TW201827454A - 新穎內－β－Ｎ－乙醯基胺基葡萄糖苷酶 - Google Patents

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Abstract

本發明提供分離自假根毛黴(Rhizomucor)屬的真菌且在高溫條件下保持活性之新穎內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶(endo-β-N-acetylglucosaminidase)、其各種的突變酵素、編碼該酵素之基因、重組質體、藉由該質體而轉形之轉形體等。

Description

新穎內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶
本發明係關於在高溫條件下保持活性之內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶(endo-β-N-acetylglucosaminidase)、編碼該酵素之基因、重組質體、藉由該質體而轉形之轉形體等。
糖蛋白廣泛存在於動植物的組織、真核微生物的細胞膜、壁等。近年來，逐漸明白糖蛋白的糖鏈在細胞的分化、癌化、細胞間的辨識等機制上扮演重要的角色，且為了闡明此機制而正針對糖鏈的結構與功能之關聯性進行研究。在新藥開發研究中，正進行將抗體等糖蛋白所含之糖鏈取代成均一結構之糖鏈的糖鏈改造(remodeling)、將肽或低分子化合物進行糖鏈修飾等的嘗試。在此種新藥開發研究中，大多使用利用內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶等酵素從天然存在之具有均一糖鏈的糖蛋白/糖肽所切取之糖鏈。
作為動物的糖蛋白所含之糖鏈的代表者，可舉出鍵結於天冬醯胺酸側鏈之N鍵結型糖鏈。N鍵結型糖鏈，依據其結構而被分類成高甘露糖(high mannose) 型、雜合(hybrid)型及複合(complex)型，但具有在還原末端連接有二個N-乙醯基胺基葡萄糖(GlcNAc)之幾丁二糖(chitobiose)結構作為共通結構。內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶係兼具以下活性之酵素：將此幾丁二糖結構之間的醣苷鍵進行水解的活性、及使所切取之糖鏈結合至具有特定結構之受體(acceptor)的轉醣苷化(transglycosylation)活性。內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶係分離自各種生物種，分別具有不同的基質特異性，且因應目的而被適當地運用。其中，就將複合型糖鏈作為基質之內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶而言，已報導有以下者。
Endo-M係源自凍土毛黴(Mucor hiemalis)的酵素，在將對於高甘露糖型的Man8GlcNAc2之活性設定為100%時，相對於複合型二分支糖鏈(agalacto biantennary PAsugar)，其基質特異性為4.4%(非專利文獻1：Fujita et al.,(2004)Arch Biochem Biophy.432：p41-49)。在相同文獻中，針對使用大腸桿菌之Endo-M的表現，報導其在37℃下的誘導表現中，因全部成為不溶性凝集體，且若將誘導溫度變更成20℃，則可溶性部分(fraction)的酵素活性弱，故探討利用酵母之表現，並且認為難以在大腸桿菌中適當表現。又，已知在40℃以上會去活化。
Endo-Om係源自為酵母之微小歐加鐵酵母(Ogataea minuta)的酵素(專利文獻1：WO2013/051608號公報或US2014-0313246號公報)，且將複合型糖鏈作為 基質，在水解反應中之最適溫度被報導為50℃。關於在酵母以外的表現則為未知。
Endo-F2及Endo-F3係源自米爾伊莉莎白菌(Elizabethkingia miricola)的酵素(非專利文獻2：Tarentino AL et al.,(1993)J Biol Chem.268：p9702-9708)，Endo-F2雖水解高甘露糖型及二分支複合型糖鏈，但沒有雜合型糖鏈的水解活性。另一方面，Endo-F3雖水解二分支或三分支複合型糖鏈，但沒有高甘露糖型、雜合型糖鏈的水解活性。
Endo-S係源自化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的酵素，雖僅水解二分支複合型糖鏈，但沒有高甘露糖型、雜合型糖鏈的水解活性(非專利文獻3：Goodfellow JJ et al.,(2012)J Am Chem Sci.134：p8030-8033)。
