JP4105693B2 - 耐熱性リボヌクレアーゼｈ - Google Patents

Description

本発明はポリペプチド、さらに詳しくは、遺伝子工学において利用価値の高いリボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドに関する。また、本発明は該ポリペプチドの遺伝子工学的生産に有用な遺伝子に関する。さらに、本発明は該ポリペプチドの遺伝子工学的な製造方法に関する。

リボヌクレアーゼ（ＲＮＡ分解酵素）にはエンド型とエキソ型が存在し、基質特異性も多様で、複雑な生理活性に関与している。リボヌクレアーゼ活性を有する酵素としては、リボヌクレアーゼＴ_１、リボヌクレアーゼＴ_２、リボヌクレアーゼＨ、リボヌクレアーゼＰ、リボヌクレアーゼＩ、リボヌクレアーゼＩＩ、リボヌクレアーゼＩＩＩ、リボヌクレアーゼＩＶ、リボヌクレアーゼＬ等の酵素が知られている。
リボヌクレアーゼＨ（本明細書に於いては、ＲＮａｓｅＨと称する場合もある）は１９６９年にＷ．Ｈ．ステイン及びＰ．ハウゼンにより仔ウシ胸腺から初めて単離された。現在、ＲＮａｓｅＨは種々の動物細胞、酵母等の真核生物及び大腸菌等の原核生物に広く存在する細胞性ＲＮａｓｅＨと、ＲＮＡ腫瘍ウイルスに存在するウイルス性ＲＮａｓｅＨとに分けられている。１種の細胞に数種のＲＮａｓｅＨ活性が存在しており、Ｍｇ^２＋、Ｍｎ^２＋等の２価金属イオン要求性である。
大腸菌由来ＲＮａｓｅＨは１５５アミノ酸からなる分子量約１７ｋＤａの加水分解酵素であって、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド型で切断するという基質特異性を有する。生成したオリゴマーは５’末端にリン酸基を、３’末端に水酸基を有する。
大腸菌由来ＲＮａｓｅＨとしては、ＲＮａｓｅＨＩとＲＮａｓｅＨＩＩが同定されている。ＲＮａｓｅＨＩの生理的機能として、Ｃｏｌ Ｅ１プラスミドの複製において、１）正常な複製開始点ではない箇所に結合したＲＮＡを分解し、正常な複製開始点を確保する、２）正常な複製開始点に特異的なＲＮＡプライマーの合成をすることが示されている。しかしながら、ＲＮａｓｅＨＩＩの機能は未だ不明である。
ＲＮａｓｅＨは、その基質特異性に基づき、下記に例示される様な用途を有し、極めて利用価値の高い酵素として注目されている。
１）ｃＤＮＡのクローニングの際の鋳型ｍＲＮＡの除去。
２）ｍＲＮＡのポリＡ領域の除去。
３）ＲＮＡの断片化。
ＲＮａｓｅＨの重要性は遺伝子工学の発展に伴ってますます増大すると思われるが、この酵素は、大腸菌内での発現量が極めて低いことから、組換えＤＮＡ技術による該酵素の生産が試みられており、既にＢＲＬ、アマシャム ファルマシア バイオテク及びタカラバイオ等から、組換えＤＮＡ技術により生産されたＲＮａｓｅＨが供給されている。
これらの市販の組換えＲＮａｓｅＨは、大腸菌を宿主として生産されるものである〔金谷ら、ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２６４巻、第１１５４６−１１５４９頁（１９８９）〕。また、大腸菌由来ＲＮａｓｅＨよりも極めて高い安定性を有する好熱菌由来ＲＮａｓｅＨの大腸菌による製造法も報告されている〔金谷ら、第２回日本蛋白工学会年会プログラム・要旨集（１９９０）、６９頁；特許第２５３３６７１号公報〕が、大腸菌を用いて産生された好熱菌ＲＮａｓｅＨの酵素活性は大腸菌由来ＲＮａｓｅＨよりも低いものであった。
上述のように耐熱性を有するＲＮａｓｅＨは大腸菌由来ＲＮａｓｅＨよりも生産性及び酵素活性が低いものしかなく、ＲＮａｓｅＨの用途拡大のため、大腸菌と同等もしくはそれ以上の生産性及び酵素活性を有する耐熱性ＲＮａｓｅＨの開発が望まれていた。
そこで、上記問題点を解決すべく、さまざまな耐熱性を有するＲＮａｓｅＨがクローン化されてきた。例えば、国際公開第０２／２２８３１号パンフレット記載のバチルス カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）、ピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、サーモトガ マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、アルカエオグロバス フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、サーモコッカス リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、サーモコッカス セラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｃｅｌｅｒ）、ピロコッカス ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来のＲＮａｓｅＨが挙げられる。
また、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．１６，ｐ４４４３−４４４９（１９９１）、米国特許第５２６８２８９号に記載のサーマス サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、米国特許第５６１００６６号に記載のピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、特開平１１−３２７７２号に記載のピロコッカスｓｐ．ＫＯＤ１株、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３０７，ｐ５４１−５５６（２００１）記載のアルカエオグロバス フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）由来のＲＮａｓｅＨが挙げられる。
しかし、これらのＲＮａｓｅＨは、耐熱性が低かったり、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖が短くなると活性が低下したり、比活性が低いなど、改善すべき問題を多く含んでいた。そこで、遺伝子工学の発展に伴ってますます増大すると思われるＲＮａｓｅＨの重要性に応えるため、さらなる耐熱性、基質特異性、作用機作を有するＲＮａｓｅＨの開発が望まれていた。

