使用されているが
、その供給源としては、西洋ワサビ、大根等の植物が用
いられているＫすぎない。しかしながら、これらの植物
由来のペルオキシダーゼには、性質が僅かづつ異なるア
イソザイムが含まれるため、診断試薬に用いる純粋な酵
素を得るには、アイソザイムを分離する必要があり、非
常に手間を要するという問題がある。
微生物起源のペルオキシダーゼも各積卸られており、例
えば細菌及び糸状菌の生産するチトクロームＣ３ペルオ
キシダーゼやＮＡＤＨペルオキシダーゼなどがあるが、
これらは通常の西洋ワサビ及び大根のそれぞれに由来す
るような非特異的なペルオキシダーゼではなく、その特
異性の面で、臨床診断用試薬に用いるＫは不適である。
えば細菌及び糸状菌の生産するチトクロームＣ３ペルオ
キシダーゼやＮＡＤＨペルオキシダーゼなどがあるが、
これらは通常の西洋ワサビ及び大根のそれぞれに由来す
るような非特異的なペルオキシダーゼではなく、その特
異性の面で、臨床診断用試薬に用いるＫは不適である。
又、近年Ｏ−ジアニシジンを水素供与体とするペルオキ
シダーゼが、大腸菌及びミロセシウム属に属する微生物
から生産されたが、０−ジアニシジンは発癌性作用を有
するため、その臨床診断薬への使用は回避される傾向に
あり、やはり上記診断試薬としての使用には適していな
い。
シダーゼが、大腸菌及びミロセシウム属に属する微生物
から生産されたが、０−ジアニシジンは発癌性作用を有
するため、その臨床診断薬への使用は回避される傾向に
あり、やはり上記診断試薬としての使用には適していな
い。
（発明が解決しようとする課題）
本発明者らは、従来の西洋ワサビ或いは大根に由来する
ペルオキシダーゼと同様に、臨床診断用試薬及び酵素免
疫試験法における標識酵素などとして使用し得るペルオ
キシダーゼを増殖の速い微生物から得るために、自然界
より多くの微生物を分離し、４−ＡＡ−フェノール系、
ＭＢＴＨ−ＤＥＡ系及びＡＢＴＳ等の発色剤により呈色
するペルオキシダーゼの生産性を検討した。その結果、
ペルオキシダーゼ高生産能を有する新菌属に属する微生
物菌株を見出し、本発明を完成した。
ペルオキシダーゼと同様に、臨床診断用試薬及び酵素免
疫試験法における標識酵素などとして使用し得るペルオ
キシダーゼを増殖の速い微生物から得るために、自然界
より多くの微生物を分離し、４−ＡＡ−フェノール系、
ＭＢＴＨ−ＤＥＡ系及びＡＢＴＳ等の発色剤により呈色
するペルオキシダーゼの生産性を検討した。その結果、
ペルオキシダーゼ高生産能を有する新菌属に属する微生
物菌株を見出し、本発明を完成した。
（発明の構成）
上記菌株の菌な的性質は次の通りである。
（１）各培地における生育状態
培養条件：室温（２５〜２８℃）、散光下■ バレイシ
ョ・ブドウ糖寒天培地 ５日後のコロニーの直径２４〜２７芦鳳。気中菌糸は短
かく密。コｄニーは白色、コロニー裏側は白色ないし黄
味をおびた白色。菌糸は隔壁を持ち分岐する。隔壁のと
ころでややくびれることかある。表面は平滑。無色。幅
２〜５μｍ０分生子の形成が認められる。又、厚膜胞子
に類似した細胞が観察された。この細胞は菌糸先端、菌
糸の部間又は菌糸側面に形成され、球形又は楕円形。直
径５〜９μｍ５又は１０〜１５×６〜１０μｍ０約２週
間後のコロニーには菌核の形成が認められる。菌核は多
数形成され、茶〜濃茶色。球形又は楕円形。直径７５〜
１００μｍ、又は１００〜１７５Ｘ７５〜１１０μｍ。
ョ・ブドウ糖寒天培地 ５日後のコロニーの直径２４〜２７芦鳳。気中菌糸は短
かく密。コｄニーは白色、コロニー裏側は白色ないし黄
味をおびた白色。菌糸は隔壁を持ち分岐する。隔壁のと
ころでややくびれることかある。表面は平滑。無色。幅
２〜５μｍ０分生子の形成が認められる。又、厚膜胞子
に類似した細胞が観察された。この細胞は菌糸先端、菌
糸の部間又は菌糸側面に形成され、球形又は楕円形。直
径５〜９μｍ５又は１０〜１５×６〜１０μｍ０約２週
間後のコロニーには菌核の形成が認められる。菌核は多
数形成され、茶〜濃茶色。球形又は楕円形。直径７５〜
１００μｍ、又は１００〜１７５Ｘ７５〜１１０μｍ。
■ 麦芽エキス寒天培地
５日後のコロニーの直径７〜１２１１ｏ気中菌糸は短か
く密。コロニーは白色、コロニー裏側も白色。菌糸は隔
壁を持ち分岐する。隔壁のところでややくびれることか
ある。表面は平滑。
く密。コロニーは白色、コロニー裏側も白色。菌糸は隔
壁を持ち分岐する。隔壁のところでややくびれることか
ある。表面は平滑。
幅２〜５μｍ０分生子の形成は認められず、厚膜胞子に
類似した細胞のみが観察される。この細胞は菌糸先端、
菌糸の部間又は菌糸側面に形成され、球形又は楕円形。
類似した細胞のみが観察される。この細胞は菌糸先端、
菌糸の部間又は菌糸側面に形成され、球形又は楕円形。
直径８〜１３μｍ１又は１０〜２０×５〜１２μｍ０
■ ＹｐＳ８培地
５日１（７）コロニーはｊｆ１５２〜６０ｗｘｏニア０
ニーは白色、コロニー裏側も白色。気中菌糸は密。但し
、コロニー中心部は気中菌糸が非常に少ない。菌糸は隔
壁を持ち分岐する。隔壁のところで、ややくびれること
かある。表面は平滑。
ニーは白色、コロニー裏側も白色。気中菌糸は密。但し
、コロニー中心部は気中菌糸が非常に少ない。菌糸は隔
壁を持ち分岐する。隔壁のところで、ややくびれること
かある。表面は平滑。