Endo-CE係源自秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)的酵素，雖水解高甘露糖型及二分支的複合型糖鏈，但不明白是否可剪切雜合型糖鏈(非專利文獻4：Kato T et al.,(2002)Glycobiology 12：p581-587)。在水解反應中之最適溫度被報導為20℃。
相較於以往所知之Endo-M或Endo-Om，Endo-CC係被報導為能在大腸桿菌中表現之酵素，但在非專利文獻5(Y.Eshima et al.,(2015)PLoS One.21；10(7)：e0132859)中，被報導在大腸桿菌中的表現量為0.1mg/250mL培養基(=0.4mg/L培養基)。在水解反應中之最適溫度被報導為35℃。
在將所切取之糖鏈使用作為醫藥品原料之情形中，由提升反應效率、防止混入雜菌之觀點來看，期望在50℃左右的高溫下保持活性之酵素。又，在使用複數種的基因重組材料作為醫藥品的原材料之情形中，被認為藉由使宿主生物種一致，而降低醫藥品的安全性問題。大多選擇大腸桿菌作為此種原材料的宿主，而期望在大腸桿菌具有一定量以上的生產能力。然而，關於周知的將複合型糖鏈作為基質之內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶，尚未得知在高溫條件下維持活性且在大腸桿菌顯示良好生產能力者。
為嗜熱性真菌之一種的小假根毛黴(Rhizomucor pusillus，R.pusillus)，其最適生育溫度為35~45℃，作為起士製造用凝乳酶的生產菌而為人所知。關於R.pusillus的基因體序列，源自R.pusillus CBS 183.67株的序列資訊被公開在Genozymes Project(Concordia University)的資料庫上。在相同資料庫中，登錄有與Endo-M具有41.56%之同源性的基因及其所編碼之胺基酸序列(序列識別號7)，但未記載關於活性之註解，至今未有實際取得源自R.pusillus之內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶的報導。又，在資料庫上被推定為內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶之序列識別號7的胺基酸序列(以下稱作「周知推定序列」)，其191位~198位的胺基酸序列為Leu-Ala-Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg(LANTYYIR)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]WO2013/051608號公報或US2014-0313246號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Fujita et al., (2004) Arch Biochem Biophy. 432: p41-49
[非專利文獻2]Tarentino AL et al., (1993) J Biol Chem. 268: p9702-9708
[非專利文獻3]Goodfellow JJ et al., (2012) J Am Chem Sci. 134: p8030-8033
[非專利文獻4]Kato T et al., (2002) Glycobiology 12: p581-587
[非專利文獻5]Y. Eshima et al., (2015) PLoS One. 21; 10 (7): e0132859
本發明之目的在於提供一種能藉由大腸桿菌生產且在高溫條件下保持對於複合型糖鏈之水解活性的新穎內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶。
本發明人等為了解決上述課題而專心致志地研究的結果，發現屬於小假根毛黴之複數菌株的培養上清液在高溫條件下對於複合糖鏈具有良好的水解活性，且選殖自該菌株之內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶在使 用大腸桿菌之產生系統中顯示良好的表現效率，而且所產生之酵素保持該水解活性，並藉由進行更進一步的研究而完成本發明。
本發明提供以下的發明。
(1)一種多肽，其具有以下(A)及(B)之特性：(A)包含與序列識別號1所記載之胺基酸序列具有75%以上的同一性及95%以上的相似性之胺基酸序列，且為與序列識別號7的胺基酸序列不同之胺基酸序列；(B)對於複合糖鏈之水解活性及/或轉醣苷化活性係在45~60℃之任一溫度下顯示最大活性值的40%以上。
(2)如(1)之多肽，其具有以下(A)及(B)之特性：(A)包含與序列識別號1所記載之胺基酸序列具有75%以上的同一性及95%以上的相似性之胺基酸序列，且相當於序列識別號1之胺基酸編號191~195的胺基酸序列之胺基酸序列為Leu-Ala-Lys-Leu-Leu(LAKLL)；(B)對於複合糖鏈之水解活性係在45~60℃之任一溫度下顯示最大活性值的40%以上。
