JPH07308192A - α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 α−１，３／４−フコシダーゼの遺伝子、Ｄ
ＮＡ配列、及びアミノ酸配列を提供し、更にその遺伝子
工学的製造方法を提供する。 【構成】 単離されたα−１，３／４−フコシダーゼ遺
伝子。該特定の遺伝子にハイブリダイズ可能なα−１，
３／４−フコシダーゼ遺伝子。該単離した遺伝子を含有
させた組換えプラスミドを導入させた組換体を培養し、
該培養物からα−１，３／４−フコシダーゼを採取する
該酵素の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は糖鎖及び糖タンパク質の
構造や機能の解析等の糖鎖工学に有用なα−１，３／４
−フコシダーゼをコードする塩基配列及びそのアミノ酸
配列に関する。本発明は、また、該遺伝子を含有させた
組換えプラスミドを導入させた組換体を用いるα−１，
３／４−フコシダーゼの工業的な製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−フコースは糖タンパク質や糖脂質、
グリコサミノグリカンと言ったいわゆる複合糖質の構成
糖として、主に糖鎖の非還元末端に存在している。α−
１，３／４結合したフコースはルイス式血液型抗原や腫
瘍関連抗原、あるいは細胞接着因子であるセレクチンの
リガンドに含まれており、これらの糖鎖構造の解析ある
いは機能の解析のためにはα−１，３／４−フコシダー
ゼが極めて有用な試薬として用いられている。α−１，
３／４−フコシダーゼとしてはアーモンド由来のα−フ
コシダーゼＩ〔アーカイブズ オブ バイオケミストリ
ー アンド バイオフィジクス（Archieves of Biochem
istry and Biophysics) 、第１８１巻、第３５３〜３５
８頁（１９７７）、ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー（Journal of Biological chemistry)、
第２５７巻、第８２０５〜８２１０頁（１９８２）〕及
びα−フコシダーゼIII 〔ジャーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー、第２６５巻、第１６４７２〜１
６４７７頁（１９９０）〕、及びストレプトマイセス
（Streptomyces) 由来のもの〔ジャーナル オブ バイ
オロジカル ケミストリー、第２６７巻、第１５２２〜
１５２７頁（１９９２）〕が知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、アーモ
ンドミールあるいはアーモンドエムルシンからα−フコ
シダーゼを取得する方法は、アーモンド中に多種多様な
糖加水分解酵素が混在するためそれらと目的のα−フコ
シダーゼを完全に分離し、高度に精製するのは非常に困
難であった。またストレプトマイセス属放線菌を培養し
てα−１，３／４−フコシダーゼを取得する方法の場合
は、酵素の生産を誘導するために培養時に高価なＬ−フ
コースを添加する必要がある上に、同時にプロテアー
ゼ、ラクト−Ｎ−ビオシダーゼなどの酵素が生産され、
これらの酵素と分離精製することが困難であった。した
がって、より安価に高純度なα−１，３／４−フコシダ
ーゼを製造する方法が求められていた。従来α−１，３
／４−フコシダーゼをアーモンドやストレプトマイセス
属放線菌から精製する方法に関しては前述のように報告
があるが、α−１，３／４−フコシダーゼのアミノ酸配
列や遺伝子構造は不明である。また、α−１，３／４−
フコシダーゼの工業的に有利な製造方法についても開示
されていない。したがって本酵素の遺伝子が明らかとな
れば、遺伝子工学的に単一で高純度品の酵素製造が可能
となり、糖鎖及び糖タンパク質の構造や機能の解析等の
糖鎖工学に有用な酵素を製造することも可能になる。ま
た、本酵素のＤＮＡ配列により本酵素とは配列が異なる
が同様の酵素活性を持つと期待される本酵素類似の遺伝
子の探索も可能となる。本酵素のＤＮＡ配列に対応する
アミノ酸配列は本酵素の抗体を作製することに用いるの
にも有用である。本発明の目的は、α−１，３／４−フ
コシダーゼ遺伝子、そのＤＮＡ配列、及びそのアミノ酸
配列を提供し、α−１，３／４−フコシダーゼの遺伝子
工学的製造方法を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は単離されたα−１，３／４−フコシ
ダーゼ遺伝子に関する。特に、配列表の配列番号１に記
載したアミノ酸配列、又はその一部であって、かつ、α
−１，３／４−フコシダーゼ酵素活性を有する部分をコ
ードするα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子、とりわ
け、配列表の配列番号２に記載したＤＮＡ配列を有する
α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子と、上記配列番号
１に記載のアミノ酸配列、又はその一部からなる遺伝子
にハイブリダイズ可能なα−１，３／４−フコシダーゼ
遺伝子を提供するものである。本発明の第２の発明は、
α−１，３／４−フコシダーゼの工業的な製造方法に関
する。特に、該α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を
含有させた組換えプラスミドを導入させた組換体を培養
し、該培養物からα−１，３／４−フコシダーゼを採取
することを特徴とするα−１，３／４−フコシダーゼの
製造方法を提供する。

【０００５】本発明者らは、該α−１，３／４−フコシ
ダーゼ遺伝子を取得するために、ストレプトマイセスｓ
ｐ １４２よりα−１，３／４−フコシダーゼを高度に
精製し、Ｎ末端アミノ酸配列、及び部分アミノ酸配列を
決定した。次にこれらのアミノ酸配列の情報を基に常法
に従い合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣ
Ｒ反応を行ったが、該α−１，３／４−フコシダーゼ遺
伝子を取得できなかった。また、該プライマーをプロー
ブとして用いても、目的の遺伝子は得られなかった。そ
こで本発明者らは、ＰＣＲ反応を行う際に種々の条件を
鋭意検討を重ねた結果、特定の条件下で、特定の合成プ
ライマー対を用いることにより該α−１，３／４−フコ
シダーゼ遺伝子の一部を増幅することに成功し、該増幅
遺伝子をプローブとし、目的の遺伝子の単離を行い、そ
の塩基配列を決定し、更に微生物において活性型α−
１，３／４−フコシダーゼを発現する組換えプラスミド
の構築を行い、該プラスミドにより形質転換した微生物
を用いて、該α−１，３／４−フコシダーゼを生産させ
ることに成功し、本発明を完成した。

【０００６】以下、ストレプトマイセスｓｐ １４２を
例として本発明を具体的に説明する。本菌は、特開平３
−９８５８３号公報に記載の菌であり、Streptomyces s
p １４２と表示され、工業技術院生命工学工業技術研究
所にＦＥＲＭ ＢＰ−４５６９として寄託されている。

【０００７】まず、ストレプトマイセスｓｐ １４２よ
り粗酵素液を調製し、各種クロマトグラフィーによりα
−１，３／４−フコシダーゼを高度に精製する。この精
製されたα−１，３／４−フコシダーゼの部分アミノ酸
配列に関する情報を得るために、例えばジャーナル オ
ブ バイオロジカル ケミストリー、第２６７巻、第１
５２２〜１５２７頁（１９９２）に記載の方法で精製し
たα−１，３／４−フコシダーゼを直接常法に従ってエ
ドマン分解法によりアミノ酸配列分析に供してもよい
し、あるいは特異性の高いタンパク質加水分解酵素を作
用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を
逆相系ＨＰＬＣを用いて分離精製する。精製ペプチド断
片についてアミノ酸配列分析を行うのが効果的である。
この部分アミノ酸配列の情報を基にα−１，３／４−フ
コシダーゼ遺伝子をクローニングするには一般的にＰＣ
Ｒ法を用いる方法あるいはハイブリダイゼーションによ
る方法を用いることができる。

