TW200418984A - Thermostable ribonuclease H - Google Patents

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200418984 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於-種多肽，再触 於基因工程利用之’係關於-種具 η… 值南的具核糖核酸糾活性之多肽。 :了：種對該多狀之基因工程生產有用之基 【先…，發明係關於-種該多狀之基因工程製造方法。 【先雨抆術】 ，核酸酶⑽A分解酶)中存在内切型與外切型，由於 其^質特異性多樣’故參與複雜的生理活性。作為具核糖 仏酸酶居U之酶’已知有核糖核酸酶L、核糖核酸酶I、 核糖核酸酶Η '核糖核酸酶p、核糖核、核糖核酸酶『 核糖核酸酶III、核糖核酸酶汊、核糖核酸酶L等酶。 核糖核酸酶Η (於本發明說明，亦有稱為RNaseH之情形） 係於1969年被W· H. Stein及P· Hausen從小牛胸腺首次單 離。現彺’ RNaseH被分為於各種動物細胞、酵母等真核生 物及大腸桿菌等原核生物廣泛存在之細胞性RNaseH、與存 在於RNA腫瘤病毒之病毒性RNaseH。於1種細胞内存在數 種RNaseH活性，係Mg2+、Mn2 +等2價金屬離子需求性。 來源於大腸桿菌之RNaseH係包含155個胺基酸，分子量 約17 kDa之水解酶，具僅對DNA/RNA雜交的RNA鏈特異性 内切之基質特異性。生成的寡聚合物於Y末端有磷酸基， 於3'末端有羥基。 作為來源於大腸桿菌之RNaseH，被鑑定為RNaseHI與 RNaseHII。作為RNaseHI的生理功能，於Col E1質體之複 87608 -6- 200418984 製，1)分解結合於非正常複製起點處之RN A，確保正常複 製起點；2)表示於正常複製起點進行特異性rna引子之合 成。但是，RNaseHII之功能尚不明。 RNaseH基於其基質特異性，具下述列舉之用途，作為利 用價值極高的酶被注意。 1) cDNA選殖之際的模板mRNA之去除。 2) mRNA的多聚A鍵之去除。 3) RNA之片段化。 RNaseH的重要性隨基因工程的發展被認為益加增大，該 酉母因於大腸桿菌内的表現量極低，藉由重組DNA技術之該 酶之生產被p嘗試，由 BRL、Amersham Pharmacia Biotech 及Takara Bio等藉由重組Dna技術生產之RNaseH已被供 給。 該等市場上販賣之重組RNaseH，係以大腸桿菌為宿主被 生產者[金谷等’ The Journal of Biological Chemistry，第 264卷，第11546-11549頁（1989)]。又，較來源於大腸桿菌 之RNaseH具極高穩定性之來源於嗜熱菌之RNaseH藉由大 腸桿菌之製造法雖然亦被報導[金谷等，第2屆日本蛋白工 程會年會日程•摘要集（199〇)，69頁；專利第2533671號公 報]’但疋使用大腸桿菌生產之嗜熱菌RNaseH之酶活性係 較來源於大腸桿菌之RNaseH低者。 如上所述，具耐熱性之RNaseH僅為較來源於大腸桿菌之 RNaseH之生產性及酶活性低者，因RNaseH之用途擴大， 具與大腸桿菌同樣或高於其之生產性及酶活性之耐熱性 87608 200418984 RNaseH之開發被期望。 故，為解決上述問題點，各種具耐熱性之RNaseH被選 殖。例如，國際公開第02/22831號手冊記載之來源於 Bacillus caldotenax、高溫嗜熱菌（Pyrococcus furiosus)、 Thermotoga maritima、Archaeoglobus fulgidus、海岸熱球 菌（Thermococcus litoralis) 、 Thermococcus celer 、 Pyrococcus horikoshii 之 RNaseH可被列舉。 又’來源於Nucleic Acids Research，Vol. 19，No. 16， p4443-4449 (1991);美國專利第 5268289號記載之Thermus thermophilus、美國專利第5610066號記載之高溫嗜熱菌 (Pyrococcus fudosus)、特開平 11-32772 號記載之 Pyrococcus sp. KOD1 株、Journal of Molecular Biology，Vol. 307 ’ p541-556 (2001)¾己載之（Archaeoglobus fulgidus)之 RNaseH被列舉。