(3)如(1)之多肽，其特徵為在50℃下之對於複合糖鏈之水解活性係顯示最大活性值的60%以上。
(4)如(1)~(3)中任一項之多肽，其除了(A)及(B)之特性，更以(C)在使用大腸桿菌之基因重組表現中，顯示10mg/L培養基以上作為特徵。
(5)如(1)~(4)中任一項之多肽，其特徵為在序列識別號1之胺基酸序列中，胺基酸編號54~341的區域中之序列同一性為85%以上。
(6)如(1)~(5)中任一項之多肽，其特徵為維持D276、V223、W225、Y247及W248的胺基酸中之至少一個(較佳為至少維持D276)。
(7)如(1)~(3)中任一項之多肽，其特徵為其係包含序列識別號1之胺基酸序列之多肽、或包含下述胺基酸序列之多肽：在序列識別號1之胺基酸序列中具有選自包含A128T、D333G、I434L、V460A、I527V、K569T、F610S及H626R之群組的至少一個突變之胺基酸序列。
(8)如(1)之多肽，其特徵為其包含序列識別號1~6之任一胺基酸序列。
(9)如(1)~(6)中任一項之多肽，其特徵為具有滿足特性(A)之胺基酸序列，且具有至少一個序列識別號23所示之突變。
(10)如(9)之多肽，其特徵為在選自N172、D176、Y214、S216、L245、N246、T275、L306、F307及A310之至少一個胺基酸具有突變，且具有經增強之糖鏈轉移活性。
(11)如(7)之多肽，其特徵為具有選自以下之群組的至少一個突變：N172被取代成Gln、Asp、Gly、Ala、Phe、Cys、His、Ile、Ser、Thr、Val或Met之突變；D176被取代成Arg之突變；Y214被取代成Phe之突變；S216被取代成Val之突變；L245被取代成Ser之突變；N246被取代成Asp之突變；T275被取代成Ile之突變；F283被取代成Ser之突變；L306被取代成Ile之突變；F307被取代成 Tyr之突變；A310被取代成Asp之突變；及E314被取代成Gln之突變。
(12)如(9)~(11)中任一項之多肽，其特徵為具有W278被取代成Phe或Tyr之突變。再者，作為具體的突變體，係以在序列識別號1~6之任一胺基酸序列中，具有N172Q、N172D、W278F、N172Q/W278F、N172D/W278F或Y214/L306I/L307Y的突變作為特徵之(11)之多肽。
(13)一種多核苷酸，其編碼如(1)~(12)中任一項之多肽。
(14)如(13)之多核苷酸，其具有序列識別號8~17之核苷酸編號1~2088的核苷酸序列及序列識別號18~19之核苷酸編號1~2091的核苷酸序列之任一核苷酸序列。
(15)一種表現用質體，其包含如(13)或(14)之多核苷酸。
(16)一種宿主細胞，其係經如(15)之質體所轉形而成。
(17)如(16)之宿主細胞，其係經包含多核苷酸之質體所轉形而成之大腸桿菌，該多核苷酸包含序列識別號9、11、13、15或17之核苷酸編號1~2088的核苷酸序列或序列識別號19之核苷酸編號1~2091的核苷酸序列。
(18)一種如(1)~(12)中任一項之多肽的製造方法，其包含將如(16)或(17)之宿主細胞進行培養並自所得之培養物回收如(1)~(12)中任一項之多肽的步驟。
(19)一種試劑，其含有如(1)~(12)中任一項之多肽。
本發明之新穎內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶，因在50℃以上的高溫反應條件下保持對於複合型糖鏈之良好的水解活性，故在利用該酵素之醫藥品製造中，防止細菌的增殖，在可期待高反應效率之高溫條件下，能安全且有效率地取得糖鏈。又，本發明之酵素係藉由使用大腸桿菌之異種表現系統而能以良好的酵素量進行生產。在用於製造醫藥品之情形中，在藉由大腸桿菌產生該酵素以外的原材料(生理活性肽/蛋白質、其他酵素等)之情形中，因使生物材料的宿主生物種一致，故變得容易評價對於最終製品的安全性之因原料的宿主生物種所致的影響。
[圖1]圖1顯示利用Endo-Rp之將SGP作為基質的水解反應之示意圖。
[圖2]圖2係SGP的酵素處理前溶液(上)及粗酵素處理液(下)之利用分析條件A之LC-MS(Liquid chromatography-mass spectrometer，液相層析質譜儀)分析結果的圖表。在3~4分鐘所檢出之大峰表示SGP，在4.5~5分鐘附近所檢出之峰表示SG(10)。
[圖3]圖3係顯示源自各種R.pusillus株之粗酵素(NBRC 9740(△)、NBRC 9741(▲)、NBRC 9742(□)及NBRC 9743(■))及Endo-M(●)之對於SGP之水解活性的溫度依賴性之圖表。X軸表示反應溫度(℃)，Y軸表示水 解率。
[圖4]圖4表示Endo-Rp與其各種同系物(homologue)、Endo-Rm及周知的推定序列之胺基酸序列的比對(alignment)。