無色。幅２〜５μｍ０分生子の形成が認められる。
（２） 検鏡観察
各培地の検鏡標本とスライド培養によって、分生子形成
様式、分生子柄、分生子などを観察した。
様式、分生子柄、分生子などを観察した。
分生子柄は栄養菌糸と区別困難である。分生子形成様式
は分節型である。分生子形成にあたって、菌糸先端の基
部がまず切断される。切断された菌糸は更にその中央部
ないし、中央部よりやや上部で分節して分生子となる。
は分節型である。分生子形成にあたって、菌糸先端の基
部がまず切断される。切断された菌糸は更にその中央部
ないし、中央部よりやや上部で分節して分生子となる。
同時に、菌糸切断面直下の菌糸側面から菌糸が伸長し、
同様にして分生子が形成される。この過程がくりかえさ
れて分生子が形成される。このため、菌糸の先端に分生
子が球状に集合することがある。また、菌糸切断面直下
の菌糸側面から伸長した菌糸がそのまま伸長を続けるこ
ともある。分生子は短円筒形。先端部は丸みをおびる。
同様にして分生子が形成される。この過程がくりかえさ
れて分生子が形成される。このため、菌糸の先端に分生
子が球状に集合することがある。また、菌糸切断面直下
の菌糸側面から伸長した菌糸がそのまま伸長を続けるこ
ともある。分生子は短円筒形。先端部は丸みをおびる。
無色。表面は平滑。３．８〜６０Ｘ１．５〜２．５μｍ
。
。
（３）生理的性質
本菌株の生育可能ｐＨは４〜１０、生育好適ｐＨは６〜
９、増殖温度は１０〜４５℃、増殖好適温度は３０〜４
０℃である。
９、増殖温度は１０〜４５℃、増殖好適温度は３０〜４
０℃である。
以上の菌学的性質のうち、分生子形成様式が分節型であ
ることに注目し、本菌株と一致する属を、Ｊ、 Ｗ、
Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ、 Ｗ、 Ｂ、 Ｋｅｎｄｒｉｃ
ｋ 、 １． Ｌ。
ることに注目し、本菌株と一致する属を、Ｊ、 Ｗ、
Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ、 Ｗ、 Ｂ、 Ｋｅｎｄｒｉｃ
ｋ 、 １． Ｌ。
（：ｏｎｎｅｒｓ 及びり、 ５１ｇ１ｅｒ 著、Ｇｅ
ｎｅｒａ ｏｆＨｖｐｈｏｔｎｙｃｅｔｅａ ｉｎ”
Ｔｈｅ Ｆａｎｇｉ ’ Ｖｏｌ、 ■Ａ。
ｎｅｒａ ｏｆＨｖｐｈｏｔｎｙｃｅｔｅａ ｉｎ”
Ｔｈｅ Ｆａｎｇｉ ’ Ｖｏｌ、 ■Ａ。
（）ｉｎｓｗｏｒｔｈ 、 ｅｔ ａｌ、、 ｅｄ ）
において検策したところ、本菌株に形態的特徴が一
致する属は見出せなかった。そこで本菌株はヒポマイセ
ーテス（Ｈｙｐｈｏｍｙｃ ｇ ｔ ｅ ８ ）中の一
新属とするのが妥当であると認めた。そこで新属アルス
ロマイセス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ） 属を創設
し、本菌株をアルスロマイセス ラモスス（Ａ、 ｒａ
ｍｏｓｕｓ ） トロ名した。
において検策したところ、本菌株に形態的特徴が一
致する属は見出せなかった。そこで本菌株はヒポマイセ
ーテス（Ｈｙｐｈｏｍｙｃ ｇ ｔ ｅ ８ ）中の一
新属とするのが妥当であると認めた。そこで新属アルス
ロマイセス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ ） 属を創設
し、本菌株をアルスロマイセス ラモスス（Ａ、 ｒａ
ｍｏｓｕｓ ） トロ名した。
ここで、アルスロマイセス属は次のとおり定義される：
不完全菌豆量（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ ）
ｒ 不完全糸状画調（Ｈｙｐｈｏｍｙｃ ｇ ｔ ａ
ｓ ）に所属する。
ｒ 不完全糸状画調（Ｈｙｐｈｏｍｙｃ ｇ ｔ ａ
ｓ ）に所属する。
菌糸は無色、隔壁を持ち、分岐する。分生子柄は栄養菌
糸との区別が困難、分生子形成様式は分節型、分生子は
菌糸の先端基部がまず切断され、切断された菌糸が更に
分節して形成される。同時に菌糸切断面直下の菌糸側面
から菌糸が伸長して同様の過程で分生子が形成される。
糸との区別が困難、分生子形成様式は分節型、分生子は
菌糸の先端基部がまず切断され、切断された菌糸が更に
分節して形成される。同時に菌糸切断面直下の菌糸側面
から菌糸が伸長して同様の過程で分生子が形成される。
分生子は短円筒形。無色。
ｓｐ、 ｎｏｖ。
これらの菌株はいずれも土壌より分離したものである。
又、アルスロマイセス ラモススは微工研菌寄託受理番
号第７７５４号（ＦＥＲＭ Ｐ−７７５４）として工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。なお
、木様の正基準標本ＣＨｏ１ｏｔｙｐｅ ）は、サン）
ＩＪ−株式会社応用微生物研究所菌類標本文庫に保管
されている。
号第７７５４号（ＦＥＲＭ Ｐ−７７５４）として工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている。なお
、木様の正基準標本ＣＨｏ１ｏｔｙｐｅ ）は、サン）
ＩＪ−株式会社応用微生物研究所菌類標本文庫に保管
されている。
本発明に使用される菌株を培養するためＫは、その菌株
の胞子、菌糸あるいは予め培養して得られた前培養液を
液体培地あるいは固形培地に接種し培養する。液体培地
