CN110036109A - 新颖的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶 - Google Patents

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Abstract

提供了一种新颖的内‑β‑N‑乙酰基氨基葡糖苷酶，其分离自属于根毛霉菌属的真菌且在高温条件下是有活性的；其各种突变体酶；编码所述酶的基因；重组质粒；通过所述重组质粒转化的转化体；等。

Description

新颖的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶
技术领域
本发明涉及在高温条件下有活性的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶、编码所述酶的基因、重组质粒、用所述质粒转化的转化体等。
背景技术
糖蛋白广泛地存在于动物和植物的组织、真核微生物的细胞膜和细胞壁等中。近年来，已经揭示糖蛋白中的糖链在诸如细胞分化、致癌作用和细胞间识别等机制中具有重要作用。为了阐明这些机制，已经进行了对糖链的结构和功能之间的关联的研究。在药物发现研究中，已经进行了尝试诸如糖链的重构（其中将包括抗体在内的糖蛋白中的糖链替换为均匀糖链结构）和肽或小分子的糖基化。这样的药物发现研究经常使用用酶（诸如内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶）从具有均匀糖链的天然存在的糖蛋白/糖肽切下来的糖链。
动物糖蛋白中的代表性糖链包括附着于天冬酰胺侧链的N-连接的糖链。N-连接的糖链根据它们的结构分类为高甘露糖型、杂合型和复杂型，但是具有壳二糖结构（其具有2个与还原端连接的GlcNAc残基）作为共同结构。内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶是具有以下活性的酶：水解所述壳二糖结构中的糖苷键的活性，和将切割的糖链转移到具有特定结构的受体上的转糖基活性。已经从多个生物物种分离出的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶具有各种不同的底物特异性。不同的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶已经被用于不同的目的。在这些中，已经报道使用复杂型糖链作为底物的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶包括如下所述的那些。
Endo-M是一种从冻土毛霉（Mucor hiemalis）衍生出的酶，当将对高甘露糖型Man8GlcNAc2的活性设定为100%时，该酶对复杂型双天线糖链（无半乳糖（agalacto）双天线PA糖）具有的底物特异性是4.4%的活性(非专利文献1: Fujita等人, (2004) ArchBiochem Biophy. 432: p41-49)。在相同文献中报道，在大肠杆菌（Escherichia coli）中在37℃的所有表达诱导中Endo-M被表达为不溶性聚集体，且诱导温度变成20℃导致可溶性级分中的低酶活性，因而在酵母中尝试了Endo-M的表达。因而，据信，难以在大肠杆菌中适当地表达Endo-M。还已知Endo-M在40℃或更高温度失活。
已经报道，Endo-Om是一种从酵母Ogataea minuta衍生出的酶(专利文献1:WO2013/051608或US2014-0313246)，该酶使用复杂型糖链作为底物且在水解反应中具有50℃的最适温度。Endo-Om在除了酵母以外的生物中的表达是未知的。
Endo-F2和Endo-F3是从Elizabethkingia miricola衍生出的酶(非专利文献2:Tarentino AL等人, (1993) J Biol Chem. 268: p9702-9708)。Endo-F2水解高甘露糖型和双天线复杂型糖链且对杂合型糖链没有水解活性。另一方面，Endo-F3水解双天线或三天线复杂型糖链且对高甘露糖型和杂合型糖链没有水解活性。
Endo-S（它是一种从酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）衍生出的酶）仅水解双天线复杂型糖链且对高甘露糖型和杂合型糖链没有水解活性(非专利文献3:Goodfellow JJ等人, (2012) J Am Chem Sci. 134: p8030-8033)。
Endo-CE（它是一种从秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）衍生出的酶）水解高甘露糖型和双天线复杂型糖链，且未知Endo-CE是否可以切割杂合型糖链(非专利文献4:Kato T等人, (2002) Glycobiology 12: p581-587)。据报道Endo-CE在水解反应中具有20℃的最适温度。
不同于到目前为止已知的Endo-M和Endo-Om，Endo-CC是一种据报道可以在大肠杆菌中表达的酶。非专利文献5 (Y. Eshima等人, (2015) PLoS One. 21; 10(7):e0132859)描述了以0.1 mg/250 mL培养物(= 0.4 mg/L培养物)的量在大肠杆菌中表达Endo-CC。据报道Endo-CC在水解反应中具有35℃的最适温度。
考虑到反应效率的提高和污染的防止，当将切割的糖链用作药物的原料时，在约50℃的高温有活性的酶是期望的。也就是说，当将多种重组物质用作药物的原料时，应当使用相同的宿主物种来减小药物中的安全性担忧。合乎需要的是，具有在大肠杆菌中以大于通常量生产的能力，因为大肠杆菌经常被选作用于生产这样的原料的宿主。但是，在已知的使用复杂型糖链作为底物的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶中尚未发现在高温下有活性且能够在大肠杆菌中以高收率生产的酶。
微小根毛霉(Rhizomucor pusillus, R. pusillus)是一种嗜热真菌，其具有35-45℃的最佳生长温度且已知是产生用于奶酪生产的凝乳酶（rennet）的真菌。在由TheGenozymes Project (Concordia University)提供的数据库中公开了微小根毛霉的基因组序列，包括来自微小根毛霉菌株CBS 183.67的序列信息。该数据库包括与Endo-M具有41.56%同源性的基因和由该基因编码的氨基酸序列(SEQ ID NO: 7)，但是不包括关于氨基酸序列的活性的注解。到目前为止尚未报道实际上得到从微小根毛霉衍生出的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶。在所述数据库中假定为内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶的SEQ ID NO: 7的氨基酸序列(在下文中被称作“已知的假定序列”)的位置191-198的氨基酸序列是Leu-Ala-Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg (LANTYYIR)。
引文列表
专利文献
专利文献1: WO2013/051608或US2014-0313246
非专利文献
非专利文献1: Fujita等人, (2004) Arch Biochem Biophy. 432: p41-49
非专利文献2: Tarentino AL等人, (1993) J Biol Chem. 268: p9702-9708
非专利文献3: Goodfellow JJ等人, (2012) J Am Chem Sci.134: p8030-8033
非专利文献4: Kato T等人, (2002) Glycobiology 12: p581-587
非专利文献5: Y. Eshima等人, (2015) PLoS One. 21; 10(7): e0132859
发明概述
技术问题
本发明的目的是提供新颖的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶，其可以由大肠杆菌生产且在高温条件下对复杂型糖链具有水解活性。
问题的解决方案
本发明的发明人已经为实现前述目的进行了深入研究。因此，发明人已经发现，来自多种属于微小根毛霉的菌株的培养物上清液在高温条件下对复杂糖链具有好的水解活性，并且从所述菌株克隆的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶在大肠杆菌生产系统中表现出好的表达效率，且生产的酶具有前述水解活性。本发明的发明人进一步进行了研究，由此完成了本发明。
本发明提供了本发明的以下方面。
(1)具有以下性质(A)和(B)的多肽：
(A)所述多肽包含与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有75%或更多同一性和95%或更多相似性的氨基酸序列，且是不同于SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的氨基酸序列；和
(B)所述多肽在45-60℃的任何温度对复杂糖链表现出的水解活性和/或转糖基活性是最大活性值的40%或更多。
(2)根据(1)的多肽，所述多肽具有以下性质(A)和(B)：
(A)所述多肽包含与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有75%或更多同一性和95%或更多相似性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO: 1的氨基酸位置191-195的氨基酸序列对应的位置处的Leu-Ala-Lys-Leu-Leu (LAKLL)的氨基酸序列；