[圖5]圖5係顯示Endo-Rp(○)、Endo-M(●)、Endo-S(■)及Endo-Om(▲)之對於SGP之水解活性的經時變化之圖表。X軸表示反應開始後之經過時間，Y軸表示水解率。
[圖6]圖6係顯示Endo-Rp之對於SGP之水解活性的溫度依賴性之圖表。X軸表示反應溫度(℃)，Y軸表示水解率。
[圖7]圖7係顯示Endo-Rp之對於SGP之水解活性的pH依賴性之圖表。X軸表示反應液的pH值，Y軸表示水解率。
[圖8]圖8係SGP單獨(上)及SGP+受體((GlcNAc-)Asn)(下)之Endo-Rp反應液的LC-MS分析結果之圖表。在1分鐘附近所檢出之大峰表示SGP，在4~5分鐘附近所檢出之峰表示SG(10)，在3分鐘附近所檢出之峰表示(SG-)Asn。
[圖9]圖9係顯示Endo-Rp(○)及Endo-Rp N172Q(■)之轉醣苷化活性的經時變化之圖表。X軸表示酵素反應開始後之經過時間(時間)，Y軸表示轉醣苷化率(%)。
[實施發明之形態]
以下詳細地說明本發明。
本發明提供一種內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶，其係具有以下(A)及(B)之特性的多肽： (A)包含與序列識別號1《Endo-Rp胺基酸序列》所記載之胺基酸序列具有75%以上的同一性及95%以上的相似性之胺基酸序列，且為與序列識別號7的胺基酸序列不同之胺基酸序列；(B)對於複合型糖鏈之水解活性及/或轉醣苷化活性係在45~60℃的範圍顯示最大活性值的40%以上。
本發明中，所謂「複合型糖鏈」，意指人類型N鍵結糖鏈中具有包含下述式(I)及(II)之基本結構的糖鏈。在該糖鏈中，成為在從位於靠近還原末端之甘露糖(β甘露糖)所分支之二個分支鏈(1-3鏈、1-6鏈)上具有GlcNAc之結構，且為具有多種結構者，此多種結構包含其非還原末端側中之半乳糖的有無、唾液酸的有無、以及此等之鍵聯異構性或位置異構性。又，只要具有此基本結構，則亦可具有其他分支結構，亦可具有對於非還原末端側之糖的羥基的一部分或唾液酸的羰基施加化學性修飾之結構。作為此種經化學修飾之複合型糖鏈的例子，已報導將SGP之唾液酸的二元醇進行氧化裂解(oxidative cleavage)後，藉由肟化而修飾之SGP成為Endo-M的基質(Org.Biomol.Chem,2016,14,9501-9518)。
作為代表性的複合型糖鏈，可舉出從雞蛋的蛋黃所萃取之唾液酸糖肽(sialylglycopeptide，SGP：下述式(III)及(IV))所含之糖鏈部分(SG)。SGP可從鳥類的蛋黃進行精製，但市面上有販售已精製之SGP，亦可例如從東京化成工業(股)等購入。
本發明中，所謂「內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶」，係指辨識作為基質的糖鏈，且兼具水解活性與轉醣苷化活性之酵素。天然型的內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶雖兼具兩種活性，但亦可藉由改變胺基酸序列而調整該等之活性，利用使任一活性增強或減弱之突變體或者使任一活性消失，而製作僅保持水解活性或轉醣苷化活性之酵素。本發明不僅包含天然型，亦包含此等之突變酵素。
本發明之酵素所具有的水解活性係將由上述複合型糖鏈的還原末端側之連續二個GlcNAc所構成之核心幾丁二糖(core chitobiose)所含之β1,4醣苷鍵進行特異性水解的活性(本說明書中，只要沒有特別提及，則所謂「水解活性」意指此活性)。例如，在利用將SGP作為基質之內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶之水解反應中，如圖1所示，生成由去除SG的還原末端之GlcNAc的結構所構成之SG(10)(下述式(V)及(VI)的結構)。
該酵素之轉醣苷化活性，係使在還原末端具有GlcNAc且源自糖鏈供體(donor)之糖鏈的還原末端，對於僅具有GlcNAc作為糖的分子或在非還原末端包含具有GlcNAc之糖鏈的分子(以下稱作「受體分子」)進行β1,4醣苷鍵結之活性(以下稱作「轉醣苷化活性」)。例如，在將具有下述式(VII)之結構的(GlcNAc-)Asn作為受體分子且將SGP作為供體分子之轉醣苷化反應中，源自SGP之SG(10)轉移至受體分子之GlcNAc，藉此生成下述式(VIII)所示之(SG-)Asn。同樣地，藉由將具有下述式(IX)的結構之GlcNAc-AcA作為受體分子且將SGP作為供體分子之轉醣苷化反應，而生成下述式(X)所示之SG-A。
<酵素‧胺基酸序列>
本發明之酵素，只要為具有上述特性者，則並不限定於實施例所取得之具體序列的酵素，亦可為自天然所分離之酵素，亦可為基於本發明之酵素的序列資訊而人為製作或改變之酵素。在自天然分離之情形中，作為其分離源之生物種並未特別限定，但較佳為真菌，更佳為嗜熱性真菌，再佳為假根毛黴(Rhizomucor)屬的真菌，又再佳為屬於小假根毛黴或米氏假根毛黴(Rhizomucor miehei)的真菌。