本発明の目的は、遺伝子工学において利用価値の高いＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子ならびに該ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法を提供することにある。
本発明者らは、上記の事情を鑑み、耐熱性ＲＮａｓｅＨを得るために鋭意研究及び探索を行った結果、高いＲＮａｓｅＨ活性を有する耐熱性ＲＮａｓｅＨポリペプチドを見出した。更に、得られた耐熱性ＲＮａｓｅＨは遺伝子工学的手法による製造においても生産性がよいことも見出し、本発明を完成するに至った。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、耐熱性リボヌクレアーゼＨポリペプチドに関し、下記の群より選択され、かつ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有することを特徴とするポリペプチドに関する。
（ａ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチド；
（ｃ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５４％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド。
本発明の第２の発明は、耐熱性リボヌクレアーゼＨをコードする核酸に関し、下記の群より選択され、かつ、耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドをコードする核酸に関する。
（ａ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｂ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｃ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも５４％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸；
（ｄ）配列表の配列番号２に示される塩基配列を有する核酸；
（ｅ）配列表の配列番号２に示される塩基配列において、少なくとも１つの塩基がアミノ酸配列に翻訳される形での欠失、付加、挿入又は置換を有する塩基配列からなる核酸；
（ｆ）前記（ａ）〜（ｄ）のいずれか記載の核酸又はその相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうる核酸；
（ｇ）配列表の配列番号２に示される塩基配列に少なくとも６１％の相同性を有する塩基配列である核酸。
本発明の第３の発明は組換えＤＮＡに関し、第２の発明の核酸を含んでなることを特徴とする。
本発明の第４の発明は形質転換体に関し、第３の発明の組換えＤＮＡにより形質転換されてなることを特徴とする。
本発明の第５の発明は耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドの製造方法に関し、第４の発明の形質転換体を培養する工程、および該培養物中より耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とする。
第６の発明はプラスミドｐＡｐｒ１０８を導入した形質転換体を培養して得られる、耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドに関する。なお、このプラスミドを有する大腸菌株は、ブダペスト条約の下、２００２年８月２０日（原寄託日）にＦＥＲＭ ＢＰ−８４３３の受託番号の下、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。