(B)所述多肽在45-60℃的任何温度对复杂糖链表现出的水解活性是最大活性值的40%或更多。
(3)根据(1)的多肽，其中在50℃对复杂糖链的水解活性是最大活性值的60%或更多。
(4)根据(1)至(3)的任一项的多肽，其中，除了具有性质(A)和(B)以外，(C)所述多肽在大肠杆菌中的重组表达中以10 mg/L培养物或更多的量产生。
(5)根据(1)至(4)的任一项的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的氨基酸位置54-341的区域具有85%或更多序列同一性。
(6)根据(1)至(5)的任一项的多肽，其中氨基酸D276、V223、W225、Y247和W248中的至少一个保持不变且优选地至少D276保持不变。
(7)根据(1)至(3)的任一项的多肽，其中所述多肽是由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成的多肽或由在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中具有至少一个选自A128T、D333G、I434L、V460A、I527V、K569T、F610S和H626R的突变的氨基酸序列组成的多肽。
(8)根据(1)的多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO: 1-6中的任一个的氨基酸序列组成。
(9)根据(1)至(6)的任一项的多肽，其中所述多肽具有满足性质(A)的氨基酸序列且具有在SEQ ID NO: 23中所含的突变中的至少一个。
(10)根据(9)的多肽，其中所述多肽具有在至少一个选自N172、D176、Y214、S216、L245、N246、T275、L306、F307和A310的氨基酸中的突变且具有增加的转糖基活性。
(11)根据(7)的多肽，其中所述多肽具有至少一个选自以下的突变：
其中N172被置换为Gln、Asp、Gly、Ala、Phe、Cys、His、Ile、Ser、Thr、Val或Met的突变；其中D176被置换为Arg的突变；其中Y214被置换为Phe的突变；其中S216被置换为Val的突变；其中L245被置换为Ser的突变；其中N246被置换为Asp的突变；其中T275被置换为Ile的突变；其中F283被置换为Ser的突变；其中L306被置换为Ile的突变；其中F307被置换为Tyr的突变；其中A310被置换为Asp的突变；和其中E314被置换为Gln的突变。
(12)根据(9)至(11)中的任一项的多肽，其中所述多肽具有其中W278被置换为Phe或Tyr的突变。根据(11)的多肽，其中，更具体地，所述多肽在SEQ ID NO: 1-6中的任一个的氨基酸序列中具有突变N172Q、N172D、W278F、N172Q/W278F、N172D/W278F或Y214/L306I/L307Y。
(13)一种多核苷酸，其编码根据(1)至(12)的任一项的多肽。
(14)根据(13)的多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQ ID NO: 8-17的核苷酸位置1-2088的核苷酸序列和SEQ ID NO: 18-19的核苷酸位置1-2091的核苷酸序列中的任一个的核苷酸序列。
(15)一种表达质粒，其包含根据(13)或(14)的多核苷酸。
(16)用根据(15)的质粒转化的宿主细胞。
(17)根据(16)的宿主细胞，其中所述宿主细胞是用包含多核苷酸的质粒转化的大肠杆菌，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 9、11、13、15或17的核苷酸位置1-2088的核苷酸序列或SEQ ID NO: 19的核苷酸位置1-2091的核苷酸序列。
(18)生产根据(1)至(12)的任一项的多肽的方法，所述方法包括，培养根据(16)或(17)的宿主细胞和从得到的培养物收集根据(1)至(12)的任一项的多肽。
(19)一种试剂，其包含根据(1)至(12)的任一项的多肽。
发明的有利效果
本发明的新颖的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶在50℃或更高的高温反应条件下对复杂型糖链具有好的水解活性，使得它们可以在高温条件下安全地和有效地提供糖链，所述高温条件可以在使用这些酶制备药物中阻止细菌生长并可以导致高反应效率。可以使用大肠杆菌以高收率在异源表达系统中生产本发明的酶。在药物制备中由大肠杆菌产生除了本发明的酶以外的生物原料(诸如生物活性肽/蛋白和其它酶)的情况下，相同宿主物种在本发明的酶的生产中的应用可以促进所述生物原料的来源宿主物种对终产物的安全性的影响的评估。
附图简述
[图1]图1的示意图显示了其中Endo-Rp使用SGP作为底物的水解反应。
[图2]图2表示的图显示了在分析条件A下在酶处理之前的SGP溶液(上小图)和在酶处理之后的粗制溶液(下小图)的LC-MS分析的结果。在3-4分钟检测到的大峰代表SGP，且在约4.5-5分钟检测到的峰代表SG(10)。
[图3]图3的图显示了从不同微小根毛霉菌株(NBRC 9740 (空心三角形)、NBRC9741 (实心三角形)、NBRC 9742 (空心正方形)和NBRC 9743 (实心正方形))和Endo-M (实心圆)衍生出的粗制酶对SGP的水解活性的温度依赖性。X轴代表反应温度(℃)且Y轴代表水解率。
[图4]图4显示了Endo-Rp及其不同同系物、Endo-Rm的氨基酸序列与已知的假定序列的比对。
[图5]图5的图显示了Endo-Rp (空心圆)、Endo-M (实心圆)、Endo-S (实心正方形)和Endo-Om (实心三角形)对SGP的水解活性的时间依赖性变化。X轴代表反应开始以后的持续时间且Y轴代表水解率。
[图6]图6的图显示了Endo-Rp对SGP的水解活性的温度依赖性。X轴代表反应温度(℃)且Y轴代表水解率。
[图7]图7的图显示了Endo-Rp对SGP的水解活性的pH依赖性。X轴代表反应溶液的pH值且Y轴代表水解率。
[图8]图8表示的图显示了在有单独的SGP(上小图)或SGP + 受体((GlcNAc-)Asn)(下小图)存在下Endo-Rp的反应溶液的LC-MS分析的结果。在1分钟附近检测到的大峰代表SGP，且在约4-5分钟检测到的峰代表SG(10)，且在约3分钟检测到的峰代表(SG-)Asn。
[图9]图9的图显示了Endo-Rp (空心圆)和Endo-Rp N172Q (实心正方形)的转糖基活性的时间依赖性变化。X轴代表反应开始以后的持续时间(小时)且Y轴代表转糖基率(%)。
实施方案的描述
现在将详细描述本发明。
本发明提供了一种内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶，其为具有性质(A)和(B)的多肽：
(A)所述多肽包含与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列(Endo-Rp氨基酸序列)具有75%或更多同一性和95%或更多相似性的氨基酸序列且是不同于SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的氨基酸序列；和
(B)所述多肽在45-60℃范围内的温度表现出的复杂型糖链的水解活性和/或转糖基活性是最大活性值的40%或更多。
在本发明中，“复杂型糖链”是指这样的糖链：其属于人N-连接的糖链且具有由如下所述的式(I)或(II)组成的基础结构。复杂型糖链具有这样的结构：其中从在还原端附近的甘露糖(β甘露糖)分支的两个支链(1-3链和1-6链)各自具有GlcNAc。所述结构将随半乳糖和唾液酸在非还原末端的存在或不存在以及它的价异构现象和位置异构现象而变化。只要复杂型糖链具有该基础结构，它还可以具有另一个支链结构或已经在碳水化合物的羟基或在非还原末端的唾液酸的羰基中的一些处化学修饰的结构。据报道，作为这样的化学修饰的复杂型糖链的一个例子，在SGP的唾液酸中的二醇的氧化切割以后通过肟化修饰的SGP可以用作Endo-M底物(Org. Biomol. Chem, 2016, 14, 9501-9518)。
[式(I)]
[式(II)]
复杂型糖链通常可以包括在从鸡蛋黄提取的唾液酸基糖肽(SGP: 下面的式(III)和(IV))中包括的唾液酸基聚糖(SG)。SGP可以从禽蛋黄中纯化，但是纯化的SGP是商购可得的且可以购自例如Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.等。
[式(III)]
[式(IV)]
在本发明中，“内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶”是识别糖链作为它的底物且具有水解活性和转糖基活性的酶。可以修饰天然存在的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶（其具有这些活性中的两者）的氨基酸序列以产生经调节以增加或减小任一种活性的突变体和通过使任一种活性消失而仅具有水解活性或转糖基活性的酶。本发明不仅包括天然存在的酶，而且包括这样的突变体酶。