在本發明中，從為嗜熱性真菌之屬於小假根毛黴(R.pusillus)的複數菌株，選殖具有本特性之內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶，並分別將源自R.pusillus NBRC 9742株之酵素命名為Endo-Rp(胺基酸序列：序列識別號1，源自菌株之核酸序列：序列識別號8)、將源自NBRC 9740株之酵素命名為Endo-Rp2(胺基酸序列：序列識別號2，源自菌株之核酸序列：序列識別號10)、將源自NBRC 9741株之酵素命名為Endo-Rp3(胺基酸序列：序列識別號3，源自菌株之核酸序列：序列識別號12)、將源自NBRC 9743株之酵素命名為Endo-Rp4(胺基酸序列：序列識別號4，源自菌株之核酸序列：序列識別號14)。上述之R.pusillus的菌株，全部皆可從NBRC取得，其原產地皆為日本。
另一方面，基於R.pusillus之基因體公開株的序列資訊，關於被公開作為內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶的推定胺基酸序列之序列識別號7的胺基酸序列(推定核酸序列：序列識別號20)，在將其核酸序列在大腸桿 菌表現系中進行最適化而使其在大腸桿菌中表現時，幾乎無法確認到酵素的表現，酵素活性亦非常低(實施例3)。此序列識別號7的胺基酸序列，係相當於序列識別號1之第193號的Lys之胺基酸被取代成Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg之胺基酸的序列(參照圖4)。由將此序列識別號7之193~198的Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg與序列識別號1同樣地取代成Lys之胺基酸序列(序列識別號5)所構成之Endo-Rp5，其被確認在大腸桿菌中之適當表現與水解活性，將具有此胺基酸序列之酵素命名為Endo-Rp5。因此，相當於序列識別號1之第191~195號的序列，被鑑定為對本發明之酵素的特性而言非常重要的區域。
又，對於為R.pusillus的近似種(allied species)之米氏假根毛黴(R.miehei)的公開基因體資訊(R.miehei CAU432株)，基於本發明所特定之Endo-Rp的序列資訊而特定相關序列，在將該蛋白質的核酸序列最適化成大腸桿菌表現用且使該蛋白質在大腸桿菌中表現時，確認到產生一定量的具有本發明之酵素活性的酵素，將此酵素命名為Endo-Rm(胺基酸序列：序列識別號6，源自真菌之核酸序列：序列識別號18)。
Endo-Rp與為其同系物之Endo-Rp2、Endo-Rp3、Endo-Rp4及Endo-Rp5的胺基酸序列之同一性為99%以上，Endo-Rp2係在序列識別號1具有A128T及K569T之突變的同系物，Endo-Rp3係在序列識別號1具有D333G、I434L、I527V、K569T、F610S及H626R 之突變的同系物，Endo-Rp4係在序列識別號1具有V460A及K569T之突變的同系物，Endo-Rp5係在序列識別號1具有K569T之突變的同系物。Endo-Rm之胺基酸序列係與序列識別號1之胺基酸序列顯示96%之相似性、77%之相同者。在此序列中，第54~340號的區域中之同一性高(同一性：89%，相似性：97%)、第190號至第195號之His-Leu-Ala-Lys-Leu-Leu(HLAKLL)係完全相同，係滿足本發明之酵素的特性(A)者。
本發明之酵素係源自真菌的酵素之情形中，其蛋白質可為自真菌的培養上清液或菌體破碎液所分離者，亦可為使用大腸桿菌、酵母等異種表現系統所表現之酵素。已知多數的周知內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶在使用大腸桿菌之異種表現系統中的生產量少，相對於此，本發明之酵素的胺基酸序列具有所謂在使用大腸桿菌之表現系統中顯示良好生產效率之特性。在使源自真菌之蛋白質在大腸桿菌中表現之情形中，一般進行將其核酸序列最適化成適於大腸桿菌表現之序列。即使在經此種最適化之情形中，例如Endo-M N175Q(1胺基酸突變體)在大腸桿菌中之生產量亦為3.7mg/L培養基。又，Endo-CC則被報導為0.4mg/L培養基。相對於此，本發明之酵素在大腸桿菌中之表現量為10mg/L培養基以上(較佳為12mg/L培養基以上，更佳為15mg/L培養基以上)，相較於以往的酵素，顯示更優異之在大腸桿菌中的生產效率。如實施例4之周知推定序列(序列識別號7)與Endo-Rp5(序列識別號5)在大腸桿菌中之生產效率的 結果所示，被認為此特性係藉由胺基酸序列(尤其為包含序列識別號1之胺基酸編號191~195的區域，其中192~194之序列，尤其為第193號之Lys)所賦予之特性。