の場合に、戻素源としてはグル：ｌ−ス、フラクトース
、キシロース、サツカロース、マルトース、可溶性澱粉
、糖蜜、グリセロール、マンニトール等の一般的に使用
されるものがいずれも使用できる。窒素源としてはペプ
トン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸
、コーンスチープリカー等の天然窒素源の他Ｋ、尿素等
の有機窒素源ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウ
ム等の無機窒素源を用いることができる。この他必要に
応じリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸鋼等の
無機塩及びビタミン等も微量栄養源として使用できる。
の胞子、菌糸あるいは予め培養して得られた前培養液を
液体培地あるいは固形培地に接種し培養する。液体培地
の場合に、戻素源としてはグル：ｌ−ス、フラクトース
、キシロース、サツカロース、マルトース、可溶性澱粉
、糖蜜、グリセロール、マンニトール等の一般的に使用
されるものがいずれも使用できる。窒素源としてはペプ
トン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸
、コーンスチープリカー等の天然窒素源の他Ｋ、尿素等
の有機窒素源ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウ
ム等の無機窒素源を用いることができる。この他必要に
応じリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸鋼等の
無機塩及びビタミン等も微量栄養源として使用できる。
これらの培地成分は微生物の生育を害しない濃度であれ
ば特に制限はない。実用上一般に、炭素源は０．１〜１
０重量％、好ましくは１〜５重量％、窒素源は０．０１
〜５重量％、好ましくは０．１〜２重量−の濃度とする
のがよい。又、培養温度は１０〜４５℃、好ましくは３
０〜４０℃とし、培地のｐＨは４〜１０、好ましくは６
〜９として、通気攪拌培養、振盪培養もしくは静置培養
を行なう。培養は通常３〜１４日間で行なわれる。
ば特に制限はない。実用上一般に、炭素源は０．１〜１
０重量％、好ましくは１〜５重量％、窒素源は０．０１
〜５重量％、好ましくは０．１〜２重量−の濃度とする
のがよい。又、培養温度は１０〜４５℃、好ましくは３
０〜４０℃とし、培地のｐＨは４〜１０、好ましくは６
〜９として、通気攪拌培養、振盪培養もしくは静置培養
を行なう。培養は通常３〜１４日間で行なわれる。
固形培地で培養する場合は、５０〜１００重量％の水を
加えたふすま、もみがら、米ぬか等を用い、１０〜４５
℃、好ましくは３０〜４０℃下に３〜１４日間で行なわ
れる。この場合に必要に応じて培地中に窒素源、無機塩
類、微量栄養源を加えることができる。大量培養のため
には液体培地を使用することが好ましい。
加えたふすま、もみがら、米ぬか等を用い、１０〜４５
℃、好ましくは３０〜４０℃下に３〜１４日間で行なわ
れる。この場合に必要に応じて培地中に窒素源、無機塩
類、微量栄養源を加えることができる。大量培養のため
には液体培地を使用することが好ましい。
このように培養して培養物中にペルオキシダーゼが生成
蓄積する。ここで培養物とは、液体培養においては培養
後の菌体及び培養上澄液又は培養ｐ液を意味し、固体培
養においては菌体及び菌体の生育した培地を意味する。
蓄積する。ここで培養物とは、液体培養においては培養
後の菌体及び培養上澄液又は培養ｐ液を意味し、固体培
養においては菌体及び菌体の生育した培地を意味する。
液体培地を使用した場合には培養液中からペルオキシダ
ーゼの採取は次のごとく行なう。
ーゼの採取は次のごとく行なう。
培養終了後、培養液より遠心分離及びｐ過などの固液分
離手段により菌体及び不溶物を除いて粗酵素液を得る。
離手段により菌体及び不溶物を除いて粗酵素液を得る。
さらに菌体中に含まれるペルオキシダーゼは磨砕もしく
は超音波処理等の手段によって菌体を破壊して酵素を抽
出することにより粗酵素液を得る。又、菌体を含む培養
液をそのまま超音波処理することＫより菌体を破壊した
のち不溶物を除去し°Ｃ粗酵素液を得ることも可能であ
る。
は超音波処理等の手段によって菌体を破壊して酵素を抽
出することにより粗酵素液を得る。又、菌体を含む培養
液をそのまま超音波処理することＫより菌体を破壊した
のち不溶物を除去し°Ｃ粗酵素液を得ることも可能であ
る。
又、固形培地を使用した場合には菌体な含む固形培地に
水を加え、そのまま又は例えば超音波処理等により菌体
を破壊したのち、不溶物を除去して粗酵素液を得る。
水を加え、そのまま又は例えば超音波処理等により菌体
を破壊したのち、不溶物を除去して粗酵素液を得る。
このようにして得られた粗酵素液から例えば有機溶媒分
別法、硫安分別法、透析、等電点沈殿法及びカラムクロ
マトグラフィー等通常の酵素精製方法を単独にあるいは
組合せて用いることにより精製されたペルオキシダーゼ
を得ることができる。
別法、硫安分別法、透析、等電点沈殿法及びカラムクロ
マトグラフィー等通常の酵素精製方法を単独にあるいは
組合せて用いることにより精製されたペルオキシダーゼ
