JP3399549B2 - 微生物由来ペルオキシダーゼ遺伝子 - Google Patents
微生物由来ペルオキシダーゼ遺伝子Info
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- JP3399549B2 JP3399549B2 JP09761591A JP9761591A JP3399549B2 JP 3399549 B2 JP3399549 B2 JP 3399549B2 JP 09761591 A JP09761591 A JP 09761591A JP 9761591 A JP9761591 A JP 9761591A JP 3399549 B2 JP3399549 B2 JP 3399549B2
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、微生物（Arthromyces
ramosus）由来のペルオキシダーゼをコード するcDNAお
よび該遺伝子を含む宿主細胞を用いてペルオキシダーゼ
を製造する方法に関するものである。
ramosus）由来のペルオキシダーゼをコード するcDNAお
よび該遺伝子を含む宿主細胞を用いてペルオキシダーゼ
を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ペルオキシダーゼは、過酸化水素の存在
下で種々の化合物を酸化する酵素であり、近年臨床診断
用試薬として、グルコース、コレステロール、リン脂質
および尿素の定量に種々のオキシダーゼと共に使用され
ている。又、酵素免疫反応法における標識酵素としても
使用されているが、その供給源としては主に西洋ワサ
ビ、大根等の植物が用いられている。しかしながら、こ
れらの植物由来のペルオキシダーゼには、性質が僅かず
つ異なるアイソザイムが含まれるため、診断用試薬に用
いる純粋な酵素を得るためには、多くの労力とコストが
必要となる。
下で種々の化合物を酸化する酵素であり、近年臨床診断
用試薬として、グルコース、コレステロール、リン脂質
および尿素の定量に種々のオキシダーゼと共に使用され
ている。又、酵素免疫反応法における標識酵素としても
使用されているが、その供給源としては主に西洋ワサ
ビ、大根等の植物が用いられている。しかしながら、こ
れらの植物由来のペルオキシダーゼには、性質が僅かず
つ異なるアイソザイムが含まれるため、診断用試薬に用
いる純粋な酵素を得るためには、多くの労力とコストが
必要となる。
【０００３】一方、微生物起源のペルオキシダーゼも各
種知られている。しかしながら、例えば、細菌及び糸状
菌の生産するチトクロームｃペルオキシダーゼやNADHペ
ルオキシダーゼなどは通常の西洋ワサビ及び大根のそれ
ぞれに由来するような非特異的なペルオキシダーゼでは
なく、その特異性の面で臨床診断用試薬に用いるには不
適である。近年、Ｏ−ジアニシジンを水素供与体とする
ペルオキシダーゼが、大腸菌及びミロセシウム属に属す
る微生物から生産されたが、Ｏ−ジアニシジンは発ガン
作用を有するため、その臨床診断薬への使用は回避され
る傾向にあり、やはり上記診断薬としての使用には適し
ていない。
種知られている。しかしながら、例えば、細菌及び糸状
菌の生産するチトクロームｃペルオキシダーゼやNADHペ
ルオキシダーゼなどは通常の西洋ワサビ及び大根のそれ
ぞれに由来するような非特異的なペルオキシダーゼでは
なく、その特異性の面で臨床診断用試薬に用いるには不
適である。近年、Ｏ−ジアニシジンを水素供与体とする
ペルオキシダーゼが、大腸菌及びミロセシウム属に属す
る微生物から生産されたが、Ｏ−ジアニシジンは発ガン
作用を有するため、その臨床診断薬への使用は回避され
る傾向にあり、やはり上記診断薬としての使用には適し
ていない。
【０００４】このような状況下に、本発明者らは従来の
西洋ワサビあるいは大根に由来するペルオキシダーゼと
同様に、臨床診断用試薬及び酵素免疫試験における標識
酵素などとして使用できる微生物起源のペルオキシダー
ゼを自然界からスクリーニングして、アルスロマイセス
（Arthromyces）属の真菌が生産するペルオキシダー ゼ
が有効であることを見いだしている（特開昭61-43987
号）。アルスロマイセス属のペルオキシダーゼは、臨床
診断薬及び酵素免疫試験における標識酵素として、例え
ば過酸化物の測定のための化学発光剤を用いる系での化
学発光触媒能が、従来知られていたペルオキシダーゼに
比べて著しく優れていることも明らかにされている（特
開昭63-219398号)。
西洋ワサビあるいは大根に由来するペルオキシダーゼと
同様に、臨床診断用試薬及び酵素免疫試験における標識
酵素などとして使用できる微生物起源のペルオキシダー
ゼを自然界からスクリーニングして、アルスロマイセス
（Arthromyces）属の真菌が生産するペルオキシダー ゼ
が有効であることを見いだしている（特開昭61-43987
号）。アルスロマイセス属のペルオキシダーゼは、臨床
診断薬及び酵素免疫試験における標識酵素として、例え
ば過酸化物の測定のための化学発光剤を用いる系での化
学発光触媒能が、従来知られていたペルオキシダーゼに
比べて著しく優れていることも明らかにされている（特
開昭63-219398号)。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】アルスロマイセスのペ
ルオキシダーゼは、上記のとおり臨床診断薬および酵素
免疫試験の使用に理想的な酵素であるが、アルスロマイ
セスは真菌であるためその大量培養が困難で、ペルオキ
シダーゼの安価な取得が困難であるという問題がある。
また酵素の分子レベルでの作用機作を明らかにするため
には、酵素蛋白質のアミノ酸配列を知る必要がある。さ
らに、そのアミノ酸配列を知ることにより、ペルオキシ
ダーゼの分子レベルでの改良、即ち蛋白質工学的な手法
による改良が可能となる。以上の問題点を解決するため
には遺伝子工学的手法を利用する必要があるが、当該ア
ルスロマイセス属由来のペルオキシダーゼ遺伝子は取得
されておらず、当該酵素を大量に生産したり、蛋白質工
学的手法による酵素の改良が出来ない状況にあった。
ルオキシダーゼは、上記のとおり臨床診断薬および酵素
免疫試験の使用に理想的な酵素であるが、アルスロマイ
セスは真菌であるためその大量培養が困難で、ペルオキ
シダーゼの安価な取得が困難であるという問題がある。
また酵素の分子レベルでの作用機作を明らかにするため
には、酵素蛋白質のアミノ酸配列を知る必要がある。さ
らに、そのアミノ酸配列を知ることにより、ペルオキシ
ダーゼの分子レベルでの改良、即ち蛋白質工学的な手法
による改良が可能となる。以上の問題点を解決するため
には遺伝子工学的手法を利用する必要があるが、当該ア
ルスロマイセス属由来のペルオキシダーゼ遺伝子は取得
されておらず、当該酵素を大量に生産したり、蛋白質工
学的手法による酵素の改良が出来ない状況にあった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、アルスロマ
イセスのペルオキシダーゼ遺伝子のcDNAを取得し、当該
遺伝子の塩基配列及び当該酵素のアミノ酸配列を明らか
にすることに成功し、本発明を完成するに至った。これ
により、アルスロマイセス属由来のペルオキシダーゼを
例えば、培養の容易な大腸菌や酵母のような適当な宿主
で大量に生産することや、ペルオキシダーゼを遺伝子工
学的手法により改良することなどの手段を講じることが
可能になった。
問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、アルスロマ
イセスのペルオキシダーゼ遺伝子のcDNAを取得し、当該
遺伝子の塩基配列及び当該酵素のアミノ酸配列を明らか
にすることに成功し、本発明を完成するに至った。これ
により、アルスロマイセス属由来のペルオキシダーゼを
例えば、培養の容易な大腸菌や酵母のような適当な宿主
で大量に生産することや、ペルオキシダーゼを遺伝子工
学的手法により改良することなどの手段を講じることが
可能になった。
【０００７】すなわち、本発明は、アルスロマイセス属
由来のペルオキシダーゼ遺伝子またはそれと生物学的に
実質的に同等な遺伝子、当該遺伝子を含有する組み換え
ベクター、当該遺伝子を含有するプラスミドで形質転換
された宿主細胞、および当該細胞を培養して得られるペ
ルオキシダーゼの製造法を提供するものである。
由来のペルオキシダーゼ遺伝子またはそれと生物学的に
実質的に同等な遺伝子、当該遺伝子を含有する組み換え
ベクター、当該遺伝子を含有するプラスミドで形質転換
された宿主細胞、および当該細胞を培養して得られるペ
ルオキシダーゼの製造法を提供するものである。
【０００８】本発明のペルオキシダーゼ遺伝子を取得す
るには、アルスロマイセス属糸状菌を用いることができ
る。例えば、アルスロマイセス・ラモサス（Arthromyce
s ramosus)（SAM0003と命名され工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条寄第８３８号；FERM BP-838とし
て寄託されている）を用いることが出来る。その他、
アルスロマイセス属糸状菌のペルオキシダーゼと生物学
的に同等の活性を有するペルオキシダーゼを生産する微
生物も存在する可能性もあり、そのような微生物を出発
材料に用いることもできる。
るには、アルスロマイセス属糸状菌を用いることができ
る。例えば、アルスロマイセス・ラモサス（Arthromyce
s ramosus)（SAM0003と命名され工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条寄第８３８号；FERM BP-838とし
て寄託されている）を用いることが出来る。その他、
アルスロマイセス属糸状菌のペルオキシダーゼと生物学
的に同等の活性を有するペルオキシダーゼを生産する微
生物も存在する可能性もあり、そのような微生物を出発
材料に用いることもできる。
【０００９】なお、本明細書中において、「生物学的に
同等の」という用語を用いる場合は、本発明の遺伝子が
コードするペルオキシダーゼの性質に関して、特開昭61
-43987号に記載された製造方法で得られた酵素と実質的
に同じであり、さらに特開昭63-219398号に記載された