本發明之酵素的胺基酸序列包含與序列識別號1的全長胺基酸序列顯示75%以上之同一性及95%以上之相似性的胺基酸序列，且為與序列識別號7不同的胺基酸序列(較佳為相當於序列識別號1之胺基酸編號193的胺基酸為Lys(較佳為相當於胺基酸編號192~194之胺基酸序列的胺基酸序列為Ala-Lys-Leu(AKL)，更佳為相當於胺基酸編號191~195之胺基酸序列的胺基酸序列為Leu-Ala-Lys-Leu-Leu(LAKLL)))。
所謂胺基酸序列之同一性(identity)，係指將相對應之胺基酸為完全一致之胺基酸作為相同胺基酸，將相對於全長序列之胺基酸的一致比例進行數值化而成者。另一方面，所謂胺基酸序列之相似性(similarity)，係指只要相對應之胺基酸為具有相似性質之胺基酸，則考慮其相似性，將二個胺基酸序列的關係性進行數值化者。本發明中之序列的同一性及相似性係使用為序列解析軟體之GENETYX-SV/RC(GENETYX股份有限公司製)所算出者，此演算法係該技術領域中所通常使用者。
由與進行結晶結構解析之Endo-A(Zhenlian Ling et al,Journal of Molecular Biology(2009),Vol.389,No.1,Pages 1-9)的序列比較，推測Endo-Rp的活性域係序列識別號1之胺基酸編號1~374的區域。實際上，作為本發明之酵素(Endo-Rp1~5、Endo-Rm)的胺基酸序列 與序列識別號1之序列同一性，在全長序列的比較中為75%以上，但在被推測為活性域之區域中的序列識別號1之胺基酸編號第54~341號的區域中之同一性為89%，顯示非常高的同一性。又，作為全長之胺基酸序列的同一性，較佳為80%以上，更佳為90%以上，再佳為95%以上，最佳為99%以上。又，作為序列識別號1之胺基酸編號54至341之區域的同一性，較佳為85%以上，更佳為90%以上，再佳為95%以上，再更佳為98%以上，最佳為此區域之胺基酸序列係完全相同。
在本說明書中，分子中所含之胺基酸的標記法，係遵循本領域之慣例，在顯示突變處之情形中，係藉由野生型之胺基酸(或核酸)的單一文字符號與其編號(例如，若為第172號的Asn則為「N172」)而表示。又，針對突變，係藉由野生型之胺基酸(或核酸)的單一文字符號、其編號及突變後之胺基酸(或核酸)的單一文字符號(例如，第172號之Asn被取代成Gln之突變係「N172Q」)而表示。又，具有突變之特定突變體，係藉由分子名與突變(例如，Endo-Rp之第172號Asn被取代成Gln之突變體係「Endo-Rp N172Q」)而表示，在具有複數的突變之情形中，表示成以「/」區隔突變之間的形式(例如，在Endo-Rp N172Q中，具有第278號的Trp被取代成Phe之追加突變的突變體係「Endo-Rp N172Q/W278F」)。
本發明之酵素，只要保持與序列識別號1一定以上的同一性‧相似性，則亦可發生胺基酸之突變(取代)、缺失、插入及/或附加，但至少在序列識別號1中 相當於序列識別號7之193~198的序列係與Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg不同的序列，較佳為係相當於序列識別號1之第193號(較佳為第192~194號，更佳為第191~195號)的胺基酸之部位具有與序列識別號1完全相同的胺基酸序列者。又，由實施例8的結果，在使序列識別號1之D276的胺基酸突變之情形中，水解活性及轉醣苷化活性兩者幾乎消失，又，關於E126A、V223R、W225H、Y247F、W248N的各突變體，兩者的活性大幅地減弱。因此，關於此等胺基酸，亦較佳為與序列識別號1相似或相同之胺基酸。如此顯示與序列識別號1完全相同之胺基酸序列的區域，較佳為胺基酸編號第118~332號的區域，更佳為第54~341號的區域，再佳為第1~374號的區域。
在本發明之酵素中，保持上述的序列同一性/相似性，且除了上述完全相同區域，在序列識別號1~6之胺基酸序列的任何區域中，亦可在多處(較佳為5處以下，更佳為3、2或1處)中，每一處有數個(較佳為10個以下，更佳為7個以下，再佳為5、4、3、2或1個)胺基酸取代、缺失、插入及/或附加。此種胺基酸的缺失，例如在自序列識別號1~6之任一胺基酸序列的N端及/或C端使數個胺基酸缺失之情形中，被認為亦可獲得保持作為本發明之酵素的特性之多肽。尤其，較序列識別號1之375更靠近C端側的區域，因非活性域，故容許多個胺基酸變更(取代、缺失、插入及/或附加)。又，關於胺基酸之附加，可列舉在序列識別號1~6之任一胺基 酸序列的N端及/或C端附加已知不影響活性之胺基酸或肽之多肽，作為此種附加肽，可列舉以蛋白精製為目的所附加之標籤(tag)肽(His標籤、GST標籤等)。
作為本發明之酵素中之胺基酸突變的位置，確認至少在序列識別號23中表示為Xaa之位置的至少一處具有突變之酵素，其保持水解活性及轉醣苷化活性的至少一者。本酵素係被推測序列識別號1之胺基酸編號1~374為活性域，但基於周知的Endo酵素之結構活性相關知識以及本發明的揭示內容，可設計突變體，其在活性域具有突變，並且保持活性或被調成所期望的活性。