【０００８】１）カセットＤＮＡを用いるＰＣＲ法 ストレプトマイセスｓｐ １４２から常法に従って抽出
したゲノムＤＮＡを適当な制限酵素で消化した後、既知
の配列を有する合成ＤＮＡ（カセットＤＮＡ）を連結し
たものを鋳型として、部分アミノ酸配列の情報を基に常
法に従ってデザインした合成オリゴヌクレオチドプライ
マーとカセットＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチ
ドプライマー（カセットプライマー）を用いてＰＣＲ反
応を行い目的のＤＮＡ断片を増幅することができる。カ
セットＤＮＡあるいはカセットプライマーについては例
えば宝酒造社製のものを利用することができる。カセッ
トＤＮＡは２種類のカセットプライマーに対応する配列
を含んでおり、まず制限酵素サイトから遠い方のプライ
マーを用いて１回目のＰＣＲ反応を行い、その反応液の
一部を鋳型として更に制限酵素サイトに近い方のプライ
マーを用いてＰＣＲ反応を行うと効果的に目的のＤＮＡ
断片を増幅することができることが知られている。本発
明者らはこの方法に従って本発明の遺伝子の取得を試み
た。まずＮ末端配列Ｎ−１（配列番号３）と部分アミノ
酸配列５７（配列番号４）からそれぞれ合成オリゴヌク
レオチドプライマーＦＳＥ−１（配列番号５）及び５７
Ｒ（配列番号６）を合成する。ストレプトマイセスｓｐ
１４２から常法に従って抽出したゲノムＤＮＡを制限
酵素Ｓａｕ３ＡＩ、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、及びＳａｌ
Ｉで消化し、対応するカセットＤＮＡ（宝酒造社製）を
それぞれ連結する。これを鋳型としてＦＳＥ−１とＣ１
プライマー（宝酒造社製）、５７ＲとＣ１プライマーの
組合せでＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲはＰＣＲテクノロジ
ー〔PCR Technology、エルリッヒＨＡ（Erlich) 編集、
ストックトンプレス社発行、１９８９年〕に記載の方法
に準じて行う。例えば、ジーンアンプＰＣＲリージェン
ト キット（GeneAmp PCR Reagent Kit 、宝酒造社製）
を用いて行うことができる。例えば９４℃、３０秒、５
５℃、１分、７２℃、１分のサイクルを３０サイクル行
い、この反応液の一部を用いてＦＳＥ−１とＣ２プライ
マー（宝酒造社製）、５７ＲとＣ２プライマーの組合せ
で同様の条件で更にＰＣＲ反応を行う。本発明のα−
１，３／４−フコシダーゼ遺伝子は、アガロースゲル電
気泳動で反応液を分析しても特異的に増幅したＤＮＡ断
片は検出できず、この方法では本発明のα−１，３／４
−フコシダーゼ遺伝子をクローニングすることはできな
い。

【０００９】２）通常のＰＣＲ法 部分アミノ酸配列の情報を基に常法に従ってデザインし
た合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反
応を行い目的のＤＮＡ断片を増幅することができる。ま
ず部分アミノ酸配列５７（配列番号４）から合成オリゴ
ヌクレオチドプライマー５７Ｆ（配列番号７）、部分ア
ミノ酸配列３９（配列番号８）から３９Ｆ（配列番号
９）と３９Ｒ（配列番号１０）、部分アミノ酸配列４５
（配列番号１１）から４５Ｆ（配列番号１２）と４５Ｒ
（配列番号１３）を合成する。上述の１）に記載のＦＳ
Ｅ−１（配列番号５）及び５７Ｒ（配列番号６）も含め
て表１の組合せのプライマーを用いて、ストレプトマイ
セスｓｐ １４２のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反
応を行う。

【００１０】

【表１】

【００１１】ＰＣＲ反応は例えばジーンアンプ ＰＣＲ
リージェントキットを用いて、９４℃、３０秒、５０
℃、１分、７２℃、１．５分のサイクルを３５サイクル
行い、アガロースゲル電気泳動で反応液を分析すると、
ＦＳＥ−１（配列番号５）と４５Ｒ（配列番号１３）の
組合せ〔表１中の（３）〕と４５Ｆ（配列番号１２）と
３９Ｒ（配列番号１０）の組合せ〔表１中の（９）〕の
みでそれぞれ２００ｂｐ、９００ｂｐの大きさのＤＮＡ
断片が増幅されるがその他の組合せでは増幅が見られな
いか、若しくは多くの増幅産物が観察される。表１中の
（３）と（９）で特異的に増幅したＤＮＡ断片について
通常用いられる方法で塩基配列を決定しても、合成した
ＤＮＡの配列以外に目的の遺伝子と考えられる配列は見
出すことができない。

【００１２】３）合成ＤＮＡハイブリダイゼーション法 部分アミノ酸配列の情報を基に常法に従って合成オリゴ
ヌクレオチドをデザインしハイブリダイゼーションによ
って目的のＤＮＡを検出する方法も一般的に用いられ
る。本発明者らはこの方法に従って本発明のα−１，３
／４−フコシダーゼ遺伝子の検出を試みた。サザンハイ
ブリダイゼーション用のプローブとして、上述の２）に
記載のＰＣＲ法で述べた合成オリゴヌクレオチド、ＦＳ
Ｅ−１（配列番号５）、３９Ｆ（配列番号７）、及び部
分アミノ酸配列２８（配列番号１４）からデザインした
合成オリゴヌクレオチド２８Ｆ（配列番号１５）、３２
（配列番号１６）からデザインした３２Ｒ（配列番号１
７）を用いる。ストレプトマイセスｓｐ １４２のゲノ
ムＤＮＡを制限酵素、ＢａｍＨＩ、ＰｓｔＩ、Ｓａｃ
Ｉ、ＳａｌＩで完全消化し、アガロースゲル電気泳動で
分離後常法に従いナイロン膜にブロッティングする。ハ
イブリダイゼーションは一般的に用いられる条件で行う
ことができる。例えば６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５
×デンハルツ（Denhardt's) 、１００μｇ／ｍｌサケ精
子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中６５
℃でナイロン膜をブロッキングし、³²Ｐでラベルした各
合成オリゴヌクレオチドを加えて４０℃で一晩保温す
る。このナイロン膜を０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ
で５０℃、３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィ
ーをとって合成オリゴヌクレオチドプローブとハイブリ
ダイズするＤＮＡ断片を検出する。プローブとして用い
た３９Ｆ（配列番号７）についてはハイブリダイズする
ＤＮＡ断片を検出することができず、その他のプローブ
として用いたＦＳＥ−１（配列番号５）、２８Ｆ（配列
番号１５）、３２Ｒ（配列番号１７）に関しては各制限
酵素消化物のレーン上に多数のバンドが検出され、目的
のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を特定すること
はできない。

【００１３】以上に述べたように、通常の方法において
はストレプトマイセスｓｐ １４２のゲノムＤＮＡから
本発明のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子をクロー
ニングすることは非常に難しく、ストレプトマイセスｓ
ｐ １４２のゲノム遺伝子を鋳型とした場合、ポリメラ
ーゼ反応の進行が阻害されたり非特異的なアニーリング
が起こるなどして、ＰＣＲ法においては増幅阻害、非特
異的ＤＮＡ断片の増幅等が、また、ハイブリダイゼーシ
ョン法においても非特異的ハイブリッドの形成などが起
こる可能性が考えられる。本発明者らはこれらの点を考
慮し、ＰＣＲ反応を行う際、二次構造の形成によるＤＮ
Ａ鎖の伸長阻害を防ぐと共に非特異的なアニーリングを
極力押える条件下でＰＣＲを行った。すなわち、ＰＣＲ
反応の基質ｄＧＴＰの代りにその誘導体である２′−デ
オキシ−７−デアザグアノシントリホスフェート（ｄｃ
⁷ ＧＴＰ）を加え、更にアニーリング温度を６０℃に上
げて反応を行い、その後反応液の一部を鋳型としてｄＧ
ＴＰの入った普通の基質を用いて２回目の反応を行い、
特定のプライマー対の組合せで、目的のα−１，３／４
−フコシダーゼ遺伝子の一部が初めて増幅されることを
見出した。

