JP2019511926A - ベータ−ラクタマーゼ変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ベータ−ラクタマーゼ活性を有する単離ポリペプチド及び該ポリペプチドをコードする核酸配列に関する。本発明の単離ポリペプチドは、改善された特性、例えば改善されたプロテアーゼ安定性、改善された固有安定性(例えば熱安定性など)、1つ以上のベータ‐ラクタム化合物(例えばベータ‐ラクタム系抗生物質など)に対する改善された活性、及び/又は宿主細胞における改善された産生などを伴う、VIM型サブグループに属するサブクラスB1メタロ‐ベータ‐ラクタマーゼである。
多くの抗菌製品、特に抗生物質を細菌感染の処置において使用してもよい。しかし、抗生物質は、感染部位で病原体を攻撃するだけでなく、健康な被験体、特に腸において見出すことができる正常な細菌叢にも影響を及ぼす。500を超える種からの10兆を上回る細菌で構成される結腸共生細菌叢(結腸微生物菌とも呼ばれる)の抗生物質による改変によって、副作用、例えば耐性菌の選択及び耐性菌による潜在的なコロニー形成、正常な消化プロセスの破壊、日和見腸内病原体(例えばクロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)など)による腸でのコロニー形成及び感染、抗生物質に関連付けられる下痢又は腸内菌共生バランス失調に関連する他の疾患などを招きうる。これらの副作用は、腸、特に回腸遠位部及び結腸において残留抗生物質を分解することが可能な酵素を投与することにより低下させることができる。このアプローチは、特にWO2004/016248又はUS20050249716に記載されている。
本発明は、VIM−2メタロ‐ベータ‐ラクタマーゼの新規変異体を提供する。具体的には、本発明は、ベータ−ラクタマーゼ活性を有するポリペプチドに関し、それは、配列番号1(その天然シグナルペプチドを伴わない野生型VIM−2の配列である)に示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明のポリペプチドは、野生型VIM−2酵素と比較し、以下の特性の1つ以上を有する:(i)改善されたプロテアーゼ耐性、特に消化プロテアーゼ耐性、(ii)改善された安定性、特に腸環境中での熱安定性及び/又は安定性、(iii)ベータ‐ラクタムに対する改善された作用スペクトル(即ち、変異体がより多数のベータ‐ラクタム化合物、特にベータ‐ラクタム抗生物質を加水分解することができる)、(iv)1つ以上のベータ‐ラクタム化合物(例、1つ以上のベータ‐ラクタム抗生物質)に対する改善された酵素活性、特に減少した抗生物質不活性化時間の変換、及び(v)改善された産生収率。より具体的には、本発明のポリペプチドは、位置34において、並びに位置22及び130より選択される少なくとも1つの位置において置換を含むVIM−2変異体であって、その位置は、配列番号1のVIM−2ベータ−ラクタマーゼのアミノ酸位置に対応する。
本発明は、VIM−2メタロ‐ベータ‐ラクタマーゼの新規変異体を提供する。従って、本発明のポリペプチドの配列は、配列番号1と比較して少なくとも2つのアミノ酸改変によりVIM−2とは異なる点において、配列番号1に示すVIM−2の配列と同一ではない。
Q22H、N;及び
Q34R;及び
E130D。
実施例1:VIM−2酵素の配列における目的の位置の決定
酵素活性、その基質プロファイル、宿主細胞におけるその安定性又はその産生レベルのいずれかに関連するアミノ酸位置を同定するために、ランダム変異誘発を使用して、最大12の変異を保有するblaVIM−2遺伝子のライブラリーを作製した。この目的のために、blaVIM−2変異体を、ヌクレオチド類似体の存在において、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応を使用して導入した。blaVIM−2由来のヌクレオチド配列を次に適切な大腸菌プラスミドベクターにクローニングし、種々の置換(blaVIM−2ヌクレオチド配列における変異の導入に由来する)を保有する酵素の特性を、変異体を産生する株についてのベータ‐ラクタムのMICの決定、種々のベータ‐ラクタムの分解のための特異的加水分解活性の決定、及び変異体酵素の安定性を使用して分析した。
VIM−2変異体を、Placプロモーターベースの系(Borgianni et al., Antimicrob. Agents Chemother.; 2010; 54:3197-3204に記載されるpLB−II高コピー数プラスミドを使用)又はT7プロモーターベースの発現系(pET−9a発現プラスミドを使用)を使用して大腸菌において産生した。簡単には、変異体blaVIM−2遺伝子を、NdeI及びBamHI制限部位を使用してプラスミドベクターpLB−II又はpET−9a中にクローニングし、結果として得られたプラスミドをエレクトロポレーションにより大腸菌DH5α又はBL21(DE3)細胞中に導入した。結果として得られた宿主細胞を、Luria−Bertani培地又は豊富な自己誘導性細胞培養培地ZYP−5052(Studier, F. W. 2005. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41:207-234.)中で24時間にわたり培養し、培養上清を遠心分離により清澄化した。結果として得られたサンプルを次に限外濾過により濃縮し、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに充填した。タンパク質を、線状NaCl勾配を使用して溶出し、活性画分をプールして濃縮した。タンパク質サンプルを次にゲル濾過カラムに充填し、タンパク質を、50μM ZnSO4を添加した50mM HEPES(pH7.5)を用いて溶出させた。精製タンパク質を次に1〜2mg/mLに濃縮して−20℃で保存した。