図１：本発明のＲＮａｓｅＨの耐熱性を示す図である。

以下、本発明に関して具体的に説明する。
本明細書において、ＲＮａｓｅＨとは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド型で切断するという基質特異性を有する加水分解酵素であって、生成したオリゴマーが５’末端にリン酸基を、３’末端に水酸基を有するように切断するものをいう。
本発明において、ポリペプチドが耐熱性のＲＮａｓｅＨ活性を有するとは、特に限定するものではないが、７０℃以上の温度で１５分間保持した後においてもＲＮａｓｅＨ活性を有することを意味する。
耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性は、例えば、次のようにして測定することができる。
ポリ（ｒＡ）及びポリ（ｄＴ）（ともにアマシャム ファルマシア バイオテク製）１ｍｇをそれぞれ１ｍＭ ＥＤＴＡを含む４０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）１ｍｌに溶解し、ポリ（ｒＡ）溶液及びポリ（ｄＴ）溶液を調製する。
次に、４ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００３％ＢＳＡ、４％グリセロールを含む４０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）に、終濃度２０μｇ／ｍｌとなるようにポリ（ｒＡ）溶液を、終濃度３０μｇ／ｍｌとなるようにポリ（ｄＴ）溶液を加え、３７℃で１０分間反応後、４℃に冷却し、ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液を調製する。
このポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液１００μｌに酵素液１μｌを加え、４０℃で１０分間反応させ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μｌを加えて反応を停止させた後、２６０ｎｍの吸光度を測定する。対照として、上記反応液に０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μｌを加えた後、４０℃で１０分間反応させ、吸光度を測定する。その後、ＥＤＴＡ非添加で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値（吸光度差）を求めることにより、酵素反応によってポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求め、本発明の耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を測定することができる。
また、活性測定しようとする酵素液１μｌに４０℃であらかじめインキュベーションした反応液〔２０ｍＭヘペス−水酸化カリウム（ｐＨ８．５）、０．０１％牛血清アルブミン（タカラバイオ社製）、１％ジメチルスルホキシド、４ｍＭ酢酸マグネシウム、２０μｇ／ｍｌポリ（ｄＴ）（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）、３０μｇ／ｍｌポリ（ｒＡ）（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）〕１００μｌを添加し、４０℃で１０分間反応させた後、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０μｌで反応を停止し、２６０ｎｍの吸光度を測定することにより、本発明の耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を測定することもできる。
ＲＮａｓｅＨの１単位（ユニット）は、１ｎｍｏｌのリボヌクレオチドが遊離したのに相当するＡ_２６０を１０分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出することができる。
単位（ｕｎｉｔ）＝〔吸光度差×反応液量（ｍｌ）〕／０．０１５２
本発明のポリペプチドとしては、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが例示される。また、本発明は耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を示す限りにおいて、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列に１個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つがなされたアミノ酸配列で示されるポリペプチドを包含する。
すなわち、天然に存在するポリペプチドにはそれをコードするＤＮＡの多型や変異の他、生成後のポリペプチドの生体内および精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の欠失、挿入、付加、置換等の変異が起こりうる。しかし、このような変異が該ポリペプチドの活性や構造の保持に関して重要でない部分に存在する場合には、変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理、生物学的活性を示すものがあることが知られている。
人為的にポリペプチドのアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。例えば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）のアミノ酸配列中のあるシステイン残基をセリンに置換したポリペプチドがインターロイキン２活性を保持することが知られている〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２４巻、１４３１頁（１９８４）〕。
また、ある種のポリペプチドは、活性には必須でないペプチド領域を有していることが知られている。例えば、細胞外に分泌されるポリペプチドに存在するシグナルペプチド、プロテアーゼの前駆体等に見られるプロ配列あるいはプレ・プロ配列などがこれにあたり、これらの領域のほとんどは翻訳後、あるいは活性型ポリペプチドへの転換に際して除去される。このようなポリペプチドは一次構造上は異なった形で存在しているが、最終的には同等の機能を発現するポリペプチドである。
本発明により単離された、配列表の配列番号２に示される塩基配列の遺伝子には、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を持つポリペプチドがコードされており、該ポリペプチドは耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を有している。そこから、活性には必須でないペプチド領域が削除されたポリペプチドも、本願のポリペプチドに含まれる。
遺伝子工学的にポリペプチドの生産を行う場合には、目的のポリペプチドのアミノ末端、あるいはカルボキシル末端に該ポリペプチドの活性とは無関係のペプチド鎖が付加されることがある。例えば、目的のポリペプチドの発現量を上げるために、使用される宿主中で高発現されているポリペプチドのアミノ末端領域の一部を目的のポリペプチドのアミノ末端に付加した融合ポリペプチドが作製されることがある。あるいは、発現されたポリペプチドの精製を容易にするために、特定の物質に親和性を有するペプチドを目的のポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に付加することも行われている。これらの付加されたペプチドは目的ポリペプチドの活性に悪影響をおよぼさない場合には付加されたままであってもよく、また、必要であれば適当な処理、例えば、プロテアーゼによる限定分解などによって目的ポリペプチドから除去できるようにすることもできる。
従って、本発明によって開示されたアミノ酸配列（配列番号１）に１個以上のアミノ酸残基の欠失、挿入、付加又は置換が生じたアミノ酸配列によって示されるポリペプチドであっても、耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を有していれば本発明の範囲内に属するものである。
また、本発明によって開示されたアミノ酸配列（配列番号１）に少なくとも５４％、好ましくは６０％、さらに好ましくは７０％、より好ましくは８５％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を有していれば本発明の範囲内に属するものである。
上記相同性は、例えばコンピュータープログラムＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ（タカラバイオ社製）、コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡ（バージョン３．０；パーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．）ら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：２４４４−２４４８，１９８８）、コンピューターアルゴリズムＢＬＡＳＴ（バージョン２．０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２，１９９７）によって測定することができる。
例えば、上記アミノ酸配列の相同性が、アルカエオグロバス プロファンダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）由来リボヌクレアーゼＨ（配列表の配列番号１）と少なくとも５４％であるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を有していれば本発明の範囲内に属するものである。
本発明のポリペプチドは、例えば、（１）本発明のポリペプチドを生産する微生物の培養物からの精製、（２）本発明のポリペプチドをコードする核酸を含有する形質転換体の培養物からの精製、等の方法により製造することができる。
（１）本発明のポリペプチドを生産する微生物の培養物からの精製
本発明のポリペプチドを生産する微生物としては、例えば、ドイッチェ・ザムルンク・フォン・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルツレンＧｍｂＨ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）より購入可能なアルカエオグロバス プロファンダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ、ＤＳＭ５６３１）等が挙げられる。微生物の培養は、その微生物の生育に適した条件で行えばよく、好ましくは、目的のポリペプチドの発現量が高くなるような培養条件が用いられる。かくして菌体あるいは培養液中に生産された目的のポリペプチドは、通常のタンパク質の精製に用いられる方法によって精製することができる。
上記菌株の培養にあたっては、通常、耐熱菌の培養に用いられる方法が利用でき、培地に加える栄養源は該菌株が利用しうるものであればよい。炭素源としては、例えば、デンプン等が利用でき、窒素源としては、例えば、トリプトン、ペプトン、酵母エキス等が利用できる。培地中には、マグネシウム塩、ナトリウム塩、鉄塩等の金属塩を微量元素として加えてもよい。また、例えば、海洋性の耐熱菌の場合、培地の調製に人工海水を用いることが有利である。
培養は静置培養又は撹拌培養で行なうことができるが、例えば、アプライド アンド エンバイロンメンタル マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、第５５巻、第２０８６−２０８８頁（１９９２）に記載のように、透析培養法を用いてもよい。培養条件や培養時間は、使用する菌株、培地組成に応じ、ポリペプチドの生産量が最大になるように設定するのが好ましい。
ポリペプチドを採取するに当たっては、まず、無細胞抽出液を調製する。無細胞抽出液は、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などによって菌体を集め、ついで菌体を破砕することにより調製できる。菌体の破砕方法としては、超音波破砕、ビーズ破砕、溶菌酵素処理等のうちから目的酵素の抽出効果の高い方法を選べばよい。また、培養液上清中に該ポリペプチドが分泌されている場合には、硫安塩析法や限外濾過法等によって培養液上清中のポリペプチドを濃縮し、これを無細胞抽出液とする。かくして得られた無細胞抽出液からポリペプチドを単離するにあたっては、通常のタンパク質の精製に用いられる方法を使用できる。例えば、硫安塩析処理、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の方法を組み合わせて使用できる。
（２）本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む組換えＤＮＡにより形質転換された形質転換体の培養物からの精製
本発明のポリペプチドをコードする核酸、例えば配列表の配列番号２に示される塩基配列を有する核酸を含む組換えＤＮＡで形質転換された形質転換体より、本発明のポリペプチドを取得することができる。配列番号２に示される塩基配列からは配列番号１に示されるアミノ酸配列のポリペプチドが生成する。
さらに、本発明のプラスミドｐＡｐｒ１０８を導入した形質転換体を培養して得られる培養物から本発明のポリペプチドを精製してもよい。
形質転換される宿主には特に限定はなく、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、植物、動物、植物培養細胞、動物培養細胞等、組換えＤＮＡの分野で通常使用されている宿主が挙げられる。