を得ることができる。
本発明のペルオキシダーゼ活性の測定は、水素供与体と
して例えば４−ＡＡ−フェノール系を使用して次のよう
に行なう。即ち、０．１Ｍリン酸バッファー（７）Ｈ７
，０）１−に、０．１チフェノール溶液１．３−１０２
％４−ＡＡ溶液０．２５−及び００２％過酸化水素溶液
０．２−を加え、３７℃に予熱後、これに酵素液０．２
５４を加えて１０分間反応させる。反応後２０％アジ化
ナトリウム溶液０．２−を加え、５００ ｎｍの吸光度
を測定して反応値とする。別にコントロールとして過酸
化水素溶液の代わりに水０２−を加えて反応を行ない、
同様の操作によって吸光度を測定しコントロール値とす
る。ベルオキシダーゼ力価の単位Ｕ（ユニット）は１分
間に１μモルの４−ＡＡ−フェノールを酸化する酵素量
として表わされ、酵素液又は培養液のベルオキシダーゼ
力価（Ｕ／ｆｎりは０．１９８ ｘ△Ｏ，Ｄ、 ｓｏｏ
Ｘ （酵素液又は培養液の希釈率）で求められる。な
お、上式においてΔＯ，Ｄ、ｓｏｏ は反応値からコ
ントロール値を引いた値を示す。
して例えば４−ＡＡ−フェノール系を使用して次のよう
に行なう。即ち、０．１Ｍリン酸バッファー（７）Ｈ７
，０）１−に、０．１チフェノール溶液１．３−１０２
％４−ＡＡ溶液０．２５−及び００２％過酸化水素溶液
０．２−を加え、３７℃に予熱後、これに酵素液０．２
５４を加えて１０分間反応させる。反応後２０％アジ化
ナトリウム溶液０．２−を加え、５００ ｎｍの吸光度
を測定して反応値とする。別にコントロールとして過酸
化水素溶液の代わりに水０２−を加えて反応を行ない、
同様の操作によって吸光度を測定しコントロール値とす
る。ベルオキシダーゼ力価の単位Ｕ（ユニット）は１分
間に１μモルの４−ＡＡ−フェノールを酸化する酵素量
として表わされ、酵素液又は培養液のベルオキシダーゼ
力価（Ｕ／ｆｎりは０．１９８ ｘ△Ｏ，Ｄ、 ｓｏｏ
Ｘ （酵素液又は培養液の希釈率）で求められる。な
お、上式においてΔＯ，Ｄ、ｓｏｏ は反応値からコ
ントロール値を引いた値を示す。
次に本発明で得られるペルオキシダーゼの性質を示す。
（１） 作用特異性；
本酵素は過酸化水素の存在下で種々の化合物の酸化を触
媒する。その作用機構は次式に示す通りである。
媒する。その作用機構は次式に示す通りである。
ペルオキシダーゼ
Ｈ２Ｏ２＋ＡＨ２−→２Ｈ２０＋Ａ
〔但し式中Ａ Ｈ２は水素供与体を、又、Ａは酸化され
た水素供与体を示す〕 （２）水素供与体に対する特異性； 本酵素の゛種々の水素供与体に対する特異性を第１表に
示す。
た水素供与体を示す〕 （２）水素供与体に対する特異性； 本酵素の゛種々の水素供与体に対する特異性を第１表に
示す。
第１表
（３）至適ｐＨ１
ｐＨ３，５〜５．５の範囲は０．１Ｍ酢酸バッファー、
ｐＨ５，５〜８．０の範囲は０．１Ｍリン酸バッファー
、ｐＨ７，５〜９．０の範囲は０１Ｍトリス−塩酸バッ
ファー、ｐＨ８，５〜９．０の範囲は０．１Ｍグリシン
−水酸化ナトリウムバッファーを使用して、活性測定と
同様の配合比率で検討した。その結果を第１図に示す。
ｐＨ５，５〜８．０の範囲は０．１Ｍリン酸バッファー
、ｐＨ７，５〜９．０の範囲は０１Ｍトリス−塩酸バッ
ファー、ｐＨ８，５〜９．０の範囲は０．１Ｍグリシン
−水酸化ナトリウムバッファーを使用して、活性測定と
同様の配合比率で検討した。その結果を第１図に示す。
１０〜８０°ＣＫおける酵素活性を測定した結果を第２
図に示す。
図に示す。
（５）ｐＨ安定性；
ｐＨ３，５〜５．０の範囲は０．１Ｍ酢酸パンファー。
ｐＨ６，０〜８．０の範囲は０．１Ｍリン酸バッファー
、ｐＨ８，０〜９．０は０．１Ｍ）リスー塩酸バッファ
ー、ｐＨ９，０〜１２．０は０．１Ｍグリシン−水酸化
ナトリウムバッファーを使用し、これらのバッファー溶
液０．９−に酵素液０．１１１１ｔを加えた後、３０℃
に１６時間放置した。この処理酵素液を０．０２ＭＩＪ
ン酸バッファー（ｐＨ７，０）で１０倍ニ竪釈した後、
活性を測定した。その結果を第３図に示す。
、ｐＨ８，０〜９．０は０．１Ｍ）リスー塩酸バッファ
ー、ｐＨ９，０〜１２．０は０．１Ｍグリシン−水酸化
ナトリウムバッファーを使用し、これらのバッファー溶
液０．９−に酵素液０．１１１１ｔを加えた後、３０℃
に１６時間放置した。この処理酵素液を０．０２ＭＩＪ
ン酸バッファー（ｐＨ７，０）で１０倍ニ竪釈した後、
活性を測定した。その結果を第３図に示す。
（６）温度安定性；
０．０２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，０） １．９ｍ
に酵素液０．１−を加えて調製した酵素液を２０〜９０
℃の種々の温度に３０分間保ち、処理後、直ちに氷水で
１０分間冷却し、残存酵素活性を測定した。その結果を
第４図に示す。
に酵素液０．１−を加えて調製した酵素液を２０〜９０
℃の種々の温度に３０分間保ち、処理後、直ちに氷水で
１０分間冷却し、残存酵素活性を測定した。その結果を
第４図に示す。
（７）分子量；
５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法により分子量を
測定した。その結果、本発明によるペルオキシダーゼは
分子量約３６，０００であることがわかった。
