JP2003259876A - 変異制限酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 安定性の向上した制限酵素、特に安定性が向
上したＢａｍＨＩ制限酵素を提供すること。 【解決手段】 特定配列で示されるアミノ酸配列又は該
アミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するアミ
ノ酸配列において、上記特定アミノ酸配列の５０位及び
１８６位に対応するアミノ酸をそれぞれシステインに置
換した配列を有する変異ＢａｍＨＩ制限酵素、これをコ
ードする核酸分子、該分子を含むベクター、該ベクター
を含む形質転換細胞。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、安定性の向上した
変異ＢａｍＨＩ制限酵素、当該酵素をコードする核酸分
子、該核酸分子を含むベクター及び該ベクターにより形
質転換された細胞及び上記変異ＢａｍＨＩ制限酵素の製
造方法、並びに当該酵素を含む制限酵素試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】数多くの酵素が研究分野のみならず実際
の医薬品、化学、発酵および食品工業等において幅広く
使用されている。これらの酵素の有用性は、その極めて
高い基質特異性と効率的な触媒作用等によって特徴付け
ることができる。しかし、多くの場合酵素は、それを発
現する宿主に有利な生理的条件下でその最大触媒活性を
示すように設計されており、従って、一般的な環境下に
生息する生物由来の酵素がその至適活性を示す温度、ｐ
Ｈや溶媒条件の範囲は限られている。また、そのような
酵素は、一般に極端な環境条件下において極めて不安定
であり、多くの酵素が高温や高濃度の酸、アルカリ、或
いは溶媒処理で速やかに変性・失活することが知られて
いる。

【０００３】一方で、例えば高温下においても変性する
ことなく、その活性を維持するような酵素に対する産業
上の需要は大きい。特開平１１−０７５８５５公報には
「耐熱性Ｆ型ＡＴＰａｓｅ及びそれをコードする遺伝
子」が開示されており、当該耐熱性の酵素は、耐熱性の
試薬やバイオリアクターに有利に用いることができると
される。また、特開平１０−３２７８８７号公報におい
ては「組換え耐熱性トレハロースホスホリラーゼをコー
ドする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベ
クターを含む形質転換体とその産生物」が開示される。
該出願の開示によれば、従来の当該酵素の熱安定性は、
高いものでも５０℃以下と低く、一方で、工業的に酵素
反応で生産を行う場合、反応温度は雑菌汚染の低減等の
目的で５５℃以上の高温に設定するのが一般的であるか
ら、従来の酵素を工業的製造条件で利用するのは困難で
あったとされ、加えて、反応温度の高温化は基質と生産
物の溶解度を上げて単位体積当たりの仕込量を多くする
ことができ、且つ、酵素反応速度が早くなり反応時間の
短縮化ができる等の利点があるので、コスト的にも有利
であり、従って、工業的に使用される酵素は、一般的に
は熱安定性の優れたものが選ばれるとされている。更
に、特開平１０−２２５２９３号公報にも「耐熱性グル
コース−６−リン酸脱水素酵素遺伝子、新規な組み換え
体ＤＮＡ及び耐熱性グルコース−６−リン酸脱水素酵素
の製造法」として定量分析試薬や診断試薬として有用な
耐熱性グルコース−６−リン酸脱水素酵素の生産が開示
されている。その他にも、例えば、特開２００２−０５
１７８８号公報の「プライマーゼ活性を有する耐熱性酵
素」や特開２００１−３２１１７８の「耐熱性α−ガラ
クトシダーゼ」等、研究分野でのみならず工業上におい
ても有用な、高い安定性を示す酵素を天然界に求める研
究・開発は、近年、ますます活発になっている。

【０００４】また、好熱性細菌サーマス・アクアティカ
ス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から単離さ
れた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを利用したＰＣＲ（Ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）と
いう新たな方法論の出現により遺伝子工学が飛躍的に進
歩したことも忘れることはできない。

【０００５】ここで、上述の従来技術は、主に、本来か
ら高い構造安定性、特に耐熱性を示す酵素を利用するこ
とに関してであるが、一方で、本来はそのような安定性
を示さない酵素を遺伝子工学的に改変し、本来の酵素が
有さないような安定性を導入しようという試みもなされ
始めている。そのような例としては、特開平１１−００
９２７１号公報「改変ピラノース・オキシダーゼ、改変
ピラノース・オキシダーゼ遺伝子、新規な組み換え体Ｄ
ＮＡ及び改変ピラノース・オキシダーゼの製造法」や特
開平２０００−２４５４６６号公報「変異α−アミラー
ゼ」があげられる。しかしながら、遺伝子工学を適用し
たタンパク質や酵素の安定化に関する一般的な方法論は
存在していないのが現状である。

