KR101655385B1

KR101655385B1 - 극지세균 유래의 저온성 리파아제와 그 변이체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101655385B1
Application number: KR1020130124223A
Authority: KR
Inventors: 임정한; 김일찬; 한세종; 김덕규; 김한우; 위아람
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2013-10-17
Filing date: 2013-10-17
Publication date: 2016-09-08
Also published as: KR20150044760A

Abstract

본 발명은 극지세균 유래의 저온성 리파아제와 그 변이체 및 그의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 호냉성 박테리아 B. pumilus 유래의 저온에서 활성을 나타내는 리파아제와 그 리파아제 변이체 및 상기 리파아제의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 저온성 리파아제와 그 변이체는 일차적으로 지방분해를 위한 효과적인 가수분해 효소로 이용될 수 있으며, 세제 산업, 식품, 화장품, 의약, 피혁 및 바이오 디젤 생산에서 촉매로의 사용 등 다양한 산업분야에서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

극지세균 유래의 저온성 리파아제와 그 변이체 및 그의 용도 {Psychrophilic Lipase Derived from Arctic Bacterium and Mutant Thereof and Use of The Same}

본 발명은 극지세균 유래의 저온성 리파아제와 그 변이체 및 그의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 호냉성 박테리아 B. pumilus 유래의 저온에서 활성을 나타내는 리파아제와 그 리파아제 변이체 및 상기 리파아제의 용도에 관한 것이다.

리파아제(EC. 3.1.1.3)는 다양한 미생물뿐만 아니라 동물과 식물에서도 생성되는 효소로, 레기오 선택성과 거울상 선택성을 갖는 합성반응 및 가수분해와 관련된 촉매활성으로 인해 (Gupta et al ., Appl Microbiol Biotechnol 64(6):763-81, 2004), 생명공학 응용분야에서 매우 유용하다. 응용분야로는 세제, 식품, 제약, 피혁, 섬유 및 바이오디젤 생산에서 촉매로 이용 가능하다.

세균성 리파아제는 현재 8개의 패밀리로 분류되고, 가장 큰 패밀리인 리파아제 패밀리 I은 6개의 서브패밀리가 있으며, 그 중 바실러스 리파아제는 서브패밀리 4와 5에 속한다. 이들은 활성부위 세린 잔기 주위의 펜타펩타이드 보존염기 G-X-S-X-G의 첫 글라이신이 알라닌으로 치환된 것이 보통이며, 서브패밀리 4 리파아제는 B. subtilis , B. licheniformis 및 B. pumilis 유래로 알려져 있다.

저온성 효소는 세제 첨가물, 저온에서 불안정한 화합물의 생체변형을 위한 생체촉매반응 및 저온에서 생물학적 오염된 폐수와 토양에 유용하게 사용된다(Joseph B et al ., Biotechnol Adv 26(5):457-70, 2008).