測定した。その結果、本発明によるペルオキシダーゼは
分子量約３６，０００であることがわかった。
（８）等電点；
ｐＨ３〜１０のキャリアーアンホライト（ファルマシア
社）を用い、４０時間９００ｖ通電して等電点分画を行
なった。その結果、本発明によるペルオキシダーゼの等
電点はｐＨ３，４であった。
社）を用い、４０時間９００ｖ通電して等電点分画を行
なった。その結果、本発明によるペルオキシダーゼの等
電点はｐＨ３，４であった。
上記述べたことから、本ペルオキシダーゼは、新規であ
り、かつ、アイソザイムを含まないという特徴を有する
。
り、かつ、アイソザイムを含まないという特徴を有する
。
またアイソザイムな含まないことにより、酵素免疫試験
法における標識酵素として特に有用である。すなわち、
Ａｖｒａｍｅａｓ （Ｉｒｎｒｎｕｎｏｃｈｅｍｉａｔ
ｒｙ。
法における標識酵素として特に有用である。すなわち、
Ａｖｒａｍｅａｓ （Ｉｒｎｒｎｕｎｏｃｈｅｍｉａｔ
ｒｙ。
６．４３ （１９６９））が、西洋ワサビ由来ペルオキ
シダーゼで行った方法に準じてアイソザイムを分離する
ことなくグルタルアルデヒドで抗原あるいは抗体に標識
して、抗原あるいは抗体の検出、あるいは定量に用いる
ことができる。
シダーゼで行った方法に準じてアイソザイムを分離する
ことなくグルタルアルデヒドで抗原あるいは抗体に標識
して、抗原あるいは抗体の検出、あるいは定量に用いる
ことができる。
次に本発明の実施例を示す。
（実施例１）
グルコース１チ、ポリペプトン０５％、酵母エキス０．
３％及び麦芽エキス０．３％を含む培地（ｐＨ６，０）
１０−を径２４關の試験管に入れ、１２０℃で１５分間
殺菌した。アルスロマイセスラモススの１白金耳を接種
し、振盪培養機（３００ｒ１ｙｍ）により３０℃で８日
間振盪培養した。培養液をｐ通し、ｐ液のベルオキシダ
ーゼ力価を測定した結果、１０．７Ｕ、／−であった。
３％及び麦芽エキス０．３％を含む培地（ｐＨ６，０）
１０−を径２４關の試験管に入れ、１２０℃で１５分間
殺菌した。アルスロマイセスラモススの１白金耳を接種
し、振盪培養機（３００ｒ１ｙｍ）により３０℃で８日
間振盪培養した。培養液をｐ通し、ｐ液のベルオキシダ
ーゼ力価を測定した結果、１０．７Ｕ、／−であった。
（実施例２）
グルコース１チ、ポリペプトン０．５％及び酵母エキス
０．３％を含む培地（ｐＨ６，０）５Ｊを１５１ジャー
ファーメンタ−に仕込み、１２０℃で４ ｏ分［ｆ［Ｌ
アルスロマイセス ラモススの前培養液２００−を接種
した。３０℃、通気量０．５ Ｖ、Ｖ、Ｍ、で５日間通
気攪拌培養を行なった。
０．３％を含む培地（ｐＨ６，０）５Ｊを１５１ジャー
ファーメンタ−に仕込み、１２０℃で４ ｏ分［ｆ［Ｌ
アルスロマイセス ラモススの前培養液２００−を接種
した。３０℃、通気量０．５ Ｖ、Ｖ、Ｍ、で５日間通
気攪拌培養を行なった。
培養液を声過し、ｐ液のベルオキシダーゼ力価を測定し
た結果、３．６Ｕ／−であった。
た結果、３．６Ｕ／−であった。
（実施例３）
実施例１と同じ組成の培地３１！を５００１１／容坂ロ
フラスコ３０本Ｖｃ１００−ずつ分注し、１２０℃で２
０分間殺菌した。アルスロマイセス ラモススの前培養
液１０−を各々に接種し、レシプロシェーカー（１１０
ｒＰ）Ｋより２８℃で８日間振盪培養した。培養液を濾
過し、培養Ｐ液１，９１５−＝／を？ｌだ。このｐ液の
ベルオキシダーゼ力価を測定した結果、７０Ｕ／−であ
った。このｐ液に硫酸アンモニウムを加え硫酸アンモニ
ウム７５％飽和で沈殿した画分を集め、０．０２Ｍリン
酸バッファー（ｐＨ７，０）６６−に溶解した。この溶
液をセロファンチューブを透析膜として同一バッファー
に対して透析し、硫酸アンモニウムを除いた。
フラスコ３０本Ｖｃ１００−ずつ分注し、１２０℃で２
０分間殺菌した。アルスロマイセス ラモススの前培養
液１０−を各々に接種し、レシプロシェーカー（１１０
ｒＰ）Ｋより２８℃で８日間振盪培養した。培養液を濾
過し、培養Ｐ液１，９１５−＝／を？ｌだ。このｐ液の
ベルオキシダーゼ力価を測定した結果、７０Ｕ／−であ
った。このｐ液に硫酸アンモニウムを加え硫酸アンモニ
ウム７５％飽和で沈殿した画分を集め、０．０２Ｍリン
酸バッファー（ｐＨ７，０）６６−に溶解した。この溶
液をセロファンチューブを透析膜として同一バッファー
に対して透析し、硫酸アンモニウムを除いた。
透析した酵素液を、予め０．０２Ｍリン酸パンファー（
ｐＨ７，０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース１７）
カラムに通し、吸着画分を塩化ナトリウでグラジェント
溶出させ、溶出液の分画中で活性の高い両分１０６−を
集めた。硫酸アンモニウムを加え、硫酸アンモニウム７
５チ飽和で沈殿する両分を集め、０．１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．０２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，０）３
−に溶解し、セロファンチューブを透析膜として透析し
た。この透析した酵素液を、予め０．１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．０２Ｍリン酸バッファー（ｐＩ（７，０）