本发明的酶的水解活性是特异性地水解在上述复杂型糖链的还原末端的核心壳二糖中的β1,4糖苷键的活性，所述核心壳二糖由两个连续GlcNAc单元组成(本文中使用的“水解活性”是指该活性，除非另外说明)。例如，如在图1中所示，在其中内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶使用SGP作为底物的水解反应中，产生了由在SG的还原端处不具有一个GlcNAc的结构组成的SG(10) (下面式(V)和(VI)的结构)。
[式(V)]
[式(VI)]
本发明的酶的转糖基活性是通过使从糖链供体衍生出的糖链的还原端（其中所述还原端具有GlcNAc）结合仅具有GlcNAc作为碳水化合物单元的分子或包含在非还原端具有GlcNAc的糖链的分子(在下文中被称作“受体分子”)而形成β1,4糖苷键的活性(在下文中被称作“转糖基活性”)。例如，在使用具有由下面式(VII)表示的结构的(GlcNAc-)Asn作为受体分子并且使用SGP作为供体分子的转糖基反应中，从SGP衍生出的SG(10)被转移给受体分子的GlcNAc单元以产生由下面式(VIII)表示的(SG-)Asn。类似地，在使用具有由下面式(IX)表示的结构的GlcNAc-AcA作为受体分子和使用SGP作为供体分子的转糖基反应中，产生了由下面式(X)表示的SG-A。
[式(VII)]
[式(VIII)]
[式(IX)]
[式(X)]
酶和氨基酸序列
本发明的酶不限于在实施例中得到且具有特定序列的酶，只要它们具有如上所述的性质。本发明的酶可以分离自天然存在的来源或基于本发明的酶的序列信息而人工生产或修饰。对于分离自天然存在的来源，被用作分离来源的生物物种优选包括，但是不具体限于，真菌，更优选嗜热真菌，更优选属于根毛霉菌属（Rhizomucor）的真菌，再更优选属于微小根毛霉（Rhizomucor pusillus）或米赫根毛霉（Rhizomucor miehei）的真菌。
在本发明中，从多种属于微小根毛霉(Rhizomucor pusillus, R. pusillus)的菌株（它们是嗜热真菌）克隆具有本发明的性质的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶。从微小根毛霉菌株NBRC 9742衍生出的酶被命名为Endo-Rp (氨基酸序列; SEQ ID NO: 1，从该菌株衍生出的核酸序列：SEQ ID NO: 8)；从菌株NBRC 9740衍生出的酶被命名为Endo-Rp2 (氨基酸序列: SEQ ID NO: 2，从该菌株衍生出的核酸序列：SEQ ID NO: 10)；从菌株NBRC 9741衍生出的酶被命名为Endo-Rp3 (氨基酸序列: SEQ ID NO: 3，从该菌株衍生出的核酸序列：SEQ ID NO: 12)；和从菌株NBRC 9743衍生出的酶被命名为Endo-Rp4 (氨基酸序列:SEQ ID NO: 4，从该菌株衍生出的核酸序列：SEQ ID NO: 14)。以上描述的微小根毛霉的所有菌株可得自NBRC。每种菌株的发源地是日本。
基于具有其公开的基因组的微小根毛霉菌株的序列信息，将SEQ ID NO: 7的氨基酸序列(它的假定核酸序列为: SEQ ID NO: 20)公开为内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶的假定氨基酸序列。针对大肠杆菌表达系统优化所述核酸序列以在大肠杆菌中表达它，导致所述酶的几乎不表达和非常低的酶活性(实施例3)。在SEQ ID NO: 7的氨基酸序列中，与在SEQ ID NO: 1的位置193处的Lys对应的氨基酸被氨基酸Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg置换(参见图4)。由氨基酸序列(SEQ ID NO: 5)组成的酶（其中SEQ ID NO: 7中的位置193-198的Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg已经被Lys置换，如SEQ ID NO: 1中）在大肠杆菌中显示适当的表达和水解活性，且具有该氨基酸序列的酶被命名为Endo-Rp5。综上所述，与SEQ ID NO:1的位置191-195对应的序列被鉴别为对于本发明的酶的性质而言非常重要的区域。
基于在本发明中鉴别的Endo-Rp的序列信息，还从米赫根毛霉（R. miehei）（微小根毛霉的一个相关物种）的公开的基因组信息（米赫根毛霉菌株CAU432）鉴别出一个有关的序列。针对大肠杆菌表达优化所述核酸序列以在大肠杆菌中表达目标蛋白，导致在一定程度上生产具有本发明的酶活性的酶。该酶被命名为Endo-Rm (氨基酸序列: SEQ ID NO: 6，从真菌衍生出的核酸序列: SEQ ID NO: 18)。
Endo-Rp和它的同系物Endo-Rp2、Endo-Rp3、Endo-Rp4和Endo-Rp5之间的氨基酸序列同一性是99%或更多。Endo-Rp2是在SEQ ID NO: 1中具有突变A128T和K569T的同系物。Endo-Rp3是在SEQ ID NO: 1中具有突变D333G、I434L、I527V、K569T、F610S和H626R的同系物。Endo-Rp4是在SEQ ID NO: 1中具有突变V460A和K569T的同系物。Endo-Rp5是在SEQ IDNO: 1中具有突变K569T的同系物。Endo-Rm的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有96%相似性和77%同一性。在该序列中从位置54至340的区域具有高水平的同一性(同一性: 89%, 相似性: 97%))，且从位置190至195的区域His-Leu-Ala-Lys-Leu-Leu (HLAKLL)是完全相同的，这满足本发明的酶的性质(A)。
当本发明的酶是从真菌衍生出的酶时，所述蛋白可以分离自真菌的培养物上清液或真菌匀浆物，或使用异源表达系统诸如大肠杆菌或酵母进行表达。已知的是，许多已知的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶使用在大肠杆菌中的异源表达系统以低收率产生，而本发明的酶的氨基酸序列具有在大肠杆菌表达系统中显示优良生产效率的性质。如果在大肠杆菌中表达蛋白，通常针对大肠杆菌表达来优化真菌-衍生的蛋白的核酸序列。即使当执行这样的优化时，例如，以仅3.7 mg/L培养物的收率在大肠杆菌中生产Endo-M N175Q (单氨基酸突变体)。还报道了以0.4 mg/L培养物的收率生产Endo-CC。与此相比，以10 mg/L培养物或更多的量(优选地12 mg/L培养物或更多，和更优选地15 mg/L培养物或更多)在大肠杆菌中表达本发明的酶，且在大肠杆菌中显示与常规酶相比好的生产效率。如在实施例4中从已知的假定序列(SEQ ID NO: 7)和Endo-Rp5 (SEQ ID NO: 5)在大肠杆菌中的生产效率的结果所示，该性质似乎是由特定氨基酸序列(具体地，包含SEQ ID NO: 1的氨基酸位置191-195的区域，尤其是从位置192至194的序列，和更具体地在位置193处的Lys)赋予的性质。
本发明的酶的氨基酸序列各自是这样的氨基酸序列：其包含与SEQ ID NO: 1的全长氨基酸序列具有75%或更多同一性和95%或更多相似性的氨基酸序列，且不同于SEQ IDNO: 7 (优选地与SEQ ID NO: 1的氨基酸位置193对应的氨基酸是Lys；优选地与氨基酸位置192-194的氨基酸序列对应的氨基酸序列是Ala-Lys-Leu (AKL)；更优选地与氨基酸位置191-195的氨基酸序列对应的氨基酸序列是Leu-Ala-Lys-Leu-Leu (LAKLL))。
氨基酸序列的同一性表示从氨基酸的匹配率定量的数值，其中如果一个氨基酸与存在于全长序列中的对应位置处的氨基酸刚好匹配，那么认为这些氨基酸是相同的氨基酸。另一方面，氨基酸序列的相似性表示从两个氨基酸序列之间的关系定量的数值，其中如果一个氨基酸具有与存在于对应位置处的氨基酸的性质类似的性质，那么认为这些氨基酸具有相似性。通过序列分析软件GENETYX-SV/RC (由GENETYX CORPORATION制造)计算本发明中的序列同一性和相似性。该算法是本领域中常用的。
基于与已经分析了其晶体结构的Endo-A的比对，预期Endo-Rp的活性结构域是SEQID NO: 1的氨基酸位置1-374的区域(Zhenlian Ling等人, Journal of MolecularBiology (2009), 第389卷, 第1期, 第1-9页)。实际上，关于全长比对，本发明的酶(Endo-Rp1-5和Endo-Rm)的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1具有75%或更多的序列同一性。在预期为活性结构域的区域中的SEQ ID NO: 1的氨基酸位置54-341的序列具有89%的非常高的同一性。所述全长氨基酸序列具有优选地80%或更多、更优选地90%或更多、更优选地95%或更多和最优选地99%或更多的同一性。SEQ ID NO: 1的氨基酸位置54-341的区域与在该区域中的氨基酸序列具有优选地85%或更多、更优选地90%或更多、进一步优选地95%或更多、甚至更优选地98%或更多的同一性，且最优选地是完全相同的。
在本说明书中，在分子中包括的氨基酸的注释遵循本领域中的实践。使用野生型氨基酸(或核酸)的单字母注释和突变的位置表示突变位点(例如，在位置172处的Asn被称作“N172”)。也通过使用野生型氨基酸(或核酸)的单字母注释、突变的位置和突变后面的氨基酸(或核酸)的单字母注释表示突变(例如，其中在位置172处的Asn被Gln置换的突变被称作“N172Q”)。通过使用分子名称和突变表示具有特定突变的突变体(例如，在Endo-Rp的位置172处的Asn被Gln置换的突变体被称作“Endo-Rp N172Q”)。通过被在多个突变之间的“/”隔开的表达来表示具有多个突变的突变体(例如，具有其中在位置278处的Trp被Phe置换的额外突变的Endo-Rp N172Q突变体被称作“Endo-Rp N172Q/W278F”)。