優れた性質も具備する酵素を全て包含することを意味す
る。
同等の」という用語を用いる場合は、本発明の遺伝子が
コードするペルオキシダーゼの性質に関して、特開昭61
-43987号に記載された製造方法で得られた酵素と実質的
に同じであり、さらに特開昭63-219398号に記載された
優れた性質も具備する酵素を全て包含することを意味す
る。
【００１０】上記出発微生物からのmRNAの単離、cDNAラ
イブラリーの作製、スクリーニングは公知の方法によっ
て行うことが出来る。そのような方法は、例えばSambro
okらのMolecular Cloning 第２版(Cold Spring Harbor,
1989) に記載されている。例示のために説明すれば、本
発明のペルオキシダーゼをコードする遺伝子は、次のよ
うにして得ることが出来る。
イブラリーの作製、スクリーニングは公知の方法によっ
て行うことが出来る。そのような方法は、例えばSambro
okらのMolecular Cloning 第２版(Cold Spring Harbor,
1989) に記載されている。例示のために説明すれば、本
発明のペルオキシダーゼをコードする遺伝子は、次のよ
うにして得ることが出来る。
【００１１】アルスロマイセスの細胞よりpolyＡ RNAを
抽出する。これを鋳型としてcDNAを合成し、クローニン
グ用ファージベクター、例えばλgt10に組み込み大腸菌
等の宿主を形質転換する。得られたｃＤＮＡライブラリ
ーをペルオキシダーゼの部分アミノ酸配列に対応する合
成ＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることによ
り、目的のペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片を
含む陽性クローンを得ることが出来る。そのようなＤＮ
Ａプローブは、アルスロマイセス属の培養物から目的の
ペルオキシダーゼ蛋白質を後述のようにして精製し、そ
のアミノ酸配列の少なくとも一部分を明らかにし、その
配列から推定して合成することが出来る。また、ポリメ
ラーゼ鎖反応（ＰＣＲ；Polymerase chain reaction）
の手法を用いることによりさらに長いプローブ断片を調
製することも出来る。
抽出する。これを鋳型としてcDNAを合成し、クローニン
グ用ファージベクター、例えばλgt10に組み込み大腸菌
等の宿主を形質転換する。得られたｃＤＮＡライブラリ
ーをペルオキシダーゼの部分アミノ酸配列に対応する合
成ＤＮＡプローブを用いてスクリーニングすることによ
り、目的のペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ断片を
含む陽性クローンを得ることが出来る。そのようなＤＮ
Ａプローブは、アルスロマイセス属の培養物から目的の
ペルオキシダーゼ蛋白質を後述のようにして精製し、そ
のアミノ酸配列の少なくとも一部分を明らかにし、その
配列から推定して合成することが出来る。また、ポリメ
ラーゼ鎖反応（ＰＣＲ；Polymerase chain reaction）
の手法を用いることによりさらに長いプローブ断片を調
製することも出来る。
【００１２】陽性クローン中に全長ｃＤＮＡが得られな
い場合は、さらに長いｃＤＮＡを得るために、上記陽性
クローンからファージＤＮＡを調製し、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで消化して得られるＤＮＡ断片をプローブとして同
じライブラリーをスクリーニングすると陽性クローンが
いくつか得られる。これらのクローンのファージＤＮＡ
を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して得られるＤＮＡ断片
を、適当なベクター、例えばＭ１３ｍｐ１８あるいはＭ
１３ｍｐ１９にサブクローンして、その挿入ＤＮＡ断片
の塩基配列をダイデオキシシークエンス法等によって決
定することが出来る。
い場合は、さらに長いｃＤＮＡを得るために、上記陽性
クローンからファージＤＮＡを調製し、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで消化して得られるＤＮＡ断片をプローブとして同
じライブラリーをスクリーニングすると陽性クローンが
いくつか得られる。これらのクローンのファージＤＮＡ
を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して得られるＤＮＡ断片
を、適当なベクター、例えばＭ１３ｍｐ１８あるいはＭ
１３ｍｐ１９にサブクローンして、その挿入ＤＮＡ断片
の塩基配列をダイデオキシシークエンス法等によって決
定することが出来る。
【００１３】一方、精製したペルオキシダーゼ蛋白質を
分析し、アミノ酸組成、アミノ末端、カルボキシル末端
のアミノ酸配列を決定し、これと上記の方法で明らかに
したＤＮＡ塩基配列から推定されるアミノ酸配列とを比
較することにより、目的の全長ｃＤＮＡの配列を明らか
にすることが出来る。
分析し、アミノ酸組成、アミノ末端、カルボキシル末端
のアミノ酸配列を決定し、これと上記の方法で明らかに
したＤＮＡ塩基配列から推定されるアミノ酸配列とを比
較することにより、目的の全長ｃＤＮＡの配列を明らか
にすることが出来る。
【００１４】得られたｃＤＮＡを発現させるための宿主
細胞としては、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌
（Bacillus subtilis）などの細菌および酵母、糸状菌
等を用 いることが出来る。
細胞としては、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌
（Bacillus subtilis）などの細菌および酵母、糸状菌
等を用 いることが出来る。
【００１５】得られたペルオキシダーゼ遺伝子および好
ましくは該遺伝子のシグナル配列を、適当なプロモータ
ーおよびターミネーターと共に含有するプラスミドで宿
主細胞を形質転換してペルオキシダーゼを製造すること
ができる。例えば、新免ら（Agric.Biol.Chem.,50, 247
-249,1986）により記載された方法に従って、適当な炭
素源、窒素源及び微量の金属元素を含む培地中で、当該
形質転換細胞を培養する。得られた培養物を回収し、細
胞抽出液または好ましくは培養上清から目的の酵素を、
沈澱法、吸着法、分子篩、電気泳動等の公知の方法を組
み合わせて精製する。例えば、硫安沈澱（約７５％飽
和）処理し、種々のカラムクロマトグラフィー（例え
ば、DEAE-セルロースカラムクロマトグラフィー及びウ
ルトロゲルAcA44カラムクロマトグラフィーなど）を用
いて精製することにより、所望のペルオキシダーゼが得
られる。得られた、ペルオキシダーゼは、特開昭６１−
４３９８７号に記載されているペルオキシダーゼと同様
に優れた性質を有していることが期待される。
ましくは該遺伝子のシグナル配列を、適当なプロモータ
ーおよびターミネーターと共に含有するプラスミドで宿
主細胞を形質転換してペルオキシダーゼを製造すること
ができる。例えば、新免ら（Agric.Biol.Chem.,50, 247
-249,1986）により記載された方法に従って、適当な炭
素源、窒素源及び微量の金属元素を含む培地中で、当該
形質転換細胞を培養する。得られた培養物を回収し、細
胞抽出液または好ましくは培養上清から目的の酵素を、
沈澱法、吸着法、分子篩、電気泳動等の公知の方法を組
み合わせて精製する。例えば、硫安沈澱（約７５％飽
和）処理し、種々のカラムクロマトグラフィー（例え
ば、DEAE-セルロースカラムクロマトグラフィー及びウ
ルトロゲルAcA44カラムクロマトグラフィーなど）を用
いて精製することにより、所望のペルオキシダーゼが得
られる。得られた、ペルオキシダーゼは、特開昭６１−
４３９８７号に記載されているペルオキシダーゼと同様
に優れた性質を有していることが期待される。
【００１６】
【実施例】以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明
する。実験の手順は、特に記載しない限り、Sambrookら
のMolecular Cloning 第２版(Cold Spring Harbor,198
9) によった。
する。実験の手順は、特に記載しない限り、Sambrookら
のMolecular Cloning 第２版(Cold Spring Harbor,198
9) によった。
【００１７】実施例１ ペルオキシダーゼ蛋白質のアミ
ノ酸組成の分析 ペルオキシダーゼ蛋白質のアミノ酸組成の分析は、市販
のアルスロマイセス由来ペルオキシダーゼ（サントリー
から販売）を用いて行った。はじめに、アミノ酸組成を
常法により分析した。分析方法の詳細は、高橋、池中ら
の生化学実験講座１、蛋白質の化学II（東京化学同
人）、綱沢、崎山らの続生化学実験講座２、蛋白質の化
学（上）に示されている。すなわち、まずペルオキシダ
ーゼ蛋白質 5n mole を６Ｎ塩酸と共に、減圧下封管し、
110 ℃、24時間加水分解を行った。得られた反応液中の
遊離アミノ酸をアミノ酸分析機（アミノ酸自動分析機83
5型；日立社製）により定量し、アミノ酸組成を決定し
た（第１表）。
ノ酸組成の分析 ペルオキシダーゼ蛋白質のアミノ酸組成の分析は、市販
のアルスロマイセス由来ペルオキシダーゼ（サントリー
から販売）を用いて行った。はじめに、アミノ酸組成を
常法により分析した。分析方法の詳細は、高橋、池中ら
の生化学実験講座１、蛋白質の化学II（東京化学同
人）、綱沢、崎山らの続生化学実験講座２、蛋白質の化
学（上）に示されている。すなわち、まずペルオキシダ
ーゼ蛋白質 5n mole を６Ｎ塩酸と共に、減圧下封管し、
110 ℃、24時間加水分解を行った。得られた反応液中の
遊離アミノ酸をアミノ酸分析機（アミノ酸自動分析機83
5型；日立社製）により定量し、アミノ酸組成を決定し
た（第１表）。
【００１８】
* ＡｓｘはＡｓｎとＡｓｐの合計を示す。
【００１９】** Ｇｌｘは、ＧｌｎとＧｌｕの合計を示
す。
す。
【００２０】*** （ ）内の数字は、ＤＮＡ塩基配列か
ら計算したアミノ酸数を示す。
ら計算したアミノ酸数を示す。
【００２１】次に、ペルオキシダーゼ蛋白質のアミノ末