但是’該等RNaseH包含很多耐熱性低、一旦DNA/RNA 雜交之RNA鏈變短活性就降低、比活性低等應改善的問 題。故’為適應隨基因工程發展被認為益加增大之RNaseH 之重要性，具更強的耐熱性、基質特異性、作用機能之 RNaseH之開發被期待著。 【發明内容】 本發明之目的在於提供具於基因工程利用價值高的 RNaseH活性之多肽，編碼該多肽之基因及該多肽之基因工 程製造方法。 本發明者等鑒於上述情況，為得到耐熱性RNaseH進行精 87608 200418984 心研兑及休索 < 結果，發現具高活性之耐熱性 RNaseH多肽。再者，亦發現得到之耐熱性RNaseH即使藉 由基因工程方法製造，生產性亦優，從而完成本發明。 概迦冬發明，本發明之第丨發明，係關於耐熱性核糖核 酸酶Η多肽，係關於一種多肽，其特徵在於選自下述之群， 且具耐熱性核糖核酸酶Η活性。 (a) 具序列表之序列編號1之胺基酸序列之多肽； (b) 具於序列表之序列編號1之胺基酸序列中，至少一個 胺基fe殘基之缺失、添加、插入或取代之多肽； (c) 具與序列表之序列編號1之胺基酸序列至少54%同源 性之胺基酸序列之多肽。 +發明之第2發明’係關於編碼耐熱性核糖核酸酶η之核 酸’係關於一種核酸，其選自下述之群，且編碼具耐熱性 核糖核酸酶Η活性之多肽。 U)編碼具於序列表之序列編號1之胺基酸序列之多肽之 核酸； (b)編碼具於序列表之序列編號1之胺基酸序列中，至少 一個胺基酸殘基之缺失、添加、插入或取代之多肽之核酸； (C)編碼具與序列表之序列編號1之胺基酸序列至少54% 同源性之胺基酸序列之多肽之核酸； (d) 具序列表之序列編號2之鹼基序列之核酸； (e) 其包含具於序列表之序列編號2之鹼基序列中，至少 一個鹼基於被轉譯成胺基酸序列之際的缺失、添加、插入 〜耳、代之驗基序列之核酸； 87608 -9 - 200418984 (0可Μ上述（a)-(d)中任一項之核酸或其互補鏈於苛刻條 件下雜交之核酸； (g)具與序列表之序列編號2之鹼基序列至少61%同源性 的驗基序列之核酸。 冬發明之第3發明係關於一種重組DNa，其特徵在於包 含第2發明之核酸而成者。 本發明之第4發明係關於一種轉形體，其特徵在於由第3 發明之重組DNA轉形而成者。 本發明之第5發明係關於一種製造方法，其係用於具耐 熱性核糖核酸酶Η活性之多肽，其特徵在於包含培養第4發 明之轉形體之工序，及自該培養物中提取具耐熱性核糖核 酉父細Η活性之多月太的工序。 第6發明係關於一種多肽，其係培養轉入質體口八^丨⑽之 轉形體而得到，具耐熱性核糖核酸酶Η活性。另，具該質 體之大腸桿菌株，基於布達佩斯條約，於2〇〇2年8月2〇日（原 寄存日）以FERM ΒΡ-8433之寄存編號，被寄存於日本國茨 城縣築波市東1丁目i番地i中央第6(郵政編碼3〇5_8566)， 獨立行政法人產業技術综合研究所專利生物寄存中心。 【實施方式】 以下，關於本發明具體說明。 於本發明說明，所謂RNaseH，稱為具只將DNa/rna雜 父的RNA鏈進行特異性内切之基質特異性之水解酶，將生 成之寡聚合物如於5’末端有磷酸基、於3,末端有羥基那樣 切斷者。 87608 -10- 200418984 於本發明，所謂多肽具耐熱性RNaseH活性，非特別限定 者，意味著於70°C以上之溫度保持15分鐘後仍具RNaseH活 性。 耐熱性RNaseH活性，例如可如下測定。 多聚（rA)及多聚（dT)(均為 Amersham Pharmacia Biotech 製）1 mg 分別溶解於 1 ml 含 1 mM EDTA 之 40 mM Tris-Hcl (pH 7.7)，配製多聚（rA)溶液及多聚（dT)溶液。 其次，向含4 mM MgCl2、1 mM DTT、0.003% BSA、4% 甘油之40 mM Tris-HCl (pH 7.7)中，以終濃度為20 pg/ml 添加多聚（rA)溶液，以終濃度為30 pg/ml添加多聚（dT)溶 液，於37°C反應10分鐘後，冷卻至4°C，配製多聚（rA) -多聚 (dT)溶液。 向該多聚（rA)-多聚（dT)溶液1〇〇μ1中添加酶液1 μΐ，使其 於40°C反應10分鐘，添加0.5Μ EDTA 10 μΐ使反應停止後， 於260 nm測定吸光度。作為對照，向上述反應液中添加 0.5M EDTA 10 μΐ後’使其於40°C反應1〇分鐘，測定吸光 度。其後，藉由求出自於EDTA非添加使其反應求得之吸光 度減去對照之吸光度的值（吸光度差），自吸光度差求出藉 由酶反應自多聚（rA)-多聚（dT)雜交游離之核苷酸的濃度， 可測定本發明之耐熱性RNaseH活性。 又，向要活性測定之酶液1 μΐ中添加預先於4〇。〇畔育之 反應液[20 mM Hepes-氫氧化钾緩衝液（pH 8·5)、0.01 %牛血 清白蛋白（Takara Bio·公司製）、1%二甲亞砜、4 醋酸鍰、 20 pg/ml 多聚（dT) (Amersham Pharmacia Biotech公司製）、 87608 -11 - 200418984 30 pg/ml 多聚（rA) (Amersham Pharmacia Biotech公司製）] 100 μ卜使其於40°C反應10分鐘後，以〇.5M EDTA (pH 8.0) 10 μΐ停止反應，藉由測定260 nm之吸光度，亦可測定本發 明之耐熱性R N a s e Η活性。 RNaseH之1個單位（unit)，係將相當於1 nm〇i核：y：酸游離 之Λαό作為1〇分鐘增加之酶量，可根據下式算出。 單位（unit)=[吸光度差X反應液量（mi)]/〇〇152 作為本發明之多肽，被列舉為具示於序列表之序列編號 1之胺基酸序列之多肽。又，本發明僅限於具耐熱性RNeseH 活性’包含以示於序列表之序列編號1的胺基酸序列中1個 以上胺基酸殘基缺失，添加，插入或取代之至少1種形成 的胺基酸序列所表示的多肽。 即’對於天然存在之多肽，除編碼其之DNA的多型性及 變異外，藉由產生後多肽之活體内及精製中的修飾反應 等’可引起其胺基酸序列中胺基酸缺失，插入，添加，取 代等變異。但是，該等變異存在於對該多肽之活性及構造 的保持非重要部分之情形下，與無變異之多肽具實質上同 等的生理，生物學活性者為所知。 人為地向多肽之胺基酸序列轉入如上述之變異之情形 亦同樣’於該情形下進一步製作多種多樣的變異體成為可 能。例如已知將人介白素2 (IL-2)胺基酸序列中某胱胺基酸 殘基取代為絲胺酸之多肽保持介白素2的活性[科學 (Science) ’ 第 224卷，1431 頁（1984)]。 又’已知某種多肽，具活性非必需之肽段。例如，存在 87608 -12- 200418984 於被分泌到細胞外之纽巾切號肽、蛋自酶之前體等中 所見足前（pro)序列或前前（pre ·ρΓ〇)序列等相當於此，該等 區間幾乎全部於翻譯後，或向活性型多肽轉換之際被去 除γ如此之多肽即使於一級構造上以不同形式存在，最終 為表現同等功能之多肽。 具记載於序列表之序列編號！的胺基酸序列之多肽係被 藉由本發明被單離之基因編碼，該基因係示於序列表之序 列編號2之鹼基序列，該多肽具耐熱性RNaseH活性。還有， 即使為活性非必須之肽段被刪除之多肽，亦包含於本申請 書之多肽中。 於基因工程上進行多肽生產之情形下，有向目的多肽之 胺基末端或羥基末端添加與該多肽活性無關之肽鏈者。例 口 ’為從鬲目的多肽之表現量，有製作將被使用之宿主中 南表現之多肽的胺基末端區間的一部分添加至目的多肽 的胺基尽端之融合多肽者。或，為使被表現之多肽之精製 k為容易’亦進行將對特定物質具親和性之多肽添加至目 勺夕肤之胺基末端或輕基末端。該等被添加之肽，於對目 的多肤活性非帶來惡劣影響之情形下，保持添加狀態亦 可’又’如果有必要，亦可進行適當處理，例如，藉由蛋 白酶所致之限制性分解等可從目的多肽去除。 >文’即使為藉由本發明被揭示之胺基酸序列（序列編號1) 中’ 1個以上之胺基酸殘基缺失、插入、添加或取代所生 私之胺基酸序列所表示之肽，只要具耐熱性RNaseH活性， 即為屬於本發明範圍内者。 87608 -13- 200418984 又，具與於本發明被揭示之胺基酸序列（序列編號1)至少 54%，60%為佳，70%更佳，85%較佳，之同源性的胺基酸 序列之多肽，只要具耐熱性RNaseH活性，即為屬於本發明 範圍内者。 上述同源性，例如可藉由Computer Program DNASIS-Mac (Takara Bio·公司製）、Computer Algorithm FASTA (version 3.0 ; Pearson ’ W. R·等，pro. Natl· Acad. Sci.，85 : 2444-2448，1988)、Computer Algorithm BLAST (version 2·0 ; Altschul等，Nucleic Acids Res. 25 : 3389-3402，1997) 測定。 例如，具上述胺基酸序列之同源性，與來源於

Archaeoglobus profundus之核糖核酸酶Η (序列表之序列編 號1)至少54%之胺基酸序列之多肽，只要具耐熱性RNaseH 活性，即為屬於本發明範圍内者。 本發明之多肽，例如可藉由（1)從產生本發明之多肽的微 生物培養物之精製；（2)從含有編碼本發明之多肽的核酸之 轉形體培養物之精製；等方法製造。 (1)從產生本發明之多肽的微生物培養物之精製 作為產生本發明之多肽的微生物，例如為購於（Deutsche

Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)之 可能（Archaeogl〇bus pr〇fundus，DSM563 1)等可被列舉。微 生物之培養，只要於適於該微生物生育之條件下進行即 可，使用使目的多肽之表現量變高之培養條件為佳。如此 菌體或培養液中產生之目的多肽，可藉由用於通常蛋白質 -14- 87608 200418984 猜製之方法精製。 關於上述菌株之培養，通常可利用用於耐熱菌培養之方 法’加入培基之營養素只要為該菌株可利用者即可。作為 炭源，例如可利用澱粉等；作為氮源，例如可利用胰化蛋 白、蛋白腺、酵母萃取物等。培基中，作為微量元素添加 鎂鹽、鈉鹽、鐵鹽等金屬鹽亦可。又，例如，於海洋性耐 熱菌之情形，於培基之配製使用人工海水為有利。 培養雖可進行靜置培養或攪拌培養，例如如應用與環境 极 i 物學（Applied and Environmental Microbiology)，第 55 卷，第2086-2088頁（1992)記載，使用透析培養法亦可。培 養條件及培養時間，根據使用之菌株，培基成分，以多肽 i產里為取大而設定為佳。 關於提取多肽，首先，配製無細胞抽出液。無細胞抽出 液’例如可藉由從培養液藉由離心分離，濾過等收集菌 體’接著破碎菌體來配製。作為菌體的破碎方法，從超音 波敬碎’粒子破碎，溶菌酶處理等中選擇目的酶抽出效果 最高的方法即可。又，於該多肽被分泌到培養液上清之情 形’猎由硫酸胺鹽析法及超漉過法等將培養液上清中之多 ^ . 乂此作為典細胞抽出液。對於從如此得到之無細 月<»由出液中單離多肽，可使用用於通常蛋白質精製之方 ^例如可將疏酸胺鹽析處理、離子交換色譜、疏水色譜、 凝膠濾過色譜等方法組合使用。 (2) 從藉由含編碼本發明之多肽的核酸之重組DNA轉 形之轉形體培養物之精製 -15- 87608 200418984 編碼本發明之多肽的核酸，例如可藉由重組DN A轉形之 将形體獲得本發明之多肽，其中重組D N A係含具示於序列 表之序列編號2的驗基序列之核酸。從示於序列編號2之驗 基序列產生示於序列編號1之胺基酸序列之多肽。 再者，亦可從培養轉入本發明之質體pApr 1〇8之轉形體 而得到之培養物精製本發明之多肽。 被轉形之宿王無特別限定，例如可列舉為大腸桿菌，枯 草杆菌’ ％母’絲狀桿菌’植物，動物，植物培養細胞， 動物培養細胞等重組DNA領域中通常被使用之宿主。 例如’本發明之多肽可藉由下述條件，使其於培養菌體 中表現：將持有於lac啟動子及T7噬菌體啟動子下游連結本 毛明之核&的質體之大腸桿菌，於通常之培養條件，例 如，含100 pg/ml胺卡青黴素之LB培基（胰化蛋白1〇 g/1，酵 母萃取物5g/l，NaC15gn，ΡΗ7·2)中，於37。(：培養至對數 玍長期後’添加異丙基-β-D-硫乳峨喃糖至1 ，藉由繼 續於37°C培養，可使多肽表現於培養菌體中。 培養結束後，以超音波破碎藉由離心分離收集之菌體， 繼續離心分離，收集上清，作為無細胞抽出液。該無細胞 η由出液具耐熱板RNaseH活性。再者，藉由使用離子變換色 瑨、統膠濾過、疏水色譜、硫酸胺沈澱等眾所週知之方法， 可從該無細胞拙出液精製本發明之多肽。於上述精製過程 中得到之部分精製品，當然亦具RNaseH活性。另，因於持 有連結本發明之核酸的質體之大腸桿菌表現之本發明的 多肽，具耐熱性，作為精製手段，對於培養菌體及/或無細 87608 -16- 200418984 胞抽出液，例如於，以上之溫度，進行約1〇分 理’熱變性’去除不溶之來源於宿主之蛋白質亦可。^ :::處理之溫度及時間，只要選擇適當，最適溫度及時間 如上所述’將本於明a _ 。 t月义夕肽，使用持有編碼該多肽之核 酸的轉形體，於堂、、四 ^ ^ 、吊，皿例如即使於37。(：使其表現之情形， 得到之表現屋物保持著其活性，耐熱性等。即，本發明之 夕肽’即使於偏離其本來生產菌之繁殖溫度的溫度下使其 表現之情形，亦可形成其固有之高級構造。 ’、 本1明之核酸，係編碼本發明之多肽之核酸，具體言 之，為將記載於序列表之序列編號丨的胺基酸序列，或將 S序到中，個以上之胺基酸殘基之缺失、添加、插入或 取代中之至少1種形成之胺基酸序列表示之，且，具耐熱 性RNaseH活性之多肽編碼之核酸（1)、序列表之序列編號2 圮載之鹼基序列表示之核酸（2)、及與上述核酸（1)或（2)於 苛刻條件下可能雜交、或與（1)或⑺之鹼基序列具至少 61% ’ 70%為佳，8〇%更佳，9〇%較佳，之同源性之鹼基序 列’且為編碼具耐熱性RNaseH活性之多肽的核酸（3)等。 丄述驗基序列之同源性，可藉由Computer Program DNASIS-Mac、Computer Algorithm FASTA (version 3·0)、 BLAST (VerSi〇n 2 0)測定。 本發明說明中之核酸，意味著單鏈或雙鏈DNA或RNA。 上述核fee (2)為rnA之情形，例如序列表之序列編號2記載 之鹼基序列，以U取代T之鹼基序列表示。 -17- 87608 200418984 本發明之核酸，例如可如下得到。 首先’以序列表之序列編號2記載的鹼基序列表示之核 fe(2)，使用基因組DNA可從製作的dna文庫中單離。其 中，基因組DNA係從記載於本發明之多肽的說明中之方法 >古養的 Archaeoglobus profundus (DSM5631)根據常法配 氣。又，精由以該基因組DNA為模板之多聚酶鏈反應 (PCR)，亦可籍由將記載於序列表之序列編號2之鹼基序列 表示之核酸擴增而獲得。 又’由本發明提供之，編碼本發明之多肽的核酸之鹼基 序列’例如可基於記載於序列表之序列編號2之鹼基序 列，獲得編碼具與本發明之多肽同樣耐熱性RNaseH活性之 多肽的核酸。即，藉由將編碼本發明之多肽的核酸，或其 鹼基序列之一部分用於雜交的探針，可將編碼具耐熱性 RNaseH活性之多肽的DNA，於從細胞抽出之DNA、以該 DNA為模板得到之PCR產物等篩選。或藉由使用用從上述 鹼基序列设計之引子之PCR等基因擴增法，可將編碼具耐 熱性RNaseH活性之多肽的DNA擴增。又，亦可將編碼具耐 熱性RNaseH活性之多肽的DNA化學合成。藉由如此方法， 可得到上述核酸（1)或（3)。 以上述方次有h可彳于到只含目的核酸之一部分之核酸 片段’當時研究得到之核酸片段的鹼基序列，在確認其係 目的核酸之一部分之基礎上，藉由將該核酸片段，或其一 邵分作為探針進行雜父’或使用基於該核酸片段之鹼基序 列被合成之引子進行PCR ’可獲得全部目的核酸。 87608 -18- 200418984 上述之所謂「於苛刻條件下雜交」，意味著於1989年， Gold Spnng Harvard Laboratory發行，T.Maniatls等編輯， 分子選殖：實驗1：指南第2版（Molecular Cloning Δ Laboratory Manual 2nd ed·)等記載之條件下可雜交，例 如，稱為於以下條件雒X可能者。即，將固定著核酸之膜 於含0.5% SDS、0.1%牛血清白蛋白（BSA)、〇1%聚乙烯呲 (1\说具〇.15^!心(：卜0.015_檬酸納、阳7〇)中，於 ：)0C與探針一起孵育12-20小時。孵育結束後，於含〇 5% SDS之2XSSC中，從於37t;之洗淨開始，使％濃度變化 於到0.1倍為止之範圍内’又，溫度變化於到贼為止之饮 圍内，於將膜洗淨至來源於被固定之核酸之信號可與背： 區別開來之基礎上，進行探針之檢出。又，對於如此得二 之新核酸，藉由以上述同樣方法研究接著被編碼之蛋白暂 所具活性，可確認得到之核酸是否為目的者。 ” 二使用寡聚核苷酸探針之情形下，作為前述「苛刻條 件」’無特別限定，稱為例如’於含有6xssc、〇 5% S; 5— 0·01%變性娃精子核酸之溶液中，於[丁⑺ -25 C ]之溫度下過夜保溫之條件等。 寡聚核芬酸探針或引子之Tm，例如可藉由下述算 出0 (A^=81N5r"6(logIO[Na+])+0·41^ 87608 (二\中，暴聚核«探針或引子之鏈長，％G+C為寡 水w'休針或引子中鳥嘌呤及胞嘧啶殘基之含量。） -19- 200418984