本发明的酶可以包括氨基酸突变（置换）、缺失、插入和/或添加，只要它们与SEQID NO: 1具有某个水平或更高的同一性或相似性，前提条件是，至少在SEQ ID NO: 1中，与SEQ ID NO: 7的位置193-198对应的序列是不同于Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg的序列，且优选地与在SEQ ID NO: 1的位置193 (优选地位置192-194，更优选地位置191-195)处的氨基酸对应的位点具有与SEQ ID NO: 1完全相同的氨基酸序列。实施例8的结果显示，当在SEQID NO: 1中的D276氨基酸发生突变时，水解活性和转糖基活性两者几乎消失，并且突变体E126A、V223R、W225H、Y247F和W248N的每种极大地减小了两种活性。这指示，在本发明的酶中的这些氨基酸优选地是与在SEQ ID NO: 1中的那些氨基酸类似或相同的氨基酸。因而，在本发明的酶中具有与SEQ ID NO: 1完全相同的氨基酸序列的区域优选地是从氨基酸位置118至332的区域，更优选从位置54至341的区域，且进一步优选从位置1至374的区域。
除了上述的完全相同的区域以外，本发明的酶可以包括在SEQ ID NO: 1-6的氨基酸序列中的任何区域中在某些位点(优选地5个位点或更少，更优选地3、2或1个位点)中的每个位点一些(优选地10个或更少，更优选地7个或更少，和更优选地5、4、3、2或1个)氨基酸的置换、缺失、插入和/或添加，只要它们具有上述的序列同一性/相似性。这样的氨基酸缺失可以提供具有本发明的酶的性质的多肽，即使当例如从SEQ ID NO: 1-6的任意氨基酸序列的N-和/或C-端删除几个氨基酸时。具体地，SEQ ID NO: 1的从位置375至C-端的区域不是活性结构域，且因此接受许多氨基酸修饰(置换、缺失、插入、和/或添加)。具有氨基酸添加的多肽包括具有被添加至SEQ ID NO: 1-6的任何氨基酸序列的N-和/或C-端的已知不会影响前述活性的氨基酸或肽的那些。要添加的这样的肽包括要添加用于蛋白纯化的标签肽(诸如His标签和GST标签)。
关于氨基酸突变在本发明的酶中的位置，已经证实在SEQ ID NO: 23中在至少一个由Xaa表示的位置具有突变的酶保留水解活性和/或转糖基活性。预期本发明的酶具有在SEQ ID NO: 1中在氨基酸位置1-374处的活性结构域。基于在已知内酶中的结构-活性关系的发现和本发明的公开内容，通过在活性结构域中产生突变，可以设计保留原始活性或经工程改造成具有期望的活性的突变体。
来自不同同系物的结果指示，本发明的酶接受在SEQ ID NO: 1中在A128、D333、I434、V460、I527、K569、F610和H626处的氨基酸置换。并且，如在实施例8中所示，产生了许多具有在活性结构域中的氨基酸的置换的突变体。这些突变体中的许多被证实与野生型Endo-Rp相比会减小表观活性，但具有某个水平的水解活性和/或足以可用于转糖基的转糖基活性(任一种活性的比活性值是野生型Endo-Rp的比活性值的至少0.5%或更多)。还证实了某些氨基酸置换在该区域中是可接受的。具体地，下述的氨基酸突变是可接受的。
尽管N172似乎是与底物接触的活性残基，但是用除了Trp、Arg和Tyr以外的任何氨基酸的置换允许维持所述活性，且因此用除了具有庞大侧链的氨基酸以外的任何氨基酸的置换是广泛地可接受的。已经证实与具有高极性侧链的氨基酸诸如Gln和Asp、以及Gly、Ala、Phe、Cys、His、Ile、Ser、Thr、Val、Met等的置换可以增加转糖基活性比(转糖基活性值/水解活性值)。
Arg对D176的置换允许维持所述活性且因此用许多氨基酸的置换可以是可接受的。Arg对D176的置换也可用于产生具有增加的转糖基活性比的突变体。
具有小侧链的氨基酸如Ala对Y214的置换会极大地减小两种活性且因此Y214将接受用具有相对大的侧链的氨基酸的置换。Phe对Y214的置换可用于产生具有增加的转糖基活性比的突变体。
具有小侧链的氨基酸(优选地Ala或Val)对S216的置换允许维持转糖基活性和减小水解活性。该突变可用于产生具有增加的转糖基活性比的突变体。
Ser对L245的置换维持了所述活性且因此许多氨基酸对L245的置换可以是可接受的。Ser对L245的置换也可用于产生具有增加的转糖基活性比的突变体。
尽管N246似乎耐受重大改变的接受，但是Asp对N246的置换极大地减小了水解活性，同时维持转糖基活性。这样的突变可用于产生具有增加的转糖基活性比的突变体。
Ile对T275的置换维持了所述活性且因此许多氨基酸对T275的置换可以是可接受的。Ile对T275的置换也可用于产生具有增加的转糖基活性比的突变体。
据信，W278和底物糖链之间的疏水相互作用为所述活性做出贡献。W278可以接受具有高疏水侧链的氨基酸，诸如Tyr、Phe、Ala、Leu和Ile。
Ser对F283的置换允许维持所述活性且因此F283可以接受许多氨基酸的置换。Ser对F283的置换也可用于产生具有增加的转糖基活性比的突变体。
Ile对L306的置换会造成更少的显著活性变化，但是倾向于维持转糖基活性和减小水解活性，且因此所述置换可能可用于产生具有增加的转糖基活性比的突变体。置换产物的预测构象指示，用具有庞大侧链或带电荷侧链的氨基酸的置换可能是不利的。
F307可以接受不同的氨基酸诸如His和Tyr。His或Tyr对F307的置换会极大地减小水解活性而不是转糖基活性，且可用于产生具有增加的转糖基活性比的突变体。
具有带有极性残基或带电荷残基的侧链的氨基酸(优选地Asp、Glu、Lys、Ser等)对A310的置换会极大地减小水解活性而不是转糖基活性。这些突变可用于产生具有增加的转糖基活性比的突变体。
Gln对E314的置换不会造成所述活性的大变化且可以是可接受的。
关于氨基酸置换/突变，本发明的酶包括这样的氨基酸序列：其优选地满足本发明的性质(A)且具有一个或多个选自在SEQ ID NO: 23中所示的突变(在SEQ ID NO: 1中的A128、N172、D176、Y214、S216、L245、N246、T275、W278、F283、L306、F307、A310、E314、D333、I434、V460、I527、K569、F610和H626)的氨基酸置换；更优选具有至少一个选自在SEQ IDNO: 1中的A128T (Rp2)、D333G (Rp3)、I434L (Rp3)、V460A (Rp4)、I527V (Rp3)、K569T(Rp2-4)、F610S (Rp3)和H626R (Rp3)的突变的氨基酸序列；或进一步具有在所述氨基酸序列中的N172、D176、Y214、S216、L245、N246、T275、W278、F283、L306、F307、A310和E314中的至少一个氨基酸处的突变的氨基酸序列，其中多个突变可以同时发生且所有突变可以发生。
内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶具有水解活性和转糖基活性两者。具有高水解活性的酶也水解作为底物的由于它的转糖基活性已经转移至受体分子的糖链。这可以阻止这样的酶适当地产生期望的转糖基分子。由于该原因，这样的转糖基作用突变酶在糖基化的化合物的合成中也是重要的。
如上所述，已经证实一些在SEQ ID NO: 1中的N172、D176、Y214、S216、L245、N246、T275、F283、L306、F307、A310和E314处的突变会增加本发明的酶的转糖基活性或相对于转糖基活性极大地减小水解活性。因而，这些突变可用于设计转糖基作用突变酶，其具有增加的转糖基活性比(转糖基活性/水解活性)。本发明也提供了这样的转糖基作用突变酶。在转糖基作用突变酶中的具体突变包括在SEQ ID NO: 1中的：其中N172被置换为Gln或Asp的突变；其中D176被置换为Arg的突变；其中Y214被置换为Phe的突变；其中S216被置换为Val的突变；其中L245被置换为Ser的突变；其中T275被置换为Ile的突变；其中W278被置换为Phe或Tyr的突变；其中F283被置换为Ser的突变；其中L306被置换为Ile的突变；其中F307被置换为Tyr的突变；其中A310被置换为Asp的突变；和其中E314被置换为Gln的突变。引入本发明的转糖基作用突变酶中的突变可以是这些突变中的至少一种。所述突变可以是单个突变或包含这些突变中的一些的多个突变。优选的突变是N172Q、N172D、W278F、N172Q/W278F、N172D/W278F或Y214/L306I/F307Y。
水解活性和转糖基活性
本发明的酶对复杂型糖链具有水解活性和/或转糖基活性。所述活性代表在45-60℃的任何温度表现出最大活性值的40%或更多的性质。
本发明的酶具有水解作为底物的多种复杂型糖链的活性。通过根据下述方法评估水解作为底物的SGP以提供SG (10)的活性，鉴别出所述酶。
在水解反应中，制备含有200 mM磷酸钾缓冲液(pH 6.25)、69 mM SGP和0.02 μM酶(对于空白，等体积的缓冲液替代酶) (列出的所有浓度都代表在反应溶液中的终浓度)的反应溶液(总体积: 100 μL)，并在预定温度温育18小时。将得到的反应溶液和空白溶液通过LC-MS分析来定量SGP和SG (10)并根据下述的公式计算水解率和比活性。
LC-MS分析条件A
MS设备: 6130 Quadrupole LC-MS (Agilent Technologies, Inc.)