저온성 리파아제는 5℃ 근처 저온 환경에서 사는 미생물에 넓게 분포하므로, 본 발명에서는 호냉성 박테리아를 북극해에서 분리한 후, 분리한 세균에서 저온 활성이 있는 리파아제를 분리하였다. TCN이 포함된 배지에서 스크리닝 한 균주는 매우 높은 지방분해 활성을 가진 B. pumilus로 확인되었으며, B. pumilus로부터 리파아제 유전자를 클로닝하고 대장균에서 재조합 효소를 발현시켜 특성을 확인하였다. 또한, 리파아제 변이체의 구조모델로부터 기능적 예측을 하고 효소활성 특성을 확인하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 저온성 리파아제, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 저온성 리파아제 변이체, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하여 리파아제를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 리파아제를 회수하는 단계를 포함하는 저온성 리파아제를 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 리파아제 또는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 139번 아미노산이 다른 아미노산으로 변환된 리파아제 변이체 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 리파아제 또는 그 변이체를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 리파아제 또는 그 변이체를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 리파아제 또는 그 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 저온성 리파아제의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 저온성 리파아제와 그 변이체는 일차적으로 지방분해를 위한 효과적인 가수분해 효소로 이용될 수 있으며, 세제 산업, 식품, 화장품, 의약, 피혁 및 바이오 디젤 생산에서 촉매로의 사용 등 다양한 산업분야에서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 B. pumilus ArcL5 유래의 리파아제 BpL5와 다른 바실러스 유래의 서브패밀리 4 리파아제와의 아미노산 서열 비교 분석 결과이다. CLUSTAL W 프로그램을 사용하였으며, 동일한 잔기는 점으로 표시하였다. 활성부위의 주요 3부분은 붉은 점으로 표시했으며, 붉은 화살표로 표시된 부분은 돌연변이 잔기이다.
도 2는 E. coli BL21(DE3)pLysS에서 BpL5 효소의 발현을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. 오른쪽은 정제된 BpL5 효소이다. 1: 세포 펠렛, 2: 배양액, 3: 불용성 세포 용해물, 4: 수용성 세포 용해물.
도 3은 리파아제 활성에 대한 pH의 영향을 분석한 결과이다. PNP-C8 기질을 사용하여 다양한 pH에서 효소활성을 측정하였다. -●-Sodium acetate (pH 4.0-5.6), -■- PBS (pH 5.2-7.45), -◆- Tris-HCl (pH 8.0-9.0)
도 4는 BpL5 (yellow)의 구조모델과 B. subtilis 리파아제의 결정구조 (cyan)를 비교한 결과이다. Ser77, Asp133 및 His156의 catalytic triad 잔기는 스틱모델로 표시되었다. 돌연변이의 구조적 위치는 B. subtilis 리파아제의 Tyr139에 해당하는 잔기와 함께 스틱모델로 표시되었다.
도 5는 와일드타입과 변이체의 온도에 의한 변성과 활성에 대한 영향을 분석한 결과이다 (-●- WT, -○- S139A, -▼- S139Y). 20℃에서 와일드타입의 활성을 100%로 한 상대적 활성을 비교하였다. 단백질의 온도에 의한 변성은 pH 8.0에서 UV 원편광 이색성 분광측정법(220nm)으로 측정하였다.
도 6은 와일드타입과 변이체의 2차 구조를 분석한 결과이다. 2차 구조는 190-260nm에서 10번 스캔 한 평균으로 측정되었다.
도 7은 와일드타입과 변이체의 기질 특이성을 분석한 결과이다. PNP-기질인 p-nitrophenyl butylate(C4), p-nitrophenyl caprylate(C8), p-nitrophenyl laulate(C12) 및 다양한 중성지방에 대한 효소 활성을 pH-STAT 방법 (1% 각각의 오일과 1X 아라비아고무 용액이 포함된 기질용액)으로 측정하였다. 효소반응은 30℃에서 3분간 실시하였다. 검은색: 와일드타입, 회색: S139A, 흰색: S139Y.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 북극 척키해 해수에서 분리한 지방분해 활성을 가진 박테리아를 대상으로 저온활성을 포함한 리파아제를 생산하는 해양미생물 Bacillus pumilis을 분리하고, B. pumilis ArcL5로 명명하였다. 상기 박테리아로부터 재조합 리파아제를 제조하기 위하여, ArcL5 균주의 유전자를 클로닝 한 후, 정제한 재조합 단백질은 BpL5로 명명하였다. BpL5의 분자량은 SDS-PAGE로 확인한 결과 약 15kDa이었고, 효소 활성의 최적온도 및 pH는 20℃ 및 pH9인 것으로 조사되었다. 또한, 점 돌연변이를 수행하여 S139A 및 S139Y 2개의 변이체를 제작하였으며, 이 변이체들은 효소활성이 향상된 것을 확인할 수 있었다.

본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 리파아제 또는 서열번호 1에서 139번 잔기 아미노산이 다른 아미노산으로 변환된 리파아제 변이체에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 변이체는 139번 세린 아미노산이 알라닌으로 변환된 S139A 리파아제 변이체 또는 139번 세린 아미노산이 타이로신으로 변환된 S139Y 리파아제 변이체인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 리파아제 또는 그 변이체를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 미생물을 배양하여 리파아제 또는 그 변이체를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 리파아제 또는 그 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 저온성 리파아제를 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, “벡터”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드” 및 “벡터”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 체한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 도는 링커를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환 되어야 한다. 형질전환은 Sambrook, et al ., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(Neumann, et al ., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현벡터가 사용될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다.

상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

[실시예]

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명 할 것이다.

실시예 1: 지방 분해 활성을 가진 저온성 세균의 분리와 확인

북극 척키해의 해수로부터 지방 분해 활성을 가지는 저온성 박테리아를 분리하기 위해, TCN이 포함된 배지에서 15℃로 배양하여 halo를 형성하는 콜로니를 선택하였다. 배지에서 선택된 가장 활성이 높은 박테리아 콜로니는 16S DNA 염기서열을 분석하여 Bacillus pumilis 인 것을 확인하였고, B. pumilis ArcL5로 명명하였다. B. pumilus 유래의 리파아제는 서브패밀리 4와 염기서열이 74% 일치하였으며, 서브패밀리 4 리파아제는 주로 Bacillus 종인 B. subtilis , B. pumilus 및 B. licheniformis로부터 유래한다 (Jaeger et al ., Curr Opin Biotechnol 13(4):390-7, 2002). 상기 박테리아들은 중온성 균주이지만, ArcL5는 중온보다는 15℃ 이하에서 더 잘 성장하였다.

실시예 2: 리파아제 유전자의 클로닝과 염기서열 분석

ArcL5 균주의 리파아제 유전자는 B. pumilus 리파아제 특이적인 프라이머(Bell et al ., Microbiology 148:2283-91, 2002)인 Bplip1-f(서열번호 3)과 Bplip1-r(서열번호 4)을 사용하여 클로닝 한 후, BpL5로 명명하였다. 19kDa의 단백질을 인코딩하는 ORF는 B. stratosphericus 리파아제와 94%로 가장 높은 유사성을 나타내며, 또한 B. pumilu 리파아제와도 높은 유사성을 나타내었다. Mature 형태의 리파아제는 B. subtilis와 81%, B. licheniformis와 65% 유사성을 나타내었으며, 서브패밀리 4의 펜타펩티드 보존염기 A-X-S-X-G는 ORF에서 A-H-S-M-G로 발견되었다(도 1). Mature 리파아제는 다른 바실러스 리파아제와 매우 유사하지만, 시그널 펩타이드 서열은 낮은 유사성을 나타낸다. 바실러스 리파아제는 라세미 기질에 대한 높은 활성으로 인해, 뛰어난 생물공학적인 잠재력을 가지고 있다(Detry et al ., Appl Microbiol Biotechnol 72(6):1107-16, 2006).

서열번호 3: 5'-GAGTCGATAAGATGAATAAGGGGGAATG-3'(Bplip1-f)

서열번호 4: 5'-TTAATTCGTATTTTGTCCTCCGCCGTTC-3'(Bplip1-r)

실시예 3: 리파아제 유전자의 발현 및 재조합 단백질의 정제

발현 벡터 pET22b와 호스트 균주 BL21(DE3)pLysS은 Novagen에서 구입 하였다. 발현 플라스미드 벡터는 2종류의 프라이머 세트로 설계하였고, 하나(pBpL5)는 시그널 펩타이드를 포함하는 전체 길이의 리파아제 유전자 발현을 위한 것과 다른 하나(pBpL5m)는 시그널 펩타이드 부분이 없는 mature 형태를 발현하기 위한 것이다. pBpL5는 ArcL5-f(서열번호 5)와 ArcL5-r(서열번호 6)의 프라이머로 증폭하였고, pBpL5m은 ArcL5-mf(서열번호 7)과 ArcL5-r(서열번호 6)의 프라이머로 증폭하였다.

서열번호 5: 5'-AAGAAGGAGATATACATATGAAAGTGATTTGTTTTAAGA-3'(ArcL5-f)

서열번호 6: 5'-GTGGTGGTGCTCGAGATTCGTATTTTGTCCTCCGC-3'(ArcL5-r)

서열번호 7: 5'-AAGAAGGAGATATACATATGGCTGAGCACAATCCGGTTG-3'(ArcL5-mf)

발현벡터가 함유된 E. coli BL21(DE3)pLysS 형질전환체는 암피실린이 포함된 LB배지에서 37℃로 하룻밤 배양한 후에 OD₆₀₀에서 0.6에 도달하면 0.1mM IPTG를 첨가하여 25℃로 하룻밤 배양하여 단백질 발현을 유도하였다. 발현이 유도된 재조합 단백질은 C-말단에 6xHis-tag 펩타이드가 융합되어 HisTrap HP 컬럼(GE Healthcare)에서 Ni-affinity 크로마토그래피와 gel filtration 컬럼을 통해 정제되었고, SDS-PAGE 분석에 의해 19kDa의 정제된 BpL5 단백질을 확인하였다.

실시예 4: 저온성 리파아제의 특성 분석

일반적으로 리파아제 활성은 PNP-C8을 이용하여 분광측정법으로 분석하며, 반응물은 100μM PNP-기질, 4% 에탄올, 20mM Tris-HCl 완충액(pH8.0) 및 효소용액으로, 효소 활성의 1unit는 분당 1μmol의 PNP를 분해하는 활성으로 정의하였다. 다양한 중성지방에 대한 리파아제의 활성은 pH-stat 기기(718 Titrino pH titrator, Metrohm, Switzerland)를 사용하여 기질 가수분해에 의한 프리 지방산을 적정하는 방법으로 수행하였으며, 분당 1μmol의 프리 지방산을 촉매하는 효소의 양을 1unit으로 정의하였다.

저온성 리파아제 효소는 pH9 근처에서 최적 활성을 나타내며(도 3), 활성의 최적 온도는 20℃이지만, 5℃에서도 높은 활성을 나타낸다(도 5). 다른 B. pumilus 리파아제 연구에서는(Bustos-Jaimes et al ., Biochim Biophys Acta 1804(12):2222-7, 2010) 이런 저온활성의 특성은 관찰되지 않았고, 남극 유래의 B. pumilus 리파아제는 40℃에서 가장 높은 활성을 나타내었다(Arifin et al ., J Microbiol Biotechnol 23(5):661-7, 2013).

효소의 활성과 안정성의 연관도을 분석하기 위해 분광측정법으로 220nm에서 리파아제의 온도 변성을 모니터링 하였으며, BpL5의 변성 전이의 중간 온도(Tm¹ ^/2)는 45℃였다(도 5). 일반적으로 중온 및 고온 효소의 최대 활성은 변성 온도에서 나타나지만, 저온성 효소의 경우 활성과 안정성의 온도가 일치하지 않는다. 이 현상은 저온성 효소의 구조적 유연성으로 인해 활성부위가 열에 불안정하기 때문이며, 활성부위의 유연성은 저온성 효소의 대표적인 특성이다(D'Amico et al ., J Biol Chem 278(10):7891-6, 2003).

실시예 5: 저온성 리파아제의 구조 예측 및 돌연변이 분석

B. pumilus ArcL5의 BpL5 단백질의 3D 구조모델을 I-TASSER로 예측하였으며(Zhang et al ,. Bioinformatics 9:40, 2008), 구조분석은 PROCHECK (Laskowski et al ., J Biomol NMR 8(4):477-86, 1996)를 이용하여 분석한 결과, B. subtilis 리파아제(PDB ID: 1i6w)와 매우 유사하였다(도 4).

점 돌연변이는 Quick-Change Mutagenesis method(Stratagene, USA)을 사용하여 위치 지정 돌연변이를 수행하여 제작하였으며, 변이체 효소의 발현과 정제는 상기 실시예 3의 방법으로 수행하였다. 와일드타입과 변이체의 단백질 변성은 Chirascan circular dichroism spectro polarimeter(Applied Photophysics, UK)로 모니터링 하였으며, 온도 변성 전이는 220nm로 파장을 고정하고 온도를 20℃에서 70℃까지 2℃씩 증가시키며 모니터링 하였다.

그 결과, Ser139 잔기는 기질 결합 반응과 연관된 기능을 할 것으로 예상되며, 서브패밀리 4의 서열과는 일치하지 않는다(도 1). 돌연변이 분석을 위해 S139A와 S139Y 2개의 변이체를 제작하였고, 돌연변이로 인해 최적온도와 pH는 변하지 않았다. 원편광 이색성 분광 측정법으로 구조분석 결과 S139A 변이체는 와일드타입과 비슷하지만, S139Y 변이체는 와일드타입의 패턴과 차이를 나타내 돌연변이로 인해 구조가 변한 것을 알 수 있었다. 단백질 변성 모니터링에서도 S139A 변이체는 와일드 타입과 같은 45℃를 나타냈지만, S139Y 변이체는 온도 안정성이 40℃로 약간 낮아졌다(도 5). 이 결과 역시 구조의 부분 변화로 인한 것으로, S139A는 PNP-기질과 중성지방 두가지에 대해 활성이 향상되었고, S139Y 변이체는 TCN 대한 활성이 와일드 타입보다 오히려 높아졌다(도 7).