端からのアミノ酸配列を調べるため、ペルオキシダーゼ
蛋白質を還元カルボキシメチル化したのち逆相ＨＰＬＣ
による精製を行った。すなわち、ペルオキシダーゼ100
mg (2.5 μmole)を3.0mlの変性バッファー (6M Gdn・HC
l, 10 mM EDTA・2Naを含むTris・HClpH8.5)に溶解し、50
℃で１時間インキュベートした。143 μmole (10μl)の
２−メルカプトエタノールを加え、反応系を窒素置換し
たのち、37℃で１時間インキュベートした。次いで、１
Ｍヨード酢酸ナトリウム（変性バッファーに溶解、0.20
7 g/ml)150 μlを加え、NaOH溶液にてpHを8.0 - 8.5に
調整した。反応系を窒素置換し、遮光して37℃で１時間
インキュベートした。この間反応系のpHを8.0 - 8.5に
維持した。反応後、反応液をH2Oに対して充分透析し
た。透析内液を以下の条件の逆相ＨＰＬＣにかけ、蛋白
質画分を分取し、濃縮後凍結乾燥した（逆相ＨＰＬＣ条
件、カラム： Zorbax Pro10 ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＬＵＳ
２０φ；流速：4.0 ml/min；移動相：Ａ＝0.05 % TFA
in H2O,Ｂ＝CH3CN: A ＝8:2 (v/v)、検出： A280）。
蛋白質の回収率は16％であった。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより、分子量約４０Ｋと３０Ｋの２つの蛋白分子種
のみを蛋白質画分に確認した。
端からのアミノ酸配列を調べるため、ペルオキシダーゼ
蛋白質を還元カルボキシメチル化したのち逆相ＨＰＬＣ
による精製を行った。すなわち、ペルオキシダーゼ100
mg (2.5 μmole)を3.0mlの変性バッファー (6M Gdn・HC
l, 10 mM EDTA・2Naを含むTris・HClpH8.5)に溶解し、50
℃で１時間インキュベートした。143 μmole (10μl)の
２−メルカプトエタノールを加え、反応系を窒素置換し
たのち、37℃で１時間インキュベートした。次いで、１
Ｍヨード酢酸ナトリウム（変性バッファーに溶解、0.20
7 g/ml)150 μlを加え、NaOH溶液にてpHを8.0 - 8.5に
調整した。反応系を窒素置換し、遮光して37℃で１時間
インキュベートした。この間反応系のpHを8.0 - 8.5に
維持した。反応後、反応液をH2Oに対して充分透析し
た。透析内液を以下の条件の逆相ＨＰＬＣにかけ、蛋白
質画分を分取し、濃縮後凍結乾燥した（逆相ＨＰＬＣ条
件、カラム： Zorbax Pro10 ＰＲＯＴＥＩＮ ＰＬＵＳ
２０φ；流速：4.0 ml/min；移動相：Ａ＝0.05 % TFA
in H2O,Ｂ＝CH3CN: A ＝8:2 (v/v)、検出： A280）。
蛋白質の回収率は16％であった。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにより、分子量約４０Ｋと３０Ｋの２つの蛋白分子種
のみを蛋白質画分に確認した。
【００２２】上記のようにして調製した5 nmolの還元カ
ルボキシメチル化ペルオキシダーゼ蛋白質のＮ末端のア
ミノ酸配列を気相プロテインシークエンサー（島津製作
所製）により分析したところ、遊離ＰＴＨ−アミノ酸を
検出することができず、Ｎ−末端アミノ酸が保護されて
いることが明らかになった。そこで還元カルボキシメチ
ル化ペルオキシダーゼ蛋白質のＮ−末端の脱保護を以下
のように行った。
ルボキシメチル化ペルオキシダーゼ蛋白質のＮ末端のア
ミノ酸配列を気相プロテインシークエンサー（島津製作
所製）により分析したところ、遊離ＰＴＨ−アミノ酸を
検出することができず、Ｎ−末端アミノ酸が保護されて
いることが明らかになった。そこで還元カルボキシメチ
ル化ペルオキシダーゼ蛋白質のＮ−末端の脱保護を以下
のように行った。
【００２３】還元カルボキシメチル化ペルオキシダーゼ
溶液(in H2O, 100 nmol/ml)を窒素ガス気流をふきつけ
ることにより100 nmol/0.5 mlにまで濃縮し、ここに反
応用緩衝液（0.25 Mリン酸ナトリウム緩衝液、0.05 M
ＥＤＴＡ， 5 mM2-メルカプトエタノール）30μｌを添
加し、NaOH溶液でpHを７に調製した。ここに85Ｕ(Sigma
社のBacillus amyloliquefaciens起源）のピログルタミ
ルペプチダーゼ(Sigma社の原液で５μ）を加え、37℃で
18 hr反応させた。反応液60μl（ペルオキシダーゼ12 n
mol）を２回に分けてシークエンサーにアプライし、ア
ミノ酸配列を決定した。
溶液(in H2O, 100 nmol/ml)を窒素ガス気流をふきつけ
ることにより100 nmol/0.5 mlにまで濃縮し、ここに反
応用緩衝液（0.25 Mリン酸ナトリウム緩衝液、0.05 M
ＥＤＴＡ， 5 mM2-メルカプトエタノール）30μｌを添
加し、NaOH溶液でpHを７に調製した。ここに85Ｕ(Sigma
社のBacillus amyloliquefaciens起源）のピログルタミ
ルペプチダーゼ(Sigma社の原液で５μ）を加え、37℃で
18 hr反応させた。反応液60μl（ペルオキシダーゼ12 n
mol）を２回に分けてシークエンサーにアプライし、ア
ミノ酸配列を決定した。
【００２４】その結果、Ｎ末端の保護基はピログルタミ
ル基であることが判明し、20残基分のＮ末端領域のアミ
ノ酸配列を、(Gln)-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-
Val-Thr-Cys-Pro-Gly-Gly-Gln-Ser-Thr-Ser-Asn と決定した（配列表中、21残基目のGlnから40残基目のA
snの部分）。ただし、(Gln)はピログルタミル基である
ことを表す。
ル基であることが判明し、20残基分のＮ末端領域のアミ
ノ酸配列を、(Gln)-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-
Val-Thr-Cys-Pro-Gly-Gly-Gln-Ser-Thr-Ser-Asn と決定した（配列表中、21残基目のGlnから40残基目のA
snの部分）。ただし、(Gln)はピログルタミル基である
ことを表す。
【００２５】次に、ペルオキシダーゼ蛋白質の部分アミ
ノ酸配列の決定を以下のようにして行った。
ノ酸配列の決定を以下のようにして行った。
【００２６】還元カルボキシメチル化ペルオキシダーゼ
48 nmole (1.9 mg)を100μlの0.1 MNH4HCO3 pH 7.9に懸
濁した。ここにＴＰＣＫ−Trypsin (Worthington)の1%
溶液(in 0.0024 N HCl)2μlを添加し、35℃で６時間イ
ンキュベートした。液体中の白濁物は酵素添加後ただち
に消え、溶液は透明になった。反応後、反応液を凍結乾
燥することにより反応を停止した。凍結乾燥後、残渣を
70 %蟻酸に溶解しＨＰＬＣに供した。
48 nmole (1.9 mg)を100μlの0.1 MNH4HCO3 pH 7.9に懸
濁した。ここにＴＰＣＫ−Trypsin (Worthington)の1%
溶液(in 0.0024 N HCl)2μlを添加し、35℃で６時間イ
ンキュベートした。液体中の白濁物は酵素添加後ただち
に消え、溶液は透明になった。反応後、反応液を凍結乾
燥することにより反応を停止した。凍結乾燥後、残渣を
70 %蟻酸に溶解しＨＰＬＣに供した。
【００２７】得られたトリプシン消化物を逆相ＨＰＬＣ
にかけ、ペプチドフラグメントを分離した（逆相ＨＰＬ
Ｃ条件、カラム：Bakerbond Widepore C4 (350オングス
トローム) 6φ × 250;流速：1.0 ml/min ;圧力：80 Kg
/cm2;温度：Ambient;移動相：Ａ＝0.05 % TFA in H2O,
Ｂ＝CH3CN:Ａ＝8:2 (v/v);検出：A220）。得られた各ピ
ークを、逆相ＨＰＬＣによりさらに精製した。精製ペプ
チドのアミノ酸配列を決定した。それらの中で、つぎの
６つのペプチドの配列を気相プロテインシークエンサ
（島津製作所製）により、以下のように決定した（各ペ
プチドは、配列表中それぞれ次のように対応する。ペプ
チド１：１２５残基目のAlaから１５４残基目のArgま
で； ペプチド２：１６２残基目のSerから１８６残基
目のArgまで； ペプチド３：２４０残基目のGlyから２
６１残基目のPheまで； ペプチド４：２７５残基目のT
hrから２８８残基目のValまで； ペプチド５：３００
残基目のMetから３０７残基目のArgまで； ペプチド
６：３２５残基目のAlaから３３６残基目のAspまで）。
にかけ、ペプチドフラグメントを分離した（逆相ＨＰＬ
Ｃ条件、カラム：Bakerbond Widepore C4 (350オングス
トローム) 6φ × 250;流速：1.0 ml/min ;圧力：80 Kg
/cm2;温度：Ambient;移動相：Ａ＝0.05 % TFA in H2O,
Ｂ＝CH3CN:Ａ＝8:2 (v/v);検出：A220）。得られた各ピ
ークを、逆相ＨＰＬＣによりさらに精製した。精製ペプ
チドのアミノ酸配列を決定した。それらの中で、つぎの
６つのペプチドの配列を気相プロテインシークエンサ
（島津製作所製）により、以下のように決定した（各ペ
プチドは、配列表中それぞれ次のように対応する。ペプ
チド１：１２５残基目のAlaから１５４残基目のArgま
で； ペプチド２：１６２残基目のSerから１８６残基
目のArgまで； ペプチド３：２４０残基目のGlyから２
６１残基目のPheまで； ペプチド４：２７５残基目のT
hrから２８８残基目のValまで； ペプチド５：３００
残基目のMetから３０７残基目のArgまで； ペプチド
６：３２５残基目のAlaから３３６残基目のAspまで）。
【００２８】
ペプチド１： Ala-Val-Gly-Ile-Asn-His-Gly-Val-Ser-Phe-
Gly-Asp-Leu-Ile-Gln-Phe-Ala-Thr-Ala-Val-
Gly-Met-Ser-Asn-Cys-Pro-Gly-Ser-Pro-Arg