电离: ESI
模式: 正
HPLC: 1260 Infinity LC (Agilent Technologies, Inc.)
柱：Inertsil ODS-3 3 μmφ3.0 x 50 mm (GL Sciences Inc.)
柱温度: 40℃
流动相A: H2O + 0.1% HCOOH
流动相B: 乙腈+ 0.1% HCOOH
梯度(流动相B%): 0%(0 min), 10%(5 min), 30%(7 min)
流速: 0.6 mL/min
水解率
根据下式计算水解率：
水解率(%) = 反应以后SG (10)的浓度(M)/ 空白中SGP的浓度(M) x 100
比活性
根据下式计算比活性：
比活性(μmol/min/μg) =产生的SG (10)的量(μmol)/反应的持续时间(min)/酶的量(μg)
本发明的酶具有识别不同糖链供体和受体分子并转移糖链的活性。通过根据下述方法评估转移用作底物的SGP的糖链以提供SG-A的活性，鉴别所述酶。
在转移反应中，制备含有1.6 M磷酸钾缓冲液(pH 6.25)、69 mM SGP、690 mMGlcNAc-AcA和1.0 μM酶(对于空白，等体积的缓冲液替代酶) (列出的所有浓度都代表在反应溶液中的终浓度)的反应溶液(总体积: 30 μL)并在预定温度温育。通过LC-MS分析在1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时和96小时以后的反应溶液和空白溶液以定量SGP、SG(10)和SG-A并根据下述的公式计算水解率和比活性。
LC-MS分析条件B
MS设备: 6130 Quadrupole LC-MS (Agilent Technologies, Inc.)
电离: ESI
模式: 正
HPLC: 1260 Infinity LC (Agilent Technologies, Inc.)
柱：Inertsil ODS-3 2 μmφ2.1 x 50 mm (GL Sciences Inc.)
柱温度: 40℃
流动相A: H2O + 0.1% HCOOH
流动相B: 乙腈+ 0.1% HCOOH
梯度(流动相B%): 0.8%(0 min), 8%(0.1 min), 8%(5 min)
流速: 0.7 mL/min
转移率
根据下式计算转移率：
转移率(%) = 在反应以后SG-A的浓度(M)/ 空白中的SGP的浓度(M) x 100
比活性
根据下式计算比活性：
比活性(μmol/min/mg) =产生的SG-A的量(μmol)/反应的持续时间(min)/酶的量(mg)
当根据上述方法在从例如10℃至70℃适当地变化的温度(例如，以2、3、5或10℃增量)测定水解活性和/或转糖基活性并将从所有温度条件计算的活性值的最大值设定为100%时，本发明的酶在从45℃至60℃的任何温度条件(优选地在50℃)表现出40%或更多、优选地50%或更多、更优选地60%或更多、更优选地80%或更多的相对活性值，且最优选在所述温度范围内的最大活性值。
通常在酶的最适温度条件下测定比活性。本发明的酶表现出高比活性。例如，当Endo-Rp在50℃使用69 mM SGP作为底物时，它表现出0.21 μmol/min/μg的比活性。该比活性是优良的活性，其为Endo-M在37℃的比活性(0.0071 μmol/min/μg)的30倍。
本发明的酶不限于在本文实施例中具体地描述的酶和突变体。本发明的酶包括各种多肽，只要它们满足性质(A)和(B)。本发明的酶可以是在某个水平或更高水平表现出它们的水解活性和转糖基活性中的至少一种的那些，所述水平优选地是在如上所述的温度条件下由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成的酶的活性的0.5%或更多，更优选1%或更多，更优选5%或更多，甚至更优选10%或更多，和最优选30%或更多。
基因
本发明进一步提供了基因，其具有编码如上所述的本发明的酶的核酸序列。
基于微小根毛霉或米赫根毛霉的基因信息，所述基因可以从自然界(例如，嗜热真菌，优选属于根毛霉菌属的真菌，且更优选微小根毛霉或米赫根毛霉)克隆作为编码本发明的酶的基因。根据已知的基因工程改造技术，基于酶的氨基酸序列，所述基因还可以作为重组基因产生。
编码本发明的酶的核酸序列会编码包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有75%或更多同一性和95%或更多相似性且是不同于SEQID NO: 7的氨基酸序列的氨基酸序列。核酸序列的例子可以包括，例如，如在SEQ ID NO:8、10、12、14、16或18(包括终止密码子)中所示的在真菌中天然存在的核酸序列。基于酶的氨基酸序列，利用例如GeneArt Strings DNA Fragments (由Thermo Fisher Scientific,Inc.制造)，可以产生具有为在大肠杆菌中的表达优化的核酸序列的核酸。SEQ ID NO: 9、11、13、15、17和19的核酸序列分别是基于SEQ ID NO: 1 (Endo-Rp)、2 (Endo-Rp2)、3(Endo-Rp3)、4 (Endo-Rp4)、5 (Endo-Rp5)和6 (Endo-Rm)的氨基酸序列而设计的核酸序列。这些核酸序列为酶在大肠杆菌中的表达进行了优化，所述酶具有添加至C-端的His标签(His x 6)。通过参考这些核酸序列，可以设计在大肠杆菌中有效地表达多肽的核酸序列，所述多肽具有不同的经修饰的氨基酸，例如SEQ ID NO: 23的氨基酸序列。
编码本发明的酶的核酸序列的具体例子可以包括与在SEQ ID NO: 8-17的核苷酸位置1-2088和SEQ ID NO: 18-19的核苷酸位置1-2091中的任一个(优选地编码Endo-Rp或其同系物的SEQ ID NO: 8-17的核苷酸位置1-2088)所示的核酸序列具有80%或更多、优选地95%或更多、更优选地95%、甚至更优选地98%或更多同一性的核酸序列和在每个核酸序列中从位置570至585的区域中编码Leu-Ala-Lys-Leu-Leu的核酸。
酶的生产和纯化
本发明进一步提供了基因构建体，其包括包含编码本发明的酶的重组基因的质粒和表达载体；用所述基因构建体转化的宿主细胞；和生产本发明的酶的方法，所述方法包括从宿主细胞的培养物收集本发明的酶。根据要用质粒/表达载体转化的宿主细胞类型(包括动物细胞、植物细胞、大肠杆菌和酵母；可以适当地选择在蛋白生产中常用的任何细胞或其它细胞)，将编码本发明的酶的基因引入合适的质粒/表达载体中。在合适的条件下培养经转化的细胞。可以从培养物收集本发明的酶。
根据已知技术，使用基因工程改造领域中通常已知的载体或质粒，可以产生用于转化的基因构建体，并根据在其中表达所述载体或质粒的细胞类型进行选择。例如，可以用于在大肠杆菌中表达的载体包括、但不限于pET载体、pCold载体、pFLAG载体等。
大肠杆菌的例子可以包括BL21 (DE3)和Origami (DE3)。
用于生产本发明的酶的大肠杆菌的培养条件的例子包括这样的方法：其中将转化的细菌培养物接种进在100 mL烧瓶中的25 mL TB培养基(50 μg/mL卡那霉素)中，并在37℃摇动培养过夜(160 rpm，过夜)。还可以使用另一种方法，但是不限于此，所述方法包括：将20 mL预培养培养基接种进在2.5 L带有挡板的烧瓶内的1 L TB培养基(50 μg/mL卡那霉素, 0.01%消泡剂204, 2 mM MgSO4)中；在37℃在摇动下培养(200 rpm, 2小时)；将培养箱温度降低至16℃并培养3小时，且其后以0.2 mM的终浓度加入IPTG；和将它进一步培养24小时。除了TB培养基以外，可以使用的培养基包括常见培养基诸如LB培养基和M9培养基。