【００１４】以下、より詳細に説明すれば上述の２）で
記載の合成オリゴヌクレオチドプライマーに加えて新た
に部分アミノ酸配列２８（配列番号１４）から合成オリ
ゴヌクレオチドプライマー２８Ｒ（配列番号１８）、部
分アミノ酸配列３２（配列番号１６）からデザインした
３２Ｆ（配列番号１９）を合成する。表２の組合せのプ
ライマーを用いて、ストレプトマイセスｓｐ １４２の
ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行う。

【００１５】

【表２】

【００１６】ＰＣＲ反応は例えばジーンアンプＰＣＲリ
ージェントキットを用いて、ｄＮＴＰ混合液の代りにｄ
ＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄｃ⁷ ＧＴＰ
の混合液を用いて、９４℃、３０秒、６０℃、１分、７
２℃、２分のサイクルを２５サイクルを行う。この反応
液の一部を鋳型として、今度は通常のｄＮＴＰ混合液を
基質として再度同じサイクルＰＣＲ反応を行う。反応液
の一部をアガロースゲル電気泳動で分析する。別に１回
目のＰＣＲ反応液の一部を鋳型として、それぞれ１種類
のプライマーだけを加えてＰＣＲ反応を行い、片方のプ
ライマーだけで増幅してくるＤＮＡ断片を調べておく。
その結果、片方だけのプライマーで増幅するＤＮＡ断片
を除くとＰＣＲ反応によって増幅してくるＤＮＡ断片の
数は表３に示したようになる。

【００１７】

【表３】

【００１８】これらのＤＮＡ断片の塩基配列を通常用い
られる方法、例えばジデオキシチェーンターミネーター
法で決定したところ４５Ｆ−３２Ｒの組合せ〔表２中の
（１９）〕で増幅してくるＤＮＡ断片（１４０ｂｐ）中
にプライマーの配列に続いてα−１，３／４−フコシダ
ーゼの部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目
的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の一部を取得
することに成功した。

【００１９】ストレプトマイセスｓｐ １４２のゲノム
ＤＮＡを適当な制限酵素で消化した後、上記のＰＣＲ産
物〔４５Ｆ−３２Ｒの組合せで増幅してくるＤＮＡ断片
（１４０ｂｐ）、配列番号２０〕をプローブとして用い
てハイブリダイゼーションを行い、プローブと特異的に
ハイブリダイズするバンドを検出することができる。検
出されたバンドに相当するＤＮＡ断片をゲルから抽出、
精製した後、通常用いられる方法によってプラスミドベ
クターに組込むことができる。プラスミドベクターとし
ては公知のものが使用でき、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ
１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎなどが挙げられる
が特にこれらに限定されるものではない。

【００２０】次いで組換えプラスミドを宿主に導入し、
宿主を形質転換するが、宿主として大腸菌を使用する場
合、宿主大腸菌としては形質転換能を有するものであれ
ば野生株、変異株いずれも使用できる。導入の方法は通
常用いられる方法、例えばモレキュラー クローニング
ア ラボラトリー マニュアル〔Molecular Cloning,
A Laboratory Manual、Ｔ．マニアティス（T.Maniati
s) ほか著、コールドスプリング ハーバー ラボラト
リー １９８２年発行〕第２５０頁に記載の方法を用い
ることができる。このようにして目的のＤＮＡ断片を宿
主に導入した後、プラスミドベクターの特性、例えばｐ
ＵＣ１９の場合、アンピシリン耐性を有するコロニー、
あるいはアンピシリン、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）及び
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰ
ＴＧ）を含むプレート上で、アンピシリン耐性を示しか
つ白色を呈するコロニーを選択することにより外来遺伝
子を導入されたコロニーを選別することができる。次に
上記集団のなかから目的のＤＮＡ断片を含むベクターを
有するコロニーを選択するが、選択の方法はベクターの
種類によってコロニーハイブリダイゼーション、プラー
クハイブリダイゼーションを適宜用いればよい。また、
ＰＣＲ法を用いることもできる。目的のＤＮＡ断片を含
むベクターが選別できればこのベクターに挿入されてい
る目的のＤＮＡ断片の塩基配列は通常の方法、例えばジ
デオキシチェーンターミネーター法により決定すること
ができる。決定された塩基配列を、α−１，３／４−フ
コシダーゼのＮ末端分析、部分アミノ酸配列、分子量な
どと比較することによって目的のα−１，３／４−フコ
シダーゼ遺伝子の構造及びα−１，３／４−フコシダー
ゼの全アミノ酸配列を知ることができる。こうして得ら
れる塩基配列の一例を配列表の配列番号２に、またその
塩基配列がコードし得るアミノ酸配列を配列表の配列番
号１に示す。

【００２１】目的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝
子を含むベクターで宿主の形質転換を行い、次いで該形
質転換体の培養を通常用いられる条件で行うことによっ
て、α−１，３／４−フコシダーゼ活性を持つポリペプ
チドないしタンパク質を生産させることができる。場合
によっては該ポリペプチドを封入体（inclusion body)
の形で生産させることもできる。発現ベクターとして
は、適当な宿主において発現できるようなベクターに、
目的のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子を接続すれ
ばよい。

【００２２】宿主としては微生物、動物細胞、植物細胞
等を用いることができる。発現の確認は例えばα−１，
３／４−フコシダーゼの活性を測定することにより行う
ことができる。活性測定は例えば組換体大腸菌の細胞抽
出液を酵素液としてジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー、第２６７巻、第１５２２〜１５２７頁
（１９９２）に記載の方法で行うことができる。目的の
α−１，３／４−フコシダーゼの発現が認められた場合
はその発現の最適条件を検討する。

【００２３】形質転換体の培養物からα−１，３／４−
フコシダーゼを精製するには通常の方法が用いられる。
例えば宿主が大腸菌の場合、培養終了後遠心分離によっ
て菌体を集め、これを超音波処理などによって破砕し
て、遠心分離等によって、可溶性画分を集める。その後
イオン交換、ゲルろ過、疎水、アフィニティーなどの各
種クロマトグラフィーを行うことにより精製すれば高純
度のα−１，３／４−フコシダーゼ標品を得ることがで
きる。また、封入体となっている場合は、封入体を含む
不溶性画分を集める。封入体を洗浄した後、通常用いら
れるタンパク質可溶化剤、例えば尿素やグアニジン塩酸
塩等で可溶化し、必要に応じてこれをイオン交換、ゲル
ろ過、疎水、アフィニティーなどの各種クロマトグラフ
ィーを行うことにより精製した後、透析法あるいは希釈
法などを用いたリホールディング操作を行うことによっ
て活性を保持した目的のα−１，３／４−フコシダーゼ
標品を得ることができる。必要に応じてこの標品を更に
各種クロマトグラフィーによって精製すれば、高純度の
α−１，３／４−フコシダーゼ標品を得ることができ
る。

【００２４】また、得られたこれらの遺伝子をプローブ
として厳密な条件下でハイブリダイゼーションを行え
ば、本酵素と配列は少し異なるが同様の酵素活性を持つ
と期待されるすべての本酵素類似の遺伝子を得ることが
期待できる。ここで言う厳密な条件下とは、以下の条件
下のことを言う。すなわち、ＤＮＡを固定したナイロン
膜を、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７
６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水
に溶かしたもの）、１％ラウリル硫酸ナトリウム、１０
０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツ（ウシ
血清アルブミン、ポリビニルピロリドン、フィコールを
それぞれ０．１％の濃度で含む）を含む溶液中で６５℃
で２０時間プローブとハイブリダイゼーションを行うこ
とを言う。

【００２５】本発明により、α−１，３／４−フコシダ
ーゼの一次構造及び遺伝子構造が提供される。更に、α
−１，３／４−フコシダーゼの遺伝子工学的な製造が可
能となった。本発明の遺伝子工学的製造法を用いれば安
価に高純度なα−１，３／４−フコシダーゼ標品を得る
ことが可能となる。