ペプチド２： Ser-Asn-Ser-Ser-Gln-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-
Leu-Ile-Pro-Gly-Pro-Gly-Asn-Thr-Val-Thr-
Ala-Ile-Leu-Asp-Arg
ペプチド３： Gly-Thr-Thr-Gln-Pro-Gly-Pro-Ser-Leu-Gly-
Phe-Ala-Glu-Glu-Leu-Ser-Pro-Phe-Pro-Gly-
Glu-Phe
ペプチド４： Thr-Ala-Cys-Arg-Trp-Gln-Ser-Met-Thr-Ser-
Ser-Asn-Glu-Val
ペプチド５： Met-Ser-Val-Leu-Gly-Phe-Asp-Arg
ペプチド６： Ala-Ala-Pro-Val-Ile-Pro-Gly-Gly-Leu-Thr-
Val-Asp
実施例２ アルスロマイセス ペルオキシダーゼのｃＤ
ＮＡクローニング （１）ｃＤＮＡライブラリーの作製 アルスロマイセスの菌体破砕は、液体窒素中、乳鉢で磨
砕して行った。この磨砕物から、グアニジンチオシアネ
ート／塩化セシウムを用いる方法によりＲＮＡを精製
し、さらにオリゴ（ｄＴ）セルロースを用いてpolyＡ・
ＲＮＡを分離した。グアニジンチオシアネート／塩化セ
シウムを用いる方法およびオリゴ（ｄＴ）セルロースに
よるpolyＡ・ＲＮＡの精製は、例えば R.McGookin, Rob
ert J.Slaterらの、Methods in Molecular Biology vol
2, (Humana Press Inc. 1984)に示されている。
ＮＡクローニング （１）ｃＤＮＡライブラリーの作製 アルスロマイセスの菌体破砕は、液体窒素中、乳鉢で磨
砕して行った。この磨砕物から、グアニジンチオシアネ
ート／塩化セシウムを用いる方法によりＲＮＡを精製
し、さらにオリゴ（ｄＴ）セルロースを用いてpolyＡ・
ＲＮＡを分離した。グアニジンチオシアネート／塩化セ
シウムを用いる方法およびオリゴ（ｄＴ）セルロースに
よるpolyＡ・ＲＮＡの精製は、例えば R.McGookin, Rob
ert J.Slaterらの、Methods in Molecular Biology vol
2, (Humana Press Inc. 1984)に示されている。
【００２９】すなわち、先ず上記磨砕物に４倍容の５Ｍ
グアニジンチオシアネート、50 mM Tris-HCl(pH7.5)、1
0 mM EDTA及び５％β-メルカプトエタノールを加えてさ
らに磨砕した。この磨砕液にＮ-ラウロイルサルコシン
及び塩化セシウムをそれぞれ終濃度４％（ｗ／ｖ）及び
０．１５ｇ／ｍｌとなるように加え溶解後、10、000g×2
0分間の遠心分離操作により上清を得た。遠心管に5.7 M
塩化セシウム、0. 1M EDTA（pH7.5)を加え、この上清
液を重層し、20℃で100,000g×18時間、遠心 分離した
（日立RPS28-A ローターを使用）。上清を除いて得た沈
澱を10mM Tris-HCl(pH7.5)に溶解し、6 M 酢酸アンモニ
ウムを終濃度 4％(v/v)及びエタノール を終濃度70％(v
/v) になるように加え、-80 ℃に一晩静置した後、遠心
分離により沈澱を回収した。沈澱は70％エタノールで洗
浄後、減圧乾燥し、滅菌水に溶解した。この溶液に10 M
塩化リチウムを加え、終濃度２Ｍとした後、氷水中に４
時間静置してＲＮＡを得た。
グアニジンチオシアネート、50 mM Tris-HCl(pH7.5)、1
0 mM EDTA及び５％β-メルカプトエタノールを加えてさ
らに磨砕した。この磨砕液にＮ-ラウロイルサルコシン
及び塩化セシウムをそれぞれ終濃度４％（ｗ／ｖ）及び
０．１５ｇ／ｍｌとなるように加え溶解後、10、000g×2
0分間の遠心分離操作により上清を得た。遠心管に5.7 M
塩化セシウム、0. 1M EDTA（pH7.5)を加え、この上清
液を重層し、20℃で100,000g×18時間、遠心 分離した
（日立RPS28-A ローターを使用）。上清を除いて得た沈
澱を10mM Tris-HCl(pH7.5)に溶解し、6 M 酢酸アンモニ
ウムを終濃度 4％(v/v)及びエタノール を終濃度70％(v
/v) になるように加え、-80 ℃に一晩静置した後、遠心
分離により沈澱を回収した。沈澱は70％エタノールで洗
浄後、減圧乾燥し、滅菌水に溶解した。この溶液に10 M
塩化リチウムを加え、終濃度２Ｍとした後、氷水中に４
時間静置してＲＮＡを得た。
【００３０】こうして得たＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セル
ロースカラムで分画した。オリゴ（ｄＴ）セルロースを
充填したカラムを１×カラム結合液〔20 mM Tris-HCl(p
H7.5),1 mM EDTA,0.5 M NaCl,0.2% SDS〕で平衡化し
た。次にＲＮＡ沈澱をカラム溶出液〔20 mM Tris-HCl(p
H7.5),1 mM EDTA,0.2% SDS〕に溶解し、65℃、５分間イ
ンキュベートした後、２×カラム結合液を等量加え、先
に平衡化したオリゴ（ｄＴ）カラムに通した。カラムを
１×カラム結合液で洗浄した後、カラム溶出液をカラム
に加え、溶出されてくるＲＮＡを回収した。この画分に
終濃度 0.15 Mと なるように2 M 酢酸ナトリウムを加
え、-80℃で一晩放置した後、遠心分離により沈澱を得
た。沈澱は70％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥後、
滅菌水に溶解した。
ロースカラムで分画した。オリゴ（ｄＴ）セルロースを
充填したカラムを１×カラム結合液〔20 mM Tris-HCl(p
H7.5),1 mM EDTA,0.5 M NaCl,0.2% SDS〕で平衡化し
た。次にＲＮＡ沈澱をカラム溶出液〔20 mM Tris-HCl(p
H7.5),1 mM EDTA,0.2% SDS〕に溶解し、65℃、５分間イ
ンキュベートした後、２×カラム結合液を等量加え、先
に平衡化したオリゴ（ｄＴ）カラムに通した。カラムを
１×カラム結合液で洗浄した後、カラム溶出液をカラム
に加え、溶出されてくるＲＮＡを回収した。この画分に
終濃度 0.15 Mと なるように2 M 酢酸ナトリウムを加
え、-80℃で一晩放置した後、遠心分離により沈澱を得
た。沈澱は70％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥後、
滅菌水に溶解した。
【００３１】こうして得られたpolyＡ・ＲＮＡを鋳型と
して、市販のｃＤＮＡ合成キット、ｃＤＮＡ合成システ
ム・プラス（アマシャム社製）を用いてキットに記載さ
れた方法でｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを大
腸菌ファージベクターλgt10に組み込み、大腸菌、例え
ばクローンテック社から購入可能なC600Hflを形質転 換
してｃＤＮＡライブラリーを得た。λgt10を用いたｃＤ
ＮＡライブラリーの作製は、市販のｃＤＮＡクローニン
グシステム−λgt10（アマシャム社製）を用いてキット
に記載された方法通りに行った。
して、市販のｃＤＮＡ合成キット、ｃＤＮＡ合成システ
ム・プラス（アマシャム社製）を用いてキットに記載さ
れた方法でｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを大
腸菌ファージベクターλgt10に組み込み、大腸菌、例え
ばクローンテック社から購入可能なC600Hflを形質転 換
してｃＤＮＡライブラリーを得た。λgt10を用いたｃＤ
ＮＡライブラリーの作製は、市販のｃＤＮＡクローニン
グシステム−λgt10（アマシャム社製）を用いてキット
に記載された方法通りに行った。
【００３２】（２）合成ＤＮＡを用いたスクリーニング
アミノ酸の部分配列から考えられる塩基配列を持つＤＮ
ＡをＤＮＡシンセサイザー371A（アプライドバイオシス
テム社）を用いて合成した。
ＡをＤＮＡシンセサイザー371A（アプライドバイオシス
テム社）を用いて合成した。
【００３３】はじめにＰＣＲ法によりペルオキシダーゼ
遺伝子の部分的なクローン化を行った。つまり、精製し
たpolyＡ・ＲＮＡからｃＤＮＡ合成キットを用いて相補
鎖を合成し、さらにそのｃＤＮＡをリンカー部分と部分
アミノ酸配列Trp-Gln-Ser-Met-Thrに対応する塩基配列
からなる合成ＤＮＡ 5'-CCCTGCAGGATCCATGTGGCA(AG)TC
(GATC)ATGAC-3' とリンカー部分とポリＴからなる合成
ＤＮＡ 5'-GCGAGCTCGGTACCCGGGTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'を
用いてＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅した。すなわち、Ge
neAmp TMKit(宝酒造）を用いキットに記載された方法で
反応液を調製した。反応は、94℃ 1.5分，45℃ 2.5分，
72℃ 3.4分を25サイクル行った。その後増幅した遺伝子
を制限酵素KpnIと BamHIで切断し、 M13mp18と M13mp19
にクローニングした。なお両端のプライマーの中にKpnI
と BamHIのサイトが存在する。そのクローンをシークエ
ンスしたところ、プライマーの塩基配列の他に、ペルオ
キシダーゼの部分アミノ酸配列に相当する塩基配列が見
つかった。従って、ペルオキシダーゼ遺伝子の一部分が
取得できた。この約0.4kbのペルオキシダーゼ遺伝子 の
部分配列を含むDNA断片をプローブとして約5000クロー
ンのcDNAライブラリー から次のようにスクリーニング
を行った。λgt10cDNAライブラリーを一枚のプレート当
り約1,000個のプラークが出るようにまいて37℃で培養
した。プレートに ナイロンメンブレン（アマシャム社
製）をおいて注射針で数カ所穴を開けプレートとメンブ
レンの相互の位置を決めておく。その後メンブレンをは
がし、プラーク側を上にして変性溶液（1.5M NaCl，0.
5M NaOH）に浸した濾紙上において、7分間放置した。
次に、中和溶液(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl pH7.2，0.