通过利用酶的物理性质，适当地与任何常见纯化技术组合，可以收集本发明的酶。为了方便收集，将基因构建体预先设计成表达与标签肽（诸如His-标签或GST-标签）连接的酶，从而通过利用标签肽的亲和力来收集所述酶。可以在纯化以后除去标签肽，但是与标签肽连接的酶可以直接用于包括水解在内的反应，只要所述标签肽对酶活性没有影响。本发明的酶包括具有与这样的标签肽连接的氨基酸序列的酶。所述酶的具体例子包括具有与SEQ ID NO: 1-6的氨基酸序列的C-端连接的His-标签(His x 6)的氨基酸序列。
由于氨基酸序列的性质，本发明的酶在大肠杆菌中具有优秀的生产效率。当在上述培养条件下在大肠杆菌中生产它们时，本发明的酶表现出每1 L培养物2 mg或更多，优选地4 mg或更多，更优选地8 mg或更多，进一步优选地12 mg或更多，且甚至更优选地每1 L培养物15 mg或更多的表达效率。
实施例
在下文中，将参考下述实施例具体地描述本发明。在实施例中的描述是本发明的一个实施方案的一个实例。这些实施例无意限制本发明。
使用Microvolume Spectrophotometer NanoDrop 1000 (由Thermo FisherScientific, Inc.制造)或NanoDrop 2000 (由Thermo Fisher Scientific, Inc.制造)，定量如本文中所述的蛋白浓度。
在实施例中，当测定酶内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶的水解活性时，使用上述LC-MS分析条件A在反应溶液中检测SGP和SG (10)。根据上述计算式计算水解率和比活性。
实施例1 从微小根毛霉衍生出的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶的发现
将微小根毛霉菌株NBRC 9740、NBRC 9741、NBRC 9742和NBRC 9743接种在GSYFe斜面(5%葡萄糖, 2%大豆蛋白胨, 1%酵母提取物, 0.05% FeSO4•7H2O, 1.5%琼脂)上并在40℃培养5天。将真菌细胞收集并在2 mL 100 mM磷酸钾缓冲液(pH 6.25)中使用玻璃匀浆器破裂，随后过滤除菌以得到粗制酶溶液。
向50 μL粗制酶溶液中，加入3 mg SGP (至21 mM的终浓度)并在50℃温育。通过LC-MS来分析反应溶液，并观察到SGP的消失和SG (10)的产生(图2)。因而，我们考虑微小根毛霉NBRC 9742具有内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶。
此外，在不同的反应温度执行水解反应。在每个样品中，计算相对活性，使得将反应最有效地进行的温度的活性设定为100%。结果显示在图3中。可以证实，尽管用作比较对照的Endo-M (由Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.制造)在45℃被失活，从微小根毛霉衍生出的粗制酶的最适温度是55℃或更高。
实施例2 从微小根毛霉衍生出的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶基因的克隆
使用下述方法从微小根毛霉菌株NBRC 9742克隆内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶基因并基于公开的基因组序列提取有关的序列。
(1)从微生物克隆基因
首先，将微小根毛霉菌株NBRC 9742接种在GSYFe斜面上并在40℃培养5天。用金属锥（metalcone）将真菌细胞一起收集到2 mL带螺旋帽的微管中在-80℃冷冻。使用Multi-beads Shocker (Yasui Kikai Corporation)在2,000 rpm通过开启时间30秒和关闭时间30秒的5个循环重复破裂真菌细胞，同时在4℃冷却冷冻的样品。使用NucleoSpin RNAPlant (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG)和Oligotex-dT30<Super> mRNA纯化试剂盒(Takara Bio Inc.)从该样品得到mRNA溶液。
将得到的mRNA用作模板与引物1 (SEQ ID NO: 22)和3'-Full RACE Core Set(Takara Bio Inc.)一起扩增编码内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶的基因，并将扩增产物克隆进pUC19载体中。该基因由2091个碱基（包括终止密码子）组成(SEQ ID NO: 8)，且编码由696个氨基酸残基(SEQ ID NO: 1)组成的具有78,874的分子量的蛋白。该蛋白被命名为Endo-Rp。
还以类似的方式从微小根毛霉菌株NBRC 9740、9741和9743克隆了Endo-Rp同系物Endo-Rp2 (SEQ ID NO: 2的氨基酸序列)、Endo-Rp3 (SEQ ID NO: 3的氨基酸序列)和Endo-Rp4 (SEQ ID NO: 4的氨基酸序列)。NBRC 9740仅具有Endo-Rp2序列，而NBRC 9741具有Endo-Rp2和Endo-Rp3序列，且NBRC 9743具有Endo-Rp3和Endo-Rp4序列。所述序列中的每一个与Endo-Rp的氨基酸序列具有99%同一性。
(2)与公开的基因组序列的对比
将Endo-Rp、Endo-Rp2、Endo-Rp3和Endo-Rp4的序列与由The Genozymes Project提供的数据库中所公开的推定序列进行比较。用SEQ ID NO: 7中的Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg置换与SEQ ID NO: 1中的位置193处的Lys对应的氨基酸，从而导致不同的蛋白长度(图4)。从微小根毛霉菌株NBRC 9742提取基因组DNA，并将Endo-Rp基因的全长ORF序列通过PCR进行扩增和分析。分析结果指示，具有公开的基因组的菌株的假定序列具有不同的预测的内含子位置。因此，这可以导致如上所述的氨基酸序列中的差异。
Endo-Rp的氨基酸序列也用于执行针对由NCBI提供的数据库的BLAST检索。来自检索的结果表明，米赫根毛霉菌株CAU432（它是微小根毛霉的一个有关物种）的基因组序列具有与Endo-Rp对应的序列。将该序列信息用于鉴别预期编码内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶的核酸序列(SEQ ID NO: 18)和其氨基酸序列(SEQ ID NO: 6)。由该氨基酸序列组成的蛋白被命名为Endo-Rm。Endo-Rm与Endo-Rp是67%同源的。
实施例3 Endo-Rp在大肠杆菌中的表达