例えば、本発明のポリペプチドは、ｌａｃプロモーターやＴ７ファージプロモーターの下流に本発明の核酸を連結したプラスミドを保持する大腸菌を通常の培養条件、例えば、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ、ｐＨ７．２）中、３７℃で対数増殖期まで培養後、１ｍＭとなるようイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加し、さらに３７℃で培養することにより、培養菌体中にポリペプチドを発現させることができる。
培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を超音波で破砕し、さらに遠心分離して上清を集め、無細胞抽出液とする。該無細胞抽出液は耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を示す。さらにイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水クロマトグラフィー、硫安沈殿等の公知の方法を用いることにより該無細胞抽出液から本発明のポリペプチドを精製することができる。上記の精製過程において得られる部分精製品も、当然ながらＲＮａｓｅＨ活性を示す。なお、本発明の核酸を連結したプラスミドを保持する大腸菌で発現される本発明のポリペプチドは耐熱性を有しているため、精製手段として培養菌体及び／又は無細胞抽出液に対して、例えば、４０℃以上の温度で、約１０分間の熱処理を行って熱変性して不溶化した宿主由来のタンパク質を除去してもよい。また、この熱処理の温度や時間は、適宜、最適な温度及び時間を選択すればよい。
上記のように本発明のポリペプチドを、当該ポリペプチドをコードする核酸を保持する形質転換体を用いて常温、例えば、３７℃で発現させた場合でも、得られた発現産物はその活性、耐熱性などを保持している。すなわち、本発明のポリペプチドは、その本来の生産菌が生育する温度とは離れた温度において発現された場合にも、その固有の高次構造を形成し得る。
本発明の核酸は、本発明のポリペプチドをコードする核酸であり、具体的には、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列、または該配列において１個以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入もしくは置換の少なくとも１つがなされたアミノ酸配列で示され、かつ、耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を示すポリペプチドをコードする核酸（１）、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で示される核酸（２）、および上記核酸（１）または（２）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能であるか、（１）または（２）の塩基配列に少なくとも６１％、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、より好ましくは９０％の相同性を有する塩基配列で、かつ耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を示すポリペプチドをコードする核酸（３）等である。
上記塩基配列の相同性は、コンピュータープログラムＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ、コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡ（バージョン３．０）、ＢＬＡＳＴ（バージョン２．０）によって測定することができる。
本明細書における核酸とは、１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。上記核酸（２）がＲＮＡである場合は、例えば配列表の配列番号２記載の塩基配列においてＴをＵで置換した塩基配列で示される。
本発明の核酸は、例えば、次のようにして得ることができる。
まず、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で示される核酸（２）は、本発明のポリペプチドの説明中に記載した方法で培養したアルカエオグロバス プロファンダス（ＤＳＭ５６３１）より常法にしたがってゲノムＤＮＡを調製し、それを用いて作製したＤＮＡライブラリーから単離することができる。またこのゲノムＤＮＡを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、配列表の配列番号２に記載の塩基配列で示される核酸を増幅することによっても取得できる。
また、本発明により提供される、本発明のポリペプチドをコードする核酸の塩基配列、例えば配列表の配列番号２に記載の塩基配列を基に、本発明のポリペプチドと同様の耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を取得することも可能である。すなわち、本発明のポリペプチドをコードする核酸、またはその塩基配列の一部をハイブリダイゼーションのプローブに用いることにより、耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、細胞から抽出したＤＮＡ、該ＤＮＡを鋳型として得られたＰＣＲ産物等からスクリーニングすることができる。あるいは上記の塩基配列から設計されたプライマーを使用したＰＣＲ等の遺伝子増幅法を用いることにより、耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを増幅することができる。また、耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを化学的に合成することも可能である。かかる方法により、上記核酸（１）または（３）を得ることができる。
上記の方法では目的の核酸の一部のみを含む核酸断片が得られることがあるが、その際には得られた核酸断片の塩基配列を調べて、それが目的の核酸の一部であることを確かめた上、該核酸断片、あるいはその一部をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うか、または該核酸断片の塩基配列に基づいて合成されたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、目的の核酸全体を取得することができる。
上記の「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、１９８９年、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．）等に記載された条件でハイブリダイズ可能なことを意味し、例えば、以下の条件でハイブリダイズ可能なことをいう。すなわち、核酸を固定したメンブレンを０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子核酸を含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を示す）中で、５０℃にて１２〜２０時間、プローブとともにインキュベートする。インキュベーション終了後、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、３７℃での洗浄から始めて、ＳＳＣ濃度は０．１倍までの範囲で、また、温度は５０℃までの範囲で変化させ、固定された核酸由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまでメンブレンを洗浄したうえ、プローブの検出を行う。また、こうして得られた新たな核酸について、そこにコードされているタンパクの有する活性を上記同様の方法によって調べることにより、得られた核酸が目的とするものであるかどうかを確認することができる。
また、オリゴヌクレオチドプローブを使用する場合、前記「ストリンジェントな条件」としては、特に限定されないが、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト、０．０１％変性サケ精子核酸を含む溶液中、〔Ｔｍ−２５℃〕の温度で一晩保温する条件などをいう。
オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーのＴｍは、例えば、下記の式により求められる。
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ^＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）
（式中、Ｎはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの鎖長であり、％Ｇ＋Ｃはオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー中のグアニンおよびシトシン残基の含有量である。）
また、オリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの鎖長が１８塩基より短い場合、Ｔｍは、例えば、Ａ＋Ｔ（アデニン＋チミン）残基の含有量と２℃との積と、Ｇ＋Ｃ残基の含有量と４℃との積との和〔（Ａ＋Ｔ）×２＋（Ｇ＋Ｃ）×４〕により推定することができる。
本発明においては、本発明のポリペプチドをコードする核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な核酸は、本明細書に開示された塩基配列と同一の塩基配列ではなくとも、それが耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性を示すポリペプチドをコードする限り本発明の範囲に含まれるものであることは上記したとおりである。
すなわち、遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合わせ）はアミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。したがって、あるアミノ酸配列をコードする核酸はそのアミノ酸配列にもよるが多数存在することができる。核酸は自然界において決して安定に存在しているものではなく、その塩基配列に変異が起こることはまれではない。核酸上に起こった変異がそこにコードされるアミノ酸配列には変化を与えない場合（サイレント変異と呼ばれる）もあり、この場合には同じアミノ酸配列をコードする異なる核酸が生じたといえる。したがって、ある特定のアミノ酸配列をコードする核酸が単離されても、それを含有する生物が継代されていくうちに同じアミノ酸配列をコードする多種類の核酸ができていく可能性は否定できない。さらに同じアミノ酸配列をコードする多種類の核酸を人為的に作製することは種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。
例えば、遺伝子工学的なタンパク質の生産において、目的のタンパク質をコードする本来の核酸上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合には、タンパク質の発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的タンパク質の高発現を図ることが行われている（例えば、特公平７−１０２１４６号公報）。このように特定のアミノ酸配列をコードする多種類の核酸は人為的に作製可能なことは言うまでもなく、自然界においても生成されうるものである。
本発明のポリペプチドをコードする核酸、例えば、配列表の配列番号２記載の塩基配列を有する核酸を適当なベクターに連結して組換えＤＮＡを作成することができる。該組換えＤＮＡの作成に使用されるベクターには特に限定はなく、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができ、組換えＤＮＡの使用目的に応じて適当なベクターを選択すれば良い。
さらに、当該組換えＤＮＡを適当な宿主に導入して形質転換体を作成することができる。形質転換体の作成に使用される宿主にも特に限定はなく、細菌、酵母、糸状菌等の微生物の他、動物、植物、昆虫等の培養細胞等を使用することができる。当該形質転換体を培養して培養物中に本発明のポリペプチドを産生させることにより、本発明のポリペプチドを大量に製造することが可能となる。
（３）本発明のポリペプチド
上述のようにして得られた本発明のポリペプチドは、例えば国際公開第００／５６８７７号パンフレット、国際公開第０２／１６６３９号パンフレットに記載の核酸増幅方法に利用することができる。さらに、従来知られているＲＮａｓｅＨには、ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡのようなキメラ核酸において、ＲＮＡの長さによってそのＲＮａｓｅＨ活性が低下するものもあるが、本発明のポリペプチドはＲＮＡの長さによる影響を受けにくい。従って、国際公開第０２／０６４８３３号パンフレット記載の塩基置換の検出方法や、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．２，ｐ２４０−２４８（１９９６）記載のサイクリングプローブ法（Ｃｙｃｌｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ）に好適に使用できる。また、９５℃１５分の処理を行っても、そのＲＮａｓｅＨ活性を保持し得るという特徴を有し、多様な用途に使用することができる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