【００２６】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【００２７】実施例１ α−１，３／４−フコシダーゼ
構造遺伝子のクローニング （１）ゲノムＤＮＡの抽出精製 α−１，３／４−フコシダーゼの生産菌株であるストレ
プトマイセスｓｐ １４２（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５６
９）をＬ−フコース１％、酵母エキス０．０１％、ペプ
トン０．０３％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０５％、
ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．１％、ｐＨ７．０からなる培地２０
ｍｌに接種し、３０℃で４４時間培養した。培養終了
後、培養液を遠心分離して菌体を集め、液体窒素中に投
入して乳鉢で完全に粉砕した。これを１０倍量の抽出緩
衝液〔１０ｍＭトリス（tris) −ＨＣｌ、１００ｍＭ
ＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡ、０．５％
ＳＤＳ、ｐＨ８．０〕中に穏やかにかくはんしながら少
量ずつ添加し、１０ｍｇ／ｍｌのプロティナーゼＫ １
００μｌを添加した後、３７℃で１時間保温した。この
後室温に戻し、等容のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−Ｈ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）飽和フェノール
／クロロホルム溶液を加えて穏やかにかくはんし、３０
００ｒｐｍで１０分間遠心した後上層を回収した（以
下、フェノール抽出と略す）。これを２回繰返し、水層
に０．６等量のイソプロピルアルコールを加えて１４０
００ｒｐｍで１分間遠心した後、７０％エタノールでリ
ンスして軽く風乾した。以上の操作により、ゲノムＤＮ
Ａ約４４０μｇを得た。

【００２８】（２）α−１，３／４−フコシダーゼの部
分アミノ酸配列の決定 ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー、第
２６７巻、第１５２２〜１５２７頁（１９９２）に記載
の方法で精製したα−１，３／４−フコシダーゼを直接
常法に従って気相エドマン分解法によるアミノ酸配列分
析に供してＮ末端アミノ酸配列Ｎ−１（配列番号３）を
決定した。更に、酵素タンパク質をピリジルエチル化し
た後リシルエンドペプチダーゼで消化し、得られたペプ
チド断片の混合物をＨＰＬＣで分離精製した。各ペプチ
ド画分についてアミノ酸配列分析を行い部分アミノ酸配
列５７（配列番号４）、３９（配列番号８）、４５（配
列番号１１）、２８（配列番号１４）、３２（配列番号
１６）を決定した。

【００２９】（３）プライマーの合成とＰＣＲによる増
幅 （２）で決定したＮ末端アミノ酸配列Ｎ−１（配列番号
３）から合成オリゴヌクレオチドプライマーＦＳＥ−１
（配列番号５）、部分アミノ酸配列５７（配列番号４）
から合成オリゴヌクレオチドプライマー５７Ｆ（配列番
号７）、５７Ｒ（配列番号６）、部分アミノ酸配列３９
（配列番号８）から合成オリゴヌクレオチドプライマー
３９Ｆ（配列番号９）、３９Ｒ（配列番号１０）、部分
アミノ酸配列４５（配列番号１１）から合成オリゴヌク
レオチドプライマー４５Ｆ（配列番号１２）、４５Ｒ
（配列番号１３）、部分アミノ酸配列２８（配列番号１
４）から合成オリゴヌクレオチドプライマー２８Ｆ（配
列番号１５）、２８Ｒ（配列番号１８）、部分アミノ酸
配列３２（配列番号１６）から合成オリゴヌクレオチド
プライマー３２Ｆ（配列番号１９）、３２Ｒ（配列番号
１７）をそれぞれ合成した。テンプレートとしては
（１）で調製したゲノムＤＮＡを用い、表２に示した組
合せのプライマーを用いた。１０分間熱変性させたゲノ
ムＤＮＡ１０ｎｇ、２５ｐｍｏｌずつの合成オリゴヌク
レオチドプライマーを含むジーンアンプＰＣＲリージェ
ントキット（宝酒造社製）の反応系で、ｄＮＴＰ混合液
の代りに終濃度１．２ｍＭ ｄＡＴＰ、１．２ｍＭ ｄ
ＣＴＰ、１．２ｍＭ ＴＴＰ、０．９ｍＭ ｄＧＴＰ、
０．３ｍＭ ｄｃ⁷ ＧＴＰ（ベーリンガー社製）を用い
てＰＣＲ反応を行った。１．２５ユニットのアンプリタ
ック（Ampli Taq)と滅菌水を加えて反応液量を２５μｌ
とし、この混合液を自動遺伝子増幅装置サーマルサイク
ラー（DNA Thermal Cycler、宝酒造社製）を用いた増幅
反応に供した。反応条件は、９４℃で３０秒間（変性）
→６０℃で１分間（プライマーのアニーリング）→７２
℃で２分間（合成反応）のサイクルを２５サイクル行っ
た。次に、この反応液１μｌをテンプレートとして、ジ
ーンアンプＰＣＲリージェントキットを用いて５０μｌ
の反応系で通常のｄＮＴＰ混合液を用い、先と同じ条件
でＰＣＲ反応を再度行った。反応液の１０μｌについ
て、３％アガロースゲル電気泳動を行った後エチジウム
ブロミドでＤＮＡを染色し、増幅ＤＮＡ断片を調べた。
同様にして、２度目の反応においてそれぞれ１種類のプ
ライマーのみを加えて反応を行い、片方のプライマーだ
けで増幅してくるＤＮＡ断片を調べておく。その結果、
片方のプライマーだけで増幅してきたものを除くと、反
応により増幅したＤＮＡ断片数は表３に示したようにな
った。これらのＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシチェ
ーンターミネーター法で決定したところプライマー４５
Ｆと３２Ｒの組合せ〔表２中の（１９）〕で増幅してく
るＤＮＡ断片（１４０ｂｐ）中にプライマーの配列に続
いてα−１，３／４−フコシダーゼの部分アミノ酸配列
に対応する配列が見出され、目的のα−１，３／４−フ
コシダーゼ遺伝子の一部を取得することに成功した。こ
のＰＣＲにより増幅したＤＮＡフラグメントを４５Ｆ−
３２Ｒ（配列番号２０）と命名した。

【００３０】（４）α−１，３／４−フコシダーゼ全長
遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローニング （１）で調製したゲノムＤＮＡ５０μｇを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ各１２０ユニッ
トで各々３７℃で２時間消化し、６０ユニットの酵素を
追加して更に４時間反応させた。この反応液からフェノ
ール抽出で得られたＤＮＡ１０μｇ相当について０．７
％アガロースゲル電気泳動を行った。泳動後、サザンブ
ロット法（遺伝子研究法II、第２１８〜２２１頁、東京
化学同人、１９８６年発行）により、ナイロン膜〔ハイ
ボンドＮ⁺ （Hybond-N⁺ ) 、アマシャム社製〕にＤＮＡ
を転写した。ハイブリダイゼーションのプローブとして
は、（３）で得られたＤＮＡフラグメント４５Ｆ−３２
Ｒ（配列番号２０）を用いた。このフラグメント５ｐｍ
ｏｌをメガラベル（MEGALABEL 、宝酒造社製）を用いて
³²Ｐで標識した。上記調製したフィルターを用いて、６
×ＳＳＣ〔１×ＳＳＣは、８．７７ｇのＮａＣｌ、及び
４．４１ｇをクエン酸ナトリウムを１リットルの水に溶
解した物〕、０．５％ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌニシン
精子ＤＮＡ、５×デンハルツ〔ウシ血清アルブミン、ポ
リビニルピロリドン、フィコールをそれぞれ０．１％濃
度で含む〕を含む溶液中、６５℃で３時間プレハイブリ
ダイゼーションを行った後、標識プローブを１ｐｍｏｌ
／ｍｌの濃度になるように加え、６５℃で一晩ハイブリ
ダイゼーションを行った。次に６×ＳＳＣ中、室温で１
０分間、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１０分
間、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で１時
間洗浄し、余分な水分を除いた後、増感紙を当てて−７
０℃で一晩オートラジオグラフを行った。その結果、Ｂ
ａｍＨＩ消化物で約４．５Ｋｂ、ＰｓｔＩ消化物で約
２．３Ｋｂ、ＳａｃＩ消化物で約１０Ｋｂ、ＳａｌＩ消
化物で約１．９Ｋｂの位置に、プローブとハイブリダイ
ズするバンドを認めた。以後の実験は、取扱いの簡便さ
からＰｓｔＩ、及びＳａｌＩ消化物について進めた。先
に制限酵素消化したゲノムＤＮＡ１０μｇの０．７％ア
ガロースゲル電気泳動を行い、上述のハイブリダイゼー
ションで認められたバンドに相当する部分を切り出し
た。これをイージートラップ（EASYTRAP、宝酒造社製）
を用いて抽出精製を行い、得られたＤＮＡ断片をｐＵＣ
１９のＰｓｔＩあるいはＳａｌＩサイトに挿入した。