使用由Thermo Fisher Scientific, Inc.提供的GeneArt Strings DNA片段，从在实施例2中得到的真菌衍生的内-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶基因设计为在大肠杆菌中的异源表达优化的核酸序列(SEQ ID NO: 15)。使用所述序列来产生编码多肽的基因，所述多肽具有添加至Endo-Rp的C-端的6个His-标签。将其克隆进pET24b(+)载体中，然后将所述载体引入要转化的大肠杆菌BL21 (DE3)中。将转化以后的细菌培养物接种进在100 mL烧瓶中的25mL TB培养基(50 μg/mL卡那霉素)中，并在37℃在摇动下培养过夜(160 rpm，过夜)。将20mL预培养培养基接种进在2.5 L带有挡板的烧瓶内的1 L TB培养基(50 μg/mL卡那霉素,0.01%消泡剂204, 2 mM MgSO4)中并在37℃在摇动下培养(200 rpm, 2小时)。在将培养箱温度降低至16℃并培养3小时以后，以0.2 mM的终浓度加入IPTG，并执行另外的培养24小时。
将收获的细菌细胞悬浮于100 mL结合缓冲液(50 mM HEPES (pH 8.0), 0.5 MNaCl, 20 mM咪唑, 5%甘油)，声处理，并离心。将来自离心的上清液用Ni Sepharose 6Fast Flow和HiLoad 16/60 Superdex 200 pg柱(GE Healthcare)纯化。收率(从A280和消光系数计算)为16.9 mg/L液体培养基。
也为Endo-Rp同系物和Endo-Rm执行类似的异源表达。也执行Endo-Rp同系物的表达，所述Endo-Rp同系物包括在实施例2中鉴别出的酶和Lys残基如在其它同系物中那样置换为SEQ ID NO: 7中的从位置193至198的Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg的序列(Endo-Rp5,SEQ ID NO: 5)。基于SEQ ID NO: 6的氨基酸序列，通过利用GeneArt Strings DNA片段(Thermo Fisher Scientific, Inc.)得到为大肠杆菌优化的Endo-Rm基因序列(SEQ IDNO: 20)。根据PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit (Takara Bio Inc.)的标准方案，通过将突变引入用于Endo-Rp的大肠杆菌表达的载体(所述载体包含SEQ ID NO: 15的碱基序列)中而得到其它基因(Endo-Rp2：SEQ ID NO：16，Endo-Rp3：SEQ ID NO：17，Endo-Rp4：SEQID NO：18，Endo-Rp5：SEQ ID NO：19)。
除了主培养在500 mL带有挡板的烧瓶中的100 mL TB培养基中以外，在上述条件下诱导表达。将收获的细菌细胞悬浮于6 mL结合缓冲液中，声处理并离心。将来自离心的上清液用His GraviTrap柱(GE Healthcare)纯化。
纯化以后，在SDS-PAGE上观察到除了SEQ ID NO: 7以外表达的蛋白的带。每种蛋白的收率如下：Endo-Rp为2.067 mg (20.67 mg/L培养物)，Endo-Rp2为2.139 mg (21.39mg/L培养物)，Endo-Rp3为2.765 mg (27.65 mg/L培养物)，Endo-Rp4为2.301 mg (23.01mg/L培养物)，Endo-Rp5为2.187 mg (21.87 mg/L培养物)，和Endo-Rm为1.650 mg (16.50mg/L培养物)。
实施例4 Endo-Rp对复杂型糖链的水解活性
使用上述方法测定在实施例3中得到的酶的水解活性。将Endo-M (由Tokyo ChemicalIndustry Co., Ltd.制造)、EndoS和Endo-Om用作该测定的比较对照。
制备了含有200 mM磷酸钾缓冲液(pH 6.25)、69 mM SGP和0.02 μM酶(列出的所有浓度都代表在反应溶液中的终浓度)的反应溶液(总体积: 100 μL)。将含有Endo-Rp或Endo-Om的反应溶液在50℃温育，同时将含有Endo-M或Endo-S的反应溶液在37℃温育。在1小时、2小时、6小时、12小时、18小时和24小时以后将反应溶液取样并在上述分析条件A下通过LC-MS分析。在图5中显示了反应收率的时间依赖性变化。比活性如下：Endo-Rp为0.21 μmol/min/ μg，Endo-M为0.0071 μmol/min/ μg，Endo-S为0.0022 μmol/min/ μg，和Endo-Om为0.060 μmol/min/ μg。Endo-Rp的比活性是Endo-M的比活性的30倍，是Endo-S的比活性的100倍，且是Endo-Om的比活性的4倍。这证实，与已知的酶相比，Endo-Rp对SGP具有非常高的水解活性。
还针对它们的活性测定了在实施例3中表达和纯化的Endo-Rp同系物。制备了含有200 mM磷酸钾缓冲液(pH 6.25)、69 mM SGP和0.2 μM酶(列出的所有浓度都代表在反应溶液中的终浓度)的反应溶液(总体积: 30 μL)，并在50℃温育1小时。在1小时以后的水解率如下：Endo-Rp为87%、Endo-Rp2为91%、Endo-Rp3为84%、Endo-Rp4为79%、Endo-Rp5为94%和Endo-Rm为23%。这证实，Endo-Rp2、Endo-Rp3、Endo-Rp4和Endo-Rp5对SGP具有与Endo-Rp的水解活性稍微类似的水解活性。
实施例5 测定Endo-Rp的最佳反应条件
测定了Endo-Rp的最佳反应温度和pH。
为了测定反应温度，制备了含有200 mM磷酸钾缓冲液(pH 6.25)、69 mM SGP和0.02 μM酶(列出的所有浓度都代表在反应溶液中的终浓度)的反应溶液(总体积: 100 μL)，并在45、50、52、55、57、60和63℃的温度温育18小时以计算水解率。结果显示在图6中。
为了测定反应pH，制备了含有200 mM醋酸钠缓冲液或磷酸钾缓冲液、69 mM SGP和0.02 μM酶(列出的所有浓度都代表在反应溶液中的终浓度)的在pH 4.5、5.0、5.5、5.8、6.0、6.2、6.5、7.0和7.5的反应溶液(体积：100 μL)，并在50℃温育23小时以计算水解率。结果显示在图7中。
测定的结果表明，Endo-Rp的最佳反应温度是约55℃且最佳反应pH是约5.8。
实施例6 Endo-Rp的转糖基活性
如下测定了Endo-Rp是否具有转糖基活性。
制备了含有1.6 M磷酸钾缓冲液(pH 6.25)、69 mM SGP、690 mM (GlcNAc-)Asn(由WATANABE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.制造)和0.1 μM酶(列出的所有浓度都代表在反应溶液中的终浓度)的反应溶液(总体积: 30 μL)并在50℃温育4小时。
在如下所述的条件下通过LC-MS分析反应溶液。
MS设备: 6130 Quadrupole LC-MS (Agilent Technologies, Inc.)
电离: ESI
模式: 正
HPLC: 1260 Infinity LC (Agilent Technologies, Inc.)
柱：Inertsil ODS-3 2 μmφ2.1 x 50 mm (GL Sciences Inc.)