で平衡化したウルトラゲル ＡＣＡ４４のカラムＣＬＫ
Ｂ製）Ｋ通し、分画した溶出液を得た。溶出液の分画中
で活性の高い画分１７−を集め、硫酸アンモニウムを加
え、硫酸アンモニウム７５％飽和で沈殿する両分を集め
た。このペルオキシダーゼ塩析物の培養ｐ液からの活性
収率は５７％、比活性は３７．６０／曙であった。
ｐＨ７，０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース１７）
カラムに通し、吸着画分を塩化ナトリウでグラジェント
溶出させ、溶出液の分画中で活性の高い両分１０６−を
集めた。硫酸アンモニウムを加え、硫酸アンモニウム７
５チ飽和で沈殿する両分を集め、０．１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．０２Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，０）３
−に溶解し、セロファンチューブを透析膜として透析し
た。この透析した酵素液を、予め０．１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．０２Ｍリン酸バッファー（ｐＩ（７，０）
で平衡化したウルトラゲル ＡＣＡ４４のカラムＣＬＫ
Ｂ製）Ｋ通し、分画した溶出液を得た。溶出液の分画中
で活性の高い画分１７−を集め、硫酸アンモニウムを加
え、硫酸アンモニウム７５％飽和で沈殿する両分を集め
た。このペルオキシダーゼ塩析物の培養ｐ液からの活性
収率は５７％、比活性は３７．６０／曙であった。
（発明の効果）
本発明のペルオキシダーゼは、アイソザイムが存在しな
いので、臨床診断用試薬及び酵素免疫試験法における標
識酵素として、従来の西洋ワサビ等のものより優れてい
る。そのうえ、本発明のペルオキシダーゼは、微生物に
より生産されるから、安定かつ大量に供給することがで
きる点でも優れている。
いので、臨床診断用試薬及び酵素免疫試験法における標
識酵素として、従来の西洋ワサビ等のものより優れてい
る。そのうえ、本発明のペルオキシダーゼは、微生物に
より生産されるから、安定かつ大量に供給することがで
きる点でも優れている。
第１図は反応ｐＨと本発明ペルオキシダーゼの相対活性
との関係を示すグラフであり、第２図は反応温度と相対
活性との関係を示すグラフであり、 第３図はｐＨ安定性を示すグラフであり、第４図は温度
安定性を示すグラフである。 （特許出願人
サントリー株式会社 （外５名） ピ ＃／図 秦３図 事 シ ｙ ′り 幕２図 本４図 丁 ：ン 手続補正書 昭和６０年１１月７日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１６５４００号 ２、発明の名称 Ｒルオキシダーゼ及びその製造法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名称（１９０）サントリー株式会社 ４、代理人 明細書の〔発明の詳細な説明〕の欄４匡１７≧、６、補
正の内容 （１）明細書第９頁第７行のｒＨｙｐｈｏｅ＋ｙｃｅｔ
ｅｓ ｉｎＪをｒＨｙｐｈｏｅ＋ｙｃｅｔｅｓ と
Ｗ、 Ｂ、 Ｋｅｎｄｒｉｃｋ 及びＪ 、 Ｗ、
Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ 着、 Ｈｙｐｈｏｅ＋
ｙｃｅｔｅｓ ｉｎＪと補正する。 （２）同第１０頁第１５行の「標本文庫」を「標本庫」
と補正する。 （３）同第１４頁第４行の［４−ＡＡ−フェノールを酸
化」を「過酸化水素を消費」と補正する。 （４） 同第１９頁第１６行の「塩化ナトリウ］を「塩
化ナトリウム」と補正する。 以上
との関係を示すグラフであり、第２図は反応温度と相対
活性との関係を示すグラフであり、 第３図はｐＨ安定性を示すグラフであり、第４図は温度
安定性を示すグラフである。 （特許出願人
サントリー株式会社 （外５名） ピ ＃／図 秦３図 事 シ ｙ ′り 幕２図 本４図 丁 ：ン 手続補正書 昭和６０年１１月７日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１６５４００号 ２、発明の名称 Ｒルオキシダーゼ及びその製造法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名称（１９０）サントリー株式会社 ４、代理人 明細書の〔発明の詳細な説明〕の欄４匡１７≧、６、補
正の内容 （１）明細書第９頁第７行のｒＨｙｐｈｏｅ＋ｙｃｅｔ
ｅｓ ｉｎＪをｒＨｙｐｈｏｅ＋ｙｃｅｔｅｓ と
Ｗ、 Ｂ、 Ｋｅｎｄｒｉｃｋ 及びＪ 、 Ｗ、
Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ 着、 Ｈｙｐｈｏｅ＋
ｙｃｅｔｅｓ ｉｎＪと補正する。 （２）同第１０頁第１５行の「標本文庫」を「標本庫」
と補正する。 （３）同第１４頁第４行の［４−ＡＡ−フェノールを酸
化」を「過酸化水素を消費」と補正する。 （４） 同第１９頁第１６行の「塩化ナトリウ］を「塩
化ナトリウム」と補正する。 以上
Claims (4)
- （１）下記の定義： 不完全菌亜門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、不