【０００６】特に、遺伝子工学において不可欠な試薬で
ある制限酵素、殊にＢａｍＨＩに関しては、安定性の向
上した変異制限酵素の作製について何ら報告されていな
い。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、安
定性の向上した制限酵素、特に安定性が向上したＢａｍ
ＨＩ制限酵素を提供することを目的とする。ＢａｍＨＩ
制限酵素は、バチルス・アミロリクエフェイシエンス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）Ｈ株由来の６塩基認識ＩＩ型制限酵素であるが、
その安定性は高いものではなく、例えば６５℃１５分間
の熱処理にて完全に失活することが知られている。本発
明は、特に当該酵素の耐熱性を含めた安定性の向上を目
的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】ＢａｍＨＩ制限酵素の安
定性は、天然型ＢａｍＨＩ制限酵素のアミノ酸配列中５
０位に位置するスレオニンと１８６位に位置するセリン
をそれぞれシステインに置換することで、飛躍的に向上
することが見いだされた。すなわち、ＢａｍＨＩ制限酵
素の安定性向上は、その原型となるＢａｍＨＩ制限酵素
（以下、「原型ＢａｍＨＩ」と略す。）において、天然
型ＢａｍＨＩ制限酵素の５０位及び１８６位に対応する
アミノ酸をシステインに置換することにより達成され
る。従って、本発明の第１は、（１）配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列に対して７０％以
上の相同性を有するアミノ酸配列において、配列番号１
のアミノ酸配列の５０位及び１８６位に対応するアミノ
酸をそれぞれシステインに置換した配列を有する変異Ｂ
ａｍＨＩ制限酵素、である。

【０００９】当該酵素をコードする核酸分子は、例え
ば、当該酵素の製造に好適に用いることができ、従っ
て、本発明の第２は、（２）上記（１）に記載の変異Ｂ
ａｍＨＩ制限酵素をコードする核酸分子、である。

【００１０】上記（２）の核酸分子、好ましくはＤＮＡ
は、好適なベクターに組み込むことができ、当該核酸分
子を組み込んだベクターを用いて宿主細胞を形質転換
し、該細胞物の培養物から本発明の変異ＢａｍＨＩ制限
酵素を得ることもできる。従って、本発明の第３乃至５
は、（３）上記（２）に記載の核酸分子を含むベクタ
ー、（４）上記（３）に記載のベクターを含む形質転換
細胞。

【００１１】（５）上記（４）に記載の形質転換細胞を
培養し、当該培養物から変異ＢａｍＨＩ制限酵素を回収
することを特徴とする、変異ＢａｍＨＩ制限酵素の製造
方法、である。

【００１２】更に、上記（１）記載の制限酵素は、高い
安定性を示すので、その精製や保存、また使用において
も高い利便性を有し、加えて、当該酵素を含む制限酵素
試薬は新たな遺伝子工学手法に応用されうる。従って、
本発明の第６では、（６）上記（１）に記載の変異Ｂａ
ｍＨＩ制限酵素を含む制限酵素試薬、が提供される。

【００１３】

【発明の実施の形態】変異ＢａｍＨＩ制限酵素 本発明の変異ＢａｍＨＩ制限酵素は、原型ＢａｍＨＩの
アミノ酸配列中、天然型ＢａｍＨＩ制限酵素の５０位ス
レオニン及び１８６位セリンに対応する位置に存在する
アミノ酸をそれぞれシステインに置換したことで特徴付
けられる。ここで、本明細書中で用いる「原型ＢａｍＨ
Ｉ」の用語は、本発明の変異が導入されるべきタンパク
質を指し、天然型ＢａｍＨＩ制限酵素のみならず、実質
的に本来のＢａｍＨＩ制限酵素活性を示す範囲におい
て、天然に存在するあらゆる突然変異体、或いは人為的
に作製された変異体をも含む。人為的な変異体において
は、例えば、Ｎ−またはＣ−末端アミノ酸配列は削除さ
れるか、或いは、それらは適切な宿主における原型Ｂａ
ｍＨＩの分泌を改良する各種の既知のプレ−またはプレ
プロ−ペプチド（シグナルペプチド）によって置換され
得る。また、原型ＢａｍＨＩは融合タンパク質の形態で
あってもよく、特定のリガンドに対する高い親和性（た
とえばストレプトアビジン、マルトース結合タンパク
質、セルロースおよび他の多糖類結合ドメイン）等の、
他の有用な機能を提供するドメインに融合していてもよ
い。

【００１４】従って、本発明のシステイン置換による安
定化は、天然型ＢａｍＨＩ制限酵素のアミノ酸配列に対
して７０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有するよ
うな原型ＢａｍＨＩに対して適用可能である。また、天
然型に対して８０％、９０％や９５％のアミノ酸配列相
同性を示すものも原型ＢａｍＨＩとして好適である。な
お、ここでいうアミノ酸配列の相同性は、プログラムの
デフォルトパラメータ（マトリクス＝Ｂｌｏｓｕｍ６
２；ギャップ存在コスト＝１１、ギャップ拡張コスト＝
１）を用いた検索で、インターネットサイトｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎ／ｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｇ
ｉ−ｇｉｎ／ＢＬＡＳＴで実装可能なＢＬＡＳＴＰアル
ゴリズムによって示される陽性のパーセンテージとして
定義できる。また、天然型ＢａｍＨＩ制限酵素のアミノ
酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、
置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し且つＢａｍ
ＨＩ活性を示すタンパク質も原型ＢａｍＨＩとなりうる
ことはいうまでもない。

【００１５】本発明の変異ＢａｍＨＩ制限酵素は、それ
自体公知の異なるいくつかの方法論を適用することによ
り製造することが可能である。たとえば、配列番号３
（配列表フリーテキスト：５０位（ＴｈｒからＣｙｓ）
及び１８６位（ＳｅｒからＣｙｓ）に置換を有するＢａ
ｍＨＩ）に示されるアミノ酸配列をもとにして、ペプチ
ド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３０Ａ
型、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｊａｐａｎ社製）を使用
した化学合成法によって本発明の変異ＢａｍＨＩ制限酵
素を製造し得る。また、変異ＢａｍＨＩ制限酵素は、遺
伝子工学的手法によっても好適に製造することができ
る。例えば、変異ＢａｍＨＩ制限酵素をコードする遺伝
子を得、次いで、これを含有するベクターを作製し、該
ベクターを用いて宿主を形質転換するか、染色体相同組
換えにより形質転換体を得、これを培養することによっ
て製造される。好ましい方法は、原型ＢａｍＨＩをコー
ドするＤＮＡ（例えば、天然型ＢａｍＨＩ制限酵素に関
しては配列番号２）を含むベクター（プラスミド）にお
いて、所定の２カ所のアミノ酸がシステインで置換され
るような部位特異的変異を導入する。当該変異が導入さ
れたベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた
形質転換細胞の培養物から本発明の変異ＢａｍＨＩ制限
酵素を得ることもできる。当該方法の詳細については後
述する。

【００１６】変異ＢａｍＨＩ制限酵素をコードする核酸
分子 上記の通り、本発明の変異ＢａｍＨＩ制限酵素は、当該
酵素をコードする核酸分子を用いて好適に製造すること
ができる。該核酸分子は、原型ＢａｍＨＩのアミノ酸配
列において、天然型ＢａｍＨＩ制限酵素のアミノ酸配列
の５０位及び１８６位に対応する位置のアミノ酸をそれ
ぞれシステインに置換したことで特徴付けられる変異Ｂ
ａｍＨＩ制限酵素をコード化する。従って、原型Ｂａｍ
ＨＩにおける当該位置のアミノ酸がスレオニンであれ
ば、当該位置のスレオニンに対するコドン（例えば、ａ
ｃｃ）はシステインのコドン（例えば、ｔｇｃ）に、
又、当該アミノ酸がセリンであればコドンは、例えばｔ
ｃｔ（セリン）からｔｇｔ（システイン）に変換され
る。なお、本明細書中「核酸分子」という用語は、ｃＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成（たとえば化学合成また
は修飾）ＤＮＡを含む、ＲＮＡとＤＮＡの両方を意図す
る。本発明の核酸分子は、二重鎖でも単鎖でもよい。単
鎖の場合、核酸はセンス鎖またはアンチセンス鎖でもよ
い。また、場合によっては、ホースラデッシュペルオキ
シダーゼなどの酵素や放射性同位体、Ｃｙ３やＣｙ５等
の蛍光物質、化学発光物質等により標識されていてもよ
い。

【００１７】このような核酸分子、特にＤＮＡは、例え
ば、配列番号４（配列表フリーテキスト：５０位（Ｔｈ
ｒからＣｙｓ）及び１８６位（ＳｅｒからＣｙｓ）に置
換を有するＢａｍＨＩをコードするＤＮＡ）に記載の塩
基配列の基づいて、ホスホアミダイド法等の化学的合成
手段により調製することも可能であり。また、原型Ｂａ
ｍＨＩを発現する生物に対し、例えばヒドロキシルアミ
ンや亜硝酸などの化学的変異剤で突然変異を誘発し、変
異株の中から、例えば、配列番号４記載の塩基配列の１
３１乃至１５８及び５４１乃至５６６の配列をもとにし
て作製したプローブにより、本発明の核酸分子を含む変
異種を取得することもできる。当該変異種からの核酸分
子の抽出、精製は当業者によく知られているいずれの方
法を用いてもよく、当該配列はジデオキシ法（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １０１， ２
０−７８， １９８３）等により確認することができ
る。

【００１８】より好ましい核酸分子の調製方法は、遺伝
子工学的な手法を用いて、原型ＢａｍＨＩをコードする
遺伝子に対し部位特異的変異を導入する方法である。す
なわち、例えば配列番号４で示される塩基配列の一部、
好ましくは、配列番号５及び配列番号６で示される変異
導入用のプライマーを用いて、鋳型となる原型ＢａｍＨ
Ｉをコードする塩基配列を置換して部位特異的変異を導
入する。部位特異的変異の方法としては一般的に行われ
ている方法であればいずれも用いることができるが、例
えばＴａＫａＲａ社のＳｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍ
ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ｍｕｔａｎ−Ｓ
ｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ ＫｉｔやＬＡ ＰＣ
Ｒ（商標） ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ Ｋｉｔ等を用いることも可能である。このようにし
て得られた核酸分子は、以下に示すベクターの作製に使
用することができる。

【００１９】なお、本発明の変異ＢａｍＨＩ制限酵素
は、本明細書に具体的に例示されるものの他、遺伝子コ
ードの縮重により、他の多くのヌクレオチド配列により
コードされることも可能であり、発現系によっては、そ
の宿主において最も使用頻度が高いコドンなどが有利に
用いられ得る。これら縮重配列を有するものも本発明の
核酸分子に含まれることはいうまでもない。

【００２０】ベクター及び形質転換細胞 本発明のベクターは、上記の変異ＢａｍＨＩ制限酵素を
コードする核酸分子、特にＤＮＡを含むプラスミドやウ
イルスであり得る。プラスミドの場合は、その自立的複
製を可能にする配列を有するものが好適である。選択マ
ーカーや他の修飾酵素を含むプラスミドも好ましい。発
現ベクターにおいては、変異ＢａｍＨＩ制限酵素をコー
ドするＤＮＡが、当該酵素の宿主における発現を制御す
る各種の配列に機能的に結合させられる。そのような制
御・調節配列には、構造性または調節プロモータ、転写
エンハンサ及びターミネータ、並びに転写抑制因子の結
合、アテニエーションまたはアンチアテニエーションな
どの既知の機構によってタンパク質の発現を調節するよ
うな他の配列が含まれる。ＳＶ４０またはアデノウイル
スの初期及び後期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、
ＴＡＣまたはＴＲＣ系、λファージの主要オペレーター
及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領
域、解糖系酵素（例えば、３−ホスホグリセレートキナ
ーゼ）に対するプロモーター、Ｐｈｏ５プロモーター、
酵母α接合系プロモーターなどが、その宿主細胞の性質
等に応じて利用可能である。ＤＮＡをベクターに導入す
る方法は公知である（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニュ
ーヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）。
すなわち、ＤＮＡとベクターをそれぞれ適当な制限酵素
で消化し、得られたそれぞれの断片をＤＮＡリガーゼを
用いてライゲーションさせればよい。

【００２１】本発明の形質転換細胞は、上記のベクター
によって形質転換させられた細胞である。形質転換後、
本発明の変異ＢａｍＨＩ制限酵素をコードする配列は、
その発現を制御する配列と一緒に、或いは単独で宿主の
ゲノムＤＮＡ内に取り込まれてもよい。

【００２２】様々な宿主・ベクター系が知られており、
例えば、細菌宿主に対してはコリシンＥ１型複製開始機
構を有するｐＢＲ３２２やｐＵＣ系ベクター、Ｍ１３等
のλファージ派生体、酵母細胞においては２μプラスミ
ド、真核宿主にはＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデ
ノウイルスおよびサイトメガロウイルスから得られる発
現制御配列からなるベクター、昆虫においてはｐＶＬ９
４１等があげられる。宿主細胞としては大腸菌、シュー
ドモナス属、バチルス属、真菌類、酵母、ＳＦ９等の昆
虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７等の動物細胞があげられる。
特に好ましい宿主・ベクター系は、大腸菌−枯草菌シャ
トルベクターｐＨＫ３００ＰＬＫと大腸菌Ｅ． ｃｏｌ
ｉＤＨ５αである。ベクターを宿主細胞に導入する方法
としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト
法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡ
Ｅデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイ
ルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増
刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年３月２０日発
行、羊土社、参照）があるが、いずれの方法を用いても
構わない。

【００２３】形質転換細胞を用いた変異ＢａｍＨＩ制限
酵素の製造 本発明の変異ＢａｍＨＩ制限酵素は、変異ＢａｍＨＩ制
限酵素が発現されるのに好適な条件下で上記の形質転換
細胞を培養することにより当該制限酵素を発現させ、そ
の培養物より当該酵素を回収することにより製造するこ
とができる。そのような培養条件は当業者によく知られ
ており、例えば、大腸菌などの細菌では、培地として、
酵母エキス、トリプトン、肉エキス、コーンステイープ
リカー、大豆粉等の１種以上の窒素源に、リン酸二水素
カリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化第二鉄、硫酸第二鉄もしくは硫酸マンガン等の無機
塩類の１種以上を添加し、更に必要によりブドウ糖や蔗
糖、モラセスなどの炭素源、ビタミン等の微量因子を適
宜添加したものが用いられる。培養は、２５〜４２℃で
６〜２４時間前後、通気撹拌培養や振とう培養、場合に
より静置培養等により実施するのが好ましい。

【００２４】培養物からの変異ＢａｍＨＩ制限酵素の精
製は、公知の方法やそれらを適宜組み合わせることによ
って行うことができる。例えば、培養により得られた菌
体を回収、超音波破砕して菌体抽出液を得、当該抽出液
を塩析、イオン交換やゲル濾過等の各種クラマトグラフ
ィーや透析、限外濾過処理等に付して、所望の比活性を
有するまで精製することができる。

【００２５】変異ＢａｍＨＩ制限酵素を含む制限酵素試
薬 本発明の変異ＢａｍＨＩ制限酵素は試薬の形態に調製さ
れ得る。当該試薬は、極めて優れた安定性を示すためそ
の生産のみならず、保存や使用に際しても極めて優れた
特性を有する。また、本発明の変異ＢａｍＨＩ制限酵素
の高い熱安定性により、遺伝子工学における新たな方法
の確立にも適用し得ると期待される。

【００２６】当該試薬は、水溶液の形態とするのが好ま
しく、当該試薬には所望の純度まで精製された本発明の
変異ＢａｍＨＩ制限酵素試薬が含まれる。試薬の溶媒と
しては各種の緩衝液、例えば燐酸緩衝液やクエン酸緩衝
液等を用いることができる。当該試薬は、必要により更
に助剤や保護剤、また試薬の用途によって他の酵素を含
んでもよい。当該試薬の製造方法は当業者にとってよく
知られている。また、当該試薬は、他の試薬と共にキッ
トの形をとってもよい。

【００２７】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
るが、実施例は本発明を何ら限定するものではない。

【００２８】

【実施例】実施例１ ＢａｍＨＩ制限酵素遺伝子の調製 配列番号２に示す塩基配列を有する天然型ＢａｍＨＩ制
限酵素遺伝子をバチルスアミロリクエフェイシエンス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）Ｈ株から調製した。当該菌株の全ＤＮＡは、培養
して得られた菌体を抽出用緩衝液に懸濁後、フェノール
・クロロホルム試薬にて精製し、エタノール沈殿により
抽出した。配列番号２に示す塩基配列を有するＢａｍＨ
Ｉ制限酵素遺伝子は、上記で得られた全ＤＮＡを鋳型と
して、常法によりＰＣＲを用いてＢａｍＨＩ制限修飾酵
素遺伝子（約２．６ｋｂ）として増幅し、調製した。

【００２９】実施例２ 制限酵素遺伝子への変異導入 天然型ＢａｍＨＩ制限酵素遺伝子への変異の導入はＴａ
ＫａＲａ社のＬＡ ＰＣＲ（商標） ｉｎ ｖｉｔｒｏ
Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて行い、変異
導入用鋳型プラスミドとしてはｐＨＹＭＣＲを用いた。
本プラスミドは、実施例１記載の方法により得られたＢ
ａｍＨＩ制限修飾酵素遺伝子を、大腸菌−枯草菌シャト
ルベクターｐＨＫ３００ＰＬＫ（ＴａＫａＲａ社製）の
ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連結して構築したキメラプラスミ
ドである。該プラスミドにおいて、まず、配列番号５に
示す変異導入プライマーを用いて、天然型ＢａｍＨＩ制
限酵素遺伝子（以下、「鋳型配列」）の５０位のスレオ
ニンをシステインに置換した。これをＴ５０Ｃと略記す
る。配列番号５は配列番号２の配列１３１〜１５８にお
いて、１４８〜１５０のスレオニンをコードするＡＣＣ
をＴＧＣに置換したものである。次いで、配列番号６に
示す変異導入プライマーを用いて、鋳型配列の１８６位
のセリンをシステインに置換した。配列番号６は配列番
号２の配列５４１〜５６６において、５５６〜５５８の
セリンをコードするＴＣＴをＴＧＴに置換したものであ
る。これにより、変異ＢａｍＨＩ制限酵素（以下「Ｔ５
０Ｃ／Ｓ１８６Ｃ」）をコードするＤＮＡを含む変異プ
ラスミドが得られた。尚、得られたプラスミドについて
塩基配列解析を行なって変異を確認した。

【００３０】実施例３ 酵素（Ｔ５０Ｃ／Ｓ１８６Ｃ）
の調製 本実施例においては、酵素を大腸菌により発現させて調
製した。ここで、Ｂｒｏｏｋｓ等により、大腸菌へのＢ
ａｍＨＩ制限酵素遺伝子の導入に際しては、あらかじめ
修飾酵素遺伝子の導入が必要であることが報告されてい
る（Ｊ．Ｅ．Ｂｒｏｏｋｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．，１９：８４１−８５０）。そこで、ＰＣＲ
により増幅させた修飾酵素遺伝子（約１．８ｋｂ）をｐ
ＵＣ１９ベクターのＨｉｎｄＩＩＩサイトに連結したキ
メラプラスミドｐＵＢＭＣ（４．４４ｋｂ）を構築し、
当該プラスミドによりあらかじめ形質転換された大腸菌
（Ｅ． ｃｏｌｉＤＨ５α）を制限酵素発現のための宿
主として用いた。すなわち、Ｅ． ｃｏｌｉＤＨ５αに
上記修飾酵素遺伝子による形質転換処理をあらかじめ施
し、更に実施例２で得られた変異プラスミド（ｐＨＹＭ
ＣＲ−Ｔ５０Ｃ／Ｓ１８６Ｃ）を導入し、液体培地（イ
ーストエクストラクト、０．５％；トリプトン、１％；
塩化ナトリウム、１％）を含む坂口フラスコ中で、３７
℃で２４時間、当該大腸菌を培養した。培養後、菌体を
洗浄、回収し、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ｐＭＳＦ、１０％グリ
セロールを含むリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．９に懸
濁した後、菌体の超音波破砕を行った。得られた菌体抽
出液を、順にＰ１１ Ｐｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓ
ｅカラム（Ｗｈａｔｍａｎ社製）、 Ｂｉｏ−Ｓｃａｌ
ｅ ＣＨＴ−Ｉ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅカラム
（ＢＩＯ ＲＡＤ社製）、ＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉ
ｎカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
製）に供し精製した。これらの精製には生体分子精製用
クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ（商標）ｅｘｐｌ
ｏｒｅｒ １０Ｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ社製）を使用した。得られた活性画分はＣＥＮＴＲ
ＩＣＵＴミニ（ＫＵＲＡＢＯ社製）により限外ろ過を行
い、濃縮することで濃度の調整を行った。

【００３１】なお、以下の熱安定性検定に使用した対照
の天然型ＢａｍＨＩ制限酵素も大腸菌により発現させて
調製したものを用いた。すなわち、修飾酵素遺伝子（約
１．８ｋｂ）を連結したキメラプラスミドｐＵＢＭＣ
（４．４４ｋｂ）によりあらかじめ形質転換された大腸
菌に、天然型ＢａｍＨＩ制限酵素をコードする変異前の
プラスミドｐＨＹＭＣＲを導入し、この系を天然型Ｂａ
ｍＨＩ制限酵素の発現系として該酵素を調製した。

【００３２】実施例４ 熱安定性の検定 実施例３で得られたＴ５０Ｃ／Ｓ１８６Ｃについて、次
に示す手法で熱安定性を検定した。対照としては、上記
の方法で大腸菌より調製した天然型ＢａｍＨＩ制限酵素
を用いた。

【００３３】酵素活性の測定法 各酵素の制限酵素活性及び蛋白量は以下に示す方法で測
定した。酵素活性測定は、基質ＤＮＡとしてｐＵＣ１９
を用いた当該基質の切断活性で測定した。すなわち、１
００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ
２−メルカプトエタノールを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝
液ｐＨ８．５中に酵素とｐＵＣ１９を混合した反応液を
用い、３７℃で３０分間反応を行なった後、切断された
ｐＵＣ１９と切断されなかったｐＵＣ１９の濃度比を電
気泳動写真からデンシトグラフ（ＡＴＴＯ社製）を用い
て定量することによって測定した。酵素の力価は１分間
に１μｇのｐＵＣ１９を完全に切断する酵素量を１単位
とした。蛋白量の測定は、牛血清アルブミンを標準とし
て、ＢＩＯ ＲＡＤ社のＰｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ
Ｋｉｔ を用いて定量した。

【００３４】安定性実験１ １００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ
２−メルカプトエタノールを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液ｐＨ８．５にあらかじめ２．５Ｕになるように酵素
を添加したものを５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９
０℃、１００℃にて５分ずつインキュベートした後に、
ｐＵＣ１９の切断活性を上記酵素活性の測定法に示す方
法で測定した。活性強度を１００％を＋＋、５０％以上
を＋、５０％未満を±、５％未満を−で示した。なお、
活性強度は、上記「酵素活性の測定法」の項に記載のと
おり、電気泳動写真からのデンシトグラフ（ＡＴＴＯ社
製）を用いて算出した（以下、同じ）。結果を表１に示
す。

【００３５】

【表１】 ６０℃、７０℃の処理後の残存活性は天然型では５０％
未満で、また８０℃、９０℃ではほとんど観察されない
のに対し、Ｔ５０Ｃ／Ｓ１８６Ｃでは９０℃の処理後で
も５０％以上の活性が確認された。なお、市販品（ＧＥ
ＮＥ ＪＡＰＡＮ社製）のＢａｍＨＩ制限酵素を対照と
して用いた場合も、上記天然型での結果と同様のものが
得られ、やはり市販品においても、６０℃、７０℃の処
理後の残存活性は５０％未満であり、また８０℃、９０
℃ではほとんどその活性が観察されなかった。

【００３６】安定性実験２ １００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ
２−メルカプトエタノールを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液ｐＨ８．５にあらかじめ２．５Ｕになるように酵素
を添加したものを６０℃にて０分、１５分、３０分ずつ
インキュベートした後に、ｐＵＣ１９の切断活性を上記
酵素活性の測定法に示す方法で測定した。活性強度を１
００％を＋＋、５０％以上を＋、５０％未満を±、５％
未満を−で示した。結果を表２に示す。