關於本發明之酵素，由各種同系物的結果，在序列識別號1之A128、D333、I434、V460、I527、K569、F610及H626中，容許胺基酸的取代。又，如實施例8所示，製作將活性域的胺基酸作取代之多個突變體，確認到相較於野生型Endo-Rp，其大多數的表觀活性降低，但保持能利用於糖鏈修飾之程度的一定水解活性及/或轉醣苷化活性(至少任一者的活性之比活性值為野生型Endo-Rp的0.5%以上)，亦確認在此區域中容許一定的胺基酸取代。具體而言，容許以下的胺基酸突變。
N172被認為係與基質接觸之活性殘基，但只要係取代成Trp、Arg及Tyr以外之胺基酸，則保持活性，故廣泛容許取代成具有大體積結構之側鏈的胺基酸以外之胺基酸。又，已確認藉由取代成如Gln、Asp之具有高極性側鏈之胺基酸或Gly、Ala、Phe、Cys、His、Ile、Ser、Thr、Val、Met等，而增強轉移活性比例(轉移活性 /水解活性)。
D176因即使取代成Arg亦維持活性，故被認為容許取代成多種的胺基酸。又，取代成Arg係有用於製作使轉移活性比例增強之突變體。
Y214若為如Ala之小側鏈的胺基酸則兩者的活性大幅降低，因此容許具有較大結構之側鏈的胺基酸。取代成Phe係有用於製作使轉移活性比例增強之突變體。
S216藉由取代成具有小側鏈之胺基酸(較佳為Ala或Val)，而維持轉醣苷化活性且使水解活性降低，因此此等突變係有用於製作使轉移活性比例增強之突變體。
L245因即使取代成Ser亦維持活性，故被認為容許取代成多種的胺基酸。又，取代成Ser係有用於製作使轉移活性比例增強之突變體。
N246雖被認為難以容許大的變化，但因藉由取代成Asp而在維持轉移活性的狀態下使水解活性大幅降低，故此種突變係有用於製作使轉移活性比例增強之突變體突變體。
T275因即使取代成Ile亦維持活性，故被認為容許取代成多種的胺基酸。又，取代成Ile係有用於製作使轉移活性比例增強之突變體。
W278被認為其與基質糖鏈的疏水性相互作用係有助於活性，而被認為容許Tyr、Phe、Ala、Leu、Ile等具有高疏水性側鏈之胺基酸。
F283，因即使取代成Ser亦維持活性，故被認為容許取代成多種的胺基酸。又，取代成Ser係有用於製作使轉移活性比例增強之突變體。
L306未觀察到因取代成Ile而有大的活性變動，但觀察到維持轉醣苷化活性且使水解活性降低之傾向，故被認為有用於製作使轉移活性比例增強之突變體。又，由所推測之立體結構，而有具有大體積側鏈之胺基酸或荷電側鏈之胺基酸較不佳的可能性。
F307被認為容許His、Tyr等各種胺基酸。因藉由取代成His、Tyr而使水解活性較轉醣苷化活性更大幅降低，故有用於製作增強轉移活性比例之突變體。
A310藉由取代成在側鏈具有極性殘基或荷電殘基之胺基酸(較佳為Asp、Glu、Lys、Ser等)，而使水解活性較轉醣苷化活性更大幅降低，因此此等突變係有用於製作增強轉移活性比例之突變體。
E314即使取代成Gln亦無大的活性變動，被認為容許取代。
關於胺基酸的取代/突變，較佳為滿足本發明之特性(A)且為選自序列識別號23所示之突變(序列識別號1之A128、N172、D176、Y214、S216、L245、N246、T275、W278、F283、L306、F307、A310、E314、D333、I434、V460、I527、K569、F610及H626)的至少一個或複數個胺基酸中具有取代之胺基酸序列，更佳為在序列識別號1中具有選自A128T(Rp2)、D333G(Rp3)、I434L(Rp3)、V460A(Rp4)、I527V(Rp3)、K569T(Rp2-4)、 F610S(Rp3)及H626R(Rp3)之至少一個突變之胺基酸序列、或者在此等胺基酸序列中進一步在N172、D176、Y214、S216、L245、N246、T275、W278、F283、L306、F307、A310及E314的至少一個胺基酸具有突變之胺基酸序列，亦可同時發生複數的突變，包含所有突變者亦包含在本發明之酵素中。
因內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶兼具水解活性與轉醣苷化活性，且因保持強水解活性之酵素亦會將藉由轉移活性而轉移至受體分子之糖鏈作為基質而進行水解，故有無法適當取得所期望之轉醣苷化體的情形。因此，在糖鏈修飾化合物的合成中，此種轉移型突變酵素亦為重要。