001M EDTA)を含む濾紙上におき5分間放置した。風乾
後、プラーク側を下にしてUVトランスイルミネーター上
に置き2-5分間照射してDNAを固定した。DNA-DNA ハイブ
リダイゼーションは、 Jeffreyと Flavell（Cell 12: 4
39-4391977）の方法に従い行った。即ち、DNAを固定し
たメンブランフィルターを65℃のハイブリダイゼーショ
ン溶液（6 ×SSC 、5 ×デンハルト溶液、0.5 ％ SDS、
10 μg/mlサケ精子DNA）に30分間浸した。メンブランを
厚手のナイロン袋に移し、32P で標識した106 〜108cpm
/μg のプローブ DNAを加えてハイブリダイゼーション
溶液中で65℃、16〜20時間反応させた。ハイブリダイゼ
ーション溶液を取り除いた後、メンブランフィルターを
洗浄用緩衝液〔5 ×SSC 、0.1 ％SDS(W/V)〕中65℃で15
分間の洗浄を４回行なった。このメンブランフィルター
を乾燥した後、Ｘ線フィルムと増感紙を用いて -80℃で
オートラジオグラフィーを行なった。
遺伝子の部分的なクローン化を行った。つまり、精製し
たpolyＡ・ＲＮＡからｃＤＮＡ合成キットを用いて相補
鎖を合成し、さらにそのｃＤＮＡをリンカー部分と部分
アミノ酸配列Trp-Gln-Ser-Met-Thrに対応する塩基配列
からなる合成ＤＮＡ 5'-CCCTGCAGGATCCATGTGGCA(AG)TC
(GATC)ATGAC-3' とリンカー部分とポリＴからなる合成
ＤＮＡ 5'-GCGAGCTCGGTACCCGGGTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'を
用いてＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅した。すなわち、Ge
neAmp TMKit(宝酒造）を用いキットに記載された方法で
反応液を調製した。反応は、94℃ 1.5分，45℃ 2.5分，
72℃ 3.4分を25サイクル行った。その後増幅した遺伝子
を制限酵素KpnIと BamHIで切断し、 M13mp18と M13mp19
にクローニングした。なお両端のプライマーの中にKpnI
と BamHIのサイトが存在する。そのクローンをシークエ
ンスしたところ、プライマーの塩基配列の他に、ペルオ
キシダーゼの部分アミノ酸配列に相当する塩基配列が見
つかった。従って、ペルオキシダーゼ遺伝子の一部分が
取得できた。この約0.4kbのペルオキシダーゼ遺伝子 の
部分配列を含むDNA断片をプローブとして約5000クロー
ンのcDNAライブラリー から次のようにスクリーニング
を行った。λgt10cDNAライブラリーを一枚のプレート当
り約1,000個のプラークが出るようにまいて37℃で培養
した。プレートに ナイロンメンブレン（アマシャム社
製）をおいて注射針で数カ所穴を開けプレートとメンブ
レンの相互の位置を決めておく。その後メンブレンをは
がし、プラーク側を上にして変性溶液（1.5M NaCl，0.
5M NaOH）に浸した濾紙上において、7分間放置した。
次に、中和溶液(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl pH7.2，0.
001M EDTA)を含む濾紙上におき5分間放置した。風乾
後、プラーク側を下にしてUVトランスイルミネーター上
に置き2-5分間照射してDNAを固定した。DNA-DNA ハイブ
リダイゼーションは、 Jeffreyと Flavell（Cell 12: 4
39-4391977）の方法に従い行った。即ち、DNAを固定し
たメンブランフィルターを65℃のハイブリダイゼーショ
ン溶液（6 ×SSC 、5 ×デンハルト溶液、0.5 ％ SDS、
10 μg/mlサケ精子DNA）に30分間浸した。メンブランを
厚手のナイロン袋に移し、32P で標識した106 〜108cpm
/μg のプローブ DNAを加えてハイブリダイゼーション
溶液中で65℃、16〜20時間反応させた。ハイブリダイゼ
ーション溶液を取り除いた後、メンブランフィルターを
洗浄用緩衝液〔5 ×SSC 、0.1 ％SDS(W/V)〕中65℃で15
分間の洗浄を４回行なった。このメンブランフィルター
を乾燥した後、Ｘ線フィルムと増感紙を用いて -80℃で
オートラジオグラフィーを行なった。
【００３４】その結果、6個の陽性クローンが取得で
き、その中でも挿入断片の長いC1とC2 クローンについ
てEcoRIで切断して、M13mp18 にサブクローニングし
た。サブクローンの方法は、後に示す。これをＤＮＡシ
ークエンサー ジェネシス2000（デュポン社製）を用い
てシークエンスしたところ、さらに既知のアミノ酸配列
に相当する塩基配列が見つかり、PCRで取得した遺伝子
の約 0.5kb上流からポリAまでを含む遺伝子を取得し
た。
き、その中でも挿入断片の長いC1とC2 クローンについ
てEcoRIで切断して、M13mp18 にサブクローニングし
た。サブクローンの方法は、後に示す。これをＤＮＡシ
ークエンサー ジェネシス2000（デュポン社製）を用い
てシークエンスしたところ、さらに既知のアミノ酸配列
に相当する塩基配列が見つかり、PCRで取得した遺伝子
の約 0.5kb上流からポリAまでを含む遺伝子を取得し
た。
【００３５】次に全長のcDNAを取得するためにC2クロー
ンのN末端側約 400bpをプローブと して約50,000個のcD
NAライブラリーから上記と同様の方法でスクリーニング
を行った。得られた20個のポジティブクローンのうち挿
入断片の長いC11 および C13クローンをEcoRI で切断し
M13mp19 にサブクローニングした。これをシークエンス
したところN末端のアミノ酸配列に相当する塩基配列が
見つかった。
ンのN末端側約 400bpをプローブと して約50,000個のcD
NAライブラリーから上記と同様の方法でスクリーニング
を行った。得られた20個のポジティブクローンのうち挿
入断片の長いC11 および C13クローンをEcoRI で切断し
M13mp19 にサブクローニングした。これをシークエンス
したところN末端のアミノ酸配列に相当する塩基配列が
見つかった。
【００３６】（３）サブクローニング
得られた陽性クローンのそれぞれからλgt10キットに示
された方法によりファージＤＮＡを調製し、EcoRIで消
化後、アガロースゲル電気泳動を行った。泳動 後ゲル
から目的の断片を切り出し、ジンクリーン（バイオ101
社）を用い記載さ れた操作方法に従ってDNAの回収、精
製を行った。さらに、フェノール／クロロ ホルム抽出
後、エタノール沈澱を行い、大腸菌ファージベクター M
13mp18をEcoRIで切断後アルカリホスファターゼで脱リ
ン酸させたものと結合し、大腸菌JM10 9株を形質転換し
た。
された方法によりファージＤＮＡを調製し、EcoRIで消
化後、アガロースゲル電気泳動を行った。泳動 後ゲル
から目的の断片を切り出し、ジンクリーン（バイオ101
社）を用い記載さ れた操作方法に従ってDNAの回収、精
製を行った。さらに、フェノール／クロロ ホルム抽出
後、エタノール沈澱を行い、大腸菌ファージベクター M
13mp18をEcoRIで切断後アルカリホスファターゼで脱リ
ン酸させたものと結合し、大腸菌JM10 9株を形質転換し
た。
【００３７】（４） 塩基配列とアミノ酸配列の比較
ペルオキシダーゼｃＤＮＡの塩基配列中、ペルオキシダ
ーゼをコードしている領域は配列表において開始コドン
ＡＴＧから始まり、終止コドンＴＧＡで終了する３６４
残基のアミノ酸配列からなる。実施例１で明らかにした
ペルオキシダーゼのアミノ末端からのアミノ酸配列は、
配列表中２１番目のGlnから始まっており、これ以降２
０残基目のAsnまでの合計２０残基のアミノ酸配列はＤ
ＮＡの配列から推定したアミノ酸配列と完全に一致し
た。また、そのほかの決定した部分アミノ酸配列（ペプ
チド１：１２５残基目のAlaから１５４残基目のArgま
で；ペプチド２：１６２残基目のSerから１８６残基目
のArgまで； ペプチド３：２４０残基目のGlyから２６
１残基目のPheまで； ペプチド４：２７５残基目のThr
から２８８残基目のValまで； ペプチド５：３００残
基目のMetから３０７残基目のArgまで；ペプチド６：３
２５残基目のAlaから３３６残基目のAspまで）に対応す
る塩基配列もみとめられた。
ーゼをコードしている領域は配列表において開始コドン
ＡＴＧから始まり、終止コドンＴＧＡで終了する３６４
残基のアミノ酸配列からなる。実施例１で明らかにした
ペルオキシダーゼのアミノ末端からのアミノ酸配列は、
配列表中２１番目のGlnから始まっており、これ以降２
０残基目のAsnまでの合計２０残基のアミノ酸配列はＤ
ＮＡの配列から推定したアミノ酸配列と完全に一致し
た。また、そのほかの決定した部分アミノ酸配列（ペプ
チド１：１２５残基目のAlaから１５４残基目のArgま
で；ペプチド２：１６２残基目のSerから１８６残基目
のArgまで； ペプチド３：２４０残基目のGlyから２６
１残基目のPheまで； ペプチド４：２７５残基目のThr
から２８８残基目のValまで； ペプチド５：３００残
基目のMetから３０７残基目のArgまで；ペプチド６：３
２５残基目のAlaから３３６残基目のAspまで）に対応す
る塩基配列もみとめられた。
【００３８】以上の結果から、クローン化されたｃＤＮ
Ａは、ペルオキシダーゼ遺伝子であると決定した。塩基
配列から明かとなった開始コドンＡＴＧでコードされる
Met から20残基目までのペプチド部分は成熟型ペルオキ
シダーゼには存在しない配列であり、この部分がシグナ
ルペプチドに相当すると考えられる。
Ａは、ペルオキシダーゼ遺伝子であると決定した。塩基
配列から明かとなった開始コドンＡＴＧでコードされる
Met から20残基目までのペプチド部分は成熟型ペルオキ
シダーゼには存在しない配列であり、この部分がシグナ
ルペプチドに相当すると考えられる。
【００３９】実施例３ ペルオキシダーゼタンパク質の
酵母での発現 実施例２で取得したアルスロマイセスのペルオキシダー
ゼの全長のｃＤＮＡを含む C13クローンから、全長のｃ
ＤＮＡを切り出し、酵母の発現プラスミドに挿入し、酵
母でのペルオキシダーゼ発現プラスミドを構築した。酵
母の発現プラスミドとしてはpYE22mを用いた。pYE22mの
構築は以下のような手順で行った。YRp7(Struhl,K.et a
l., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76, 1035-1039(1979); St
inchcomb,D.T.et al., Nature 282, 39-43(1979); Tsch
umper,G.およびCarbon,J., Gene10, 157-166(1980)(FER
M BP-3355))からBamHI とBglII でARS 領域（酵母染色
体複製開始点）を取り除いたプラスミドYRp7-arsのEcoR
I サイトに２μm ＤＮＡＢ−フォームよりIR領域（逆位