アルカエオグロバス プロファンダス ＲＮａｓｅＨ遺伝子のクローニング
（１）アルカエオグロバス プロファンダス ゲノムＤＮＡの調製
アルカエオグロバス プロファンダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンＧｍｂＨより購入：ＤＳＭ５６３１）１０ｍｌ相当分の菌体を集め、１００μｌの２０％ショ糖、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、２０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で２時間反応させた。反応終了後、この反応液に８００μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（タカラバイオ社製）及び５０μｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に５０μｌのＴＥに溶解してゲノムＤＮＡ溶液を得た。
（２）ＲＮａｓｅＨ遺伝子中央部のクローニング
様々な耐熱性ＲＮａｓｅＨのアミノ酸配列の間で保存されている部分をもとにしてオリゴヌクレオチドＲＮ−Ｆ１（配列番号３）とオリゴヌクレオチドＲＮ−Ｒ２（配列番号４）を合成した。
上記実施例１−（１）で調製したアルカエオグロバス プロファンダス ゲノムＤＮＡ溶液５μｌを鋳型にして、１００ｐｍｏｌのＲＮ−Ｆ１及び１００ｐｍｏｌのＲＮ−Ｒ２をプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＥｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして、５０サイクル行った。反応終了後、マイクロコン−１００（タカラバイオ社製）で、プライマーを除去すると同時に濃縮し、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片ＡｐｒＦ１Ｒ２を得た。
（３）ＲＮａｓｅＨ遺伝子上流および下流部分のクローニング
上記実施例１−（２）で得た約０．５ｋｂの断片ＡｐｒＦ１Ｒ２の塩基配列を決定し、それをもとに上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＡｐｒＲＮ−１（配列番号５）と下流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＡｐｒＲＮ−２（配列番号６）を合成した。さらに、表１に示す４８種類のプライマーを合成した。表１中のタグ配列を配列表の配列番号７に示す。