完全糸状菌綱（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）に所属する
； 菌糸は無色、隔壁を持ち、分岐する；分生 子柄は栄養菌糸との区別が困難、分生子形成様式は分節
型、分生子は菌糸の先端基部がまず切断され、切断され
た菌糸が更に分節して形成される；同時に菌糸切断面直
下の菌糸側面から菌糸が伸長して同様の過程で分生子が
形成される；分生子は短円筒形、無色； 基準種：￥Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ￥ ￥ｒａｍｏｓｕ
ｓ￥ Ｎ．Ａｍａｎｏ，ｓｐ．ｎｏｖ．； で規定されるアルスロマイセス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅ
ｓ）属に属するペルオキシダーゼ産生能を有する微生物
から得られるペルオキシダーゼ。 - （２）下記の特性： 至適ｐＨ５〜７； 至適温度３０〜４５℃； ｐＨ５〜１０で安定； 温度５０℃以下で安定； ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法 での分子量約３６，０００； 等電点分画法（アンホライン使用）によ る等電点ｐＨ約３．４； アイソザイムを含まない； を有する特許請求の範囲第１項記載のペルオキシダーゼ
。 - （３）アルスロマイセス属に属する微生物が、アルスロ
マイセス ラモスス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓｒａｍｏ
ｓｕｓ）（微工研菌寄託受理番号第７７５４号；ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−７７５４）である特許請求の範囲第１項記載の
ペルオキシダーゼ。 - （４）下記の定義： 不完全菌亜門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、不
完全糸状菌綱（Ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ）に所属する
； 菌糸は無色、隔壁を持ち、分岐する。分生 子柄は栄養菌糸との区別が困難、分生子形成様式は分節
型、分生子は菌糸の先端基部がまず切断され、切断され
た菌糸が更に分節して形成される；同時に菌糸切断面直
下の菌糸側面から菌糸が伸長して同様の過程で分生子が
形成される；分生子は短円筒形、無色； 基準種：￥Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ￥ ￥ｒａｍｏｓｕ
ｓ￥ Ｎ．Ａｍａｎｏ，ｓｐ、ｎｏｖ．； で規定されるアルスロマイセス（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅ
ｓ）属に属するペルオキシダーゼ産生能を有する微生物
を培養し、ペルオキシダーゼを培養物中に生成蓄積させ
、これを採取することを特徴とするペルオキシダーゼの
製造法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59165400A JPS6143987A (ja) | 1984-08-07 | 1984-08-07 | ペルオキシダ−ゼ及びその製造法 |
| US06/762,838 US4737460A (en) | 1984-08-07 | 1985-08-06 | Peroxidase and a process of its preparation |
| AT85109917T ATE69265T1 (de) | 1984-08-07 | 1985-08-07 | Peroxidase und verfahren zu deren herstellung. |
| CA000488211A CA1261289A (en) | 1984-08-07 | 1985-08-07 | Peroxidase and a process of its preparation |
| EP85109917A EP0171074B1 (en) | 1984-08-07 | 1985-08-07 | A peroxidase and a process of its preparation |
| DE8585109917T DE3584593D1 (de) | 1984-08-07 | 1985-08-07 | Peroxidase und verfahren zu deren herstellung. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59165400A JPS6143987A (ja) | 1984-08-07 | 1984-08-07 | ペルオキシダ−ゼ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6143987A true JPS6143987A (ja) | 1986-03-03 |
| JPH03996B2 JPH03996B2 (ja) | 1991-01-09 |
Family
ID=15811687