の繰り返し配列）１つを含むEcoRI 断片を挿入してpYE2
001 を構築した。このpYE2001 の２つのEcoRI サイトと
SalIサイトをフィルインして欠失させたプラスミドをpY
E2006 とした( 第１図) 。pYE2006 のIR領域の横にある
HindIII サイトに酵母染色体より取得した2.1 kbp のグ
リセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(GAP
DH) (Holland JP, Holland MJ, J.Biol.Chem., 245, 98
39-9845(1979); Ashikari,T.et al., Appl.Microbiol.B
iotechnol.30, 515-520(1989) を挿入してpYE2011 を構
築した。
酵母での発現 実施例２で取得したアルスロマイセスのペルオキシダー
ゼの全長のｃＤＮＡを含む C13クローンから、全長のｃ
ＤＮＡを切り出し、酵母の発現プラスミドに挿入し、酵
母でのペルオキシダーゼ発現プラスミドを構築した。酵
母の発現プラスミドとしてはpYE22mを用いた。pYE22mの
構築は以下のような手順で行った。YRp7(Struhl,K.et a
l., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76, 1035-1039(1979); St
inchcomb,D.T.et al., Nature 282, 39-43(1979); Tsch
umper,G.およびCarbon,J., Gene10, 157-166(1980)(FER
M BP-3355))からBamHI とBglII でARS 領域（酵母染色
体複製開始点）を取り除いたプラスミドYRp7-arsのEcoR
I サイトに２μm ＤＮＡＢ−フォームよりIR領域（逆位
の繰り返し配列）１つを含むEcoRI 断片を挿入してpYE2
001 を構築した。このpYE2001 の２つのEcoRI サイトと
SalIサイトをフィルインして欠失させたプラスミドをpY
E2006 とした( 第１図) 。pYE2006 のIR領域の横にある
HindIII サイトに酵母染色体より取得した2.1 kbp のグ
リセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(GAP
DH) (Holland JP, Holland MJ, J.Biol.Chem., 245, 98
39-9845(1979); Ashikari,T.et al., Appl.Microbiol.B
iotechnol.30, 515-520(1989) を挿入してpYE2011 を構
築した。
【００４０】合成ＤＮＡ 5'-TAAATAGAATTCATGGTTA-3'を
用いた部位特異的変異法により、pYE2011 のGAPDH 遺伝
子の開始コドンに接して上流にEcoRI サイトを導入して
プラスミドpYE2211 を構築した。pYE2211(Ashikari,T.e
t al., Appl.Microbiol.Biotechnol., 30, 515-520(198
9)) からEcoRI とSalIでGAPDH 構造遺伝子部分を取り除
き、代わりにpUC19 のマルチクローニングサイトのEcoR
I からSalIの部分を挿入してプラスミドpYE22mを構築し
た（第２図）。
用いた部位特異的変異法により、pYE2011 のGAPDH 遺伝
子の開始コドンに接して上流にEcoRI サイトを導入して
プラスミドpYE2211 を構築した。pYE2211(Ashikari,T.e
t al., Appl.Microbiol.Biotechnol., 30, 515-520(198
9)) からEcoRI とSalIでGAPDH 構造遺伝子部分を取り除
き、代わりにpUC19 のマルチクローニングサイトのEcoR
I からSalIの部分を挿入してプラスミドpYE22mを構築し
た（第２図）。
【００４１】C13 クローンをEcoRI で部分分解して得ら
れた約1.4kbpの断片（この断片がＰＯＤの全長のｃＤＮ
Ａ断片である）を、pYE22mをEcoRI で消化して得られる
約8.3kbpの断片とライゲーションし、得られたプラスミ
ドをpYEPOD1 とした（第３図）。このプラスミドにおい
てＰＯＤはグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナー
ゼプロモーターによって発現されるはずである。このプ
ラスミドで酵母（S.cerevisiae G-1315 株（Matα,trp
1) (H.Yoshizumi et al., J.Jpn.Soc.Starch Sci., 34,
148(1987)) を形質転換した。宿主としてはトリプトフ
ァン要求性株(trp1)であれば他のものでも用いることが
できる。形質転換の方法は、伊藤らの方法(Ito et al.,
J. Bacteriol. 153, 163(1983))によった。こうしてト
リプトファンの合成能の回復した形質転換株を得た。以
下、この形質転換株をG-1315(pYEP0D1) とする。
れた約1.4kbpの断片（この断片がＰＯＤの全長のｃＤＮ
Ａ断片である）を、pYE22mをEcoRI で消化して得られる
約8.3kbpの断片とライゲーションし、得られたプラスミ
ドをpYEPOD1 とした（第３図）。このプラスミドにおい
てＰＯＤはグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナー
ゼプロモーターによって発現されるはずである。このプ
ラスミドで酵母（S.cerevisiae G-1315 株（Matα,trp
1) (H.Yoshizumi et al., J.Jpn.Soc.Starch Sci., 34,
148(1987)) を形質転換した。宿主としてはトリプトフ
ァン要求性株(trp1)であれば他のものでも用いることが
できる。形質転換の方法は、伊藤らの方法(Ito et al.,
J. Bacteriol. 153, 163(1983))によった。こうしてト
リプトファンの合成能の回復した形質転換株を得た。以
下、この形質転換株をG-1315(pYEP0D1) とする。
【００４２】得られた形質転換体G-1315(pYEP0D1) を1%
カザミノ酸を加えたバークホルダー培地(P. R. Burkhol
der, Am. J. Bot., 30, 206(1943)) 5mlにて、30℃で48
時間振とう培養した。このうち、1 mlを集菌して上清
は、ウルトラフリーC3GC（ミリポア社）を用いて、約50
倍に濃縮した。菌体はヤッフェらの方法(M.P. Yaffe et
al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA., 81, 4819(1984)) で
酵母菌体から蛋白質を得た。これらをＳＤＳポリアクリ
ルアミド電気泳動を行い、ナイロンメンブレンにウェス
ターンブロッティングして、抗アルスロマイセスペルオ
キシダーゼ抗体を用いて酵素抗体法（例えば、今堀ら、
続生化学実験講座蛋白質の化学、東京化学同人(1987)）
にてその抗体と反応するものを検出したところ、菌体外
画分、菌体内画分共にアルスロマイセスペルオキシダー
ゼ蛋白とほぼ同じ位置に一本のバンドが見られた。また
プラスミドを持たない宿主G-1315には同じバンドは見ら
れなかったことから、アルスロマイセスペルオキシダー
ゼ蛋白が組み換え酵母で生産されていると考えられる
（第４図）。
カザミノ酸を加えたバークホルダー培地(P. R. Burkhol
der, Am. J. Bot., 30, 206(1943)) 5mlにて、30℃で48
時間振とう培養した。このうち、1 mlを集菌して上清
は、ウルトラフリーC3GC（ミリポア社）を用いて、約50
倍に濃縮した。菌体はヤッフェらの方法(M.P. Yaffe et
al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA., 81, 4819(1984)) で
酵母菌体から蛋白質を得た。これらをＳＤＳポリアクリ
ルアミド電気泳動を行い、ナイロンメンブレンにウェス
ターンブロッティングして、抗アルスロマイセスペルオ
キシダーゼ抗体を用いて酵素抗体法（例えば、今堀ら、
続生化学実験講座蛋白質の化学、東京化学同人(1987)）
にてその抗体と反応するものを検出したところ、菌体外
画分、菌体内画分共にアルスロマイセスペルオキシダー
ゼ蛋白とほぼ同じ位置に一本のバンドが見られた。また
プラスミドを持たない宿主G-1315には同じバンドは見ら
れなかったことから、アルスロマイセスペルオキシダー
ゼ蛋白が組み換え酵母で生産されていると考えられる
（第４図）。
【００４３】次に、残りの培養液4mlについて、上清と
菌体中のペルオキシダーゼ活性を測った。即ち、この培
養液を集菌して上清はそのまま原液でペルオキシダーゼ
活性を測った。菌体は10mMリン酸カリウム緩衝液１mlに
懸濁後、超音波で破砕し、遠心分離して上清を粗酵素液
とした。活性測定は以下の方法で行った。0.1 M リン酸
カリウム緩衝液(pH7.0) 1ml に、11.5mMフェノール溶液
1.3 ml、10 mM 4-アミノアンチピリン溶液0.25ml及び6
mM過酸化水素溶液0.2ml を加え、37℃に予熱後これにサ
ンプル0.25mlを加えて5 分間反応させる。反応後20％ア
ジ化ナトリウム溶液0.2 mlを加え、500 nmの吸光度を測
定して反応値とする。別にコントロールとしてサンプル
を加える前に 20%アジ化ナトリウム溶液0.2 mlを加えて
から反応を行い、同様の操作によって吸光度を測定しコ
ントロール値とする。ペルオキシダーゼの力価の単位
(U: ユニット) は１分間に１μモルの過酸化水素を消費
する酵素量として表され、サンプルのペルオキシダーゼ
力価（U/ml) は、 0.396 ×ΔＡ500 ×（サンプルの希釈率） で求められる。なお上式においてΔＡ500 は反応値から
コントロール値を引いた値を示す。測定の結果、菌体外
上清には15.6mU/ml の活性が認められ、菌体破砕後の上
清には活性はなかった。菌体外上清の蛋白質濃度は0.53
mg/ml でＰＯＤの比活性290U/ml から計算すると、菌体
外蛋白質の約0.01% が活性型のPOD 蛋白質として存在す
ることになる。
菌体中のペルオキシダーゼ活性を測った。即ち、この培
養液を集菌して上清はそのまま原液でペルオキシダーゼ
活性を測った。菌体は10mMリン酸カリウム緩衝液１mlに
懸濁後、超音波で破砕し、遠心分離して上清を粗酵素液
とした。活性測定は以下の方法で行った。0.1 M リン酸
カリウム緩衝液(pH7.0) 1ml に、11.5mMフェノール溶液
1.3 ml、10 mM 4-アミノアンチピリン溶液0.25ml及び6
mM過酸化水素溶液0.2ml を加え、37℃に予熱後これにサ
ンプル0.25mlを加えて5 分間反応させる。反応後20％ア
ジ化ナトリウム溶液0.2 mlを加え、500 nmの吸光度を測