実施例１−（１）で調製したアルカエオグロバス プロファンダス ゲノムＤＮＡ溶液１μｌを鋳型にして２０ｐｍｏｌのＡｐｒＲＮ−１または２０ｐｍｏｌのＡｐｒＲＮ−２と、各２０ｐｍｏｌの表１記載の４８種類のプライマーとの組み合わせで２０ｍＭ トリス酢酸（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ酢酸カリウム、３ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、各３０μＭ ｄＮＴＰ混合物、２．５単位のタカラＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を含む反応液中でＰＣＲをおこなった。ＰＣＲは９４℃で３分インキュベートした後、９８℃で１０秒、５０℃で１０秒、７２℃で４０秒を１サイクルとし、４０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物の一部をアガロース電気泳導し、シングルバンドになったものを選び出し、それらの反応液をマイクロコンー１００（タカラバイオ社製）で、プライマーを除去すると同時に濃縮し、ダイレクトシークエンスをおこない、ＲＮａｓｅＨの上流または下流を含む断片をスクリーニングした。その結果、約６００ｂｐのＰＣＲ増幅断片Ａｐｒ−１Ａ５にＲＮａｓｅＨ遺伝子の上流が、約５００ｂｐのＰＣＲ増幅断片Ａｐｒ−２Ｄ９に下流が含まれていることがわかった。
（４）ＲＮａｓｅＨ遺伝子全域のクローニング
上記塩基配列をもとにプライマーＡｐｒＮｄｅ（配列番号８）及びＡｐｒＢａｍ（配列番号９）を合成した。
実施例１−（１）で得たサーモコッカス プロファンダス ゲノムＤＮＡ溶液１μｌを鋳型にして、２０ｐｍｏｌのＡｐｒＮｄｅ及び２０ｐｍｏｌのＡｐｒＢａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、４０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともにタカラバイオ社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換したもの）またはｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込み、プラスミドｐＡＰＲ１１１ＮｄおよびｐＡｐｒ１０８を作製した。
（５）ＲＮａｓｅＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例１−（４）で得られたｐＡＰＲ１１１ＮｄおよびｐＡｐｒ１０８の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。ｐＡｐｒ１０８のオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号２に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。ＰＣＲ断片ＡｐｒＦ１Ｒ２は配列番号２の１１〜４４９番塩基、Ａｐｒ−１Ａ５は５９番塩基より５’末端側、Ａｐｒ−２Ｄ９は３７３番塩基より３’末端側に相当した。なお、プラスミドｐＡｐｒ１０８で形質転換された大腸菌ＨＭＳ１７４ＤＥ３は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４／ｐＡｐｒ１０８と命名、表示され、平成１４年８月２０日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８４３３として寄託されている。ＤＮＡシーケンス入力解析システムＤＮＡＳＩＳ（Ｖｅｒ．３．６、タカラバイオ社製）を用いて解析したところ、２４．４ｋＤａのタンパク質で、等電点は８．５０であった。また、塩基配列の比較から、ＲＮａｓｅＨＩＩに分類されると推定できた。
（６）アルカエオグロバス プロファンダス ＲＮａｓｅＨ遺伝子の発現
ｐＡＰＲ１１１Ｎｄで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１ｍＭ ＩＰＴＧを含む１０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１晩振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を１７６．３μｌのバッファー（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を７０℃、１０分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、熱処理上清液を得た。同様にｐＡｐｒ１０８で形質転換された大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１晩振盪培養し、培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を上記の方法で処理し、Ａｐｒ ＲＮａｓｅＨ熱処理上清液を得た。
上記で得られた熱処理上清液を用いて、以下の方法により酵素活性を測定した。
ポリ（ｒＡ）及びポリ（ｄＴ）（ともにアマシャム ファルマシア バイオテク製）１ｍｇをそれぞれ１ｍＭ ＥＤＴＡを含む４０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）１ｍｌに溶解し、ポリ（ｒＡ）溶液及びポリ（ｄＴ）溶液を調製した。
次に、４ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．１％ ＤＭＳＯ、０．０１％ ＢＳＡを含む２０ｍＭヘペス−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）に、終濃度２０μｇ／ｍｌとなるようポリ（ｒＡ）溶液を、終濃度３０μｇ／ｍｌとなるようポリ（ｄＴ）溶液を加え、４０℃で１０分間反応後、４℃に冷却し、ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液を調製した。
ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液１００μｌにＡｐｒ ＲＮａｓｅＨ熱処理上清液１μｌを加え、４０℃で１０分間反応させ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μｌを加えて反応を停止させた後、２６０ｎｍの吸光度を測定した。対照として、上記反応液に０．５Ｍ ＥＤＴＡ１０μｌを加えた後、４０℃で１０分間反応させ、吸光度を測定した。その後、ＥＤＴＡ非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値（吸光度差）を求めた。すなわち、酵素反応によってポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。ＲＮａｓｅＨの１単位は、１ｎｍｏｌのリボヌクレオチドが遊離したのに相当するＡ_２６０を１０分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出した。なお、酵素液を希釈した場合は、下記式の値を希釈率で補正した。
単位（ｕｎｉｔ）＝〔吸光度差×反応液量（ｍｌ）〕／０．０１５２
その結果、Ａｐｒ ＲＮａｓｅＨ熱処理上清液にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
（７）精製ＲＮａｓｅＨ標品の調製
実施例１−（４）で得られたｐＡｐｒ１０８で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、得られたｐＡｐｒ１０８を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む４００ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１７時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を５００ｍｌのバッファーＡ〔２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１４０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離を行い、得られた上清を７０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１４０００ｒｐｍで３０分の遠心分離を行い、上清を集め、４００ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡで平衡化したＤＥ５２陰イオン交換カラム（Ｗｈａｔｍａｎ社製）に供し、バッファーＡで洗浄した。その結果、ＲＮａｓｅＨはＤＥ５２カラムを素通りした。
ＤＥ５２カラムを素通りした蛋白溶液を、バッファーＢ〔２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕で平衡化したＰ−ＩＩ陽イオン交換カラム（Ｗｈａｔｍａｎ社製）に供し、１００ｍＭ〜１０００ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約５００ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨ画分１５０ｍｌをＰＥＧ（ポリエチレングリコール）２００００で５０ｍｌに濃縮した。これに１５０ｍＭのバッファーＣ〔２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕を加え、バッファーＢで平衡化したＨｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＯＬ−６Ｂヘパリンアフィニティカラム（Ａｍａｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）に供し、１００ｍＭ〜５００ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約２５０ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨ画分１３０ｍｌを、ＰＥＧ２００００によって１０ｍｌに濃縮した後、バッファーＤ〔２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール〕で平衡化したＨｉＬｏａｄ ２６／６０ ＳｕｐｅｒｄｅｘＧ２００ＨＲゲル濾過カラム（Ａｍａｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）に供し、バッファーＤで溶出を行った結果、２５ｍｌのＲＮａｓｅＨ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨ画分２５ｍｌに３５ｍｌのバッファーＣを加え、バッファーＢで平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ陽イオン交換カラム（Ａｍａｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）に供し、１００ｍＭ〜５００ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約２５０ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨ画分５０ｍｌを得た。
このＲＮａｓｅＨ画分５０ｍｌを、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−４ ＢＩＯＭＡＸ−５Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて１１ｍｌに遠心濃縮した。この濃縮液１１ｍｌを形状バッファー〔２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、５０％ グリセロール〕に対して透析し、４．５ｍｌのＲＮａｓｅＨ溶液を得た。
こうして得られたＲＮａｓｅＨをＡｐｒＲＮａｓｅＨ標品とした。
上記で得られたＡｐｒＲＮａｓｅＨ標品を用いて、実施例１−（６）に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＡｐｒＲＮａｓｅＨ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
実施例２ ホモロジー検索
実施例１において得られたアルカエオグロバス プロファンダス（Ａｐｒ）ＲＮａｓｅＨのアミノ酸配列とそれをコードする塩基配列について、ホモロジー検索を行なった。相同性は検索プログラムとして、コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡ（バージョン３．２；パーソン（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．）ら、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：２４４４−２４４８，１９８８）で算出した。
コンピュータアルゴリズムＦＡＳＴＡで遺伝子データベースをＡｐｒ ＲＮａｓｅＨに関して検索した。その結果、Ａｐｒ ＲＮａｓｅＨのアミノ酸配列、塩基配列に対して、リボヌクレアーゼであると推定されているアミノ酸配列、塩基配列で最も相同性の高かったものは、それぞれ５３％、６０％の相同性を有していた。
実施例３ ＲＮａｓｅＨの耐熱性の検討
アルカエオグロバス プロファンダス ＲＮａｓｅＨとして実施例１−（６）で得られたｐＡｐｒ１０８で形質転換された大腸菌を用いて耐熱性を調べた。すなわち、上記大腸菌を培養し、培養液から調製した素酵素抽出液を９５℃、１５分の条件で熱処理を行ない、実施例１−（６）と同様の方法でＲＮａｓｅＨ活性を調べた。その結果、アルカエオグロバス プロファンダス由来のＲＮａｓｅＨにおいてＲＮａｓｅＨ活性が確認できた。
さらに、熱処理バッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５ｍＭ メルカプトエタノール、３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ ＢＳＡ、５０％ グリセロール）中の５単位／ｍｌのＡｐｒ ＲＮａｓｅＨを、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃のそれぞれの温度条件で１０分間熱処理し、残存活性を調べた。熱処理をしなかったサンプル、熱処理後のサンプルを、最終濃度０．２単位／ｍｌになるように、最終濃度がそれぞれ３２ｍＭヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ ＤＭＳＯ、０．０５％ ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．２μＭ 基質 ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ、１μＭ ｔｅｍｐｌａｔｅＷ４９（配列番号１６）の活性測定溶液に添加して、ｐｒｏｂｅＷ３（配列番号１５）に対する酵素単位当たりの分解速度を求めた。熱処理を行わなかったＲＮａｓｅＨの活性を１００として図１に、その結果を示す。Ａｐｒ ＲＮａｓｅＨは、５０〜８０℃においては、ほぼ１００％、９０℃、１０分間の反応の後でも、８６．９±７．０％の残存活性を有していた。
実施例４ Ａｐｒ由来ＲＮａｓｅＨを用いたＩＣＡＮ ｓｙｓｔｅｍによるＨＢＶ検出の検討
配列表の配列番号１０に記載のＨＢＶ Ｘプロテイン遺伝子の一部である５６０ｂｐをＰＣＲ反応にて増幅し、その断片をＴＡクローニングによりｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔベクターに挿入した。これをＨＢＶ陽性コントロールプラスミドとした。
反応組成は最終濃度３２ｍＭヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ酢酸マグネシウム、各６００μＭｄＮＴＰ混合物、１１単位ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、および、配列表の配列番号１１、１２に記載の塩基配列を有するＨＢＶＦ−２プライマーとＨＢＶＲ−１プライマーを各々５０ｐｍｏｌ、ＨＢＶ陽性コントロール１０^３コピー、および、Ａｐｒ由来ＲＮａｓｅＨ、１．６２５単位 または、３．２５単位 または、６．５単位 または、１３単位を添加して最終容量を２５μｌにした。該反応液は予め５５℃に設定したサーマルサイクラーにセットし、６０分間保持した。
反応終了後、該反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、いずれのＲＮａｓｅＨ量においても目的の増幅断片７６ｂｐが確認できた。
同様の実験を、ＨＢＶ陽性コントロール１０^２コピー、またはＨＢＶ陽性コントロール１０コピー、またはＨＢＶ陽性コントロール１コピーの場合についても行い、ＨＢＶ陽性コントロールに対する感度を検討した。その結果、Ａｐｒ ＲＮａｓｅＨ ６．５単位添加した場合の感度が最も高く、ＨＢＶ陽性コントロール１コピーを検出すること出来た。
次にピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓｕ）由来ＲＮａｓｅＨＩＩ（Ｐｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ）、アルカエオグロバスフルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）由来 ＲＮａｓｅＨＩＩ（Ａｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ）、サーモコッカス リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来 ＲＮａｓｅＨＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨＩＩ）を国際公開第０２／２２８３１号パンフレット記載の方法で調製し、上記ＩＣＡＮ ｓｙｓｔｅｍによるＨＢＶ検出に用いて、その感度をＡｐｒ ＲＮａｓｅＨと比較した。Ｐｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ を用いた場合に最も高い感度が得られた酵素添加量は２．２単位で、ＨＢＶ陽性コントロールに対する感度は１０コピーであった。Ａｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ を用いた場合に最も高い感度が得られた酵素添加量は２．２単位で、ＨＢＶ陽性コントロールに対する感度は１０コピーであった。Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨＩＩ を用いた場合に最も高い感度が得られた酵素添加量は８単位で、ＨＢＶ陽性コントロールに対する感度は１０コピーであった。
このように、このＩＣＡＮ ｓｙｓｔｅｍによるＨＢＶ遺伝子の検出では、Ａｐｒ由来ＲＮａｓｅＨを用いた場合にＨＢＶ陽性コントロール１コピーを検出することが可能であり、最も高い感度が得られることが確認できた。