【００３７】

【表２】 表２に示すとおり、Ｔ５０Ｃ／Ｓ１８６Ｃの熱安定性
は、天然型及び市販品（ＧＥＮＥ ＪＡＰＡＮ社製）双
方より顕著に向上した。

【００３８】

【発明の効果】本発明の変異制限酵素は、特にその際だ
った熱安定性により、さまざまな分野、殊に、遺伝子工
学において極めて有用である。その高い安定性から、ｐ
Ｈや溶媒に対する安定性も向上していると期待され、そ
の有用性は多方面に及ぶ。

【００３９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Waseda University <120> Mutated Restriction Enzyme <130> WSD-7 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 213 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 1 Met Glu Val Glu Lys Glu Phe Ile Thr Asp Glu Ala Lys Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Lys Asp Lys Leu Ile Gln Gln Ala Tyr Asn Glu Val Lys Thr Ser 20 25 30 Ile Cys Ser Pro Ile Trp Pro Ala Thr Ser Lys Thr Phe Thr Ile Asn 35 40 45 Asn Thr Glu Lys Asn Cys Asn Gly Val Val Pro Ile Lys Glu Leu Cys 50 55 60 Tyr Thr Leu Leu Glu Asp Thr Tyr Asn Trp Tyr Arg Glu Lys Pro Leu 65 70 75 80 Asp Ile Leu Lys Leu Glu Lys Lys Lys Gly Gly Pro Ile Asp Val Tyr 85 90 95 Lys Glu Phe Ile Glu Asn Ser Glu Leu Lys Arg Val Gly Met Glu Phe 100 105 110 Glu Thr Gly Asn Ile Ser Ser Ala His Arg Ser Met Asn Lys Leu Leu 115 120 125 Leu Gly Leu Lys His Gly Glu Ile Asp Leu Ala Ile Ile Leu Met Pro 130 135 140 Ile Lys Gln Leu Ala Tyr Tyr Leu Thr Asp Arg Val Thr Asn Phe Glu 145 150 155 160 Glu Leu Glu Pro Tyr Phe Glu Leu Thr Glu Gly Gln Pro Phe Ile Phe 165 170 175 Ile Gly Phe Asn Ala Glu Ala Tyr Asn Ser Asn Val Pro Leu Ile Pro 180 185 190 Lys Gly Ser Asp Gly Met Ser Lys Arg Ser Ile Lys Lys Trp Lys Asp 195 200 205 Lys Val Glu Asn Lys 210 <210> 2 <211> 720 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 2 atggaagtag aaaaagagtt tattactgat gaagcaaaag aattactatc taaagataag 60 ttaattcaac aagcatacaa tgaagttaaa acatctattt gttcacctat ttggccagca 120 acctcaaaaa ccttcacgat taacaacacc gaaaagaatt gtaacggtgt agtaccaatt 180 aaagaactat gttacacctt acttgaagat acatataact ggtatagaga aaaacccctt 240 gatatactta aacttgaaaa gaaaaaaggt ggtccgattg atgtttataa agagttcata 300 gaaaacagtg aacttaaacg tgtaggtatg gaatttgaaa caggaaatat tagttctgcc 360 caccgttcaa tgaacaaact tctattagga ttaaaacatg gcgaaattga tttggctatt 420 atccttatgc ctattaaaca attggcctat tatcttacag atcgtgttac caatttcgag 480 gaattagaac cttattttga acttactgaa ggacaaccat ttatttttat tggatttaat 540 gctgaggctt ataattctaa tgtcccttta attcccaaag gttctgacgg tatgtcaaaa 600 cgctcaatta agaaatggaa agataaagtt gaaaacaaat agtttttggt aaagaggctt 660 cgatttttgg agtctttttt gttataaaaa tcgctgttcc cattatgaaa aaattgcggt 720 <210> 3 <211> 213 <212> PRT <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism:mutated ＢａｍＨＩ having replacements at position 50 (Thr to Cys) and position 186 (Ser to Cys) <400> 3 Met Glu Val Glu Lys Glu Phe Ile Thr Asp Glu Ala Lys Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Lys Asp Lys Leu Ile Gln Gln Ala Tyr Asn Glu Val Lys Thr Ser 20 25 30 Ile Cys Ser Pro Ile Trp Pro Ala Thr Ser Lys Thr Phe Thr Ile Asn 35 40 45 Asn Cys Glu Lys Asn Cys Asn Gly Val Val Pro Ile Lys Glu Leu Cys 50 55 60 Tyr Thr Leu Leu Glu Asp Thr Tyr Asn Trp Tyr Arg Glu Lys Pro Leu 65 70 75 80 Asp Ile Leu Lys Leu Glu Lys Lys Lys Gly Gly Pro Ile Asp Val Tyr 85 90 95 Lys Glu Phe Ile Glu Asn Ser Glu Leu Lys Arg Val Gly Met Glu Phe 100 105 110 Glu Thr Gly Asn Ile Ser Ser Ala His Arg Ser Met Asn Lys Leu Leu 115 120 125 Leu Gly Leu Lys His Gly Glu Ile Asp Leu Ala Ile Ile Leu Met Pro 130 135 140 Ile Lys Gln Leu Ala Tyr Tyr Leu Thr Asp Arg Val Thr Asn Phe Glu 145 150 155 160 Glu Leu Glu Pro Tyr Phe Glu Leu Thr Glu Gly Gln Pro Phe Ile Phe 165 170 175 Ile Gly Phe Asn Ala Glu Ala Tyr Asn Cys Asn Val Pro Leu Ile Pro 180 185 190 Lys Gly Ser Asp Gly Met Ser Lys Arg Ser Ile Lys Lys Trp Lys Asp 195 200 205 Lys Val Glu Asn Lys 210 <210> 4 <211> 720 <212> DNA <213> Unknown Organism <220> <223> Description of Unknown Organism:DNA coding for mutated ＢａｍＨＩ having replacements at position 50 (Thr to Cys) and position 186 (Ser to Cys) <400> 4 atggaagtag aaaaagagtt tattactgat gaagcaaaag aattactatc taaagataag 60 ttaattcaac aagcatacaa tgaagttaaa acatctattt gttcacctat ttggccagca 120 acctcaaaaa ccttcacgat taacaactgc gaaaagaatt gtaacggtgt agtaccaatt 180 aaagaactat gttacacctt acttgaagat acatataact ggtatagaga aaaacccctt 240 gatatactta aacttgaaaa gaaaaaaggt ggtccgattg atgtttataa agagttcata 300 gaaaacagtg aacttaaacg tgtaggtatg gaatttgaaa caggaaatat tagttctgcc 360 caccgttcaa tgaacaaact tctattagga ttaaaacatg gcgaaattga tttggctatt 420 atccttatgc ctattaaaca attggcctat tatcttacag atcgtgttac caatttcgag 480 gaattagaac cttattttga acttactgaa ggacaaccat ttatttttat tggatttaat 540 gctgaggctt ataattgtaa tgtcccttta attcccaaag gttctgacgg tatgtcaaaa 600 cgctcaatta agaaatggaa agataaagtt gaaaacaaat agtttttggt aaagaggctt 660 cgatttttgg agtctttttt gttataaaaa tcgctgttcc cattatgaaa aaattgcggt 720 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 ccttcacgat taacaactgc gaaaagaa 28 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 gctgaggctt ataattgtaa tgtccc 26

【図面の簡単な説明】

【図１】 天然型とT50C/S186Cの配列比較：図１はバチ
ルス・アミロリクエフェイシエンスＨ株由来の天然型Ｂ
ａｍＨＩ制限酵素及び本発明の変異ＢａｍＨＩ制限酵素
の例のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列（一文字表記）を示
す。第１列（ＤＮＡ及びアミノ酸配列）は天然型Ｂａｍ
ＨＩ制限酵素を、第２列（ＤＮＡ及びアミノ酸配列）は
本発明の変異ＢａｍＨＩ制限酵素の例をそれぞれ示す。
図中下線を付した配列は、変異導入用のプライマー配列
に対応し、置換したＤＮＡは大文字で示される。アスタ
リスクは終止コドン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/44 5/00 Ａ (72)発明者 神垣 清威 東京都新宿区大久保３丁目４番１号 早稲 田大学理工学部内 (72)発明者 栗村 啓之 東京都新宿区大久保３丁目４番１号 早稲 田大学理工学部内 (72)発明者 宇佐美 昭次 東京都新宿区大久保３丁目４番１号 早稲 田大学理工学部内 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA11 CA02 DA06 FA15 HA09 4B050 CC04 DD02 FF01 FF05 FF09 FF11 FF12 HH02 LL05 4B063 QA06 QQ34 QR14 4B065 AA15Y AA26X AB01 CA31

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列又は
   該アミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有するア
   ミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列の５０
   位及び１８６位に対応するアミノ酸をそれぞれシステイ
   ンに置換した配列を有する変異ＢａｍＨＩ制限酵素。
2. 【請求項２】 請求項１記載の変異ＢａｍＨＩ制限酵素
   をコードする核酸分子。
3. 【請求項３】 請求項２に記載の核酸分子を含むベクタ
   ー。
4. 【請求項４】 請求項３に記載のベクターを含む形質転
   換細胞。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の形質転換細胞を培養
   し、当該培養物から変異ＢａｍＨＩ制限酵素を回収する
   ことを特徴とする、変異ＢａｍＨＩ制限酵素の製造方
   法。
6. 【請求項６】 請求項１に記載の変異ＢａｍＨＩ制限酵
   素を含む制限酵素試薬。