又，於寡聚核苷酸探針或引子之鏈長比18個鹼基短之情 元 T m可猎由例如A + T (腺嗓吟+胸腺p密淀）权基含里與2 C 之積’與G + C殘基含量與4。(：之積的和[(A+T) X 2 + (G + C) X 4]推算。 於本發明，與編碼本發明之多肽的核酸於苛刻條件下可 能雜交之核酸，即使與揭示於本發明說明之鹼基序列非同 一驗基序列，如上所述，只要其編碼具耐熱性RNaseH活性 之多肽’即為包含於本發明之範圍内者。 即’已知於基因上指定胺基酸之密碼子（3個鹼基之組合） 於每種胺基酸各存在種。故，編碼某胺基酸序列之核 酸’根據其胺基酸序列亦可存在多數。核酸於自然界絕非 穩足存在者，於其鹼基序列引起變異者非少見。於核酸上 引起之變異亦有不給被編碼之胺基酸序列帶來變化之情 形（被稱為沉默突變），可以說於此情形，產生編碼相同胺 基酸序列之不同核酸。故，編碼某特定胺基酸序列之核酸 即使被單離’亦不能否定於含有其之生物在傳代過程中， 編碼相同胺基酸序列之多種核酸產生的可能性。再者，人 為地製作編碼相同胺基酸序列之多種核酸，只要使用各種 基因工程方法，並非難事。 例如，於基因工程蛋白質之生產，於編碼目的蛋白質之 原核酸上被便用之岔碼子，為宿主中使用頻率低者之情形 下，有蛋白質表現量低之事。於如此之情形，並非給被編 碼之胺基酸序列帶來變化，而是藉由將密碼子人為地變換 的蛋白質之高表現（例 成於宿主中被頻繁使用者，可謀求目 87608 -20- 200418984 如，特公平7-102 146號公報）。不必說如此編碼特定胺義齡 序列之多種核酸可人為地製作，即使於自然界中亦、 ~Γ 產 生者。 編碼本發明之多肽的核酸，例如，可將具序列喪之序列 編號2記載之鹼基序列的核酸連接於適當載體，製#今组 DNA。對於該重組DNA之製作被使用之載體，無特別限 定’例如’可使用質體載體、嗜菌體載體、病毒載體等， 只要應重組DNA之使用目的，選擇適當載體即可。 再者，可將該重組DNA轉入適當宿主，製成轉形體。對 於轉形體之製作被使用之宿主亦無特別限定，除細菌、酵 母、絲狀样菌等微生物外，亦可使用動物、植物、昆蟲等 培養細胞等。藉由培養該轉形體，使本發明之多肽被產生 於培養物中，大量製造本發明之多肽成為可能。 (3)本發明之多肽 如上所述得到（本發明之多肽，例如可利用記載於國際 公開第00/56877號手冊、國際公開第〇2/16639號手冊之核 酸擴增方法。再者，雖然於先前已知之RNaseH中，於如 DNA-RNA-DNA之嵌合核酸中，亦有因RNA長度其 心性iv低者，但疋本發明之多肽很難受到rna長度導致之 影響。故，可適宜使用國際公開第〇2/〇64833號手冊記載之 鹼基取代檢測方法、及 Bi〇Techniques，ν〇1. 2〇，Νσ 2，p24(^ 248 0996)記載之循環探針法（Cyclingpr〇be)。又，具即使 進订於95 C15分鐘之處理，亦可保持其RNaseH活性之特 徵，可用於多種用途。 87608 -21 - 200418984 實施例 以下，將本發明藉由實施例具體說明，但是本發明之範 圍並非限定於該等實施例者。 實施例1

Archaeoglobus Profundus RNaseH基因之選殖 (1) Archaeoglobus pro fundus基因組 DNA之配製 收集 Archaeoglobus Profundus (Archaeoglobus profundus，購於 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen

I und Zellkulturen GmbH: DSM5631)相當於 10 ml之菌體， 懸浮於 100 μΐ 之 20%蔗糖、50 mM Tris-HCl (pH 8·0)，添加 20 μΐ 之 0.5M EDTA、10 μΐ 之 10 mg/ml 氯化溶菌酶（Nacalai tesque公司製）水溶液，於20°C反應2小時。反應結束後，向 該反應液中添加 800 μΐ之 150 mM NaCn、1 mM EDTA、20 mM Tris-HCl (pH 8·0)、10 μΐ之 20 mg/ml蛋白酶 K (Takara Bio.公司製）及50 μΐ之10%聚氧乙烯燒基硫酸鈉水溶液，於 3 7 °C保溫1小時。反應結束後，驗-氣仿抽出、乙醇沈殿、 風乾後’溶解於50 μΐ之TE，得到基因組DNA溶液。 (2) RNaseH基因中間部分之選殖 以各種耐熱性RNaseH胺基酸序列之間保守存在之部分 為基礎，合成寡聚核甞酸RN-F1 (序列編號3)與寡聚核：y：酸 RN-F2 (序歹ij編號4)。 於上述貫施例1-(1)配製之Archaeoglobus Profundus基 因組DNA)谷液5 μΐ作為模板，將1〇〇 pmol RN-F1及100 pmol RN-F2用於引子，以1〇〇 μι之體積進行pCR。pCR之dna多 87608 -22- 200418984 聚酶，根據添付之操作指南使用Takara Ex Taq (Takara Bio. 公司製），PCR以於94°C 30秒、於45t 30秒、於72°C 1分鐘 為1個循環，進行50個循環。反應結束後，以Mi croc on-100 (Takara Bio.公司製）去除引子之同時濃縮，得到約0.5 kb之 DNA 片段 AprFlR2 〇 (3) RNaseH基因上游及下游部分之選殖 決定於上述實施例1-(2)得到之約0.5 kb之片段Api*FlR2 之驗基序列，以其為基礎’合成為選殖上游之特異性寡聚 核苷酸AprRN-1 (序列編號5)與為選殖下游之特異性寡聚 核苷酸AprRN-2 (序列編號6)。再者，合成示於表1之48種 引子。將表1中之標籤（ta§)序列示於序列表之序列編號7。 87608 -23 - 200418984 表1 5’-標籤序列-N^^SSSSSSS-3’ (N : G、A、T、C之混合物，S為示於下列之鹼基序列） 序號 驗基序列 序號 驗基序列 序號 驗基序列 1 ggagcag 19 gtaacgg 37 gcgcaag 2 ggcaaag 20 gtaagcg 38 gcgcttg 3 ggcaacg 21 gtacacg 39 gcggacg 4 ggcacag 22 gtagacg 40 gcgtaag 5 ggcattg 23 gtagcgg 41 gctacgg 6 ggccaag 24 gtcaacg 42 gctcacg 7 ggccttg 25 gcaccag 43 gctccag 8 ggctaag 26 gcagacg 44 gcttgcg 9 ggctacg 27 gcagcag 45 gcttggg 10 ggctcag 28 gcatggg 46 ggacacg 11 ggctttg 29 gccaaag 47 ggaccag 12 gggacag 30 gccacag 48 ggagacg 13 gggcaag 31 gccattg 14 gggcttg 32 gcccaag 15 gggtacg 33 gcccttg 16 ggtaacg 34 gcctacg 17 ggtacgg 35 gcctcag 18 ggtagcg 36 gcctttg -24- 87608 200418984 以於實施例1-(1)配製之Archae〇globus Profundus基因組 DNA溶液 1 μΐ作為模板，以 20 pmol AprRN-1 或 20 pmol AprRN-2，與各20 pmol表1記載之48種引子組合，於含20 mM Tris醋酸（pH 8.5)、50 mM酷酸钾、3 mM醋酸鍰、〇·〇 1 % BSA、各 30 μΜ dNTP混合物、2.5個單位 Takara Ex Taq DNA 多聚酶（Takara Bio.公司製）之反應液中進行PCR。PCR於 94°C孵育3分鐘後，於以98°C 1〇秒、於50°C 10秒、於72°C 40 秒為1個循環，進行40個循環。將得到之PCR產物之一部分 進行瓊脂膠電泳，選出成為一條帶者，將該等反應液藉由 Microcon-100 (Takara Bio.公司製）於去除引子之同時濃 縮，進行直接序列測定，篩選出含RNaseH之上游或下游之 片段。其結果，已清楚RNaseH基因之上游含於約600bp之 PCR擴增片段Αρι:-1Α5，下游含於約500 bp之PCR擴增片段 Apr-2D9。 (4) RNaseH基因全長之選殖 以上述鹼基序列為基礎，合成引子AprNde (序列編號8) 及AprBam (序列編號9)。 以於實施例1-(1)得到之Thermo coccus Profundus基因組 DNA溶液 1 μΐ作為模板，將 20 pmol AprRNde及 20 pmol AprBam用於引子，以100 μΐ之體積進行PCR。PCR之DNA 多聚酶，根據添付之操作指南使用Takara Ex Taq (Takara Bio·公司製），PCR以於94°C30秒、於55°C30秒、於72°C 1分 鐘為1個循環，進行40個循環。將擴增之約0.7 kb之DNA片 段以Ndel及Bam HI (均為Takara Bio.公司製）消化，將得到 87608 -25- 200418984 之DNA片段插入質體載體pTV119Nd (將pTV119N之Ncol位 點變換為Ndel位點者）或pET3a (Novagen公司製）之Ndel及 BamHI之間，製作質體 pAPRlllNd 及 pAprl08。 (5) 含RNaseH基因之DNA片段之鹼基序列之決定 將於實施例1-(4)得到之pAPRlllNd及pApr 108之插入 DN A片段之驗基序列藉由雙股去氧序列測定法決定。 分析得到之鹼基序列之結果，發現被認為係編碼RNaseH 之開放性閱讀架構（open reading frame)。將pApr 108之開放 性閱$買架構之驗基序列示於序列表之序列編號2。又，由 遠驗基序列被推測之RNaseH胺基酸序列示於序列表之序 列編號1。PCR片段AprFlR2相當於序列編號2之第11-449 號鹼基，Apr-1A5相當於從第59號鹼基開始之5,末端側， Apr-2D9相當於從第373號鹼基開始之3’末端側。另，以質 體pAprl08轉形之大腸桿菌HMS174DE3，被命名、表示為 Escherichia coli HMS174/pAprl08，自平成 14年 8 月 20 日（原 寄存曰）作為受托號FERM BP-8433被寄存於日本國〒 305-85 66茨城縣築波市東1 丁目1番地1中央第6，獨立行政 法人產業技術综合研究所專利生物寄存中心，並其於2003 年10月27曰寄存中華民國（台灣）食品工業發展研究所，寄 ?子編號為BCRC 940435。使用DNA序列輸入分析系統 DNASIS (Ver· 3. 6 ’ Takara Bio·公司製）分析時，得知其详 24.4 kDa之蛋白質，等電點為8.50。又，從鹼基序列之比 較，可推測出其係被分類於RNaseHII。 (6) Archaeoglobus Profundus RNaseH基因之表現 87608 -26- 200418984 將以PAPIU i 1Nd轉形之大腸桿菌JM1〇9植於含ι〇〇叩/w 月乂「同禮i：素及1 mM IPTG之1〇 ml之LB培基，於37〇C過夜振 盪培養。培養結束後，將藉由離心分離收集之菌體懸浮於 176.3 μΐ 緩衝液（20 mM Tds-HCl (pH 8.0)、1 mM EDTA)， 以超音波破碎機處理。將該破碎液於i 2〇〇〇 rpm進行i 〇分鐘 之離心分離’將得到之上清於70它進行10分鐘之熱處理。 其後，再次於12000 rpm進行1〇分鐘之離心分離，收集上 /¾，知到熱處理上滑液。同樣，將以ρΑρΓ1〇8轉形之大腸 桿菌HMS174 (DE3)植於含1〇〇 pg/ml胺芊青黴素之1〇…之 培基，於37t：過夜振盪培養。培養結束後，將藉由離心 刀離收集之菌體以上述方法處理，得到Apr RNaseH熱處理 上滑液。 使用於上述得到之熱處理上清液，藉由以下方法測定酶 活性。 多聚（rA)及多聚（dT)(均為 Amersham Pharmacia Biotech 製）1 mg分別溶解於 1 mi 含 1 mM EDTA 之 40 mM Tris-HCl (pH 7.7)，配製多聚（rA)溶液及多聚（dT)溶液。 其次，向含 4 mM MgCl2、0.1% DMS〇、0.01% BSA之 20 mM Hepes-KOH (pH 7.8)以終濃度為20 pg/ml添加多聚 (rA)溶液，以終濃度為30 pg/ml添加多聚（dT)溶液，於40°C 反應10分鐘後，冷卻至4°C，配製多聚（rA)-多聚（dT)溶液.。 向該多聚（rA)-多聚（dT)溶液100 μΐ中添加Apr RNaseH熱 處理上清液1 μΐ，使其於40°C反應1〇分鐘，添加〇·5Μ EDTA i〇 μΐ使反應停止後，於260 nm測定吸光度。作為對照，向 87608 -27- 200418984 上述反應液中添加〇·5Μ EDTA 10 μΐ後，使其於4〇°C反應i〇 分鐘，測定吸光度。其後，求出自於EDTA非添加使其反應 求得之吸光度減去對照之吸光度的值（吸光度差）。即，自 吸光度差求出藉由酶反應自多聚（rA)-多聚（dT)雜交游離之 核苷酸的濃度。RNaseH之1個單位，係將相當於1 nmol核 菩酸游離之A26〇作為1 〇分鐘之增加之酶量，根據下式琴 出。另，於將酶液稀釋之情形下，將下式之值以稀釋率補 正。 單位（unit)=[吸光度差X反應液量（mi)]/〇 0152 其結果，於Apr RNaseH熱處理上清液中確認有RNaseH 活性。 (7) 精製RNaseH標準品之配製 以於實施例1-⑷得到之pAprl08將大腸桿菌BL21 (DE3) 轉形，將含得到之pAprl08之大腸桿菌BL21 (DE3)植於含 100 pg/ml胺+青徹素之400 ml之LB培基，於37。〇振蘆培養 17小時。培養結束後’將藉由離心分離收集之菌體释浮於 500 ml 緩衝液 A [20 mM Tds-HCl (pH 8.0)、i mM EDTA、2 mM PMSF (phenylmethanesulphonyl floride)、l〇 mM 2-鲢 基乙醇]，以超音波破碎機處理。將該破碎液於14〇〇〇 rpm 進行30分鐘之離心分離，將得到之上清於7(rc進行15分鐘 之熱處理。其後，再次於14000 rpm進行30分鐘之離心分 離，收集上清，得到400 ml熱處理上清液。 將該熱處理上清液供於以緩衝液A平衡過之DE52陰離子 交換柱（Whatman公司製），以緩衝液a洗淨。其結果， -28- 87608 200418984 RNaseH完全通過DE52柱。 將完全通過DE52柱之蛋白溶液，供於以緩衝液B [20 mM Tris-HCl (pH 7·0)、1 mM EDTA、100 mM NaC卜 10 mM 2-筑基乙醇]平衡過之P-II陽離子交換柱（Whatman公司製）， 藉由100 mM-1000 mM NaCl直線濃度梯度溶出。其結果， 於約500 mM NaCl處得到被溶出之RNaseH成分。 將該 RNaseH 成分 150 ml以 PEG(聚乙二醇（Polyethylene Glycol)) 20000濃縮至50 ml。向其添加150 mM之緩衝液C [20 mM Tris-HCl (pH 7.0)、1 mM EDTA、10 mM 2-巯基乙 醇]’供於以緩衝液B平衡過之Heparin-Sepharose 0L-6B肝 素親和柱（Amarsham BioSciences公司製），藉由 100 mM-500 mM NaCl直線濃度梯度溶出。其結果，於約250 mM NaCl處得到被溶出之RNaseH成分。 將該RNaseH成分130 ml以PEG 20000濃縮至10 ml後，供 於以緩衝液 D [20 mM Tris-HCl (pH 7.0)、0.5 mM EDTA、 200 mM NaCl、10 mM 2-鏡基乙醇]平衡之 HiLoad 26/60 Supei*dexG200HR 膠體濾過柱（Amarsham BioSciences 公司 製），以緩衝液D進行溶出之結果，得到25 ml RNaseH成分。 向該RNaseH成分25 ml中添加35 ml緩衝液C，供於以緩 衝液B平衡之SP-Sepharose FF陽離子交換柱（Amarsham BioSciences公司製），藉由 100 mM-500 mM NaCl直線濃摩 梯度溶出。其結果，於約250 mM NaCl處得到被溶出之 RNaseH成分 50 ml。

將該 RNaseH 成分 50 ml 用 Ultrafree-4 BIOMAX-5K 87608 -29- 200418984 (Millipore公司製）離心濃縮至u m卜將該濃縮液H m!相對 於形狀緩衝液[25 mM Tris-HCl (pH 7.0)、0·5 mM EDTA、 30 mM NaCl、5 mM 2-銃基乙醇、50%甘油]進行透析，得 到 4.5 ml RNaseH溶液。 將如此得到之RNaseH作為Apr RNaseH標準品。 使用上述得到之Apr RNaseH標準品，藉由實施例1-(6) 記載之方法測定酶活性之結果，確認於Apr RNaseH標準品 中有RNaseH活性。 貫施例2同族性檢索

對於於貫施例 1 得到之 Archaeoglobus Profundus (Apr) RNaseH之胺基酸序列與編碼其之鹼基序列，進行同族性檢 索。同源性’作為檢索程序，以Computer Algorithm FASTA (version 3.2 ; Pearson，W· R.等，ΡΓ0· Natl· Acad· Sci·，85 : 2444-2448，1988)算出。 以 Computer Algorithm FASTA 關於 Apr RNaseH檢索了基 因數據庫。其結果，對於Apr RNaseH之胺基酸序列、鹼基 序列’於被推測為核糖核酸酶之胺基酸序列、驗基序列中 同源性最高者分別有53%、60%之同源性。 實施例3 RNaseH之耐熱性之檢討 作為 Archaeoglobus Profundus RNaseH，使用以實施例 1-（6)得到之pAprl08轉形之大腸桿菌研究耐熱性。即，培 養上述大腸桿菌，將從培養液配製之酶抽出液於95〇c，15 分鐘之條件下進行熱處理，以與實施例1-(6)同樣之方法研 先 RNaseH，石性。其結果’於來源於 Archae〇gi〇bus profundus 87608 -30- 200418984 之RNaseH確認有RNaseH活性。 再者，將熱處理緩衝液（2 5 mM Tris-HCl(pH8.0)、5 mM 巯基乙醇、30 mM NaC卜 0.5 mM EDTA、0.1% BSA、50% 甘油）中之5單位/ml之Apr RNaseH ’分別於50°C、60 C、 70°C、80°C、90°C之溫度條件下熱處理分鐘，研究殘存 活性。將未進行熱處理之樣品、熱處理後之樣品，以終濃 度為0.2單位/ml，添加至終濃度分別為32 mM Hepes-氫氧 化鉀緩衝液（pH 7.8)、100 mM 醋酸鉀、1% DMSO ' 0.05% BSA、4 mM酷酸鎂、0·2 μΜ基質 DNA-RNA-DNA、1 μΜ模 板W49 (序列編號16)之活性測定溶液，求出對於探針W3 (序列編號15)之酶每單位之分解速度。以未進行熱處理之 RNaseH活性作為1〇〇，其結果示於圖1。Apr RNaseH於 50-80它幾乎100%，即使於90°(：10分鐘之反應後，亦有86.9 ± 7.0%之殘存活性。 實施例4使用來源於Apr之RNaseH之ICAN system之HBV 檢出之檢討 將於序列表之序列編號10記載之HBV X蛋白基因一部分 之560 bp於PCR反應擴增，將其片段藉由TA選殖插入 pT7Blue T載體。以此作為HBV陽性對照質體。 反應成分係添加終濃度為32 mM Hepes-氫氧化钾緩衝液 (pH 7.8)、1〇〇 mM醋酸钾、1% DMSO、〇·〇ΐ% BSA、4 mM 醋酸鎂、各600 μΜ dNTP混合物、11單位BcaBEST DNA多 聚酶、及具序列表之序列編號11、12記載之鹼基序列之 HBVF-2引子與HBVR-1引子分別50 pmo卜HBV陽性對照 87608 -31 - 200418984 ίο3拷貝、及來源於Apr之RNaseH 1.625單位、或3.25單位、 或6·5單位、或13單位，使終體積為25 μΐ。將該反應液置於 預先設為55之溫度循環儀（Thermal cycler)，保溫60分鐘。 反應結束後，將該反應液3 μΐ進行3.0%瓊脂凝膠電泳。 其結果，於任一 RNaseH量，均可確認出目的擴增片段76 bp 〇 將同樣之實驗，於HBV陽性對照1〇2拷貝、或HBV陽性對 照1 〇拷貝、或HBV陽性對照1拷貝之情形下亦進行，檢討 對HBV陽性對照之敏感度。其結果，將Apr RNaseH添加6.5 單位之情形下敏感度最高，可檢出HB V陽性對照1拷貝。 其次，將來源於Pyrococcus furiosusu 之 RNaseHII (Pfu RNaseHII)、來源於 Archaeoglobus fulgidus之 RNaseHII (Afu RNaseHII)、來源於Thermococcus litoralis 之 RNaseHII (Tli RNaseHII)以國際公開第02/22831號手冊記載之方法配製， 用於上述ICAN system之HBV檢出，將其敏感度與Apr RNaseH作一比較。使用pfu RNaseHII之情形下，得到最高 敏感度之酶添加量為2 · 2單位，對HB V陽性對照之敏感度為 10拷貝。使用Afu RNaseHII之情形下，得到最高敏感度之 酶添加量為2.2單位，對HBV陽性對照之敏感度為10拷貝。 使用Tli RNaseHII之情形下’得到最高敏感度之酶添加量 為8單位’對HBV陽性對照之敏感度為1〇拷貝。 如此，於此ICAN system之HBV基因檢出，於使用來源 於Apr之RNaseH之情形下，檢出HBV陽性對照1拷貝為可 能，且可確認得到最高敏感度。 87608 -32- 200418984 實施例 5

Apr RNaseH之基質形狀之不同導致之基質分解速度之 比較 包含於序列中之RNA數為不同之3個DNA-RNA-DNA，測 定將探針W1 (序列編號13)、探針W2 (序列編號14)、探針 W3 (序列編號15)用於基質之情形之RNaseH所致之分解速 度，研冗其差異。同時，將來源於Pyrococcus furiosusu之 RNaseHII (Pfu RNaseHII)、來源於Pyrococcus horikoshii之 RNaseHII (Pho RNaseHII)以國際公開第 02/2283 1 號手冊 記載之方法配製，與來源於Thrmus thermophilus之RNaseHI (Tth RNaseHI，東洋紡公司製）配合，比較使用上述基質時 之切斷速度。 於將FAM最大激勵波長495 nm附近之波長用於含探針 W1、探針W 2、探針W 3之溶液之情形，被各基質y端修飾 之FAM雖然發出最大波長519 nm之螢光，但是其螢光因與 被J端修飾之D A B C Y L之間引起之勞光共振能量轉移 (Fluoresence resonance energy transfer，FRET)而衰減。基 質因RNaseH而接受切斷之情形下，因FRET被削減，519 nm 之螢光強度增大。故，藉由測定基質接受切斷前與被切斷 後之5 19 nm之螢光強度差，可監測基質之分解。 於基質濃度對於酶濃度為足夠之情形，酶反應產物量與 時間成比例增大。使用對於酶量足夠過剩量之基質，藉由 519nm之螢光強度之測定監測其分解速度時，反應初期之 每單位時間之螢光強度上昇，可以線性式近似。該近似直 -33 - · 87608 200418984 線之趨勢’成為平均時間之營光強度上昇（（螢光強 度）/(分））。又，螢光強度上昇達到平台期，假定進一步螢 光強度達到最大時，反應系中之基質完全分解，（最大之螢 光強度）-(分解前之螢光強度）成為基質平均分解量之螢光 強度上昇值。可從該值與平均時間之螢光強度上昇（（瑩光 強度）/(分）），求出反應速度v((基質分解量）/(分））。 向終濃度分別為32 mM Hepes-氫氧化钟緩衝液（pH 7.8)、100 mM醋酸鉀、1% DMSO、0.05% BSA、4 mM醋酸 鎂、0·2 μΜ基質DNA-RNA-DNA、1 μΜ模板W49 (序列編號 16)之活性測定溶液中分別以終濃度為〇·4單位/nU、〇·8單位