定して反応値とする。別にコントロールとしてサンプル
を加える前に 20%アジ化ナトリウム溶液0.2 mlを加えて
から反応を行い、同様の操作によって吸光度を測定しコ
ントロール値とする。ペルオキシダーゼの力価の単位
(U: ユニット) は１分間に１μモルの過酸化水素を消費
する酵素量として表され、サンプルのペルオキシダーゼ
力価（U/ml) は、 0.396 ×ΔＡ500 ×（サンプルの希釈率） で求められる。なお上式においてΔＡ500 は反応値から
コントロール値を引いた値を示す。測定の結果、菌体外
上清には15.6mU/ml の活性が認められ、菌体破砕後の上
清には活性はなかった。菌体外上清の蛋白質濃度は0.53
mg/ml でＰＯＤの比活性290U/ml から計算すると、菌体
外蛋白質の約0.01% が活性型のPOD 蛋白質として存在す
ることになる。
【００４４】次に、大腸菌での発現も試みた。発現プラ
スミドとしてはpKK223-3（ファルマシア社より購入）を
用いた。上記と同様に調製したc13 クローンのEcoRI 断
片を、pkk223-3をEcoRI で消化して得られた約4.6 kbp
の断片とライゲーションし、得られたプラスミドをpKPO
D1とした。このプラスミドにおいて PODは tacプロモー
ターによって発現されるはずである。このプラスミドで
大腸菌WA802(ATCC33526)(F- metB1 lacY1 galK2 galT22
λ- supE44hsdR2)(Escherichia Coli Genet ic Stock
Center のB.Bachmann博士から供与) を形質転換し、ア
ンピシリン耐性を獲得した形質転換株を得た。以下、こ
の形質転換株をWA802(pKPOD1) とする。
スミドとしてはpKK223-3（ファルマシア社より購入）を
用いた。上記と同様に調製したc13 クローンのEcoRI 断
片を、pkk223-3をEcoRI で消化して得られた約4.6 kbp
の断片とライゲーションし、得られたプラスミドをpKPO
D1とした。このプラスミドにおいて PODは tacプロモー
ターによって発現されるはずである。このプラスミドで
大腸菌WA802(ATCC33526)(F- metB1 lacY1 galK2 galT22
λ- supE44hsdR2)(Escherichia Coli Genet ic Stock
Center のB.Bachmann博士から供与) を形質転換し、ア
ンピシリン耐性を獲得した形質転換株を得た。以下、こ
の形質転換株をWA802(pKPOD1) とする。
【００４５】得られた形質転換株WA802(pKPOD1) を２ml
のLB培地（AP 50 μg/ml, IPTG 1mM) にて、37℃で15時
間振とう培養した。このうち１mlを集菌してヤッフェら
の方法で菌体蛋白質を調製した。これを前記と同じく酵
素抗体法にて抗アルスロマイセスペルオキシダーゼ抗体
と反応するものを検出したところ、アルスロマイセスペ
ルオキシダーゼ蛋白と同じ位置に一本のバンドが見ら
れ、またプラスミドを持たない宿主WA802 には同じバン
ドは見られなかったことから、アルスロマイセスペルオ
キシダーゼ蛋白が組み換え大腸菌で生産されたと考えら
れる。
のLB培地（AP 50 μg/ml, IPTG 1mM) にて、37℃で15時
間振とう培養した。このうち１mlを集菌してヤッフェら
の方法で菌体蛋白質を調製した。これを前記と同じく酵
素抗体法にて抗アルスロマイセスペルオキシダーゼ抗体
と反応するものを検出したところ、アルスロマイセスペ
ルオキシダーゼ蛋白と同じ位置に一本のバンドが見ら
れ、またプラスミドを持たない宿主WA802 には同じバン
ドは見られなかったことから、アルスロマイセスペルオ
キシダーゼ蛋白が組み換え大腸菌で生産されたと考えら
れる。
【００４６】残りの1ml の培養液は集菌後酵母の場合と
同様に粗酵素液を調製し活性を測定したが、ペルオキシ
ダーゼ活性は認められなかった。
同様に粗酵素液を調製し活性を測定したが、ペルオキシ
ダーゼ活性は認められなかった。
【００４７】
【発明の効果】本発明により微生物由来のペルオキシダ
ーゼ遺伝子のｃＤＮＡが取得され、その塩基配列及びア
ミノ酸配列が明らかにされた。このｃＤＮＡを含むプラ
スミドで形質転換された酵母および大腸菌は、アルスロ
マイセスのペルオキシダーゼと同じ蛋白質を生産し、特
に酵母においてはペルオキシダーゼ活性も検出された。
本発明により、アルスロマイセス属由来のペルオキシダ
ーゼを遺伝子工学的技術を利用して大量に生産すること
や、ペルオキシダーゼを蛋白工学的手法により改良する
ことなどが可能になった。
ーゼ遺伝子のｃＤＮＡが取得され、その塩基配列及びア
ミノ酸配列が明らかにされた。このｃＤＮＡを含むプラ
スミドで形質転換された酵母および大腸菌は、アルスロ
マイセスのペルオキシダーゼと同じ蛋白質を生産し、特
に酵母においてはペルオキシダーゼ活性も検出された。
本発明により、アルスロマイセス属由来のペルオキシダ
ーゼを遺伝子工学的技術を利用して大量に生産すること
や、ペルオキシダーゼを蛋白工学的手法により改良する
ことなどが可能になった。
【００４８】
【配列表】配列番号：１
配列の長さ：１３８４
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列
AAACCCACCT GTTCTACTAC TAGTCCTCTT CCATTTTGTA TTTGAACGCT GTTTCCGACG 60
TCAAGAACGA CAACT ATG AAG CTC TCG CTT TTC TCC ACC TTC GCT GCT GTC 111
Met Lys Leu Ser Leu Phe Ser Thr Phe Ala Ala Val
1 5 10
ATC ATC GGT GCT CTC GCT CTC CCC CAG GGT CCT GGA GGA GGA GGC GGG 159
Ile Ile Gly Ala Leu Ala Leu Pro Gln Gly Pro Gly Gly Gly Gly Gly
15 20 25
TCA GTC ACT TGC CCG GGT GGA CAG TCC ACT TCG AAC AGC CAG TGC TGC 207
Ser Val Thr Cys Pro Gly Gly Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gln Cys Cys
30 35 40
GTC TGG TTC GAC GTT CTA GAC GAT CTT CAG ACC AAC TTC TAC CAA GGG 255
Val Trp Phe Asp Val Leu Asp Asp Leu Gln Thr Asn Phe Tyr Gln Gly
45 50 55 60
TCC AAG TGT GAG AGC CCT GTT CGC AAG ATT CTT AGA ATT GTT TTC CAT 303
Ser Lys Cys Glu Ser Pro Val Arg Lys Ile Leu Arg Ile Val Phe His
65 70 75
GAC GCG ATC GGA TTT TCG CCG GCG TTG ACT GCT GCT GGT CAA TTC GGT 351
Asp Ala Ile Gly Phe Ser Pro Ala Leu Thr Ala Ala Gly Gln Phe Gly
80 85 90
GGT GGA GGA GCT GAT GGC TCC ATC ATT GCG CAT TCG AAC ATC GAA TTG 399
Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Ile Ile Ala His Ser Asn Ile Glu Leu
95 100 105
GCC TTC CCG GCT AAT GGC GGC CTC ACC GAC ACC ATC GAA GCC CTC CGC 447
Ala Phe Pro Ala Asn Gly Gly Leu Thr Asp Thr Ile Glu Ala Leu Arg
110 115 120
GCG GTC GGT ATC AAC CAC GGC GTC TCT TTC GGC GAT CTC ATC CAA TTC 495
Ala Val Gly Ile Asn His Gly Val Ser Phe Gly Asp Leu Ile Gln Phe
125 130 135 140
GCC ACT GCC GTC GGC ATG TCC AAC TGC CCT GGC TCT CCT CGA CTT GAG 543
Ala Thr Ala Val Gly Met Ser Asn Cys Pro Gly Ser Pro Arg Leu Glu
145 150 155
TTC TTG ACG GGA AGA AGC AAC AGT TCC CAG CCC TCC CCT CCT TCG CTG 591
Phe Leu Thr Gly Arg Ser Asn Ser Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Leu
160 165 170
ATC CCG GGT CCT GGA AAC ACT GTC ACT GCT ATC TTG GAT CGT ATG GGC 639
Ile Pro Gly Pro Gly Asn Thr Val Thr Ala Ile Leu Asp Arg Met Gly
175 180 185
GAT GCA GGC TTC AGC CCT GAT GAA GTC GTT GAC TTG CTT GCT GCG CAT 687
Asp Ala Gly Phe Ser Pro Asp Glu Val Val Asp Leu Leu Ala Ala His
190 195 200
AGT TTG GCT TCT CAG GAA GGT TTG AAC TCG GCT ATT TTC AGG TCG CCT 735
Ser Leu Ala Ser Gln Glu Gly Leu Asn Ser Ala Ile Phe Arg Ser Pro
205 210 215 220
TTG GAC TCG ACC CCT CAA GTT TTC GAT ACC CAG TTC TAT ATC GAG ACC 783
Leu Asp Ser Thr Pro Gln Val Phe Asp Thr Gln Phe Tyr Ile Glu Thr
225 230 235
TTG CTC AAG GGA ACC ACT CAG CCC GGA CCC TCT CTC GGC TTT GCA GAG 831
Leu Leu Lys Gly Thr Thr Gln Pro Gly Pro Ser Leu Gly Phe Ala Glu
240 245 250
GAG CTC TCC CCC TTC CCT GGT GAA TTC CGC ATG AGG TCC GAC GCT CTC 879
Glu Leu Ser Pro Phe Pro Gly Glu Phe Arg Met Arg Ser Asp Ala Leu