VIM−2変異体の安定性を測定するために、以下の手順を適用する:精製タンパク質サンプルのイミペネム加水分解活性を子豚又は成体豚から採取した回腸、空腸、及び盲腸環境中でのインキュベーション後に測定した。変異体についての特異的な活性(Sp. Act.)を、インキュベーションの間での異なる時点(0、30、60、90、120、及び240分)で測定した。時間tでの特異的な活性を、時間t=0での特異的な活性と比較し、腸環境中での変異体の活性の喪失を評価した。経時変化を、初期活性(t=0)とその後の時間に測定された活性との比率として表した((Sp. Act. Variant)t/(Sp. Act. Variant)t=0)。1より低い値は、腸環境中でインキュベートした場合の活性の喪失を示す。異なる時点での残留活性を比較し、野生型酵素と比較した、一部の変異体の腸内培地中でのより大きな安定性を評価する。
実施例3で述べたように産生された変異体酵素については、特定のベータ‐ラクタム化合物(例えばベータ‐ラクタム系抗生物質など)に対する特異的な活性を測定することが可能である。特異的な活性の評価は、以下に記載するように実施する:以前に記載されたように(Docquier J.-D. et al., J. Antimicrob. Chemother.; 2003; 51:257-266)、VIM−2変異体及び/又は精製VIM−2変異体を含む、対数増殖期又は定常増殖期の細菌培養物から調製した粗抽出物の存在下におけるベータ‐ラクタムの加水分解を適切な波長で分光光度的にモニタリングした。特異的な活性は、サンプル中の総タンパク質1mgあたり1分間毎に加水分解されたベータ‐ラクタム基質のnmolで表してもよい。
Claims (17)
- 配列番号1に対して少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ポリペプチドが位置34において、並びに位置22及び130より選択される少なくとも1つの位置において置換を含み、位置が、配列番号1において表される配列中の位置に対応する、ベータ−ラクタマーゼ活性を有するポリペプチド。
- ポリペプチドが、以下を含む、請求項1記載のポリペプチド:
−位置22及び34の各々での置換;
−位置34及び130の各々での置換;又は
−位置22、34、及び130の各々での置換。 - 以下より選択される少なくとも1つの改変を含む、請求項1又は2記載のポリペプチド:
Q22H又はQ22N;
Q34R;及び
E130D。 - 配列番号1の第1残基がメチオニン残基で置換されている、請求項1〜3のいずれか一項記載のポリペプチド。
- N末端にシグナルペプチドをさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のポリペプチド。
- 配列番号1に示される配列と比較してそのN末端又はC末端に切断を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のポリペプチド。
- −配列番号1の残基237〜240のC末端切断;
−配列番号1の残基236〜240のC末端切断;又は
−配列番号1の残基235〜240のC末端切断を含む、請求項6記載のポリペプチド。 - 配列番号3〜22のいずれか1つのアミノ酸配列又はベータ−ラクタマーゼ活性を有するその断片を、含むか又はそれからなる、請求項1〜6のいずれか一項記載のポリペプチド。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離された核酸配列。
- 適切な発現宿主中でポリペプチドの発現に向ける1つ以上の制御配列に動作可能に連結された、請求項9記載の核酸配列を含む核酸構築物。
- 請求項10記載の核酸構築物を含む組換え宿主細胞。
- 請求項1〜8のいずれか一項記載のポリペプチドを含む組成物。
- 経口投与可能であり、腸の所望の部分において、特に空腸、回腸、盲腸、又は結腸においてポリペプチドを放出することができる、請求項12記載の組成物。
- 別々、連続的、又は同時投与のために
(a)請求項1〜8のいずれか一項記載のポリペプチド又は請求項12〜13のいずれか一項記載の組成物;及び
(b)(a)の前記ポリペプチドに感受性である、又は(a)の組成物中に含まれるベータ‐ラクタム系抗生物質を含むパーツキット。 - 医薬としての使用のための請求項1〜8記載のポリペプチド。
- それを必要とする被験体においてベータ‐ラクタム系抗生物質を不活性化するための方法における使用のための、又はベータ‐ラクタム系抗生物質に感受性である細菌により起こされる細菌感染の処置のための方法における使用のための、請求項1〜8のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項12〜13のいずれか一項記載の組成物、請求項14記載のパーツキット、又は請求項11記載の組換え宿主細胞。
- ポリペプチド又は組成物又は宿主細胞が、ポリペプチドに感受性であるベータ‐ラクタム系抗生物質との組み合わせにおける使用のためである、細菌感染を処置するための方法における使用のための、請求項1〜8のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項12〜13のいずれか一項記載の組成物、請求項14記載のパーツキット、又は請求項11記載の宿主細胞。
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