JP4431722B2 - 新規耐熱性プロテアーゼ - Google Patents
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(1)超好熱菌パイロコッカス・ホリコシ由来である、
(2)SDS−PAGEで測定された分子量が約25kDaである、
(3)活性型が二量体である、
(4)至適温度が約98℃以上である、
(5)至適pHが約5〜約6である、
(6)エンド型セリン系である、及び
(7)膜タンパク質ストマチンの多量体化に関与する疎水性アミノ酸配列を認識し限定分解する、
を有するプロテアーゼを提供する。
(A)配列番号1又は4に示されるアミノ酸配列を含むポリぺプチド、又は
(B)配列番号1又は4に示されるアミノ酸配列において1以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、膜タンパク質ストマチンの多量体化に関与する疎水性アミノ酸配列を特異的に認識し限定分解するプロテアーゼ活性をもつポリ
ペプチド、
をコードするDNAを提供する。
(C)配列番号2又は3に示される塩基配列を含むDNA、
(D)配列番号2又は3に示される塩基配列において1以上の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含み、かつ、膜タンパク質ストマチンの多量体化に関与する疎水性アミノ酸配列を特異的に認識し限定分解するプロテアーゼをコードするDNA、及び
(E)前記(C)又は(D)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、かつ、膜タンパク質ストマチンの多量体化に関与する疎水性アミノ酸配列を特異的に認識し限定分解するプロテアーゼをコードするDNA、
からなる群から選択されるDNAを提供する。
本発明はまた、第7の態様において、上記発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を提供する。
さらなる実施形態において、プローブは標識されている。
チドの変異を含む誘導体を指し、本発明のプロテアーゼと同様に膜タンパク質ストマチンの限定分解を可能にする特性を有するものである。
(1)超好熱菌パイロコッカス・ホリコシ由来である、
(2)SDS−PAGEで測定された分子量が約25kDaである、
(3)活性型が二量体である、
(4)至適温度が約98℃以上である、
(5)至適pHが約5〜約6である、
(6)エンド型セリン系である、及び
(7)膜タンパク質ストマチンの多量体化に関与する疎水性アミノ酸配列を認識し限定分解する。
(A)配列番号1又は4に示されるアミノ酸配列を含むポリぺプチドをコードするDNA、
(B)配列番号1又は4に示されるアミノ酸配列において1以上、例えば1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、膜タンパク質ストマチンの多量体化に関与する疎水性アミノ酸配列を特異的に認識し限定分解するプロテアーゼ活性をもつポリペプチドをコードするDNA、
(C)配列番号2又は3に示される塩基配列を含むDNA、
(D)配列番号2又は3に示される塩基配列において1以上、例えば1〜45、1〜30、1〜21、1〜15又は1〜9個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列を含み、かつ、膜タンパク質ストマチンの多量体化に関与する疎水性アミノ酸配列を特異的に認識し限定分解するプロテアーゼをコードするDNA、並びに、
(E)前記(C)又は(D)のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、かつ、膜タンパク質ストマチンの多量体化に関与する疎水性アミノ酸配列を特異的に認識し限定分解するプロテアーゼをコードするDNA、
(F)配列番号1又は4に示されるアミノ酸配列と50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、又は98%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、膜タンパク質ストマチンの多量体化に関与する疎水性アミノ酸配列を認識し限定分解するプロテアーゼ活性を有するポリペプチドをコードするDNA、
からなる群から選択される。
。
胎児腎臓細胞、ヒト神経前駆細胞、BHK21細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞)などを含む。
シグナル配列(もしくはリーダー配列)を連結する。シグナル配列は、タンパク生合成後に細胞膜へのタンパク輸送の役割を担い、細胞内のシグナルペプチダーゼによって切断され、成熟タンパク質が細胞外に分泌される。
硫黄代謝好熱性古細菌パイロコッカス、ホリコシ(登録番号JCM9974)は、次の方法で培養した。
JCM9974の染色体DNAは以下の方法により調製した。