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59165400A Granted JPS6143987A (ja) | 1984-08-07 | 1984-08-07 | ペルオキシダ−ゼ及びその製造法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4737460A (ja) |
| EP (1) | EP0171074B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6143987A (ja) |
| AT (1) | ATE69265T1 (ja) |
| CA (1) | CA1261289A (ja) |
| DE (1) | DE3584593D1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0232259A (ja) * | 1988-06-13 | 1990-02-02 | Eastman Kodak Co | 低 ｐＩ蛋白質または炭水化物を含んでなる特異的バインディング組成物ならびに診断試験キットおよび使用方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2528457B2 (ja) * | 1987-03-09 | 1996-08-28 | サントリー株式会社 | 過酸化水素の定量法 |
| US5112752A (en) * | 1990-10-18 | 1992-05-12 | The Mead Corporation | Biocatalytic oxidation using soybean and other legume peroxidases |
| JP3399549B2 (ja) * | 1990-11-16 | 2003-04-21 | サントリー株式会社 | 微生物由来ペルオキシダーゼ遺伝子 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4328312A (en) * | 1979-04-11 | 1982-05-04 | Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. | Process for production of peroxidase |
| JPS585035B2 (ja) * | 1980-12-11 | 1983-01-28 | 上田化学工業株式会社 | ペルオキシダ−ゼの製造法 |
| JPS58179488A (ja) * | 1982-04-15 | 1983-10-20 | Ueda Kagaku Kogyo Kk | ペルオキシダ−ゼの製造法 |
| JPS6013670B2 (ja) * | 1983-03-28 | 1985-04-09 | 大阪市 | ペルオキシダ−ゼの製造法 |
-
1984
- 1984-08-07 JP JP59165400A patent/JPS6143987A/ja active Granted
-
1985
- 1985-08-06 US US06/762,838 patent/US4737460A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-07 DE DE8585109917T patent/DE3584593D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-07 AT AT85109917T patent/ATE69265T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-08-07 EP EP85109917A patent/EP0171074B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-08-07 CA CA000488211A patent/CA1261289A/en not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0232259A (ja) * | 1988-06-13 | 1990-02-02 | Eastman Kodak Co | 低 ｐＩ蛋白質または炭水化物を含んでなる特異的バインディング組成物ならびに診断試験キットおよび使用方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03996B2 (ja) | 1991-01-09 |
| US4737460A (en) | 1988-04-12 |
| CA1261289A (en) | 1989-09-26 |
| EP0171074A3 (en) | 1987-10-07 |
| ATE69265T1 (de) | 1991-11-15 |
| EP0171074B1 (en) | 1991-11-06 |
| EP0171074A2 (en) | 1986-02-12 |
| DE3584593D1 (de) | 1991-12-12 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |