JPH07298881A - 耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ及びその遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ（以下、
ＰＧと略記する）をコードする遺伝子、及び該遺伝子を
用いる耐熱性ＰＧの製造方法を提供する。 【構成】 ６０℃で６０分間処理したとき約９５％以上
の残存活性を保持している耐熱性ＰＧ。該ＰＧをコード
する、単離された耐熱性ＰＧ遺伝子。特定の単離された
該遺伝子にハイブリダイズ可能な耐熱性ＰＧ遺伝子。特
定の耐熱性ＰＧ遺伝子を含有させた組換えプラスミドを
導入させた組換体を培養し、該培養物から耐熱性ＰＧを
採取する耐熱性ＰＧの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、タンパク質工学の分野
で有用な新規な耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ、及
び該酵素をコードする遺伝子、及び該酵素の遺伝子工学
的製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】タンパク質やペプチドにはＮ末端がＬ−
ピログルタミン酸残基で保護されているものが多数存在
している。また、タンパク質やペプチドが加水分解され
た際に、新しく生じたアミノ末端のグルタミン又はグル
タミン酸が非酵素的に閉環してピログルタミン酸残基が
形成されることが多い。これらの、Ｎ末端がＬ−ピログ
ルタミン酸残基で保護されているタンパク質やペプチド
にはそのままではエドマン法によるアミノ酸配列決定法
を用いることができず、該Ｌ−ピログルタミン酸残基を
除去する操作が必要である。ピログルタミルペプチダー
ゼは、これらのタンパク質やペプチドのアミノ末端のＬ
−ピログルタミン酸残基を特異的に遊離する酵素であ
り、タンパク質工学の分野で非常に有用な酵素である。
ピログルタミルペプチダーゼは、種々の動物の脳、肺、
血清や脳下垂体及び植物、微生物にも広く存在している
ことが知られている。例えばブタ肝臓由来の酵素〔ジャ
ーナル オブ バイオケミストリー（Ｊ．Biochem.) 、
第１０１巻、第２１７〜２２３頁（１９８７）、同、第
１０６巻、第３８３〜３８８頁（１９８７）〕、仔牛肝
臓由来の酵素〔バイオケミカルアンド バイオフィジカ
ル リサーチ コミュニケーションズ（Biochem. Bioph
ys. Res. Comn.) 、第８１巻、第１７６〜１８５頁（１
９７８）〕又はバチルスアミロリクエファシエンス（Ba
cillus amyloliquefaciens) 由来の酵素〔ジャーナル
オブ バイオケミストリー、第８４巻、第４６７〜４７
６頁（１９７８）〕等が知られており、このうちバチル
ス アミロリクエファシエンス由来の酵素については遺
伝子が単離され、遺伝子工学的な製造方法が報告されて
いる（特開平５−１３７５８２号）。一方、タンパク質
工学のプロセスに利用されるプロテアーゼには、高い熱
安定性が要求されている。上述の酵素のうち、ブタ肝臓
由来の酵素及び仔牛肝臓由来の酵素の至適温度は５０℃
付近である。またバチルス アミロリクエファシエンス
由来の酵素の至適温度は５０℃付近にあり、該酵素は６
０℃、３０分の加熱でほぼ９０％失活するため、これら
の酵素を６０℃以上の高温で使用することは困難であ
り、より耐熱性の高いピログルタミルペプチダーゼの開
発が望まれている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】近年、ピロコッカス
フリオサス（Pyrococcus furiosus)に代表される好熱菌
は、極めて高い耐熱性を持った酵素の供給源として期待
されるが、これらの好熱菌よりピログルタミルペプチダ
ーゼは得られていない。また、これらの菌体から酵素を
取得するには、高温での微生物の培養が必要であり、工
業的な製造方法としては遺伝子工学的な製造方法が望ま
しい。本発明はこれらの課題を解決するために、新規な
耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ及び該酵素をコード
する遺伝子及び該遺伝子を用いる耐熱性ピログルタミル
ペプチダーゼの製造方法を提供するものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明は、６０℃で６０分間処理したとき約
９５％以上の残存活性を保持していることを特徴とする
耐熱性ピログルタミルペプチダーゼに関する。本発明の
第２の発明は、第１の発明の耐熱性ピログルタミルペプ
チダーゼをコードする単離された遺伝子に関し、配列表
の配列番号１で示されるアミノ酸配列、又はその一部で
あって、かつ耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ酵素活
性を有するＤＮＡ配列及び配列表の配列番号２で示され
ることを特徴とし、またこの遺伝子にハイブリダイズ可
能である耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ遺伝子に関
する。本発明の第３の発明は、工業的な製造方法に関
し、第２の発明の遺伝子を含有させた組換えプラスミド
を導入させた組換体を培養し、該培養物から耐熱性ピロ
グルタミルペプチダーゼを採取することを特徴とする。

【０００５】本発明者らは、耐熱性に優れたピログルタ
ミルペプチダーゼを得るためにピロコッカス フリオサ
ス ＤＳＭ３６３８よりピログルタミルペプチダーゼを
精製し、部分アミノ酸配列を決定し、その情報に基づい
て遺伝子をスクリーニングしようと試みたが、菌体より
のピログルタミルペプチダーゼの精製は困難であった。
目的とする酵素の一次構造に関する情報なしに酵素遺伝
子をクローニングする方法としては例えば発現クローニ
ング法があり、例えば、ピロコッカス ボウゼイ（Pyro
coccus woesei)由来のプルラナーゼ遺伝子（国際公開９
２／０２６１４号）はこの方法により取得された。一般
に発現クローニング法にはプラスミドベクターが使用さ
れるが、この場合には目的遺伝子が途中で切断されるこ
となく、かつプラスミドベクターに挿入可能な程度の比
較的小さなＤＮＡ断片に切断されるような制限酵素を用
いなければならず、必ずしもすべての酵素遺伝子のクロ
ーニングに適用可能ではない。更に、数多くのクローン
について酵素活性の発現を調べなければならず、操作が
繁雑である。本発明者らは、プラスミドベクターに代え
てより大きなＤＮＡ断片（３５〜５０kb）を保持できる
コスミドベクターを用いてピロコッカス フリオサスゲ
ノムより作製したコスミドライブラリーを構築し、該ラ
イブラリー中にピログルタミルペプチダーゼ活性を発現
するコスミドクローンを検索することにより、ピログル
タミルペプチダーゼ遺伝子を単離することを試みた。コ
スミドベクターを用いることにより、酵素遺伝子内部が
切断される恐れが減ると共に、スクリーニングする形質
転換体の数を減らすことができる。その半面、コスミド
ベクターはプラスミドベクターほど宿主内でのコピー数
が高くないため、酵素の発現量が低く、活性を検出でき
ない可能性がある。本発明者らは、目的とする酵素が高
い耐熱性を有する点に着目し、コスミドライブラリー中
の形質転換体を個別に培養し、得られた菌体から耐熱性
のタンパクのみを含むライゼートを調製する工程を組合
せた。この一群のライゼートは、コスミドプロテインラ
イブラリーと命名され、該コスミドプロテインライブラ
リーを酵素活性の検出に用いることにより、形質転換体
のコロニーを用いる方法よりも検出感度が上がると共
に、宿主由来のタンパク等によりバックグラウンドや酵
素活性の阻害といった悪影響を除去することができる。

【０００６】本発明者らは、ピロコッカス フリオサス
由来のコスミドプロテインライブラリーを検索し、ピロ
グルタミルペプチダーゼ活性を示す数個のコスミドクロ
ーンを取得した。本発明者らは、このクローン中に含ま
れる耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ遺伝子を含有す
る遺伝子断片の塩基配列を決定し、耐熱性ピログルタミ
ルペプチダーゼをコードする領域を決定し、微生物にお
いて耐熱性ピログルタミルペプチダーゼを大量に発現す
る組換えプラスミドの構築を行った。本発明者らは該プ
ラスミドにより形質転換した微生物を用いて新規な耐熱
性ピログルタミルペプチダーゼを生産させることに成功
し、該酵素の種々の酵素学的性質を明らかにした。更
に、本発明者らはピロコッカス フリオサスの菌体を培
養し、培養物より耐熱性ピログルタミルペプチダーゼを
採取できることを見出して本発明を完成した。

【０００７】なお、このコスミドプロテインライブラリ
ーを利用した発現クローニング法は、必ずしもあらゆる
耐熱性酵素に応用できるわけではなく、目的とする遺伝
子によりその成否は左右される。例えば本発明者らは該
方法を用いてピロコッカスフリオサス由来のプロテアー
ゼ〔アプライド アンド エンバイロンメンタルマイク
ロバイオロジー（Appl. Environment. Microbiol.)、第
５６巻、第１９９２〜１９９８頁（１９９０）〕につい
ても該プロテアーゼをコードする遺伝子の単離を試みた
が該遺伝子の単離には至っていない。

【０００８】本発明に係る耐熱性ピログルタミルペプチ
ダーゼ遺伝子は、好熱菌の遺伝子ライブラリーのスクリ
ーニングにより得ることができる。好熱菌としてはピロ
コッカス属に属する細菌が使用でき、例えばピロコッカ
ス フリオサスのゲノムのコスミドライブラリーより目
的の遺伝子をスクリーニングし、得ることができる。ピ
ロコッカス フリオサスとしてはピロコッカス フリオ
サス ＤＳＭ３６３８が使用でき、該菌株は、ドイッチ
ェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウン
ト ツェルクルチュウレンＧｍｂＨ（Deutsche Sammlun
g von Mikroorganismen und Zellkulturen und Ｇｍｂ
Ｈ）より入手可能な菌株である。

【０００９】ピロコッカス フリオサス ゲノムのコス
ミドライブラリーは、ピロコッカスフリオサスゲノムＤ
ＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（宝酒造社製）で部分消化
して得られたＤＮＡ断片とトリプルヘリックスコスミド
ベクター（ストラタジーン社製）とをライゲーションし
た後、インビトロパッケージング法によってラムダファ
ージ粒子中にパッケージングし、適当な微生物、例えば
大腸菌ＤＨ５ＭＣＲ（ＢＲＬ社製）を形質転換すること
によって得ることができる。次にライブラリー中の形質
転換体を培養した後、熱処理（１００℃、１０分間）、
超音波処理、再熱処理（１００℃、１０分間）してコス
ミドプロテインライブラリーとして、得られたライゼー
ト中のピログルタミルペプチダーゼ活性の有無を合成基
質ピログルタミルパラニトロアニリド（Ｐｙｒ−ｐＮ
Ａ）を基質としてスクリーニングすることができる。こ
れにより、上記の熱処理に耐性のピログルタミルペプチ
ダーゼを発現する、耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ
遺伝子を含むコスミドクローンをいくつか得ることがで
きる。更に、このようにして得られたコスミドクローン
の１つから調製したコスミドをＢａｍＨＩ（宝酒造社
製）消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクター
ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）のＢａｍＨＩサイトに導入
した組換えプラスミドを作製し、該プラスミドを導入し
た大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）を培養した後、ライ
ゼート中の耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ活性を測
定することにより、発現したピログルタミルペプチダー
ゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを得ることができる。
該プラスミドはプラスミドｐＰＧＰ１と命名されてい
る。図１にプラスミドｐＰＧＰ１の制限酵素地図を示
す。

【００１０】更にｐＰＧＰ１について数種類の制限酵素
を用いて種々の長さのＤＮＡ断片を調製し、各断片を適
当なプラスミドベクターに挿入した組換えプラスミドを
作製することができる。次に、該プラスミドを用いて大
腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、これらの形質転換体につ
いて耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ活性を測定する
ことにより、ｐＰＧＰ１より耐熱性ピログルタミルペプ
チダーゼをコードしない遺伝子の部分を除いた組換えプ
ラスミドを得ることができる。すなわち、前記のプラス
ミドｐＰＧＰ１をＸｂａＩ（宝酒造社製）消化して得ら
れる約２kbのＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１１８のＸｂａＩサ
イトに導入して作製したプラスミドはプラスミドｐＰＧ
Ｐ２と命名され、これを導入された大腸菌ＪＭ１０９を
培養して得られる培養物のライゼートは耐熱性ピログル
タミルペプチダーゼ活性を示す。図２にプラスミドｐＰ
ＧＰ２の制限酵素地図を示す。更に、該プラスミドｐＰ
ＧＰ２をＨｉｎｃIIで消化後、アガロースゲル電気泳動
を行い、約４．２kbのＤＮＡ断片をアガロースゲルより
回収する。このＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８にライゲーシ
ョンして得られた組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９
に導入し、出現したコロニーについてピログルタミルペ
プチダーゼ活性を測定し、活性が認められたコロニーよ
りプラスミドを調製することができ、該プラスミドは、
ｐＰＧＰ３と命名されている。図３にその制限酵素地図
を示す。

【００１１】更に、プラスミドｐＰＧＰ３から耐熱性ピ
ログルタミルペプチダーゼ遺伝子を含まない約１kbのＤ
ＮＡ断片を次のように除くことができる。すなわち、ｐ
ＰＧＰ３をＸｈｏＩ（宝酒造社製）及びＳａｃＩ（宝酒
造社製）消化して得られる約１kbのＸｈｏＩ−ＳａｃＩ
断片をプラスミドベクターｐＵＣ１１８のＳａｌＩ−Ｓ
ａｃＩサイトに導入した後、大腸菌ＪＭ１０９に導入し
た。得られたコロニーの耐熱性ピログルタミルペプチダ
ーゼ活性を測定し、活性を示したコロニーよりプラスミ
ドを調製する。該プラスミドはプラスミドｐＰＧＰ６と
命名されている。図４にその制限酵素地図を示す。プラ
スミドｐＰＧＰ６で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は
Escherichia coli JM109/pPGP6 と命名、表示され、工
業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１３
８９４として寄託されている。プラスミドｐＰＧＰ６に
挿入されている約０．７kbp のＤＮＡ断片の塩基配列を
配列表の配列番号３に示す。

【００１２】耐熱性ピログルタミルペプチダーゼを大量
に発現するためのプラスミドをプラスミドｐＰＧＰ６か
ら次のように構築することができる。すなわち、配列表
の配列番号４に示すオリゴヌクレオチドｐＰＧＰ６−Ｐ
ＴＶ及びＭ１３プライマーＭ４（宝酒造社製）をプライ
マーとし、プラスミドｐＰＧＰ６を鋳型としてＰＣＲを
行うことにより、耐熱性ピログルタミルペプチダーゼの
Ｎ末端をコードすると考えられる領域の直前に制限酵素
ＤｒａＩの認識配列を導入した、これらのプライマーの
配列を両端にもつＤＮＡ断片を増幅することができる。
増幅された約７００bpのＤＮＡ断片をＤｒａＩ及びＸｈ
ｏＩで消化し、プラスミドベクターｐＴＶ１１８Ｎ（宝
酒造社製）のＮｃｏＩ−ＳａｌＩサイトに挿入して、大
腸菌ＪＭ１０９に導入して、得られたコロニーの耐熱性
ピログルタミルペプチダーゼ活性を測定し、活性を示し
たコロニーよりプラスミドを調製する。該プラスミドは
プラスミドｐＰＧＰ７と命名されている。図５にその制
限酵素地図を示す。プラスミドｐＰＧＰ７で形質転換さ
れた大腸菌ＪＭ１０９は Escherichia coli JM109/pPGP
7 と命名されている。プラスミドｐＰＧＰ７に挿入され
ている約０．６kbpのＤＮＡ断片の塩基配列の一部を配
列表の配列番号２に示す。すなわち配列表の配列番号２
は本発明によって得られる耐熱性ピログルタミルペプチ
ダーゼ遺伝子の１例の塩基配列である。該配列中、塩基
番号１番〜６１４番がピロコッカスフリオサス由来の配
列であり、６１５〜６３９番がプラスミドｐＴＶ１１８
Ｎ由来の配列である。また配列表の配列番号１に、配列
番号２に示される塩基配列のうち塩基番号１〜６１２番
の部分より推定される遺伝子産物のアミノ酸配列を示
す。すなわち配列表の配列番号１は本発明によって得ら
れる耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ遺伝子を用いて
生産される酵素タンパクの１例のアミノ酸配列である。

【００１３】また、ｐＰＧＰ７に比較してより長い部分
の耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ遺伝子を含む発現
用プラスミドを構築することができる。すなわち、上述
のｐＰＧＰ６−ＰＴＶ及びＭ１３プライマーＭ４をプラ
イマーとし、プラスミドｐＰＧＰ３を鋳型としてＰＣＲ
を行うことによりこれらのプライマーの配列を両端に有
する約１kbp のＤＮＡ断片を増幅する。該断片をＤｒａ
Ｉ及びＨｉｎｃIIで消化し、プラスミドベクターｐＴＶ
１１８ＮのＮｃｏＩ−ＨｉｎｃIIサイトに挿入し、大腸
菌ＪＭ１０９に導入して、得られたコロニーの耐熱性ピ
ログルタミルペプチダーゼ活性を測定し、活性を示した
コロニーよりプラスミドを調製する。該プラスミドはプ
ラスミドｐＰＧＰ８と命名されている。図６にその制限
酵素地図を示す。プラスミドｐＰＧＰ８で形質転換され
た大腸菌ＪＭ１０９は Escherichia coli JM109/pPGP8
と命名されている。更に上記プラスミドｐＰＧＰ８をＡ
ｐａＬＩ及びＨｉｎｃIIで消化して切り出される約０．
３kbp のＤＮＡ断片を取り除いて得られたプラスミドは
ｐＰＧＰ９と命名されている。プラスミドｐＰＧＰ９の
制限酵素地図を図７に示す。プラスミドｐＰＧＰ９で形
質転換された大腸菌ＪＭ１０９は Escherichia coli JM
109/pPGP9 と命名、表示され、工業技術院生命工学工業
技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４２０７として寄託され
ている。プラスミドｐＰＧＰ９に挿入されている約６７
０bpのＤＮＡ断片の塩基配列を配列表の配列番号５に示
す。すなわち配列表の配列番号５は本発明によって得ら
れる耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ遺伝子の１例の
塩基配列である。また配列表の配列番号６に、配列番号
５に示される塩基配列の塩基番号１〜６２４番までの部
分より推定される遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。す
なわち配列表の配列番号６は本発明によって得られる耐
熱性ピログルタミルペプチダーゼ遺伝子を用いて生産さ
れる酵素タンパクの１例のアミノ酸配列の一部である。

【００１４】Escherichia coli JM109/pPGP7又はEscher
ichia coli JM109/pPGP9を通常の培養条件、例えば１０
０μｇ／mlのアンピシリンを含む２×ＴＹ培地（トリプ
トン１６ｇ／リットル、酵母エキス１０ｇ／リットル、
ＮａＣｌ ５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）中、３７℃で
培養することにより、培養菌体中に耐熱性ピログルタミ
ルペプチダーゼを発現させることができる。培養終了
後、培養菌体を集菌し、得られた菌体の超音波処理後の
遠心上清を粗酵素液とし、該酵素液の１００℃、１０分
間の熱処理による夾雑タンパク質の変性処理、除核酸処
理、硫安塩析処理、透析処理、疎水性クロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー等の通常酵素の精製
に用いられる方法を組合せて用いることによって耐熱性
ピログルタミルペプチダーゼを精製することができる。

【００１５】Escherichia coli JM109/pPGP7を培養終了
後、培養菌体を集菌し、得られた菌体の超音波処理後の
遠心上清を粗酵素液とし、該酵素液の１００℃、５分間
の熱処理による夾雑タンパク質の変性処理後の遠心処理
を行って、遠心上清を耐熱性ピログルタミルペプチダー
ゼの酵素標品（１）として酵素化学的、及び理化学的性
質を測定した。またEscherichia coli JM109/pPGP9につ
いて同様に酵素標品を調製し、酵素標品（２）として酵
素化学的、及び理化学的性質を測定した。

【００１６】本発明の耐熱性ピログルタミルペプチダー
ゼ遺伝子を発現することにより得られる耐熱性ピログル
タミルペプチダーゼは、ピロコッカス属に属する菌株、
例えばピロコッカス フリオサス ＤＳＭ３６３８やピ
ロコッカス ボウゼイ ＤＳＭ３７７３を適当な増殖培
地中で培養し、その菌体及び培養液より精製して得るこ
ともできる。ピロコッカス属の菌体の培養に当っては、
通常、好熱菌の培養に用いられる方法が利用でき、培地
に加える栄養源は使用する菌株が利用し得るものであれ
ばよい。炭素源としては、例えばデンプン等が利用で
き、窒素源としては、例えばトリプトン、ペプトン等が
利用でき、他の栄養源としては、例えば、酵母エキス等
が利用できる。培地中には、マグネシウム塩、ナトリウ
ム塩、鉄塩などの金属塩を微量元素として加えてもよ
い。また例えば、培地の調製に人工海水を用いることが
有利である。また培地は固形の硫黄を含んでいない透明
な培地が望ましく、該培地を用いれば、菌体の増殖は光
学密度を測定することにより容易に監視することができ
る。培養に当っては、静置培養又はかくはん培養で行う
ことができるが、例えば特表平４−５０３７５７号公報
に記載のごとく、通気培養を行ってもよいし、例えばア
プライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバ
イオロジー、第５５巻、第２０８６〜２０８８頁（１９
９２）に記載のように、透析培養法を用いてもよい。一
般に培養温度は、９５℃前後が好ましく、通常１６時間
程度で耐熱性ピログルタミルペプチダーゼが培養物中に
著量蓄積する。培養条件は、使用する菌体、培地組成に
応じ耐熱性ピログルタミルペプチダーゼの生産量が最大
になるように設定するのは当然である。

【００１７】耐熱性ピログルタミルペプチダーゼを採取
するに当っては、例えば培養液から遠心分離、ろ過など
によって菌体を集め、次いで菌体を破砕すればよく、菌
体の破砕方法としては、超音波破砕、ビーズ破砕、溶菌
酵素処理等があり、これらの方法を利用して菌体中より
耐熱性ピログルタミルペプチダーゼを抽出することがで
きる。なお、酵素の抽出は使用する菌体によって最も抽
出効果の高い方法を採用して粗酵素液を調製すればよ
い。かくして得られた粗酵素液から耐熱性ピログルタミ
ルペプチダーゼを単離するに当っては、通常の酵素の精
製に用いられる方法を使用できる。例えば、硫安塩析処
理、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラ
フィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等の方法を組合せ
て使用できる。

【００１８】本発明者らはピロコッカス フリオサス
ＤＳＭ３６３８を培養し、該培養物中に耐熱性ピログル
タミルペプチダーゼが存在することを確認した。すなわ
ち、トリプトン１％、酵母エキス０．５％、可溶性デン
プン１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジャマリンラボラ
トリー）３．５％、ジャマリンＳ・リキッド（ジャマリ
ンラボラトリー）０．５％、ＭｇＳＯ₄ ０．００３％、
ＮａＣｌの０．００１％、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．
０００１％、ＣｏＳＯ₄ ０．０００１％、ＣａＣｌ₂ ・
７Ｈ₂ Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ₄ ０．０００１
％、ＣｕＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ ０．１ppm 、ＫＡｌ（ＳＯ
₄ ）₂ ０．１ppm 、Ｈ₃ ＢＯ₃ ０．１ppm、Ｎａ₂ Ｍｏ
Ｏ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ ０．１ppm 、ＮｉＣｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ
０．２５ppm の組成が培地２リットルを２リットル容の
メディウムボトルに入れ、１２０℃、２０分間殺菌した
後、窒素ガスを吹込み溶存酸素を除去した後、これに上
記菌株を接種して９５℃、１６時間静置培養した。培養
後、遠心分離によって菌体を集めた。集菌体を５０mMト
リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）に懸濁し、超音波処
理により菌体を破砕した。該菌体破砕液を遠心分離し得
られた上清を酵素標品（３）として耐熱性ピログルタミ
ルペプチダーゼ活性の酵素化学的、及び理化学的性質を
測定した。酵素標品（１）、（２）及び（３）の酵素化
学的及び理化学的性質を以下に示す。

【００１９】（１）作 用 Ｌ−ピログルタミン酸−ｐ−ニトロアニリド（Ｐｙｒ−
ｐＮＡ）を加水分解し、黄色物質（ｐ−ニトロアリニ
ン）を生成する。また、Ｌ−ピログルタミン酸−７−ア
ミド−４−メチルクマリン（Ｐｙｒ−ＭＣＡ）を加水分
解し、蛍光発色物質７−アミノ−４−メチルクマリン
（ＡＭＣ）を生成する。更に、ニューロテンシン又はフ
ィサラミンを加水分解し、Ｎ末端由来の遊離のピログル
タミン酸を生成する。

【００２０】（２）酵素活性測定方法 上述した酵素標品（１）、（２）及び（３）の性質検討
においては、適度に希釈した酵素標品の試料溶液５μｌ
に１mMのＰｙｒ−ｐＮＡ、１０mMのＤＴＴを含む５０mM
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５００μｌを加
え、７５℃で１５分間反応させた。氷冷して終濃度５％
となるように３０％酢酸を加えて反応を停止し、４１０
nmにおける吸光度を測定し、ｐ−ニトロアニリンの生成
量を求めた。酵素１単位は７５℃において１分間に１μ
moleのｐ−ニトロアニリンを生成する酵素量とした。酵
素標品（１）、（２）及び（３）は測定されたｐＨ７．
０、７５℃においてＰｙｒ−ｐＮＡ分解活性を有してい
た。コスミドプロテインライブラリーのスクリーニング
においては、酵素活性を測定しようとする溶液を適度に
希釈し、その試料溶液に２０μｌに１mMのＰｙｒ−ｐＮ
Ａを含む５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
１００μｌを加え、９５℃で３０分間反応させた。氷冷
して反応を停止した後、４１０nmにおける吸光度を測定
し、ｐ−ニトロアニリンの生成量を求めた。Ｐｙｒ−Ｍ
ＣＡ（ペプチド研究所社製）を基質としてその分解活性
を測定した。すなわち１ミリ単位の酵素を含む試料溶液
２０μｌに１mMのＰｙｒ−ＭＣＡを含む５０mMリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌを加えて、９
５℃で３０分間反応させた。氷冷して反応を停止した
後、励起波長３８０nm、測定波長４６０nmにおける蛍光
強度を測定し、ＡＭＣの生成量を求めた。酵素１単位は
９５℃において１分間に１μmoleのＡＭＣを生成する酵
素量とした。酵素標品（１）、（２）及び（３）は測定
されたｐＨ７．５、９５℃においてＰｙｒ−ＭＣＡ分解
活性を有していた。ニューロテンシン、又はフィサラミ
ン（ペプチド研究所社製）を基質として耐熱性ピログル
タミルペプチダーゼによる分解活性を測定した。すなわ
ち１００pmole のニューロテンシン又はフィサラミンを
含む５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１９
７．５μｌに酵素を含む試料溶液２．５μｌを加え、９
５℃で５時間反応させた。氷冷して反応を停止した後、
反応液の一部をアミノ酸分析に供し、遊離したアミノ酸
を分析した。酵素標品（１）、（２）及び（３）は測定
されたｐＨ７．０、９５℃においてニューロテンシン又
はフィサラミンのＮ末端のピログルタミン酸を遊離する
活性を有していた。

【００２１】（３）至適温度 測定には３ミリ単位の酵素標品を用い、種々の温度で反
応を行った。酵素標品（１）、（２）及び（３）は図８
に示すように測定されたｐＨ７．０において、３７℃〜
１０４℃の範囲で活性があり、その至適温度は８５℃〜
９５℃であった。図８は酵素標品（１）、（２）及び
（３）の至適温度を示す図であり、縦軸は相対活性率
（％）、横軸は反応温度（℃）を示す。図中白丸印は酵
素標品（１）、黒丸印は酵素標品（２）、＋印は酵素標
品（３）の各結果を示す。

【００２２】（４）至適ｐＨ 測定には３ミリ単位の酵素標品を用い、活性測定に用い
る基質溶液をｐＨ４．０〜６．０においては５０mMクエ
ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０〜５．０においては
５０mM酢酸トナリウム緩衝液、ｐＨ６．０〜８．０にお
いては５０mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０〜
９．６においては５０mMホウ酸ナトリウム緩衝液、また
ｐＨ１０．２〜１０．９においては５０mMリン酸水素二
ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を用いて調製し使
用した。酵素標品（１）、（２）及び（３）は図９で示
すように、ｐＨ７．０付近で最大活性を示した。図９は
酵素標品（１）、（２）及び（３）の至適ｐＨを示す図
であり、縦軸は相対活性率（％）、横軸はｐＨを示す。
図中白丸印は酵素標品（１）、黒丸印は酵素標品
（２）、＋印は酵素標品（３）の各結果を示す。

【００２３】（５）温度安定性 １．５単位の酵素を含む１０mMＤＴＴ、５０mMリン酸ナ
トリウム ｐＨ７．０溶液を６０℃及び７５℃で種々の
時間処理をした後その一部を用いて残存する酵素活性を
測定した。図１０に示すように酵素標品（１）、
（２）、（３）は６０℃、３０分間の処理後では９５％
以上の活性を保持しており、７５℃、１５０分間の処理
後も、ほぼ９０％の活性を保持していた。図１０は本発
明により得られる酵素標品（１）、（２）、（３）の温
度安定性を示す図であり、縦軸は残存活性率（％）、横
軸は熱処理時間（分）を示す。図中白丸印は酵素標品
（１）、黒丸印は酵素標品（２）、＋印は酵素標品
（３）の各測定結果であり、破線は６０℃、実線は７５
℃での結果を示す。

【００２４】（６）ｐＨ安定性 ０．７５単位の酵素を含む１０mMＤＴＴ、５０mMの各ｐ
Ｈの緩衝液を７５℃で３０分間処理した後、その一部を
用いて残存する酵素活性を測定した。緩衝液として、ｐ
Ｈ４．０〜６．０においてはクエン酸ナトリウム、ｐＨ
４．０〜５．０においては酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０
〜８．０においてはリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０〜
９．６においてはホウ酸ナトリウム、ｐＨ１０．２〜１
０．９においてはリン酸水素二ナトリウム−水酸化ナト
リウムをそれぞれ用いた。図１１に示すように、酵素標
品（１）、（２）、（３）はｐＨ５．０〜８．８の間で
は７５℃３０分間の処理後も８０％以上の活性を保持し
ていた。図１１は本発明により得られた酵素標品
（１）、（２）、（３）のｐＨ安定性を示す図であり、
縦軸は残存活性率（％）、横軸はｐＨを示す。図中、白
丸印は酵素標品（１）、黒丸印は酵素標品（２）、＋印
は酵素標品（３）の各測定結果を示す。

【００２５】以上、詳細に説明したように、本発明によ
り耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ及び該酵素をコー
ドする遺伝子が提供され、該遺伝子を用いた耐熱性ピロ
グルタミルペプチダーゼの工業的製造方法が提供され
る。本発明により得られる耐熱性ピログルタミルペプチ
ダーゼは高度の耐熱性を有する新規酵素であり、高温下
でのタンパク質工学的な処理において特に有用である。
また、本発明により単離された遺伝子を用いることによ
り、該遺伝子にハイブリダイズ可能な耐熱性ピログルタ
ミルペプチダーゼ遺伝子を簡便にクローニングすること
ができる。また本発明により得られる耐熱性ピログルタ
ミルペプチダーゼ遺伝子に適当な修飾を施すことによ
り、該ピログルタミルペプチダーゼの機能を更に改善す
ることができる。

【００２６】

【実施例】以下に本発明の実施例を示すが、本発明が以
下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。な
お、実施例中の％は重量％を意味する。

【００２７】実施例１ （ピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡの調製）ピ
ロコッカス フリオサス ＤＳＭ３６３８の培養は以下
のとおりに行った。トリプトン１％、酵母エキス０．５
％、可溶性デンプン１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジ
ャマリンラボラトリー）３．５％、ジャマリンＳ・リキ
ッド（ジャマリンラボラトリー）０．５％、ＭｇＳＯ₄
０．００３％、ＮａＣｌの０．００１％、ＦｅＳＯ₄ ・
７Ｈ₂ Ｏ ０．０００１％、ＣｏＳＯ₄ ０．０００１
％、ＣａＣｌ₂ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ
₄ ０．０００１％、ＣｕＳＯ₄・５Ｈ₂ Ｏ ０．１ppm
、ＫＡｌ（ＳＯ₄ ）₂ ０．１ppm 、Ｈ₃ ＢＯ₃ ０．１p
pm 、Ｎａ₂ ＭｏＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ ０．１ppm 、ＮｉＣ
ｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ ０．２５ppm の組成が培地２リットル
を２リットル容のメディウムボトルに入れ、１２０℃、
２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹込み溶存酸素を除去
した後、これに上記菌株を接種して９５℃、１６時間静
置培養した。培養後、遠心分離によって菌体を集めた。
次に集菌体を２５％スクロースを含む０．０５Ｍトリス
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４mlに懸濁し、この懸濁液に
０．８mlのリゾチーム〔５mg／ml、０．２５Ｍトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕、２mlの０．２Ｍ ＥＤＴＡを
加えて、２０℃で１時間保温した後、２４mlのＳＥＴ溶
液〔１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、２０mMトリ
ス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）〕を加え、更に５％ＳＤＳ４
ml、プロティナーゼＫ（１０mg／ml）４００μｌを加
え、３７℃、１時間反応させた。反応終了後、フェノー
ル−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、
約３．２mgのゲノムＤＮＡを調製した。

【００２８】（コスミドプロテインライブラリーの作
製）ピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡ４００μ
ｇをＳａｕ３ＡＩで部分消化し、密度勾配超遠心法によ
り、３５〜５０kbにサイズ分画した。次に、トリプルヘ
リックスコスミドベクター１μｇをＢａｍＨＩ消化し、
上記分画された３５〜５０kbのＤＮＡ１４０μｇと混合
したライゲーションを行い、ガイガーパックゴールド
（ストラタジーン社製）を用いたイン ビトロ パッケ
ージング法によってピロコッカス フリオサス ゲノム
ＤＮＡのフラグメントをラムダファージ粒子中にパッケ
ージングした。得られたファージ溶液の一部を用いて大
腸菌ＤＨ５αＭＣＲを形質転換し、ライブラリーを調製
した。得られたコロニーのうち数個を選んでコスミドを
調製し、適当な大きさの挿入断片があることを確認した
のち、調製した５００個のコロニーから個別に形質転換
体を１００μｇ／mlのアンピシリンを含む１５０mlのＬ
Ｂ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ
／リットル、ＮａＣｌの５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）
中で培養した。該培養物を遠心し、回収した菌体を２０
mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０ １mlに懸濁し、１００
℃で１０分間熱処理した。続いて超音波処理を行い、更
にもう一度１００℃、１０分間熱処理した。遠心後の上
清として得られるライゼートをコスミドプロテインライ
ブラリーとした。

【００２９】（耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ遺伝
子を含むコスミドの選択）上記のコスミドプロテインラ
イブラリーからライゼート２０μｌずつをとり、前述し
た酵素活性測定方法に従って９５℃でのＰｙｒ−ｐＮＡ
分解活性及びＰｙｒ−ＭＣＡ分解活性、ニューロテンシ
ン及びフィサラミンに対する分解活性を測定し、ピログ
ルタミルペプチダーゼ活性を持つ２つのコスミドクロー
ンを得た。

【００３０】（プラスミドｐＰＧＰ１の調製）ピログル
タミルペプチダーゼ活性を持つ２つのコスミドクローン
の一方についてコスミドを調製し、ＢａｍＨＩ消化した
後、プラスミドベクターｐＵＣ１１８のＢａｍＨＩサイ
トにライゲーションした。この組換えプラスミドを大腸
菌ＪＭ１０９に導入した後、１００μｇ／mlのアンピシ
リンを含むＬＢプレート上にまき、出現したコロニーに
ついて１００μｇ／mlのアンピシリンを含む５mlのＬＢ
培地中で培養を行った。該培養物を遠心して回収した菌
体を５０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０μｌ
に懸濁し、１００℃、１０分間熱処理を行った後、超音
波処理によって菌体を破砕した。更にもう一度、１００
℃、１０分間の熱処理を行い、遠心してライゼートを得
た。このライゼートについてピログルタミルペプチダー
ゼ活性を測定した。すなわち２０μｌのライゼートに１
mMのＰｙｒ−ｐＮＡを有する５０mMリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．５）１００μｌを加え、９５℃で３０分
間反応させた。氷冷して反応を停止した後、４１０nmに
おける吸光度を測定しｐ−ニトロアニリンの生成量を求
めた。ピログルタミルペプチダーゼ活性を有するコロニ
ーよりプラスミドを調製し、これをプラスミドｐＰＧＰ
１と命名した。

【００３１】（プラスミドｐＰＧＰ２の調製）上記プラ
スミドｐＰＧＰ１についてＸｂａＩの切断位置を調べ、
図１に示す制限酵素地図を得た。この制限酵素地図を基
に約２kbのＸｂａＩ断片をプラスミドベクターｐＵＣ１
１８にＸｂａＩサイトを利用して挿入した。この組換え
プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入し、出現したコロ
ニーについて上述の方法でピログルタミルペプチダーゼ
活性を調べた。耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ活性
が認められたコロニーよりプラスミドを調製し、これを
プラスミドｐＰＧＰ２と命名した。図２にプラスミドｐ
ＰＧＰ２の制限酵素地図を示す。

【００３２】（プラスミドｐＰＧＰ３の調製）上記プラ
スミドｐＰＧＰ２をＨｉｎｃII消化後、アガロースゲル
電気泳動を行い、約４．３kbのＤＮＡ断片をアガロース
ゲルより回収した。このＤＮＡ断片をライゲーションし
て得られた組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入
し、出現したコロニーについて前述の方法でピログルタ
ミルペプチダーゼ活性を調べた。耐熱性ピログルタミル
ペプチダーゼ活性が認められたコロニーよりプラスミド
を調製し、これをプラスミドｐＰＧＰ３と命名した。図
３にプラスミドｐＰＧＰ３の制限酵素地図を示す。

【００３３】（プラスミドｐＰＧＰ６の調製）上記プラ
スミドｐＰＧＰ３をＸｈｏＩ、ＳａｃＩ消化して得られ
た約０．７kbのＸｈｏＩ−ＳａｃＩ断片をプラスミドベ
クターｐＵＣ１１８にＳａｌＩ−ＳａｃＩサイトを利用
して導入した。この組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０
９に導入した。出現したコロニーについて前述の方法で
ピログルタミルペプチダーゼ活性を調べた。耐熱性ピロ
グルタミルペプチダーゼ活性が認められたコロニーより
プラスミドを調製し、これをプラスミドｐＰＧＰ６と命
名した。図４にプラスミドｐＰＧＰ６の制限酵素地図を
示す。プラスミドｐＰＧＰ６で形質転換された大腸菌Ｊ
Ｍ１０９は Escherichia coli JM109/pPGP6 と命名、表
示され、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
Ｐ−１３８９４として寄託されている。上記プラスミ
ドｐＰＧＰ６に挿入された耐熱性ピログルタミルペプチ
ダーゼ遺伝子を含む約０．７kbのＤＮＡ断片を種々の制
限酵素で適当なサイズに断片化し、該断片をプラスミド
ベクターｐＵＣ１１８にサブクローニングした後、各断
片の塩基配列を決定した。塩基配列の決定は BcaBestジ
デオキシシークエンシングキット（宝酒造社製）を用い
たジデオキシ法により行った。該ＤＮＡ断片の塩基配列
の一部を配列表の配列番号３に示す。

【００３４】（耐熱性ピログルタミルペプチダーゼを大
量発現するプラスミドｐＰＧＰ７の調製）上記のＤＮＡ
配列の情報に基づいて、大腸菌内で耐熱性ピログルタミ
ルペプチダーゼを直接に大量発現する組換えプラスミド
をＰＣＲを利用した部位特異的変異導入法により構築し
た。耐熱性ピログルタミルペプチダーゼのＮ末端をコー
ドすると考えられる領域の直前に制限酵素ＤｒａＩの認
識配列を導入できるように設計した、配列表の配列番号
４に示すオリゴヌクレオチドｐＰＧＰ６−ｐＴＶを合成
した。このオリゴヌクレオチドとＭ１３プライマーＭ４
（宝酒造社製）をプライマー、プラスミドＰＧＰ６を鋳
型としてＰＣＲを行い、これらのプライマーの配列を両
端にもつ約７００bpの２本鎖ＤＮＡを合成した後、これ
をＤｒａＩ、ＸｈｏＩで消化した。一方、プラスミドベ
クターｐＴＶ１１８ＮをＮｃｏＩ消化し、ブランディン
グキット（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化した後に
ＳａｌＩ消化し、これと前述の制限酵素消化したＰＣＲ
産物をライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９に導入
した。得られたコロニーについて、前述の方法でピログ
ルタミルペプチダーゼ活性を調べ、活性が認められたコ
ロニーよりプラスミドを調製し、これをプラスミドｐＰ
ＧＰ７と命名した。プラスミドｐＰＧＰ７で形質転換さ
れた大腸菌ＪＭ１０９を Escherichia coli JM109/pPGP
7 と命名した。プラスミドｐＰＧＰ７に挿入されている
約６４０bpのＤＮＡ断片の塩基配列を前述の方法に基づ
いて決定した。該配列を配列表の配列番号２に示す。ま
た、配列番号２の塩基配列１〜６１２番の部分から推定
されるアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。

【００３５】（プラスミドｐＰＧＰ８の構築）上述した
プライマーｐＰＧＰ６−ｐＴＶとＭ１３プライマーＭ４
をプライマーとし、プラスミドｐＰＧＰ３を鋳型とした
ＰＣＲを行い、これらのプライマーの配列を両端にもつ
約１kbの２本鎖ＤＮＡを合成した後、これをＤｒａＩ、
ＨｉｎｃIIで消化した。一方、プラスミドベクターｐＴ
Ｖ１１８ＮをＮｃｏＩ消化し、末端を平滑化した後、更
にＨｉｎｃII消化し、これと前述の制限酵素消化したＰ
ＣＲ産物とをライゲーションした後、大腸菌ＪＭ１０９
に導入した。得られたコロニーについて前述の方法でピ
ログルタミルペプチダーゼ活性を調べ、活性が認められ
たコロニーよりプラスミドを調製し、これをプラスミド
ｐＰＧＰ８と命名した。図６にプラスミドｐＰＧＰ８の
制限酵素地図を示す。

【００３６】（プラスミドｐＰＧＰ９の構築）上記プラ
スミドｐＰＧＰ８をＡｐａＬＩ（宝酒造社製）消化した
のちＤＮＡ末端を平滑化し、更にＡｃｃIII （宝酒造社
製）消化後アガロースゲル電気泳動を行い、分離した約
４００bpのＡｐａＬＩ−ＡｃｃIII 断片をアガロースゲ
ルより回収した。次に、プラスミドｐＰＧＰ８をＡｃｃ
III −ＨｉｎｃII（宝酒造社製）消化後、前述の約４０
０bpのＤＮＡ断片と混合してライゲーションを行い、大
腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られたコロニーについて
前述の方法でピログルタミルペプチダーゼ活性を調べ、
活性が認められたコロニーよりプラスミドを調製し、こ
れをプラスミドｐＰＧＰ９と命名した。図７にプラスミ
ドｐＰＧＰ９の制限酵素地図を示す。プラスミドｐＰＧ
Ｐ９により形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は Escheri
chiacoli JM109/pPGP9 と命名、表示され、工業技術院
生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４２０７と
して寄託されている。

【００３７】プラスミドｐＰＧＰ９に挿入されている約
６８０bpのＤＮＡ断片について、前述の方法に準じてＤ
ＮＡの塩基配列を決定した。該断片のＤＮＡ塩基配列の
一部を配列表の配列番号５に示す。配列番号５中、塩基
番号１番〜３番が開始コドンであり、塩基番号６２５番
〜６２７番が終止コドンである。塩基番号１番〜６２７
番の部分のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列を配
列表の配列番号６に示す。

【００３８】次に Escherichia coli JM109/pPGP7 又は
Escherichia coli JM109/pPGP9 を１００μｇ／mlのア
ンピシリンを含む２×ＴＹ培地（トリプトン１６ｇ／リ
ットル、酵母エキス１０ｇ／リットル、ＮａＣｌ ５ｇ
／リットル、ｐＨ７．２）中、３７℃で培養し、培養終
了後、培養菌体を集菌し、得られた菌体の超音波処理後
の遠心上清を粗酵素液とし、該酵素液の１００℃、５分
間の熱処理による夾雑タンパク質の変性処理後に遠心処
理を行って、遠心上清を耐熱性ピログルタミルペプチダ
ーゼの酵素標品（１）として酵素化学的、及び理化学的
性質を測定した。また Escherichia coli JM109/pPGP9
について同様に酵素標品を調製し、酵素標品（２）とし
て酵素化学的、及び理化学的性質を測定した。

【００３９】更に、トリプトン１％、酵母エキス０．５
％、可溶性デンプン１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジ
ャマリンラボラトリー）３．５％、ジャマリンＳ・リキ
ッド（ジャマリンラボラトリー）０．５％、ＭｇＳＯ₄
０．００３％、ＮａＣｌの０．００１％、ＦｅＳＯ₄ ・
７Ｈ₂ Ｏ ０．０００１％、ＣｏＳＯ₄ ０．０００１
％、ＣａＣｌ₂ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ
₄ ０．０００１％、ＣｕＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ ０．１ppm
、ＫＡｌ（ＳＯ₄ ）₂ ０．１ppm 、Ｈ₃ ＢＯ₃ ０．１p
pm 、Ｎａ₂ ＭｏＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ ０．１ppm 、ＮｉＣ
ｌ₂ ・６Ｈ₂ Ｏ ０．２５ppm の組成の培地２リットル
を２リットル容のメディウムボトルに入れ、１２０℃、
２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹込み溶存酸素を除去
した後、ピロコッカス フリオサス ＤＳＭ３６３８を
接種して９５℃、１６時間静置培養した。培養後、遠心
分離によって菌体を集めた。集菌体を５０mMトリス−Ｈ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．８）に懸濁し、超音波処理により
菌体を破砕した。該菌体破砕液を遠心分離しその上清を
酵素標品（３）として耐熱性ピログルタミルペプチダー
ゼ活性の酵素化学的、及び理化学的性質を測定した。酵
素標品（１）、（２）及び（３）の酵素化学的及び理化
学的性質の測定結果を以下に示す。

【００４０】（１）作 用 Ｌ−ピログルタミン酸−ｐ−ニトロアニリド（Ｐｙｒ−
ｐＮＡ）を加水分解し、黄色物質（ｐ−ニトロアニリ
ン）を生成した。また、Ｌ−ピログルタミン酸−７−ア
ミド−４−メチルクマリン（Ｐｙｒ−ＭＣＡ）を加水分
解し、蛍光発色物質７−アミノ−４−メチルクマリン
（ＡＭＣ）を生成した。更に、ニューロテンシン又はフ
ィサラミンを加水分解し、Ｎ末端由来の遊離のピログル
タミン酸を生成した。

【００４１】（２）酵素活性測定方法 上述した酵素標品（１）、（２）及び（３）の性質検討
においては、適度に希釈した酵素標品の試料溶液５μｌ
に１mMのＰｙｒ−ｐＮＡ、１０mMのＤＴＴを含む５０mM
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）５００μｌを加
え、７５℃で１５分間反応させた。氷冷した終濃度５％
となるように３０％酢酸を加えて反応を停止し、４１０
nmにおける吸光度を測定し、ｐ−ニトロアニリンの生成
量を求めた。酵素１単位は７５℃において１分間に１μ
moleのｐ−ニトロアニリンを生成する酵素量とした。酵
素標品（１）、（２）及び（３）は測定されたｐＨ７．
０、７５℃においてＰｙｒ−ｐＮＡ分解活性を有してい
た。コスミドプロテインライブラリーのスクリーニング
においては、酵素活性を測定しようとする溶液を適度に
希釈し、その試料溶液２０μｌに１mMのＰｙｒ−ｐＮＡ
を含む５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１
００μｌを加え、９５℃で３０分間反応させた。氷冷し
て反応を停止した後、４１０nmにおける吸光度を測定
し、ｐ−ニトロアニリンの生成量を求めた。Ｐｙｒ−Ｍ
ＣＡ（ペプチド研究所社製）を基質としてその分解活性
を測定した。すなわち１ミリ単位の酵素を含む試料溶液
２０μｌに１mMのＰｙｒ−ＭＣＡを含む５０mMリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ７．５）１００μｌを加えて、９
５℃で３０分間反応させた。氷冷して反応を停止した
後、励起波長３８０nm、測定波長４６０nmにおける蛍光
強度を測定し、ＡＭＣの生成量を求めた。酵素１単位は
９５℃において１分間に１μmoleのＡＭＣを生成する酵
素量とした。酵素標品（１）、（２）及び（３）は測定
されたｐＨ７．５、９５℃においてＰｙｒ−ＭＣＡ分解
活性を有していた。ニューロテンシン、又はフィサラミ
ン（ペプチド研究所社製）を基質として耐熱性ピログル
タミルペプチダーゼによる分解活性を測定した。すなわ
ち１００pmole のニューロテンシン又はフィサラミンを
含む５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１９
７．５μｌに酵素を含む試料溶液２．５μｌを加え、９
５℃で５時間反応させた。氷冷して反応を停止した後、
反応液の一部をアミノ酸分析に供し、遊離したアミノ酸
を分析した。酵素標品（１）、（２）及び（３）は測定
されたｐＨ７．０、９５℃においてニューロテンシン又
はフィサラミンのＮ末端のピログルタミン酸を遊離する
活性を有していた。

【００４２】（３）至適温度 測定には３ミリ単位の酵素標品を用い、種々の温度で反
応を行った。酵素標品（１）、（２）及び（３）は図８
に示すように測定されたｐＨ７．０において、３７℃〜
１０４℃の範囲で活性があり、その至適温度は８５℃〜
９５℃であった。図８は酵素標品（１）、（２）及び
（３）の至適温度を示す図であり、縦軸は相対活性率
（％）、横軸は反応温度（℃）を示す。図中白丸印は酵
素標品（１）、黒丸印は酵素標品（２）、＋印は酵素標
品（３）の各結果を示す。

【００４３】（４）至適ｐＨ 測定には３ミリ単位の酵素標品を用い、活性測定に用い
る基質溶液をｐＨ４．０〜６．０においては５０mMクエ
ン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０〜５．０においては
５０mM酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０〜８．０にお
いては５０mMリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０〜
９．６においては５０mMホウ酸ナトリウム緩衝液、また
ｐＨ１０．２〜１０．９においては５０mMリン酸水素二
ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液を用いて調製し、
使用した。酵素標品（１）、（２）及び（３）は図９で
示すようにｐＨ７．０付近で最大活性を示した。図９は
酵素標品（１）、（２）及び（３）の至適ｐＨを示す図
であり、縦軸は相対活性率（％）、横軸はｐＨを示す。
図中白丸印は酵素標品（１）、黒丸印は酵素標品
（２）、＋印は酵素標品（３）の各結果を示す。

【００４４】（５）温度安定性 １．５単位の酵素を含む１０mMＤＴＴ、５０mMリン酸ナ
トリウム ｐＨ７．０溶液を６０℃及び７５℃で種々の
時間処理をした後、その一部を用いて残存する酵素活性
を測定した。図１０に示すように酵素標品（１）、
（２）、（３）は６０℃、３０分間の処理後では９５％
以上の活性を保持しており、７５℃１５０分間の処理後
も、ほぼ９０％の活性を保持していた。図１０は本発明
により得られる酵素標品（１）、（２）、（３）の温度
安定性を示す図であり、縦軸は残存活性率（％）、横軸
は熱処理時間（分）を示す。図中白丸印は酵素標品
（１）、黒丸印は酵素標品（２）、＋印は酵素標品
（３）の各測定結果であり、破線は６０℃、実線は７５
℃での結果を示す。

【００４５】（６）ｐＨ安定性 ０．７５単位の酵素を含む１０mMＤＴＴ、５０mMの各ｐ
Ｈの緩衝液を７５℃で３０分間処理した後、その一部を
用いて残存する酵素活性を測定した。緩衝液として、ｐ
Ｈ４．０〜６．０においてはクエン酸ナトリウム、ｐＨ
４．０〜５．０においては酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０
〜８．０においてはリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０〜
９．６においてはホウ酸ナトリウム、ｐＨ１０．２〜１
０．９においてはリン酸水素二ナトリウム−水酸化ナト
リウムをそれぞれ用いた。図１１に示すように、酵素標
品（１）、（２）、（３）はｐＨ５．０〜８．８の間で
は７５℃３０分間の処理後も８０％以上の活性を保持し
ていた。図１１は本発明により得られる酵素標品
（１）、（２）、（３）のｐＨ安定性を示す図であり、
縦軸は残存活性率（％）、横軸はｐＨを示す。図中、白
丸印は酵素標品（１）、黒丸印は酵素標品（２）、＋印
は酵素標品（３）の各測定結果を示す。

【００４６】

【発明の効果】本発明により、タンパク質工学の分野で
有用な新規な耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ、及び
該酵素をコードする遺伝子が提供され、該遺伝子を用い
ることにより工業的に耐熱性ピログルタミルペプチダー
ゼを得ることができる。

【００４７】

【配列表】

【００４８】配列番号：1 配列の長さ：204 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源：生物名：ピロコッカス フリオサス(Pyrococcus
furiosus) 配列： Met Lys Val Leu Val Thr Gly Phe Glu Pro Phe Gly Gly Glu Lys 1 5 10 15 Ile Asn Pro Thr Glu Arg Ile Ala Lys Asp Leu Asp Gly Ile Lys 20 25 30 Ile Gly Asp Ala Gln Val Phe Gly Arg Val Leu Pro Val Val Phe 35 40 45 Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Glu Lys Thr Leu Glu Glu Ile Lys 50 55 60 Pro Asp Ile Ala Ile His Val Gly Leu Ala Pro Gly Arg Ser Ala 65 70 75 Ile Ser Ile Glu Arg Ile Ala Val Asn Ala Ile Asp Ala Arg Ile 80 85 90 Pro Asp Asn Glu Gly Lys Lys Ile Glu Asp Glu Pro Ile Val Pro 95 100 105 Gly Ala Pro Thr Ala Tyr Phe Ser Thr Leu Pro Ile Lys Lys Ile 110 115 120 Met Lys Lys Leu His Glu Arg Gly Ile Pro Ala Tyr Ile Ser Asn 125 130 135 Ser Ala Gly Leu Tyr Leu Cys Asn Tyr Val Met Tyr Leu Ser Leu 140 145 150 His His Ser Ala Thr Lys Gly Tyr Pro Lys Met Ser Gly Phe Ile 155 160 165 His Val Pro Tyr Ile Pro Glu Gln Ile Ile Asp Lys Ile Gly Lys 170 175 180 Gly Gln Val Pro Pro Ser Met Cys Tyr Glu Met Glu Leu Glu Ala 185 190 195 Val Lys Val Ala Ile Glu Val Ala Leu 200

【００４９】配列番号：2 配列の長さ：639 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 起源：生物名：ピロコッカス フリオサス(Pyrococcus
furiosus) 配列： ATGAAAGTAT TAGTTACCGG GTTTGAGCCG TTTGGAGGAG AGAAAATTAA CCCCACCGAA 60 AGAATAGCAA AGGATCTTGA CGGGATTAAG ATTGGAGATG CCCAAGTATT TGGGAGAGTC 120 CTCCCAGTGG TCTTTGGGAA AGCCAAGGAA GTATTGGAGA AAACATTAGA GGAGATAAAG 180 CCAGACATAG CAATTCATGT GGGATTGGCC CCAGGAAGGA GCGCAATAAG TATAGAGAGG 240 ATAGCCGTCA ATGCTATTGA CGCTAGAATT CCGGATAATG AAGGGAAGAA GATTGAGGAC 300 GAGCCAATAG TCCCAGGAGC CCCAACGGCG TATTTCTCTA CACTTCCAAT AAAGAAGATC 360 ATGAAGAAGT TACACGAAAG AGGAATTCCC GCTTACATCT CAAACTCCGC TGGACTTTAT 420 CTCTGCAACT ACGTTATGTA CCTAAGCCTC CATCACTCAG CGACTAAAGG ATATCCAAAG 480 ATGAGCGGAT TTATACACGT CCCTTACATC CCAGAGCAGA TCATAGATAA GATAGGGAAG 540 GGCCAAGTGC CTCCAAGCAT GTGCTATGAG ATGGAGCTTG AAGCTGTTAA AGTAGCCATA 600 GAGGTTGCGC TCGACCTGCA GGCATGCAAG CTTGGCACT 639

【００５０】配列番号：3 配列の長さ：730 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 起源：生物名：ピロコッカス フリオサス(Pyrococcus
furiosus) 配列： GAGCTCGGTC ACGGTTATTT CTTTGTTGGA GAAACACAAA TTCCGTATCA TAGGATACTT 60 AAGGTTGTTA GAAAAGATGG GAGGGTAGTT TGGGAAAGCA GGAAGAGGGG GTTAAAATGA 120 AAGTATTAGT TACCGGGTTT GAGCCGTTTG GAGGAGAGAA AATTAACCCC ACCGAAAGAA 180 TAGCAAAGGA TCTTGACGGG ATTAAGATTG GAGATGCCCA AGTATTTGGG AGAGTCCTCC 240 CAGTGGTCTT TGGGAAAGCC AAGGAAGTAT TGGAGAAAAC ATTAGAGGAG ATAAAGCCAG 300 ACATAGCAAT TCATGTGGGA TTGGCCCCAG GAAGGAGCGC AATAAGTATA GAGAGGATAG 360 CCGTCAATGC TATTGACGCT AGAATTCCGG ATAATGAAGG GAAGAAGATT GAGGACGAGC 420 CAATAGTCCC AGGAGCCCCA ACGGCGTATT TCTCTACACT TCCAATAAAG AAGATCATGA 480 AGAAGTTACA CGAAAGAGGA ATTCCCGCTT ACATCTCAAA CTCCGCTGGA CTTTATCTCT 540 GCAACTACGT TATGTACCTA AGCCTCCATC ACTCAGCGAC TAAAGGATAT CCAAAGATGA 600 GCGGATTTAT ACACGTCCCT TACATCCCAG AGCAGATCAT AGATAAGATA GGGAAGGGCC 660 AAGTGCCTCC AAGCATGTGC TATGAGATGG AGCTTGAAGC TGTTAAAGTA GCCATAGAGG 720 TTGCGCTCGA 730

【００５１】配列番号：4 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA ） 配列： GGGGTTAAAT TTAAAGTATT AGTTACCGGG 30

【００５２】配列番号：5 配列の長さ：678 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA ハイポセティカル配列：NO アンチセンス：NO 起源：生物名：ピロコッカス フリオサス(Pyrococcus
furiosus) 配列： ATGAAAGTAT TAGTTACCGG GTTTGAGCCG TTTGGAGGAG AGAAAATTAA CCCCACCGAA 60 AGAATAGCAA AGGATCTTGA CGGGATTAAG ATTGGAGATG CCCAAGTATT TGGGAGAGTC 120 CTCCCAGTGG TCTTTGGGAA AGCCAAGGAA GTATTGGAGA AAACATTAGA GGAGATAAAG 180 CCAGACATAG CAATTCATGT GGGATTGGCC CCAGGAAGGA GCGCAATAAG TATAGAGAGG 240 ATAGCCGTCA ATGCTATTGA CGCTAGAATT CCGGATAATG AAGGGAAGAA GATTGAGGAC 300 GAGCCAATAG TCCCAGGAGC CCCAACGGCG TATTTCTCTA CACTTCCAAT AAAGAAGATC 360 ATGAAGAAGT TACACGAAAG AGGAATTCCC GCTTACATCT CAAACTCCGC TGGACTTTAT 420 CTCTGCAACT ACGTTATGTA CCTAAGCCTC CATCACTCAG CGACTAAAGG ATATCCAAAG 480 ATGAGCGGAT TTATACACGT CCCTTACATC CCAGAGCAGA TCATAGATAA GATAGGGAAG 540 GGCCAAGTGC CTCCAAGCAT GTGCTATGAG ATGGAGCTTG AAGCTGTTAA AGTAGCCATA 600 GAGGTTGCGC TCGAGGAGTT GTTATGAGAG CCAAAATAGC TGTAGTCCTA ATTTTATTTC 660 TCTTCTTTAG TGGGTGCA 678

【００５３】配列番号：6 配列の長さ：208 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：ピロコッカス フリオサス(Pyrococcus furios
us) 配列： Met Lys Val Leu Val Thr Gly Phe Glu Pro Phe Gly Gly Glu Lys 1 5 10 15 Ile Asn Pro Thr Glu Arg Ile Ala Lys Asp Leu Asp Gly Ile Lys 20 25 30 Ile Gly Asp Ala Gln Val Phe Gly Arg Val Leu Pro Val Val Phe 35 40 45 Gly Lys Ala Lys Glu Val Leu Glu Lys Thr Leu Glu Glu Ile Lys 50 55 60 Pro Asp Ile Ala Ile His Val Gly Leu Ala Pro Gly Arg Ser Ala 65 70 75 Ile Ser Ile Glu Arg Ile Ala Val Asn Ala Ile Asp Ala Arg Ile 80 85 90 Pro Asp Asn Glu Gly Lys Lys Ile Glu Asp Glu Pro Ile Val Pro 95 100 105 Gly Ala Pro Thr Ala Tyr Phe Ser Thr Leu Pro Ile Lys Lys Ile 110 115 120 Met Lys Lys Leu His Glu Arg Gly Ile Pro Ala Tyr Ile Ser Asn 125 130 135 Ser Ala Gly Leu Tyr Leu Cys Asn Tyr Val Met Tyr Leu Ser Leu 140 145 150 His His Ser Ala Thr Lys Gly Tyr Pro Lys Met Ser Gly Phe Ile 155 160 165 His Val Pro Tyr Ile Pro Glu Gln Ile Ile Asp Lys Ile Gly Lys 170 175 180 Gly Gln Val Pro Pro Ser Met Cys Tyr Glu Met Glu Leu Glu Ala 185 190 195 Val Lys Val Ala Ile Glu Val Ala Leu Glu Glu Leu Leu 200 205

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＰＧＰ１の制限酵素地図を示す図
である。

【図２】プラスミドｐＰＧＰ２の制限酵素地図を示す図
である。

【図３】プラスミドｐＰＧＰ３の制限酵素地図を示す図
である。

【図４】プラスミドｐＰＧＰ６の制限酵素地図を示す図
である。

【図５】プラスミドｐＰＧＰ７の制限酵素地図を示す図
である。

【図６】プラスミドｐＰＧＰ８の制限酵素地図を示す図
である。

【図７】プラスミドｐＰＧＰ９の制限酵素地図を示す図
である。

【図８】本発明の耐熱性ピログルタミルペプチダーゼの
酵素標品の至適温度を示す図である。

【図９】本発明の酵素標品の至適ｐＨを示す図である。

【図１０】本発明の酵素標品の温度安定性を示す図であ
る。

【図１１】本発明の酵素標品のｐＨ安定性を示す図であ
る。

フロントページの続き (72)発明者 光永 研一 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 綱澤 進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ６０℃で６０分間処理したとき約９５％
   以上の残存活性を保持していることを特徴とする耐熱性
   ピログルタミルペプチダーゼ。
2. 【請求項２】 請求項１記載の耐熱性ピログルタミルペ
   プチダーゼをコードする、単離された耐熱性ピログルタ
   ミルペプチダーゼ遺伝子。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１で表されるアミノ酸
   配列、又はその一部であって、かつ耐熱性ピログルタミ
   ルペプチダーゼ酵素活性を有する部分をコードする請求
   項２記載の単離された耐熱性ピログルタミルペプチダー
   ゼ遺伝子。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号２で表される塩基配
   列、又はその一部を有することを特徴とする請求項３に
   記載の耐熱性ピログルタミルペプチダーゼ遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項３に記載の遺伝子にハイブリダイ
   ズ可能な、請求項２に記載の耐熱性ピログルタミルペプ
   チダーゼ遺伝子。
6. 【請求項６】 請求項２に記載の耐熱性ピログルタミル
   ペプチダーゼ遺伝子を含有させた組換えプラスミドを導
   入させた組換体を培養し、該培養物から耐熱性ピログル
   タミルペプチダーゼを採取することを特徴とする耐熱性
   ピログルタミルペプチダーゼの製造方法。