実施例2で得られた染色体DNAを制限酵素HindIIIにより部分分解後アガロースゲル電気泳動により約40kb長の断片を調製した。このDNA断片と制限酵素HindIIIによって完全分解したBacベクターpBAC108L及びpFOS1とをT4リガーゼを用いて結合させた。前者のベクターを用いた場合には結合終了後のDNAをただちに大腸菌内へ電気窄孔法により導入した。後者のベクターpFOS1を用いた場合には結合終了後のDNAをGIGA Pack Gold (ストラタジーン社製)により試験管内でλファージ粒子内に詰め込み、この粒子を大腸菌に感染させることによりDNAを大腸菌内に導入した。これらの方法により得られた抗生物質クロラムフェニコール耐性の大腸菌集団をBAC及びFosmidライブラリーとした。ライブラリーからJCM9974の染色体をカバーするのに適したクローンを選択して、クローンの整列化を行った。
整列化されたBAC或いはFosmidクローンについて順次以下の方法で塩基配列を決定した。
実施例4で決定された各BAC或いはFosmidクローンの塩基配列を大型計算機を用いて解析し、その結果、PH1510遺伝子は、パイロコッカス・ホリコシのゲノム上でストマチン(stomatin)ホモログ(PH1511)とオペロンを構成し、かつセリンプロテアーゼモチーフを有する遺伝子であることを見い出した。PH1510遺伝子及びアミノ酸配列はそれぞれ配列番号3及び4として示した。
(1) pET21b/1510-N
コンピュータを用いた情報解析により、セリンプロテアーゼモチーフを有する遺伝子(PH1510)のC末端側ドメイン(残基番号237から441に相当する)には4ケ所の膜貫通領域が予測された。さらに、PH1510全長遺伝子の大腸菌での生産を試みたが、この膜貫通領域のために欠失体が生産され易く、全長産物の生産性は低かった。そこで、N末端側水溶性ドメイン(残基番号16から236に相当する)をコードする部分遺伝子を発現プラスミドに挿入し、その水溶性ドメイン1510-Nを調製した。
はじめに、構造遺伝子領域(1510-N)の前後に制限酵素(NdeIとXhoI)サイトを構築する目的でDNAプライマーを合成し、PCRでその遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した
。
TGACTGGTGCATATGTCCCCAATTCTAGCAAAAAA(下線部はNdeIサイトを示す;配列番号5)
Lower primer-1510-N
GGGTTTCTCGAGATCCGTGATGTAACTTATTAG(下線部はXhoIサイトを示す;配列番号6)
PCR反応後、制限酵素(NdeIとXhoI)で完全分解(37℃、2時間)した後、その構造
遺伝子を精製した。
膜タンパク質ストマチン(PH1511がコードする。)の中で、その多量体化に関与し、かつ
酵素1510-Nの基質となるドメイン(残基番号189から266に相当する)をコードする遺伝子(1511-C)の発現プラスミドの構築法を以下に述べる。
GCTGAAAGGGAGAGGCATATGAGGATAACGCTAGCTG(下線部はNdeIサイトを示す;配列番号7)
Lower primer-1511-C
GGGTTTCTCGAGCTTTTCTTCTTCCTTCTTCTTCATGT(下線部はXhoIサイトを示す;配列番号8)
とT4リガーゼで16℃、2時間反応させ連結した。連結したDNAの一部をE.coli-XL2-BlueMRF' のコンピテントセルに導入し形質転換体のコロニーを得た。得られたコロニーからプラスミドをアルカリ法で精製し発現プラスミド、pET21b/1511-Cを得た。この発現プラスミドを用いると1511-CはC末端にヒスチジンタグが付加された融合タンパク質とし
て生産された。
大腸菌(E. coli BL21(DE3) CodonPlus RIL, Novagen社製)のコンピテントセルを融解して、二本のファルコンチューブに各々0.1mlづつ移した。その中に上記の発現プラスミド溶液0.005mlを別々に加え、氷中に30分間放置した後、42℃でヒートショックを30秒間行い、SOC medium (バクトトリプトン16g、酵母エキス10g、NaCl 5g/l) 0.9mlを加え、37度で1時間振とう培養した。その後アンピシリンを含む2YT寒天プレートに適量まき、37℃で一晩培養し、形質転換体E.coli BL21(DE3) CodonPlus RIL/pET21b/1510-NとE. coli BL21(DE3) CodonPlus RIL/pET21b/1511-Cを得た。
冷凍保存した菌体に2倍量の50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)を加え懸濁液を得た。このトリス塩酸緩衝液には0.15M NaCl、1.5% dodesyl-β-maltoside (DDM, Anatrace, Maumee, OH)、1錠のプロテアーゼ阻害剤(Complete EDTA-free, Roche社製)、0.5mgのDNase I(Sigma)が予め加えられている。得られた懸濁液を超音波破砕し、遠心分離(15,000 xg、20分)により上清液を得た。この上清液を、0.3M NaCl、0.1% DDM、5mMイミダゾールで平衡化した Ni-カラム(Novagen, His・Bind metal chelation resin)に懸け、30mMイミダゾールを含む緩衝液による洗浄後、目的タンパク質は500mMイミダゾールを含む緩衝液
で溶出された。回収されたタンパク質はセントリプレップ-10かセントリコン-10(アミコン社)で濃縮し、4℃で保存した。タンパク質濃度はCoomassie protein assay 試薬(Pierce)で測定した。
精製方法は、実施例8の酵素1510-Nの精製法と同様であるが、緩衝液にDDMが含まれない点で異なる。Ni-カラム後の更なる精製は、50mMトリス塩酸緩衝液(pH8.5)で平衡化された陰イオン交換Qセファロースカラムで行われ、0〜0.5M NaCl勾配で溶出された。目的タンパク質は4℃で保存した。
オーバーラップPCR法により、触媒候補残基のアラニン変異体遺伝子、すなわちD61(GCG)、T62(GCC)、S94(GCA)、S97(GCT)、H107(GCG)、C120(GCC)、K138(GCG)、R156(GCG)、D168(GCC)、D188(GCG)、及びD236(GCG)を作製した。
(1)活性染色
酵素サンプルは、0.8% sodium lauroylsarcosine (半井テスク)、10% グルセロール、1% 2-メルカプトエタノールと混和した後、0.2%カゼインを含む10%ポリアクリルアミド-SDS-ゲルで電気泳動した。泳動終了後、2連で泳動されたゲルの左右を半分づつに切断し、
片方はクマシーブリリアントブルーR250(CBBR250)で染色した。残り半分は2.5%Triton X-100を含む50mMリン酸緩衝液(pH7.5)で1時間洗浄した後、タンパク質分解反応のために50mMリン酸緩衝液(pH7.5)中で80℃、16時間加温した。冷却後、ゲルは、30%メタノールと10%酢酸を含む0.1%アミドブラック染色液で染色した。タンパク質分解活性は、カゼイン分解による透明なゾーンとして観察される。
(2) タンパク質分解活性の定量
タンパク質分解活性は、蛍光標識されたカゼイン(ウシ由来のcasein fluorescein isothiocyanate (FITC-カゼイン), Sigma)の加水分解を測定した。標準反応液は20μlの20mM MES-Na緩衝液(pH6.0)中に基質FITC-カゼインと酵素を含む。反応液は80℃で数分間加温した後に、氷中保存で反応を停止し、終濃度が0.5% SDS、10%グリセロール、1%2-メルカプトエタノールになるようにSDS-サンプルバッファーを加え、98℃で5分間加温した。このサンプル(14μl)を10%ポリアクリルアミド-SDS-ゲルで電気泳動した。この後、ゲル上での分解産物を、フルオロイメージャー585(Molecular Dynamics, Inc., CA)を用い、励起光フィルター(488nm)と発光フィルター(530nm)で可視化、定量した。タンパク質分解活性は、以下の式で計算した。
R=P/(S+P)
(ここで、Rは分解率、Sは未分解カゼインのバンド量、Pは分解前のカゼインバンドの下部に現れた全ての分解産物量である。)
(% cleavage)=100x(RX-R0)/(1-R0)
(ここで、RXはX分後のR値、R0は0分時のR値である。)
初速度は、時間経過における% cleavage値プロットの初傾度から求めた。
至適pHは、基質FITC-カゼイン(0.5μg)と酵素1510-N(0.2μg)を50mM濃度の各々酢酸Na緩衝液、リン酸Na緩衝液、MES-Na緩衝液、Tris-HCl緩衝液、グリシン-NaOH緩衝液中で80℃で反応させて測定した。温度依存性は20mM MES-Na緩衝液(pH6.0)中で基質FITC-カゼイン(0.5μg)と酵素1510-N (0.1μg)を各温度で反応させて、測定した。
基質α-カゼインとβ-カゼイン(共に牛血清由来、Sigma)と基質1511-Cは、酵素1510-Nで分解された。その反応産物を、SDS-PAGEで分離し、polyvinylidene difluoride 膜(Millipore)に電気的に転写した。反応産物のN末端配列解析は、APRO Life Science Institute, Inc.(日本)又は北海道システムサイエンス(日本)に依頼し分析された。
(1)酵素1510-Nと基質1511-Cのタンパク質化学的性質
酵素1510-Nと基質1511-Cは上記の精製プロセスで完全に精製され、SDS-PAGEで分子量約25kDaと10kDaの単一バンドを示した(図3A)。また、精製1511-Cを用い、ネイティブ状態での分子量をゲルろ過で測定したところ、排除限界近くに一つのピークとして溶出され、数十量体の巨大分子として挙動した。このことは1511-C ドメインがストマチン、つまり1511の多量体化に大きく貢献している可能性を強く示唆した。なお、1510-Nは230アミノ酸残基より構成され、そのアミノ酸配列から予測される分子量は25,398 Daである。また、1511-Cは87アミノ酸残基より構成され、そのアミノ酸配列から予測される分子量は9,998Daである。また、酵素1510-Nの変異酵素、D61A、H107A、D188A、D236A、S94A、S97A、C120A、D168A、T62A、K138A、R156Aも上記の精製プロセスで完全に精製され、SDS-PAGEで分子
量約25kDaの単一バンドを示した(図3B)。
野生型1510-NとS97A、C120A変異体のSDS-PAGEパターンと活性染色の結果を図4に示した。図4A,Bレーン1と3に示されたように、野生型1510-NとC120A変異体はタンパク質バンドと同じ位置にカゼイン分解活性に由来する透明なハローを示した。このSDS-PAGEパターンより、活性タンパク質の分子量は45kDaと見積もられ、1510-N分子は2量体で活性を発現すると考えられた。このことは、本酵素がゲルろ過で二量体として挙動する事実とも一致した。なお、S97A変異体には明瞭なカゼイン分解活性が検出されなかった。さらに、起源の異なる種々のセリンプロテアーゼと1510-Nの一次配列併置の結果から、S97に相当する位置に全てのセリンプロテアーゼでSer残基が保存されていた。これらの結果より1510-Nがタンパク質分解酵素であることが証明された。また、S97残基が反応中心を構成する可能性が示された。
図5Aに示すように、1510-NはFITC-カゼインにエンド型に作用し、20kDaの主産物とボトムに泳動される小分子量FITC-ペプチドを生産した。また、図5Bに示すように、エンド型切断産物は経時的に増加した。さらに、図6Aに示したように、本酵素の至適pHは5〜6であった。また、図6Bに示したように、本酵素活性は50〜98℃まで温度に依存して増加し、至適温度は98℃以上と考えられた。
1510-N酵素の触媒候補残基におけるAla置換体を作製し、FITC-カゼインに対する活性(% cleavage値)を時間に対してプロットした(図7A)。また、図7Aを基に、四つの異なる酵素量に対して% cleavage/time/enzyme値(%/min/μg)を計算し、平均値を野生型酵素と比較して図7Bに示した。この結果から、S97A, K138A, D168A, T62Aの活性が野生型の各々0.08%,1.2%, 3.2%, 5.5%となった。また、1510-N分子に存在する唯一のHis残基の置換体H107Aは全く活性が減少しなかった。このことは、1510-N酵素がcatalytic triad (Ser, His, Asp) を有する典型的なセリンプロテアーゼではないことを示した。以上のことから、1510-N酵素は活性中心がS97とK138のcatalytic dyadで構成されるエンド型セリンプロテアーゼと考えられた。さらに、この事実は、典型的なセリンプロテアーゼ阻害剤であるPMSFやDCIがほとんど阻害効果を示さない実験結果からも支持された。
1510-Nプロテアーゼの酸一次配列特異性を調べるために、いくつかにタンパク質を基質として用いた。α-カゼイン、β-カゼイン、1511-C、1511-N(1511のN末ドメイン(69〜234))、1510-C(1510のC末ドメイン(371〜441))の内でα-カゼインと1511-Cが良い基質であり、特異的分解産物が検出された(図8A,B)。α-カゼインから、主産物であるα-13k(α-カゼイン由来の13kDa断片を意味する。)とα-14kが得られた。1511-Cからは1511-10k(1511-C由来の見かけ上10kDa断片を意味する。)が得られた。さらに、マイナー産物であるα-20kとβ-12k断片は各々α-カゼインとβ-カゼインから得られた。一方、1511-Nと1510-Cは全く分解されなかった。ここで得られた特異的分解産物のN末アミノ酸配列を解析し、その基質特異性を表1に示した。
Ser2-Asp222はパイロコッカス・ホリコシ由来である。
His225-His230はヒスタグである。
配列番号2:配列番号1の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
配列番号5〜8:プライマー。
Claims (8)
- 配列番号9に示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼ活性を有するポリぺプチド。
- 配列番号1に示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼ活性を有するポリペプチド。
- 配列番号9または1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膜タンパク質ストマチンの多量体化に関与する疎水性アミノ酸配列を特異的に認識し限定分解するプロテアーゼ活性を有するポリペプチド。
- 以下のプロテアーゼ活性をもつ(A)又は(B)のポリペプチドをコードするDNA。(A)配列番号9又は1に示されるアミノ酸配列をからなるポリぺプチド。
(B)配列番号9又は1に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、膜タンパク質ストマチンの多量体化に関与する疎水性アミノ酸配列を特異的に認識し限定分解するプロテアーゼ活性を有する、ポリペプチド。 - 配列番号2又は10に示される塩基配列からなるDNA。
- 請求項4又は5又に記載のDNAを含む発現ベクター。
- 請求項6に記載の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞。
- 請求項7記載の宿主細胞を培養し、プロテアーゼ活性を有するポリペプチドを回収することを含む、請求項1〜3のいずれかに記載のプロテアーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
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