<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> Psychrophilic Lipase Derived from Arctic Bacterium and Mutant Thereof and Use of The Same <130> P13-B258 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 181 <212> PRT <213> Bacillus <400> 1 Ala Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Met Gly Gly Ala Ser 1 5 10 15 Tyr Asn Phe Ala Ser Ile Lys Ser Tyr Leu Val Thr Gln Gly Trp Asp 20 25 30 Arg Asn Gln Leu Phe Ala Ile Asp Phe Ile Asp Lys Thr Gly Asn Asn 35 40 45 Arg Asn Asn Gly Pro Arg Leu Ser Arg Phe Val Lys Asp Val Leu Gly 50 55 60 Lys Thr Gly Ala Lys Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser Met Gly Gly 65 70 75 80 Ala Asn Thr Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asp Lys Ile 85 90 95 Glu Asn Val Val Thr Leu Gly Gly Ala Asn Gly Leu Val Ser Leu Arg 100 105 110 Ala Leu Pro Gly Thr Asp Pro Asn Gln Lys Ile Leu Tyr Thr Ser Val 115 120 125 Tyr Ser Ser Ala Asp Met Ile Val Val Asn Ser Leu Ser Arg Leu Ile 130 135 140 Gly Ala Arg Asn Val Leu Ile His Gly Val Gly His Ile Ser Leu Leu 145 150 155 160 Ala Ser Ser Gln Val Lys Gly Tyr Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly 165 170 175 Gly Gln Asn Thr Asn 180 <210> 2 <211> 648 <212> DNA <213> Bacillus <400> 2 atgaaagtga tttgttttaa gaaaaagagt ttgcaaattc ttgttgccct tgccttagtg 60 ataggttcaa tggccttcat ccagccgaaa gaaatcaaag cggctgagca caatccggtt 120 gtgatggtgc atggtatggg aggagcgtct tacaacttcg cttcgattaa aagttacttg 180 gtcacacaag gctgggatcg aaatcaatta tttgctatcg atttcataga caaaacaggg 240 aataaccgca acaatggccc gcgtctatct agattcgtca aagatgtgct aggcaaaaca 300 ggtgccaaaa aagtagatat tgtggcacat agtatgggcg gagcgaacac gctatactat 360 attaagaatc tagacggcgg tgataaaatt gaaaacgtcg tcacacttgg tggagcgaat 420 ggactcgttt cactcagagc attaccaggc accgatccaa atcaaaaaat tctttataca 480 tctgtctata gctcagccga tatgattgtt gtcaacagcc tctcgcgttt aattggcgca 540 agaaatgtcc tcattcacgg cgttggtcac atcagtctat tagcttcaag ccaagtcaaa 600 gggtatatca aagaaggact gaacggcgga ggacaaaata cgaattaa 648 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bplip1-f <400> 3 gagtcgataa gatgaataag ggggaatg 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bplip1-r <400> 4 ttaattcgta ttttgtcctc cgccgttc 28 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ArcL5-f <400> 5 aagaaggaga tatacatatg aaagtgattt gttttaaga 39 <210> 6 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ArcL5-r <400> 6 gtggtggtgc tcgagattcg tattttgtcc tccgc 35 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ArcL5-mf <400> 7 aagaaggaga tatacatatg gctgagcaca atccggttg 39

Claims

삭제
서열번호 1의 아미노산 서열에서 139번 세린이 알라닌 또는 타이로신으로 변환된 리파아제 변이체.
삭제
제2항의 리파아제 변이체를 코딩하는 유전자.
제4항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
제4항의 유전자가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물.
제5항의 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물.
제6항의 재조합 미생물을 배양하여 리파아제 변이체를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 리파아제 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 저온성 리파아제의 제조방법.
제7항의 재조합 미생물을 배양하여 리파아제 변이체를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 리파아제 변이체를 회수하는 단계를 포함하는 저온성 리파아제의 제조방법.