柱温度: 40℃
流动相A: H2O + 0.1% HCOOH
流动相B: 乙腈+ 0.1% HCOOH
梯度(流动相B%): 0.8%(0 min), 2%(5 min), 2%(6 min)
流速: 0.7 mL/min
结果显示在图8中。仅在没有受体的条件下检测到SGP（它是供体）和SG (10)（它是水解物）的峰。在具有作为受体加入的(GlcNAc-)Asn的条件下检测到SG (10)和(SG-)Asn（它是转糖基反应产物）的峰。这些结果证实，Endo-Rp具有转糖基活性。
实施例7 Endo-Rp N172Q的产生
为了得到具有受抑制的对糖链的水解活性、同时保留Endo-Rp的转糖基活性的酶，将在位置172处的天冬酰胺(N)（它是活性中心）用谷氨酰胺(Q)置换以产生N172Q变体。通过使用如在实施例3中所述的方法在SEQ ID NO: 9所示的编码Endo-Rp的碱基序列中用CAA置换从位置514至516的AAC，制备N172Q变体。
如下评估转糖基活性。制备了含有1.6 M磷酸钾缓冲液(pH 6.25)、69 mM SGP、690mM (GlcNAc-)Asn和1.0 μM酶(列出的所有浓度都代表在反应溶液中的终浓度)的反应溶液(总体积: 30 μL)并在50℃温育。在反应的20分钟、40分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、20小时、24小时和48小时以后将反应溶液取样，并在实施例6所述的条件下通过LC-MS分析。
在图9中显示了反应收率的时间依赖性变化。Endo-Rp WT快速地水解转糖基反应产物(SG-)Asn，而N172Q变体造成更少的水解，这证实，N172Q变体以高收率产生(SG-)Asn。
实施例8 Endo-Rp的修饰
为了得到与Endo-Rp N172Q变体的转糖基活性相比具有增加的转糖基活性的酶，尝试了修饰。基于Endo-A (PDB ID: 3FHQ)和Endo-D (PBD ID: 2W92)的结构，设计了在表1中列出的各种突变体。测定了这些突变体对SGP的水解活性和转糖基活性。
如下评估转糖基活性。制备了含有1.6 M磷酸钾缓冲液(pH 6.25)、69 mM SGP、690mM GlcNAc-AcA和1.0 μM酶(列出的所有浓度都代表在反应溶液中的终浓度)的反应溶液(总体积: 30 μL)并在50℃温育。在反应的1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时和96小时以后将反应溶液取样并在上述LC-MS分析条件B下通过LC-MS分析。
如下评估水解活性。制备了含有1.6 M磷酸钾缓冲液(pH 6.25)、69 mM SG-A和0.2μM酶(列出的所有浓度都代表在反应溶液中的终浓度)的反应溶液(总体积: 20 μL)并在50℃温育。在反应的1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时和72小时以后将反应溶液取样并在上述LC-MS分析条件B下通过LC-MS分析。
表1显示了当将Endo-Rp的转移和水解的比活性设定为100时每种变体的相对比活性(水解和转糖基)。结果显示，具有突变N172A、N172C、N172D、N172E、N172G、N172H、N172I、N172M、N172S、N172T、N172V、D176R、Y214F、S216V、L245S、N246D、T275I、F283S、L306I、F307Y、F307H、A310D和E314Q的变体具有受抑制的水解活性、维持的转糖基活性和增加的转糖基活性比(转糖基活性/水解活性；在表中的转移/水解比率)。具有突变W278F和W278Y的变体也具有增加的转糖基活性和水解活性，但是减小了转糖基活性比。
[表1-1]
突变体 相对转糖基活性% 相对水解活性% 转移/水解比率
WT 100 100 1.00
N172Q 25 6.7 3.71
N172H 16 4.4 3.59
N172A 9.5 2.2 4.27
N172C 6.2 3.1 2.01
N172D 48 27 1.81
N172E 9.2 5.3 1.74
N172F ND 1.4 -
N172G 10 2.4 4.12
N172I 13 3.3 3.86
N172K ND 1.5 -
N172L ND 1.7 -
N172M 6.7 3.2 2.13
N172P 0.67 0.94 0.71
N172R ND 0.34 -
N172S 6.7 5.8 1.16
N172T 11 6.2 1.75
N172V 12 6.6 1.83
N172W ND 0.15 -
N172Y ND 0.36 -
N172Q/E126A 0.15 0.36 0.42
N172Q/Y214F 5.5 3.1 1.77
N172Q/Y214A 0.16 0.48 0.33
N172Q/V223R 0.020 0.30 0.05
N172Q/W225H 0.92 0.54 1.69
N172Q/W248N 0.55 1.2 0.45
N172Q/N246L ND 0.32 -
[表1-2]
N172Q/N246A ND ND -
N172Q/Y247F 2.0 1.0 1.98
N172Q/W278E 0.080 0.18 0.44
N172Q/W278R ND 0.23 -
N172Q/W278F 28 8.1 3.46
N172Q/W278Y 29 9.5 3.02
N172Q/F307Y 4.2 1.5 2.86
N172Q/A310D 0.60 0.60 0.99
W278F 93 155 0.60
W278F/D176R 104 129 0.81
W278F/Y214F 189 98 1.92
W278F/S216V 65 13 5.17
W278F/L245S 120 74 1.63
W278F/N246D 15 0.60 24.71
W278F/N246V ND ND -
W278F/T275I 156 129 1.21
W278F/D276N 2.2 0.46 4.83
W278F/R280E ND 0.080 -
W278F/F283S 119 50 2.38
W278F/L306I 113 141 0.80
W278F/F307Y 207 62 3.32
W278F/F307H 22 9.5 2.31
W278F/A310D 93 23 3.98
W278F/E314Q 95 141 0.67
W278F/N172D 34 33 1.01
W278F/N172D/D176R 20 19 1.06
W278F/N172D/Y214F 15 6.6 2.34
W278F/N172D/S216V 1.3 ND -
W278F/N172D/L245S 19 14 1.33
W278F/N172D/N246D 0.17 ND -
W278F/N172D/N246V ND ND -
W278F/N172D/T275I 22 19 1.19
W278F/N172D/D276N 0.11 ND -
W278F/N172D/R280E ND ND -
W278F/N172D/F283S 19 5.8 3.36
W278F/N172D/L306I 33 27 1.20
W278F/N172D/F307Y 14 1.5 9.43
W278F/N172D/F307H 2.3 0.16 14.05
W278F/N172D/A310D 8.2 0.87 9.41
[表1-3]
W278F/N172D/E314Q 18 22 0.79
N172Q/Y214F/F307Y 0.25 0.13 1.85
Y214F/F307Y 20 6.6 3.03
Y214F/L306I/F307Y 34 8.3 4.12
ND: 未检测。

Claims (19)

1.一种具有以下性质(A)和(B)的多肽：
(A) 所述多肽包含与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有75%或更多同一性和95%或更多相似性的氨基酸序列，且是不同于SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的氨基酸序列；和
(B) 所述多肽在45-60℃的任何温度对复杂糖链表现出的水解活性和/或转糖基活性是最大活性值的40%或更多。
2.根据权利要求1所述的多肽，所述多肽具有以下性质(A)和(B)：
(A) 所述多肽包含与SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有75%或更多同一性和95%或更多相似性的氨基酸序列，和与SEQ ID NO: 1的氨基酸位置191-195的氨基酸序列对应的位置处的Leu-Ala-Lys-Leu-Leu (LAKLL)的氨基酸序列；
(B) 所述多肽在45-60℃的任何温度对复杂糖链表现出的水解活性是最大活性值的40%或更多。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中在50℃对复杂糖链的水解活性是最大活性值的60%或更多。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的多肽，其中，除了具有性质(A)和(B)以外，(C)所述多肽在大肠杆菌中的重组表达中以10 mg/L培养物或更多的量产生。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的氨基酸位置54-341的区域具有85%或更多序列同一性。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的多肽，其中氨基酸D276、V223、W225、Y247和W248中的至少一个保持不变且优选地至少D276保持不变。
7.根据权利要求1-3中的任一项所述的多肽，其中所述多肽是由SEQ ID NO: 1的氨基酸序列组成的多肽或由在SEQ ID NO: 1的氨基酸序列中具有至少一个选自A128T、D333G、I434L、V460A、I527V、K569T、F610S和H626R的突变的氨基酸序列组成的多肽。
8.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽由SEQ ID NO: 1-6中的任一个的氨基酸序列组成。
9.根据权利要求1-6中的任一项所述的多肽，其中所述多肽具有满足性质(A)的氨基酸序列且具有在SEQ ID NO: 23中所含的突变中的至少一个。
10.根据权利要求9所述的多肽，其中所述多肽具有在至少一个选自N172、D176、Y214、S216、L245、N246、T275、L306、F307和A310的氨基酸中的突变且具有增加的转糖基活性。
11.根据权利要求7所述的多肽，其中所述多肽具有至少一个选自以下的突变：
其中N172被置换为Gln、Asp、Gly、Ala、Phe、Cys、His、Ile、Ser、Thr、Val或Met的突变；其中D176被置换为Arg的突变；其中Y214被置换为Phe的突变；其中S216被置换为Val的突变；其中L245被置换为Ser的突变；其中N246被置换为Asp的突变；其中T275被置换为Ile的突变；其中F283被置换为Ser的突变；其中L306被置换为Ile的突变；其中F307被置换为Tyr的突变；其中A310被置换为Asp的突变；和其中E314被置换为Gln的突变。
12.根据权利要求9-11中的任一项所述的多肽，其中所述多肽具有其中W278被置换为Phe或Tyr的突变。
13.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-12中的任一项所述的多肽。
14.根据权利要求13所述的多核苷酸，所述多核苷酸具有SEQ ID NO: 8-17的核苷酸位置1-2088的核苷酸序列和SEQ ID NO: 18-19的核苷酸位置1-2091的核苷酸序列中的任一个的核苷酸序列。
15.一种表达质粒，其包含根据权利要求13或14所述的多核苷酸。
16.一种用根据权利要求15所述的质粒转化的宿主细胞。
17.根据权利要求16所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是用包含多核苷酸的质粒转化的大肠杆菌，所述多核苷酸包含SEQ ID NO: 9、11、13、15或17的核苷酸位置1-2088的核苷酸序列或SEQ ID NO: 19的核苷酸位置1-2091的核苷酸序列。
18.一种生产根据权利要求1-12中的任一项所述的多肽的方法，所述方法包括，培养根据权利要求16或17所述的宿主细胞和从得到的培养物收集根据权利要求1-12中的任一项所述的多肽。
19.一种试剂，其包含根据权利要求1-12中的任一项所述的多肽。
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