ＡｐｒＲＮａｓｅＨの基質形状の違いによる基質分解速度の比較
配列中に含むＲＮＡの数が異なる３つのＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡである、ｐｒｏｂｅＷ１（配列番号１３）、ｐｒｏｂｅＷ２（配列番号１４）、ｐｒｏｂｅＷ３（配列番号１５）を基質に用いた場合のＲＮａｓｅＨによる分解速度を測定し、その違いを調べた。同時に、ピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ）由来ＲＮａｓｅＨＩＩ（Ｐｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ）、ピロコッカス ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）由来 ＲＮａｓｅＨＩＩ（Ｐｈｏ ＲＮａｓｅＨＩＩ）を国際公開第０２／２２８３１号パンフレット記載の方法で調製し、サーマス サーモファイラス（Ｔｈｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＲＮａｓｅＨＩ（Ｔｔｈ ＲＮａｓｅＨＩ、東洋紡社製）とあわせて、上記の基質を用いた時の切断速度を比較した。
ＦＡＭの最大励起波長４９５ｎｍ付近の波長をｐｒｏｂｅＷ１，ｐｒｏｂｅＷ２，ｐｒｏｂｅＷ３を含む溶液に当てた場合、各基質の５’端に修飾されたＦＡＭが最大波長５１９ｎｍの蛍光を発するが、その蛍光は、３’端に修飾されたＤＡＢＣＹＬとの間に起こる蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）によって減衰される。基質がＲＮａｓｅＨによって切断を受けた場合は、ＦＲＥＴが解消されるので、５１９ｎｍ の蛍光強度は増大する。従って、基質が切断を受ける前と切断された後の５１９ｎｍの蛍光強度差を測定することにより、基質の分解をモニターすることが出来る。
基質濃度が酵素濃度に対して十分な場合は、酵素反応産物量は時間に比例して増大する。酵素量に対して十分過剰な量の基質を用いて、その分解速度を５１９ｎｍの蛍光強度の測定によりモニターする時、反応初期の単位時間当たりの蛍光強度上昇は、一次式で近似出来る。この近似直線の傾きは、時間当たりの蛍光強度上昇（（蛍光強度）／（分））になる。また、蛍光強度上昇がプラトーに達し、更に蛍光強度が最大に達した時に反応系中の基質が完全に分解したと仮定すると、（最大の蛍光強度）−（分解前の蛍光強度）は、基質分解量当たりの蛍光強度上昇値となる。この値と、時間当たりの蛍光強度上昇（（蛍光強度）／（分））から、反応速度ｖ（（基質分解量）／（分））を求めることが出来る。
最終濃度がそれぞれ３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ ＤＭＳＯ、０．０５％ ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．２μＭ 基質 ＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡ、１μＭ ｔｅｍｐｌａｔｅＷ４９（配列番号１６）の活性測定溶液に最終濃度０．４単位／ｍｌ、０．８単位／ｍｌ、１．６単位／ｍｌ、２．４単位／ｍｌ のＡｐｒＲＮａｓｅＨをそれぞれ添加した。ＲＮａｓｅＨの反応と蛍光強度の測定には、タカラバイオ社製リアルタイムＰＣＲ測定装置ＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒを用い、５５℃で１００分間反応させて反応速度ｖ（（基質分解量）／（分））を求めた。更に、ＡｐｒＲＮａｓｅＨの濃度に対して、反応速度ｖ（（基質分解量）／（分））をプロットし、検量線を作成してその傾きから酵素単位当たりの反応速度（（基質分解量）／（分・単位））を求めた。また、Ｐｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ、Ｐｈｏ ＲＮａｓｅＨＩＩ、Ｔｔｈ ＲＮａｓｅＨＩについても同様の方法で活性測定を行い、酵素単位当たりの反応速度（（基質分解量）／（分・単位））を求めた。Ｔｔｈ ＲＮａｓｅＨＩに関しては、最終濃度１０単位／ｍｌ、２０単位／ｍｌ、３０単位／ｍｌ、４０単位／ｍｌのＴｔｈ ＲＮａｓｅＨＩを活性測定溶液にそれぞれ添加した。
各酵素のｐｒｏｂｅＷ１，ｐｒｏｂｅＷ２，ｐｒｏｂｅＷ３に対する酵素単位当たりの反応速度を、表２に示す。表中の数値は、ｐｍｏｌ／（分・単位）を示す。また、ｐｒｏｂｅＷ３に対する酵素単位当たりの反応速度を１００％とした場合の相対的な反応速度をカッコ内に示す。他のＲＮａｓｅＨに比べてＡｐｒ ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡの数がいずれの場合でも切断速度が大きく、ＲＮＡが２個の基質に対する切断速度が最も大きかった。ＲＮＡが１個または２個の基質に対する切断速度が、ＲＮＡが３個の基質を切断する速度に近い値を示した。