/ml、1.6 單位/ml、2.4 單位/ml 添加 AprRNaseH。於 RNaseH 之反應與螢光強度之測定，使用Takara Bio·公司製實時 PCR測定裝置SmartCycler，於55°C使其反應100分鐘，求出 反應速度v((基質分解量）/(分））。再者，針對Apr RNaseH之 濃度，將反應速度v((基質分解量）/(分））製圖，製成定量曲 線，由其趨勢求出酶平均單位之反應速度（（基質分解 量）/(分•單位））。又，對於 Pfu RNaseHII、Pho RNaseHII、 Tth RNaseHI亦以同樣方法進行活性測定，求出酶平均單位 之反應速度（（基質分解量）/(分•單位））。關於Tth RNaseHI， 向活性測定溶液中分別添加終濃度為1 〇單位/ml、2〇單位 /ml、30 單位/ml、40 單位/ml 之 Tth RNaseHI。 將各酶之對於探針W1、探針W2、探針W3之酶平均單位 之反應速度示於表2。表中之數值表示pniol/(分•單位）。 又，將以對於探針W3之酶平均單位之反應速度作為1 〇.〇% 87608 -34 - 200418984 之情形之相對反應速度示於括號内。與其他RNaseH相比， AprRNaseH於RNA數為任一之情形，切斷速度均大，對於 RNA為2個之基質之切斷速度最大。對於RNA為1個或2個之 基質之切斷速度，表示出與切斷RNA為3個之基質之速度 之相近值。 表2 探針W1 (RNA=1) 探針W2 (RNA=2) 探針W3 (RNA=3) Apr RNaseHII 17.0 (61.6) 41.1 (148.9) 27.6(100) Pfu RNaseHII 3.3 (34.8) 5.3 (55.9) 9.5 (100) Pho RNaseHII 2.7 (55.6) 3.2 (67.8) 4.8 (100) Tth RNaseHI 0.0 (0) 0.0 (2.2) 1.4(100) 如上，切斷速度不易被RNA長度影響之Apr RNaseH，表 示出對核酸擴增反應、核酸檢出反應有用。 【產業上利用之可能性】 藉由本發明，具於基因工程利用價值高的RNaseH活性之 多肽，編碼該多肽之基因及該多肽之基因工程製造方法被 提供。又，本發明之RNaseH具耐熱性，對工業有利之 RNaseH之製造方法亦被提供。 藉由本發明，於各種用途使用本發明之RNaseH成為可 能。 【圖式簡單說明】 圖1係表示本發明之RNaseH之耐熱性之圖。 87608 -35- 200418984 序歹ll 表 free text SEQ ID NO : 3 :從Archaeoglobus Profundus選殖一編碼 具RNaseH活性之多肽基因用之PCR引子RN-F1 SEQIDNO: 4:從 Archaeoglobus Pro fundus選殖一編碼 具RNaseH活性之多肽基因用之PCR引子RN-R2 SEQ ID NO : 5 :從 Archaeoglobus Profundus選殖一編碼 具RNaseH活性之多肽基因用之PCR引子AprRN-1 SEQ ID NO : 6 :從 Archaeoglobus Profundus選殖一編碼 具RNaseH活性之多肽基因用之PCR引子AprRN-2 SEQ ID NO : 7 :標籤序列 SEQ ID NO : 8 ··從 Archaeoglobus Profundus擴增一編碼 具RNaseH活性之多肽基因用之PCR引子AprNde SEQ ID NO ·· 9 ··從 Archaeoglobus Profundus擴增一編碼 具RNaseHIII活性之多肽基因用之PCR引子AprBam SEQ ID NO : 11 :擴增一部分B型肝炎病毒X蛋白質之嵌 合寡聚核甞酸引子。’’第18-20核：y：酸為核糖核：y：酸，其他 核苷酸為脫氧核糖核苷酸π SEQ ID NO : 12 :擴增一部分Β型肝炎病毒X蛋白質之嵌 合寡聚核苷酸引子。”第20-22核苷酸為核糖核苷酸，其他 核甞酸為脫氧核糖核苷酸π SEQ ID NO ·· 13 :設計為探針W1之嵌合寡聚核苷酸。 "第9核苷酸為核糖核苷酸，其他核苷酸為脫氧核糖核苷酸” SEQ ID NO : 14 :設計為探針W2之嵌合寡聚核苷酸。 "第9-1 〇核苷酸為核糖核苷酸，其他核：y：酸為脫氧核糖核苷 -36- 87608 200418984 酸π SEQ ID NO : 15 :設計為探針W3之嵌合寡聚核苷酸。 π第9-11核苷酸為核糖核苷酸，其他核苷酸為脫氧核糖核苷 酸，， SEQ ID NO : 16 :設計為模板W49之寡聚核苷酸。 87608 37- 200418984 序列表 <11〇>寶生物股份有限公司 <120>耐熱性核糖核酸酶Η <130> <140> 092123972 <141> 2003-08-29 <150〉 JP 2002-254153 <151〉 2002-08-30 <160> 16

<210> 1 <211〉 211 <212> PRT <213> Archaeoglobus profundus <400〉 9

Met lie Ala Gly lie Asp Glu Ala Gly Lys Gly Pro Val lie Gly 15 10 15

Pro Leu Val lie Cys Gly Val Leu Cys Asp Glu Glu Thr Val Glu 20 25 30

Tyr Leu Lys Ser Val Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Asp Arg 35 40 45

Arg Lys Arg Glu Glu Leu Tyr Asn lie lie Lys Ser Leu Cys Lys 50 55 60

Val Lys Val Leu Lys lie Ser Val Glu Asp Leu Asn Arg Leu Met 65 70 75 87608 200418984

Glu Tyr Met Ser lie Asn Glu lie Leu Lys Arg Ala Tyr Val Glu 80 85 90 lie He Arg Ser Leu Met Pro Lys Val Val Tyr lie Asp Cys Pro 95 100 105

Asp lie Asn Val Glu Arg Phe Lys His Glu He Glu Glu Arg Thr 110 115 120

Gly Val Glu Val Phe Ala Ser His Lys Ala Asp Glu lie Tyr Pro 125 130 135 lie Val Ser lie Ala Ser lie Val Ala Lys Val Glu Arg Asp Phe 140 145 150