【００３１】このプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質
転換し、直径８．５ｃｍの丸シャーレ３枚に、１枚当り
２００〜１０００個のコロニーを形成させた。次に、こ
れらのプレートより制限酵素１種類当り２００個のコロ
ニーを選択し、ナイロン膜（ハイボンドＮ⁺ 、アマシャ
ム社製）上に写した。３７℃で３時間保温した後、この
ナイロン膜を０．５Ｍ ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ
の溶液に浸したろ紙上で５分間（変性）、０．５Ｍ ト
リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、３Ｍ ＮａＣｌの
溶液に浸したろ紙上で５分間（中和）処理した後、２×
ＳＳＣでリンスした。このナイロン膜とＤＮＡフラグメ
ント４５Ｆ−３２Ｒ（配列番号２０）を用い、前述と同
じ条件でハイブリダイゼーションを行ったところ、Ｐｓ
ｔＩ断片で１個、ＳａｌＩ断片で２個のポジティブシグ
ナルが得られた。それぞれの大腸菌ＪＭ１０９をＰ５
４、Ｓ３０、Ｓ６８と命名した。

【００３２】アルカリ溶菌法により、得られたクローン
のプラスミドＤＮＡを調製し、それぞれｐＵＦＳＥＰ５
４、ｐＵＦＳＥＳ３０、ｐＵＦＳＥＳ６８と命名した。
これを数種の制限酵素で消化し、電気泳動により切断パ
ターンを解析した。その結果、ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、
ＳａｃＩ、ＳｍａＩなどの制限酵素サイトの存在を確認
した。なお、この解析によりプラスミドｐＵＦＳＥＳ３
０とｐＵＦＳＥＳ６８は同一であることが判明したの
で、以後の実験はｐＵＦＳＥＰ５４及びｐＵＦＳＥＳ３
０を用いて行った。また、ｐＵＦＳＥＰ５４及びｐＵＦ
ＳＥＳ３０の挿入部分は約８００ｂｐの共通配列を有す
ることが推定された。これらのクローンを適当な制限酵
素で消化し、ライゲーションキット（DNA Ligation Ki
t、宝酒造社製）でセルフライゲーションを行って、各
種の欠失変異体を作製した。ジデオキシ法によってこれ
らの変異体の塩基配列を決定した結果、２つのクローン
に渡って、挿入断片中に１６８９ｂｐの読み取り枠が見
出された。この読み取り枠中に、α−１，３／４−フコ
シダーゼのアミノ酸配列分析により得られた配列がすべ
て見出された。以上の結果より、α−１，３／４−フコ
シダーゼ遺伝子の全塩基配列及び一次構造が決定され
た。その結果を図１に示す。すなわちＡは２．３ｋｂ
ＰｓｔＩ断片及びＢは１．９ｋｂ ＳａｌＩ断片の制限
酵素地図と、α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子の位
置を示した図であり、図中矢印はα−１，３／４−フコ
シダーゼの翻訳開始点、太線はα−１，３／４−フコシ
ダーゼのコード領域を示し、Ａの太線中のＳａｌＩ−Ｐ
ｓｔＩ間は、Ｓの太線中のＳａｌＩ−ＰｓｔＩ間に相当
し、ＡとＢを合せることにより、α−１，３／４−フコ
シダーゼ遺伝子の全長を知ることができる。また、α−
１，３／４−フコシダーゼをコードする塩基配列を配列
表の配列番号２に、その塩基配列がコードし得るアミノ
酸配列を配列表の配列番号１に示す。

【００３３】実施例２ α−１，３／４−フコシダーゼ
ポリペプチドを発現するプラスミドの構築 （１）α−１，３／４−フコシダーゼのＮ末端側ポリペ
プチドをコードするプラスミドの構築 α−１，３／４−フコシダーゼのＮ末端側ポリペプチド
をコードする遺伝子を増幅するために２種類の合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーＦＳＥ−ＨＮｄｅ（配列番号
２１）、プライマーＳ３０ＲＶ（配列番号２２）をデザ
インし合成した。プライマーＦＳＥ−ＨＮｄｅは配列番
号２の塩基配列番号１３６−１５３の５′−３′の向き
に相当する１８ｍｅｒの上流にＨｉｎｄ III及びＮｄｅ
Ｉサイトをデザインした３４ｍｅｒであり、プライマー
Ｓ３０ＲＶは配列番号２、塩基配列番号４４３−４６１
の３′−５′の向きに相当する１９ｍｅｒの合成ＤＮＡ
である。テンプレートとして、実施例１で得られたプラ
スミドｐＵＦＳＥＰ５４約１００ｐｇをジーンアンプＰ
ＣＲリージェントキット（宝酒造社製）中の１０μｌの
１０倍濃度増幅用緩衝液、１６μｌの１．２ｍＭ ｄＮ
ＴＰ混合液、２０ｐｍｏｌのプライマーＦＳＥ−ＨＮｄ
ｅ、２０ｐｍｏｌのプライマーＳ３０ＲＶ、２．５ユニ
ットのアンプリタックと混合し、更に滅菌水を加えて１
００μｌの溶液にした。この混合液を自動遺伝子増幅装
置サーマルサイクラーによる増幅反応に供した。ＰＣＲ
反応は、９４℃で３０秒間（変性）→５５℃で１分間
（プライマーのアニーリング）→７２℃で１．５分間
（合成反応）のサイクルを２５サイクル行った。反応液
の１０μｌについて３％アガロースゲル電気泳動を行っ
た後エチジウムブロミドでＤＮＡを染色し、予想される
３４２ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を確認した。ＰＣＲ反応液
の残りをエタノール沈殿により濃縮した後二つに分け
た。一方はＨｉｎｄ III、ＳａｌＩで切断後、ｐＴＶ１
１９ＮＮｄｅ〔ｐＴＶ１１９Ｎ（宝酒造社製）のＮｃｏ
ＩサイトをＮｄｅＩに変換することにより作製〕のＨｉ
ｎｄ III−ＳａｌＩサイトに挿入し、もう一方はＮｄｅ
Ｉ、ＳａｌＩで切断後、ｐＴＶ１１９ＮＮｄｅのＮｄｅ
Ｉ−ＳａｌＩサイトに挿入した。それぞれをｐＴＦＳＥ
Ｆ１０１Ｎ及びｐＴＦＳＥＭ１０１Ｎと命名した。各々
で宿主として大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換し、アルカ
リ溶菌法によりプラスミドＤＮＡを調製した後、ＰＣＲ
法による挿入断片の確認、ジデオキシチェーンターミネ
ーター法による挿入断片の塩基配列の確認を行った。