以上のように、ＲＮＡの長さに切断速度が影響されにくいＡｐｒ ＲＮａｓｅＨは、核酸増幅反応、核酸検出反応に有用であることが示された。

産業上の利用の可能性

本発明により、遺伝子工学において利用価値の高いＲＮａｓｅＨ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする遺伝子ならびに該ポリペプチドの遺伝子工学的製造方法を提供される。また、本発明のＲＮａｓｅＨは耐熱性を有しており、工業的に有利なＲＮａｓｅＨの製造方法も提供される。
本発明によって、さまざまな用途で本発明のＲＮａｓｅＨを用いることが可能となった。

Claims (6)

1. 下記の群より選択され、ＲＮＡが１個のＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ核酸を切断することができ、かつ、リボヌクレアーゼＨ活性を有することを特徴とするポリペプチド：
   （ａ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
   （ｂ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチド；
   （ｃ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
2. 下記の群より選択され、ＲＮＡが１個のＤＮＡ−ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ核酸を切断することができ、かつ、リボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドをコードする核酸：
   （ａ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸；
   （ｂ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチドをコードする核酸；
   （ｃ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸；
   （ｄ）配列表の配列番号２に示される塩基配列を含む核酸；
   （ｅ）配列表の配列番号２に示される塩基配列において、１もしくは数個の塩基の欠失、付加、挿入又は置換を有する塩基配列からなる核酸；
   （ｆ）配列表の配列番号２に示される塩基配列に少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列である核酸。
3. 請求項２記載の核酸を含んでなる組換えＤＮＡ。
4. 請求項３記載の組換えＤＮＡにより形質転換されてなる形質転換体。
5. 請求項４記載の形質転換体を培養する工程、および該培養物中より請求項２記載の核酸によってコードされるリボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドを採取する工程を包含することを特徴とするリボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチドの製造方法。
6. Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４／ｐＡｐｒ１０８（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４３３として寄託）に保持されるプラスミドｐＡｐｒ１０８を導入した形質転換体を培養して得られる、ｐＡｐｒ１０８上にコードされるリボヌクレアーゼＨ活性を有するポリペプチド。

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