Glu lie Asp Lys Leu Lys Lys lie Tyr Gly Asp Phe Gly Ser Gly 155 160 165

Tyr Pro Ser Asp Leu Arg Thr He Glu Phe Leu Arg Ser Tyr Leu 170 175 180

Arg Glu His Lys Ser Phe Pro Pro lie Val Arg Lys Arg Trp Lys 185 190 195

Thr Leu Lys Arg Leu Thr Thr His Thr Leu Ser Asp Phe Phe Glu 200 205 210

Val 211

〈210〉 2 <211〉 636 <212> DNA <213> Archaeoglobus profundus <400〉 2 60 atgattgctg ggatagacga agctggaaaa ggacctgtaa taggccctct tgtaatatgc ggagtactgt gcgatgaaga gaccgtagaa tacttgaaga gcgtaggcgt taaagattca 87608 120 200418984 aagaagctgg ataggaggaa gagagaggaa ctttacaata tcataaaatc gctttgcaag 180 gttaaggtat tgaaaatatc tgtcgaggat ttgaacaggt taatggaata catgagtata 240 aatgaaatct tgaagagagc ttacgttgaa ataataaggt ctttgatgcc taaagttgtg 300 tacatagact gtccagatat taatgtggag agatttaagc acgaaataga ggagagaacg 360 ggagtggagg tatttgcgag ccataaagcg gacgagatat atccaatagt atctatagct 420 tcgatagtcg caaaagttga aagggatttt gaaatagaca agctgaagaa gatttatgga 480 gactttggga gtggatatcc atcagatcta agaaccatcg aatttttaag gagttatcta 540 agggaacaca aaagttttcc accaatcgta agaaagagat ggaaaactct caaaagattg 600 acaacgcaca ctttaagcga tttctttgaa gtttag 636 <210> 3 <211〉 23 <212> DNA <213〉人造序列 <220〉 〈223> 從 Archaeoglobus Profundus 選殖一編碼具 RNaseH 活 性之多肽基因用之PCR引子RN-F1 <400> 3 ggcattgatg aggctggnar rgg 23 <210〉 4 <211> 20 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220> <223〉從 Archaeoglobus Profundus 選殖一編碼具 RNaseH 活 87608 - 3 - 200418984 性之多肽基因用之PCR引子RN-R2 <400〉 4 ggtagggaaa gctgraancg <210> 5 <211> 22 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220〉<223> 從 Archaeoglobus Profundus 選殖 性之多肽基因用之PCR引子AprRN-1 <400〉 5 ctcttcatcg cacagtactc eg 編碼具RNaseH活 22 <210〉 6 <211> 22 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220〉<223〉從 Archaeoglobus Profundus 選殖 性之多肽基因用之PCR引子AprRN-2 <400〉 6 tttgegagee ataaagcgga eg 編碼具RNaseH活 22 87608 -4- 200418984 <210〉 7 <211> 17 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉標籤序列 <400> 7 17 ggcacgattc gataacg <210〉 8 <211〉 39 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220〉 編碼具RNaseH活 <223〉從 Archaeoglobus Profundus 擴增一 性之多肽基因用之PCR引子AprNde <400〉 8 aatcgatggt gttcatatga ttgctgggat agacgaagc 39 <210〉 9 <211〉 39 <212〉 DNA <213〉人造序列 87608 <220〉 200418984 <223〉從 Archaeoglobus Profundus擴增一編碼具 RNaseHIII 活性之多肽基因用之PCR引子AprBam <400〉 9 gcccacgccc tgggatccct aggctacggg tcctttaag 39

<210〉 10 <211〉 560 <212> DNA <213〉B型肝炎病毒 <400〉 10 ccttcccatg gctgctcggg tgtgctgcca actggatcct gcgcgggacg tcctttgtct 60 acgtcccgtc ggcgctgaat cccgcggacg acccgtctcg gggccgtttg ggcctctacc 120 gtcccttgct ttctctgccg ttccagccga ccacggggcg cacctctctt tacgcggtct 180 ccccgtctgt gccttctcat ctgccggacc gtgtgcactt cgcttcacct ctgcacgtcg 240 catggagacc accgtgaacg gccaccaggt cttgcccaag ctcttacata agaggactct 300 tggactctca gcaatgtcaa caaccgacct tgaggcatac ttcaaagact gtttgtttaa 360 agactgggag gagttggggg aggagattag gttaaaggtc tttgtactag gaggctgtag 420 gcataaattg gtctgttcac cagcaccatg caactttttc acctctgcct aatcatctca 480 tgttcatgtc ctactgttca agcctccaag ctgtgccttg ggtggctttg gggcatggac 540 attgacccgt ataaagaatt 〈210〉 11 <211〉 20 <212〉 DNA 〈213〉人造序列 -6- 87608 <220〉 200418984 <223〉擴增一部分B型肝炎病毒X蛋白質之嵌合寡聚核苷酸 引子。’’第18-20核苷酸為核糖核苷酸，其他核苷酸為脫氧 核糖核芬酸π <400〉 11 ctcttggact ctcagcaaug 20 <210> 12 <211〉 22 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉擴增一部分B型肝炎病毒X蛋白質之嵌合寡聚核苷酸 引子。’’第20-22核苷酸為核糖核苷酸，其他核苷酸為脫氧 核糖核苷酸" <400〉 12 tcctcccagt ctttaaacam ac 22 <210> 13 <211〉 20 <212〉 DNA <213>人造序列 <220〉 <223>設計為探針W1之嵌合寡聚核苷酸。”第9核:y：酸為核糖 核苷酸，其他核：y：酸為脫氧核糖核：y：酸” 87608 200418984 <400〉 13 cctacgccac cagctccaac 20 <210〉 14 <211〉 20 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220〉 <223>設計為探針W2之嵌合寡聚核苷酸。”第9-10核芬酸為 核糖核苷酸，其他核苷酸為脫氧核糖核苷酸π <400> 14 cctacgccac cagctccaac 20 <210〉 15 <211> 20 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220〉 <223>設計為探針W3之嵌合寡聚核苷酸。”第9-11核：y：酸為 核糖核荅酸，其他核甞酸為脫氧核糖核苷酸” <400〉 15 cctacgccac cagctccaac 20 <210〉 16 <211〉 49 87608 200418984 <212〉 DNA <213〉人造序列 <220〉 <223〉設計為模板W49之寡聚核苷酸。 〈400> 16 ataaacttgt ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag tgccttgac 9- 87608

Claims (1)

1. 200418984 拾、申請專利範圍： 1 · 一種多肽，其特徵在於選自下述之群，且具耐熱性核糖 核酸酶Η活性： (a) 具序列表之序列編號1之胺基酸序列之多肽； (b) 具於序列表之序列編號1之胺基酸序列中，至少— 個胺基酸殘基之缺失、添加、插入或取代之多肽； (c) 具與序列表之序列編號1之胺基酸序列至少54%同 源性之胺基酸序列之多肤。 2· —種核酸，其係選自下述之群，且編碼具耐熱性核糖核 酉父酶Η活性之多肤： (a) 編碼具於序列表之序列編號1之胺基酸序列之多肽 之核酸； (b) 編碼具於序列表之序列編號1之胺基酸序列中，至 少一個胺基酸殘基之缺失、添加、插入或取代之多肽之 核酸； (C)編碼具與序列表之序列編號1之胺基酸序列至少 54%同源性之胺基酸序列之多肽之核酸； (d) 具序列表之序列編號2之驗基序列之核酸； (e) 其包含具於序列表之序列編號2之驗基序列中，至 少一個驗基於被轉譯成胺基酸序列之際的缺失、添加、 插入或取代之鹼基序列之核酸； (f) 可與上述（a)-(d)中任一項之核酸或其互補鏈於苛刻 條件下雜交之核酸； (g) 具與序列表之序列編號2之鹼基序列至少6 1 %同源 87608 200418984 性的鹼基序列之核酸。 3· —種重組DNA，其係包含申請專利範圍第2項之核酸而成 者。 4. 一種轉形體，其係藉由申請專利範圍第3項之重組DNA轉 形而成者。 5 · —種製造具耐熱性核糖核酸酶Η活性之多肽之方法，其 特徵在於包含培養申請專利範圍第4項轉形體之工序，及 自該培養物中提取具耐熱性核糖核酸酶Η活性之多肽之 工序。 6· —種具耐熱性核糖核酸酶Η活性之多肽，其係培養轉入保 持於 Escherichia coli HMS174/pAprl08 (BCRC 940435) 之質體pAprl08之轉形體而得者。 87608 2-