【００３４】（２）α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝
子全長をコードするプラスミドの構築 実施例１で得られたプラスミドｐＵＦＳＥＳ３０をＳａ
ｌＩで消化してアガロースゲル電気泳動を行い、１．９
ｋｂのＳａｌＩフラグメントを切り出し抽出精製した。
次に、実施例２−（１）で得られたプラスミドｐＴＦＳ
ＥＭ１０１ＮをＳａｌＩで消化し、１．９ｋｂのＳａｌ
Ｉフラグメントを挿入した後、大腸菌ＪＭ１０９株へ形
質転換させた。アルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡ
を調製し、ＳａｌＩ消化によるＳａｌＩサイト再生の確
認、及びＳａｃＩ消化による挿入断片の方向確認を行っ
た。こうして得られたα−１，３／４−フコシダーゼ遺
伝子全長をコードするプラスミドをｐＴＦＳＥＭ２０１
と命名した。同様に実施例２−（１）で得られたプラス
ミドｐＴＦＳＥＦ１０１ＮをＳａｌＩで消化し、１．９
ｋｂのＳａｌＩフラグメントを挿入したプラスミドｐＴ
ＦＳＥＦ２０１を構築した。このプラスミドには、α−
１，３／４−フコシダーゼＮ末端の上流にｌａｃＺα由
来のペプチドを含む１０アミノ酸残基（Ｍｅｔ Ａｌａ
Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｈｅ
Ｈｉｓ Ｍｅｔ）〔配列番号２３〕をコードする配列が
含まれており、ｌａｃＺのＳＤ配列及びその開始コドン
を利用してｌａｃＺαとの融合体としてのα−１，３／
４−フコシダーゼの誘導発現が期待される。ｐＴＦＳＥ
Ｍ２０１を導入した大腸菌ＪＭ１０９を Escherichia c
oli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＭ２０１と表示する。ま
た、ｐＴＦＳＥＦ２０１を導入した大腸菌ＪＭ１０９を
Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１と
表示し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
Ｐ−１４２０６として寄託されている。

【００３５】実施例３ 組換体α−１，３／４−フコシ
ダーゼの大腸菌における発現 （１）α−１，３／４−フコシダーゼポリペプチドの大
腸菌における発現 実施例２で得られた大腸菌 Escherichia coli ＪＭ１０
９／ｐＴＦＳＥＭ２０１あるいは Escherichia coli Ｊ
Ｍ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１を１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含むＬ培地５ｍｌに接種して３７℃で一晩
振とう培養し、その１％を新たに同培地５ｍｌに接種し
た。培養後の濁度（６００ｎｍの吸光度）がおよそ０．
５の段階で、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、３７℃で
一晩振とう培養を行った。培養終了後、培養液１００μ
ｌを遠心分離して菌体を集め、５０ｍＭ リン酸カリ緩
衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した。次に、同緩衝液１００
ｍｌに懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。これ
を遠心分離して上清を回収し、大腸菌抽出液とした。こ
の抽出液及び沈殿をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分析した結果、 Escherichia coli ＪＭ１０９／
ｐＴＦＳＥＦ２０１由来の抽出液及び沈殿には分子量約
５５，０００のα−１，３／４−フコシダーゼと考えら
れるバンドが観察され、α−１，３／４−フコシダーゼ
タンパク質を発現していることが確認できたが、 Esche
richia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＭ２０１はほとん
ど酵素タンパク質を発現していないことがわかった。そ
こで次に Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ
２０１の菌体抽出液のα−１，３／４−フコシダーゼ活
性測定を、ジャーナル オブ バイオケミストリー、第
２６７巻、第３号、第１５２２〜１５２７頁（１９９
２）に記載の方法に従って行った。その結果、 Escheri
chia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１の菌体抽出
液の活性は培養液１ｍｌ当りに換算して約１ミリユニッ
トであることがわかった。なお、α−１，３／４−フコ
シダーゼ構造遺伝子をコードしないｐＴＶ１１９Ｎｄ
ｅ、及びＮ末端部分のみをコードするｐＴＦＳＥＦ１０
１Ｎを保持する大腸菌ＪＭ１０９を同様に処理したが、
α−１，３／４−フコシダーゼ活性は全く認められなか
った。以上の結果から、 Escherichia coli ＪＭ１０９
／ｐＴＦＳＥＦ２０１が生産するα−１，３／４−フコ
シダーゼの大部分は封入体の形で不溶化している可能性
が考えられた。

【００３６】（２）α−１，３／４−フコシダーゼの大
腸菌における発現と封入体の精製 大腸菌 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＦ２
０１を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ培地１
０ｍｌに接種して３７℃で５時間振とう培養し、これを
５００ｍｌの同じ培地の入った２リットル三角フラスコ
に５ｍｌ植菌して３７℃で１００ｒｐｍで振とう培養し
た。培養液の濁度（６６０ｎｍの吸光度）がおよそ０．
５になった時点で終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを
添加し、更に３７℃で一晩振とう培養した。培養終了後
遠心分離によって菌体を集め、これを０．１Ｍ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ
緩衝液（ｐＨ８．０）３０ｍｌに懸濁して超音波処理を
行い菌体を破砕した。破砕液を遠心分離して封入体を含
む不溶性画分を集めた後、２０ｍｌの１Ｍショ糖溶液に
懸濁した。これを１８，０００×ｇで３０分間遠心分離
して封入体を含む沈殿を得た。これを１０ｍＭ ＥＤＴ
Ａを含む２％トリトンＸ−１００溶液４０ｍｌに懸濁
し、一晩４℃に静置した。遠心分離により不溶物を集め
てから再度同じ操作を繰返し封入体を洗浄した。得られ
た封入体の一部をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動で分析した結果、半分以上のタンパク質は分子量約５
５，０００の位置に泳動されており、得られた封入体画
分の半分以上のタンパク質は組換体α−１，３／４−フ
コシダーゼであると推定された。またこの組換体α−
１，３／４−フコシダーゼのタンパク質量は、同時に分
析した牛血清アルブミンのバンドとの比較から、培養液
１リットル当り少なくとも１０ｍｇ以上得られると推定
された。

【００３７】（３）封入体の可溶化とリフォールディン
グ 得られた封入体の１／１０量（培養液１００ｍｌ相当）
を８Ｍ 尿素、１０ｍＭ ジチオスレイトールを含む１
０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）１ｍｌに
懸濁し、室温で１時間かくはんして可溶化した。遠心分
離により残った不溶物を除去した後、上清の５０μｌに
同じ緩衝液を加え５ｍｌとした。これを分子量１０，０
００カットの透析チューブに入れて０．６Ｍ ＫＣｌを
含む２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）５
００ｍｌに対して１５℃で一晩透析した。透析内液を遠
心分離して不溶物を除き、上清７ｍｌを得た。この溶液
のα−１，３／４−フコシダーゼ活性をジャーナル オ
ブ バイオケミストリー、第２６７巻、第３号、第１５
２２〜１５２７頁（１９９２）に記載の方法に従って測
定した。その結果、この上清中の活性は約１０ｍＵ／ｍ
ｌであることがわかった。すなわち、本発明の遺伝子を
もつ大腸菌 Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥ
Ｆ２０１の培養液１リットルから約１４ユニットの組換
体α−１，３／４−フコシダーゼが得られることがわか
った。

【００３８】（４）組換体α−１，３／４−フコシダー
ゼの基質特異性 ピリジルアミノ化（ＰＡ−）ラクト−Ｎ−フコペンタオ
ースIII （宝酒造社製）、１００ｐｍｏｌを含む３０ｍ
Ｍ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０に実施例３−
（３）で得られた酵素溶液１０μｌを加えて３７℃で一
晩反応を行った。反応液を凍結乾燥した後、グライコタ
ッグ（Glyco TAG 、宝酒造社製）を用いてＰＡ化反応を
行い、この反応液を陰イオン交換ＨＰＬＣカラムを用い
た単糖分析に供した。その結果、組換体酵素の作用によ
って、基質であるＰＡ−ラクト−Ｎ−フコペンタオース
III からフコースが遊離してきたことを確認することが
できた。

【００３９】また、種々のＰＡ化オリゴ糖を基質として
α−１，３／４−フコシダーゼ活性をジャーナル オブ
バイオケミストリー、第２６７巻、第３号、第１５２
２〜１５２７頁（１９９２）に記載の方法に従って測定
したところ、該組換体酵素はα１，３及びα１，４フコ
シド結合に特異的で、α１，２フコシド結合及びα１，
６フコシド結合には全く作用しないことがわかった。ま
たα２，３シアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースIIに
もほとんど作用しなかった。以上の基質特異性は、スト
レプトマイセスｓｐ １４２のα−１，３／４−フコシ
ダーゼのものと全く同じであった。

【００４０】

【発明の効果】以上の結果から、本発明によりα−１，
３／４−フコシダーゼのアミノ酸配列及び塩基配列が初
めて明らかとなり、これにより、α−１，３／４−フコ
シダーゼ遺伝子を提供することが可能となり、α−１，
３／４−フコシダーゼ活性を持つポリペプチドの工業的
に有利な遺伝子工学的製造方法が提供される。本発明に
よれば、本酵素生産においてＬ−フコースによる誘導培
養は不要であり、生産性は高い。また、α−１，３／４
−フコシダーゼの存在、あるいは発現の様子を調べるタ
ーゲットが提供されたことにより、この塩基配列を基に
プローブやプライマーを作製することや、アミノ酸配列
を基に抗体を作製することなどが可能となった。

【００４１】

【配列表】

【００４２】配列番号：1 配列の長さ：563 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Ala Arg Arg Thr Arg Val Leu Ser Ala Ile Ala Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Leu Val Pro Val Gln Ala Thr Ala Gln Gln Ala Ala 20 25 30 Pro Ala Ala Ala Gln Gln Pro Gly His Arg Ala Ala Ala Pro Pro 35 40 45 Gly Thr Pro Cys Ala Ala Pro Val Lys Pro Ala Ser Gln Met Ala 50 55 60 Val Glu Ser Cys Asp Ser Pro Glu Arg Ile Ile Glu Lys Ala Ala 65 70 75 Asn Ile Val Pro Thr Ser Gly Gln Leu Ala Trp Gln Gln Arg Glu 80 85 90 Val Thr Ala Phe Thr His Phe Gly Met Asn Thr Phe Thr Gly Arg 95 100 105 Glu Trp Gly Ser Gly Thr Glu Asp Glu Lys Leu Phe Ala Pro Lys 110 115 120 Ser Ile Asp Val Asp Gln Trp Met Arg Ala Tyr Lys Ala Ala Gly 125 130 135 Ala Glu Gln Val Met Leu Thr Ala Lys His His Asp Gly Phe Val 140 145 150 Leu Tyr Pro Ser Arg Tyr Thr Asp His Ser Val Glu Leu Ser Pro 155 160 165 Gly Ser Pro Asp Val Val Gly Ala Tyr Val Lys Ala Ala Arg Lys 170 175 180 Ala Gly Leu Lys Val Gly Leu Tyr Leu Ser Pro Ser Asp Gly Ala 185 190 195 Glu Leu Pro His Ala Trp His Ala Gln Trp Val Glu Ser Ile Arg 200 205 210 Lys Lys Gln Ala Glu Gly Lys Pro Leu Ser Leu Pro Glu Gln Met 215 220 225 Ala Leu Glu Asp Gly Asp Arg Ala Pro Ala Gly Glu Gly Arg Phe 230 235 240 Gly Asn Gly Ser Ala Val Thr Glu Arg Thr Ile Pro Thr Leu Val 245 250 255 Pro Gly Asp Asp Arg Ala Ala Ala Val Lys Arg His Lys Leu Pro 260 265 270 Thr Phe Thr Val Met Ala Asp Asp Tyr Asp Ala Tyr Tyr Leu Asn 275 280 285 Gln Leu Tyr Glu Ile Phe Thr Gln Tyr Gly Pro Ile Glu Glu Leu 290 295 300 Trp Leu Asp Gly Ala Asn Pro Trp Ser Gly Ser Gly Ile Thr Gln 305 310 315 Lys Tyr Asn Val Lys Gln Trp Phe Asp Met Val Lys Ala Leu Ser 320 325 330 Pro Asn Thr Val Val Phe Gln Gly Pro Gln Gly Val Arg Trp Val 335 340 345 Gly Asn Glu Gly Gly Thr Ala Arg Glu Thr Glu Trp Ser Val Thr 350 355 360 Pro His Ala Thr Asp Pro Trp Thr Gly Leu Gly Ser Leu Pro Asn 365 370 375 Asp Ser Thr Asp Ala Asp Ile Gly Ser Arg Ala Arg Ile Leu Asp 380 385 390 Pro Thr Thr Lys Tyr Leu Gln Trp Tyr Pro Ala Glu Ala Asp Val 395 400 405 Ser Ile Arg Pro Gly Trp Phe Tyr His Pro Glu Gln Gln Pro Lys 410 415 420 Thr Ala Pro Gln Leu Met Asn Leu Tyr Glu Lys Ser Val Gly Arg 425 430 435 Asn Ala Ala Leu Leu Leu Asn Val Pro Pro Gly Arg Asp Gly Arg 440 445 450 Ile Ala Asp Ala Asp Val Ala Ser Leu Thr Ala Phe Gly Lys Ala 455 460 465 Val Arg Ser Thr Tyr Gly Thr Asp Val Arg Arg Thr Gln Ala Pro 470 475 480 Gly Pro Tyr Thr Phe Asp Arg Val Ala Val Arg Glu Asp Ile Arg 485 490 495 His Gly Gln Arg Val Glu Lys Phe Ala Val Glu Ala Arg Ile Asp 500 505 510 Gly Ser Trp Gln Arg Ile Ala Glu Gly Thr Thr Ile Gly Asn Arg 515 520 525 Arg Ile Leu Ser Leu Ala Ser Pro Val Thr Ala Thr Ala Val Arg 530 535 540 Val Lys Val Leu Glu Ser Arg Ala Thr Pro His Leu Gly Ala Thr 545 550 555 Thr Leu His Leu Ser Ser Thr Gly 560

【００４３】配列番号：2 配列の長さ：1689 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： ATGGCACGAC GCACCCGTGT GCTCAGTGCG ATCGCACTGG CTGCCGCGGC CGCGCTCGTT 60 CCCGTGCAGG CCACCGCTCA GCAAGCCGCG CCGGCGGCCG CGCAGCAGCC CGGACATCGG 120 GCCGCCGCAC CGCCTGGCAC CCCGTGCGCC GCGCCTGTGA AGCCTGCTTC GCAGATGGCC 180 GTGGAGTCCT GCGACAGCCC CGAGCGGATC ATCGAGAAGG CCGCGAACAT AGTCCCCACC 240 TCCGGCCAAC TCGCCTGGCA GCAGCGGGAA GTCACCGCCT TCACCCACTT CGGCATGAAC 300 ACCTTCACGG GCCGCGAATG GGGATCGGGT ACCGAGGACG AAAAGCTCTT CGCCCCGAAG 360 AGCATCGACG TCGACCAGTG GATGCGCGCC TACAAGGCGG CCGGTGCCGA GCAGGTCATG 420 CTCACCGCCA AGCACCACGA CGGGTTCGTC CTGTACCCGT CCCGCTACAC CGACCACTCC 480 GTCGAACTCA GCCCCGGCAG CCCCGATGTC GTCGGCGCCT ACGTGAAGGC CGCCCGTAAG 540 GCGGGCCTGA AGGTCGGTCT CTATCTCTCG CCCTCCGACG GCGCCGAACT TCCGCACGCC 600 TGGCATGCCC AGTGGGTCGA GTCGATCCGC AAGAAGCAGG CGGAGGGCAA GCCGCTGAGC 660 CTGCCCGAAC AGATGGCGCT GGAGGACGGC GACCGGGCAC CCGCGGGCGA GGGCAGGTTC 720 GGCAACGGCA GTGCCGTCAC CGAGCGCACC ATCCCCACCC TCGTGCCCGG CGACGACCGC 780 GCAGCCGCGG TCAAGCGTCA CAAGCTCCCC ACCTTCACGG TGATGGCCGA CGACTACGAC 840 GCCTACTACC TCAACCAGCT GTACGAAATC TTCACCCAGT ACGGGCCGAT CGAGGAGCTC 900 TGGCTGGACG GCGCCAACCC CTGGTCCGGC TCCGGCATCA CCCAGAAGTA CAACGTCAAG 960 CAGTGGTTCG ACATGGTCAA GGCGCTGTCG CCGAACACCG TCGTCTTCCA GGGCCCGCAG 1020 GGCGTGCGCT GGGTCGGCAA CGAGGGCGGG ACCGCTCGTG AGACCGAGTG GAGCGTCACC 1080 CCGCACGCCA CCGACCCATG GACCGGGCTC GGCAGCCTGC CCAACGACTC GACCGACGCC 1140 GACATCGGCT CCCGCGCCAG GATCCTCGAC CCGACGACCA AGTACCTGCA GTGGTACCCG 1200 GCCGAGGCGG ACGTCTCCAT CCGGCCCGGC TGGTTCTACC ACCCGGAACA ACAACCCAAG 1260 ACTGCGCCGC AGTTGATGAA TCTGTACGAG AAGAGCGTCG GCCGGAACGC CGCACTGCTG 1320 CTGAACGTGC CGCCCGGCCG GGACGGCCGG ATCGCCGATG CGGACGTCGC GTCACTGACC 1380 GCCTTCGGCA AGGCGGTGCG CAGCACCTAC GGCACCGATG TGCGACGCAC GCAGGCTCCG 1440 GGGCCGTACA CCTTCGACCG GGTCGCCGTC CGCGAGGACA TCCGGCACGG GCAGCGGGTC 1500 GAGAAGTTCG CCGTGGAGGC CAGGATCGAC GGCAGCTGGC AGCGGATCGC CGAGGGCACC 1560 ACGATCGGCA ACCGGCGCAT CCTGTCGCTC GCCTCACCCG TCACAGCGAC GGCGGTACGG 1620 GTCAAGGTCC TGGAGTCCCG GGCCACACCT CACCTCGGGG CGACCACGCT GCACCTGAGT 1680 TCGACCGGA

【００４４】配列番号：3 配列の長さ：18 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列： Gly Thr Pro Cys Ala Ala Pro Val Lys Pro Ala Ser Gln Met Ala 1 5 10 15 Val Glu Arg

【００４５】配列番号：4 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Leu Pro Thr Phe Thr Val Met Ala Asp Asp Tyr Asp Ala Tyr Tyr 1 5 10 15 Leu Asn Gln Leu Tyr 20

【００４６】配列番号：5 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCSGCVWSHC ARATGGCNGT NGARMG 26

【００４７】配列番号：6 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TARTANGCRT CRTARTCRTC NGCCAT 26

【００４８】配列番号：7 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATGGCNGAYG AYTAYGAYGC 20

【００４９】配列番号：8 配列の長さ：19 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Ala Leu Ser Pro Asn Thr Val Cys Phe Gln Gly Pro Gln Val Arg 1 5 10 15 Asp Val Gly Asn

【００５０】配列番号：9 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGYTTYCARG GNCCNCARGG 20

【００５１】配列番号：10 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGRAARCANA CNGTRTTNGG 20

【００５２】配列番号：11 配列の長さ：20 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Ala Cys Asn Ile Val Pro Thr Ser Gly Gln Leu Ala Cys Gln Gln 1 5 10 15 Arg Glu Val Thr Ala 20

【００５３】配列番号：12 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGYCARCARM GNGARGTNAC 20

【００５４】配列番号：13 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTNGGNACDA TRTTRCANGC 20

【００５５】配列番号：14 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント

【００５６】配列番号：15 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CARTGYTTYG AYATGGTNAA 20

【００５７】配列番号：16 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列： Ser Ile Asp Val Asp Gln Cys Met Arg Ala Tyr Lys 1 5 10

【００５８】配列番号：17 配列の長さ：23 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTGTABGCNC KCATRCAYTG RTC 23

【００５９】配列番号：18 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TTNACCATRT CRAARCAYTG 20

【００６０】配列番号：19 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAYGTNGAYC ARTGYATGMG 20

【００６１】配列番号：20 配列の長さ：140 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列： TGTCAGCAGC GGGAGGTCAC CGCCTTCNCC CACTTCGGCA TGAACACCTT CACGGGCCGC 60 GAATGGGGAT CGGGTACCGA GGACGAAAAG CTCTTCGCCC CGAAGAGCAT CGACGTCGAT 120 CAATGTATGC GCGCGTACAA 140

【００６２】配列番号：21 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GCCAAGCTTT CATATGGGCA CCCCGTGCGC CGCG 34

【００６３】配列番号：22 配列の長さ：19 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GACGGGTACA GGACGAACC 19

【００６４】配列番号：23 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】Pst I 断片とSal I 断片の制限酵素地図の相関
を示す図でありＡは２．３Kb Pst I断片及びＢは１．９
Kb Sal I断片の制限酵素地図を示す図である。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年１月１７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３４】（２）α−１，３／４−フコシダーゼ遺伝
子全長をコードするプラスミドの構築 実施例１で得られたプラスミドｐＵＦＳＥＳ３０をＳａ
ｌＩで消化してアガロースゲル電気泳動を行い、１．９
ｋｂのＳａｌＩフラグメントを切り出し抽出精製した。
次に、実施例２−（１）で得られたプラスミドｐＴＦＳ
ＥＭ１０１ＮをＳａｌＩで消化し、１．９ｋｂのＳａｌ
Ｉフラグメントを挿入した後、大腸菌ＪＭ１０９株へ形
質転換させた。アルカリ溶菌法によりプラスミドＤＮＡ
を調製し、ＳａｌＩ消化によるＳａｌＩサイト再生の確
認、及びＳａｃＩ消化による挿入断片の方向確認を行っ
た。こうして得られたα−１，３／４−フコシダーゼ遺
伝子全長をコードするプラスミドをｐＴＦＳＥＭ２０１
と命名した。同様に実施例２−（１）で得られたプラス
ミドｐＴＦＳＥＦ１０１ＮをＳａｌＩで消化し、１．９
ｋｂのＳａｌＩフラグメントを挿入したプラスミドｐＴ
ＦＳＥＦ２０１を構築した。このプラスミドには、α−
１，３／４−フコシダーゼＮ末端の上流にｌａｃＺα由
来のペプチドを含む１０アミノ酸残基（Ｍｅｔ Ａｌａ
Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｈｅ
Ｈｉｓ Ｍｅｔ）〔配列番号２３〕をコードする配列が
含まれており、ｌａｃＺのＳＤ配列及びその開始コドン
を利用してｌａｃＺαとの融合体としてのα−１，３／
４−フコシダーゼの誘導発現が期待される。ｐＴＦＳＥ
Ｍ２０１を導入した大腸菌ＪＭ１０９をＥｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＦＳＥＭ２０１と
表示する。また、ｐＴＦＳＥＦ２０１を導入した大腸菌
ＪＭ１０９をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ
１０９／ｐＴＦＳＥＦ２０１と表示し、通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ ＢＰ−４９
５０として寄託されている。

【書類名】 受託番号変更届

【提出日】 平成７年１月１７日

【旧寄託機関の名称】 工業技術院生命工学工業技
術研究所

【旧受託番号】 ＦＥＲＭ Ｐ−１４２０６

【新寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所

【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−４９５０

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単離されたα−１，３／４−フコシダー
   ゼ遺伝子。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１に記載したアミノ酸
   配列又はその一部であって、かつ、α−１，３／４−フ
   コシダーゼ酵素活性を有する部分をコードする請求項１
   に記載のα−１，３／４−フコシダーゼ遺伝子。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号２に記載したＤＮＡ配
   列を有する請求項１に記載のα−１，３／４−フコシダ
   ーゼ遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項２に記載の遺伝子にハイブリダイ
   ズ可能な請求項１に記載のα−１，３／４−フコシダー
   ゼ遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のα−１，３／４−フコ
   シダーゼ遺伝子を含有させた組換えプラスミドを導入さ
   せた組換体を培養し、該培養物からα−１，３／４−フ
   コシダーゼを採取することを特徴とするα−１，３／４
   −フコシダーゼの製造方法。