255 260 265
TTG GCT CGC GAC TCC CGA ACC GCC TGC CGA TGG CAA TCC ATG ACC AGC 927
Leu Ala Arg Asp Ser Arg Thr Ala Cys Arg Trp Gln Ser Met Thr Ser
270 275 280
AGC AAT GAA GTT ATG GGC CAG CGA TAC CGC GCC GCC ATG GCC AAG ATG 975
Ser Asn Glu Val Met Gly Gln Arg Tyr Arg Ala Ala Met Ala Lys Met
285 290 295 300
TCT GTT CTC GGC TTC GAC AGG AAC GCC CTC ACC GAT TGC TCT GAC GTT 1023
Ser Val Leu Gly Phe Asp Arg Asn Ala Leu Thr Asp Cys Ser Asp Val
305 310 315
ATT CCT TCT GCT GTG TCC AAC AAC GCT GCT CCT GTT ATC CCT GGT GGC 1071
Ile Pro Ser Ala Val Ser Asn Asn Ala Ala Pro Val Ile Pro Gly Gly
320 325 330
CTT ACT GTC GAT GAT ATT GAG GTT TCG TGC CCG AGC GAG CCT TTC CCT 1119
Leu Thr Val Asp Asp Ile Glu Val Ser Cys Pro Ser Glu Pro Phe Pro
335 340 345
GAA ATT GCT ACC GCC TCA GGC CCT CTC CCC TCC CTC GCT CCT GCT CCT 1167
Glu Ile Ala Thr Ala Ser Gly Pro Leu Pro Ser Leu Ala Pro Ala Pro
350 355 360
TGATCTGGTG AAGATGGTAC ATCCTGCTCT CTCACGATCC CTCTTAGCTA TTTATCCAAT 1227
CTATCTACCT ATCTATGCAG TTTCTGTCCA CCCTCAGTTA TGAATATGAC TTGGTTATCT 1287
GTGTATCCGA CTCGGTGCTT GGCAGCACGT GTATGATATT ATATAATCAA TCATGAACGC 1347
ATTCCTCCGT GTGGGAGTGT GCGTCTTTCT CTCGGAG 1384
【図１】ペルオキシダーゼ蛋白質を酵母で発現するプラ
スミドpYEPOD1を構築する際のプラスミド中間体pYE2006
までの工程図である。
スミドpYEPOD1を構築する際のプラスミド中間体pYE2006
までの工程図である。
【図２】pYE2006からpYE22m迄の工程図である。
【図３】pYE22mから最終生産物のプラスミドpYEPOD1迄
の工程図である。
の工程図である。
【図４】pYEPOD1で形質転換した酵母が、ペルオキシダ
−ゼ蛋白質を産生することを示す電気泳動図である。
−ゼ蛋白質を産生することを示す電気泳動図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｎ 9/08
Ｃ１２Ｒ 1:645）
(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ
Ｃ１２Ｒ 1:645）
(72)発明者 柴野 裕次
大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１
号 サントリー株式会社 基礎研究所内
(72)発明者 天知 輝夫
大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１
号 サントリー株式会社 基礎研究所内
(72)発明者 中山 亨
大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１
号 サントリー株式会社 基礎研究所内
(72)発明者 角田 元男
大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１
号 サントリー株式会社 基礎研究所内
(56)参考文献 特開 昭63−219398（ＪＰ，Ａ)
特開 平２−174693（ＪＰ，Ａ)
特開 昭61−43987（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (6)
- 【請求項１】 下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列に
おいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは
付加されたアミノ酸配列を有する、ペルオキシダーゼ活
性を有するポリペプチドをコードする遺伝子： QGPGGGGGSV TCPGGQSTSN SQCCVWFDVL DDLQTNFYQG SKCESPVRKI LRIVFHDAIG FSPALTAAGQ FGGGGADGSI IAHSNIELAF PANGGLTDTI EALRAVGINH GVSFGDLIQF ATAVGMSNCP GSPRLEFLTG RSNSSQPSPP SLIPGPGNTV TAILDRMGDA GFSPDEVVDL LAAHSLASQE GLNSAIFRSP LDSTPQVFDT QFYIETLLKG TTQPGPSLGF AEELSPFPGE FRMRSDALLA RDSRTACRWQ SMTSSNEVMG QRYRAAMAKM SVLGFDRNAL TDCSDVIPSA VSNNAAPVIP GGLTVDDIEV SCPSEPFPEI ATASGPLPSL APAP （Ｉ） （但し、式（Ｉ）中のアルファベットは、以下のアミノ
酸を示す：Ａ；アラニン、Ｃ；システイン、Ｄ；アスパ
ラギン酸、Ｅ；グルタミン酸、Ｆ；フェニルアラニン、
Ｇ；グリシン、Ｈ；ヒスチジン、Ｉ；イソロイシン、
Ｋ；リシン、Ｌ；ロイシン、Ｍ；メチオニン、Ｎ；アス
パラギン、Ｐ；プロリン、Ｑ；グルタミン、Ｒ；アルギ
ニン、Ｓ；セリン、Ｔ；スレオニン、Ｖ；バリン、Ｗ；
トリプトファン、Ｙ；チロシン）。 - 【請求項２】 請求項１記載の式（Ｉ）で表されるアミ
ノ酸配列または該配列において１若しくは数個のアミノ
酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列のアミ
ノ末端に下記式（II）で表されるアミノ酸配列を有する
ペルオキシダーゼ前駆体のアミノ酸配列をコードする遺
伝子： MKLSLFSTFAAVIIGALALP （II） （但し、式（II）中のアルファベットは、以下のアミノ
酸を示す：Ａ；アラニン、Ｆ；フェニルアラニン、Ｇ；
グリシン、Ｉ；イソロイシン、Ｋ；リシン、Ｌ；ロイシ
ン、Ｍ；メチオニン、Ｐ；プロリン、Ｓ；セリン、Ｔ；
スレオニン、Ｖ；バリン）。 - 【請求項３】 下記式（III）で表される塩基配列、ま
たは該塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、
置換若しくは付加された塩基配列を有してペルオキシダ
ーゼ活性を有するタンパク質に発現可能なペルオキシダ
ーゼ遺伝子： ATGAAGCTCTCGCTTTTCTCCACCTTCGCTGCTGTCATCATCGGTGCTCTCGCTCTCCCC CAGGGTCCTGGAGGAGGAGGCGGGTCAGTCACTTGCCCGGGTGGACAGTCCACTTCGAACAGCCAGTGCTGC GTCTGGTTCGACGTTCTAGACGATCTTCAGACCAACTTCTACCAAGGGTCCAAGTGTGAGAGCCCTGTTCGC AAGATTCTTAGAATTGTTTTCCATGACGCGATCGGATTTTCGCCGGCGTTGACTGCTGCTGGTCAATTCGGT GGTGGAGGAGCTGATGGCTCCATCATTGCGCATTCGAACATCGAATTGGCCTTCCCGGCTAATGGCGGCCTC ACCGACACCATCGAAGCCCTCCGCGCGGTCGGTATCAACCACGGCGTCTCTTTCGGCGATCTCATCCAATTC GCCACTGCCGTCGGCATGTCCAACTGCCCTGGCTCTCCTCGACTTGAGTTCTTGACGGGAAGAAGCAACAGT TCCCAGCCCTCCCCTCCTTCGCTGATCCCGGGTCCTGGAAACACTGTCACTGCTATCTTGGATCGTATGGGC GATGCAGGCTTCAGCCCTGATGAAGTCGTTGACTTGCTTGCTGCGCATAGTTTGGCTTCTCAGGAAGGTTTG AACTCGGCTATTTTCAGGTCGCCTTTGGACTCGACCCCTCAAGTTTTCGATACCCAGTTCTATATCGAGACC TTGCTCAAGGGAACCACTCAGCCCGGACCCTCTCTCGGCTTTGCAGAGGAGCTCTCCCCCTTCCCTGGTGAA TTCCGCATGAGGTCCGACGCTCTCTTGGCTCGCGACTCCCGAACCGCCTGCCGATGGCAATCCATGACCAGC AGCAATGAAGTTATGGGCCAGCGATACCGCGCCGCCATGGCCAAGATGTCTGTTCTCGGCTTCGACAGGAAC GCCCTCACCGATTGCTCTGACGTTATTCCTTCTGCTGTGTCCAACAACGCTGCTCCTGTTATCCCTGGTGGC CTTACTGTCGATGATATTGAGGTTTCGTGCCCGAGCGAGCCTTTCCCTGAAATTGCTACCGCCTCAGGCCCT CTCCCCTCCCTCGCTCCTGCTCCT （III） - 【請求項４】 請求項２または３に記載のペルオキシダ
ーゼ遺伝子を有する組換えベクター。 - 【請求項５】 請求項４記載の組換えベクターにより形
質転換された酵母または糸状菌である宿主細胞。 - 【請求項６】 請求項５記載の宿主細胞を培養し、その
細胞内または培養液からペルオキシダーゼ活性を有する
ペルオキシダーゼを回収することを特徴とするペルオキ
シダーゼの製造法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09761591A JP3399549B2 (ja) | 1990-11-16 | 1991-04-26 | 微生物由来ペルオキシダーゼ遺伝子 |
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| CA002055698A CA2055698C (en) | 1990-11-16 | 1991-11-15 | Peroxidase gene of microbial origin |
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