如上所述，序列識別號1的N172、D176、Y214、S216、L245、N246、T275、F283、L306、F307、A310及E314中之突變的若干個，係被確認使本發明之酵素的轉醣苷化活性提升、或相較於轉醣苷化活性而使水解活性更大幅降低。因此，此等突變係有用於用以設計使轉移活性比例(轉移活性/水解活性)提升之轉移型突變酵素，本發明亦提供此種轉移型突變酵素。作為具體的轉移型突變酵素中之突變，可舉出在序列識別號1中N172被取代成Gln或Asp之突變、D176被取代成Arg之突變、Y214被取代成Phe之突變、S216被取代成Val之突變、L245被取代成Ser之突變、T275被取代成Ile之突變、W278被取代成Phe或Tyr之突變、F283被取代成Ser之突變、L306被取代成Ile之突變、F307被取 代成Tyr之突變、A310被取代成Asp之突變、E314被取代成Gln之突變。作為本發明之轉醣苷化型突變酵素所採用之突變，只要採用此等之中至少一個即可，可為單獨的突變，亦可為包含複數此等突變之多重突變體。較佳的突變體為N172Q、N172D、W278F、N172Q/W278F、N172D/W278F或Y214/L306I/F307Y。
<水解活性‧轉醣苷化活性>
本發明之酵素具有將複合型糖鏈進行水解及/或轉醣苷化之活性，此活性具有在45~60℃之任一溫度中顯示最大活性值的40%以上之特性。
本發明之酵素具有將各種複合型糖鏈作為基質而進行水解之活性，但作為用於將酵素特定之指標，係利用以下的方法，藉由將SGP作為基質進行水解並產生SG(10)之活性而進行評價。
水解反應係製備包含最終濃度200mM之磷酸鉀緩衝液(potassium phosphate buffer)(pH6.25)、69mM SGP及0.02μM的酵素(在空白試樣(blank)中添加相同量的緩衝液)之反應液(總容量100μL)，在指定的溫度下培養(incubate)18小時。以LC-MS分析所得之反應液及空白試樣液，定量SGP及SG(10)，並藉由以下的公式算出水解率及比活性。
[LC-MS分析條件A]
質譜儀裝置：四極液相層析質譜儀6130型(6130 Quadrupole LC-MS，Agilent Technologies公司)
離子化：電噴灑離子化(electrospray ionization，ESI)
模式：正(Positive)
HPLC：1260 Infinity LC(Agilent Technologies公司)
管柱：Inertsil ODS-3 3μm 3.0×50mm(GL Sciences公司)
管柱溫度：40℃
移動相A：H2O+0.1% HCOOH
移動相B：乙腈+0.1% HCOOH
梯度(移動相B%)：0%(0分鐘)、10%(5分鐘)、30%(7分鐘)
流速：0.6mL/min
[水解率]
藉由以下的公式算出水解率。
水解率(%)=反應後之SG(10)濃度(M)/空白試樣之SGP濃度(M)×100
[比活性]
藉由以下的公式算出比活性。
比活性(μmol/min/μg)=生成之SG(10)量(μmol)/反應時間(min)/酵素量(μg)
本發明之酵素具有辨識各種糖鏈供體及受體分子且使糖鏈轉移之活性，但作為用於將酵素特定之指標，係利用以下的方法，藉由將SGP作為基質而使糖鏈轉移且產生SG-A之活性而進行評價。
轉移反應係製備包含最終濃度1.6M之磷酸鉀緩衝液(pH6.25)、69mM SGP、690mM GlcNAc-AcA及1.0μM之酵素(在空白試樣中添加相同量之緩衝液)的反 應液(總容量30μL)，並在指定的溫度下進行培養。以LC-MS分析反應1小時、2小時、4小時、8小時、24小時、48小時及96時間之反應液及空白試樣液，定量SGP、SG(10)及SG-A，藉由以下的公式算出水解率及比活性。
[LC-MS分析條件B]
質譜儀裝置：四極液相層析質譜儀6130型(Agilent Technologies公司)
離子化：電噴灑離子化
模式：正
HPLC：1260 Infinity LC(Agilent Technologies公司)
管柱：Inertsil ODS-3 2μm 2.1×50mm(GL Sciences公司)
管柱溫度：40℃
移動相A：H2O+0.1% HCOOH
移動相B：乙腈+0.1% HCOOH
梯度(移動相B%)：0.8%(0分鐘)、8%(0.1分鐘)、8%(5分鐘)
流速：0.7mL/min
[轉移率]
藉由以下的公式算出轉移率。
轉移率(%)=反應後之SG-A濃度(M)/空白試樣之SGP濃度(M)×100
[比活性]
藉由以下的公式算出比活性。
比活性(μmol/min/mg)=生成之SG-A量(μmol)/反應時間(min)/酵素量(mg)
本發明之酵素，於例如在10℃~70℃之間使溫度適當變化(例如，2、3、5或10℃間隔)而實施利用上述方法之水解活性及/或轉醣苷化活性量測之情形中，將在全部溫度條件下所算出之活性值的最大值設定為100%時，在45℃~60℃的任一溫度(較佳為50℃)下之相對活性值為40%以上，較佳為50%以上，更佳為60%以上，再佳為80%以上，最佳為在該溫度範圍中顯示最大活性值。
比活性通常在酵素的最適溫度條件下被量測。本發明之酵素顯示高的比活性。例如，Endo-Rp在50℃下將69mM SGP作為基質時，顯示0.21μmol/min/μg之比活性，此係Endo-M在37℃下之比活性(0.0071μmol/min/μg)的30倍之優異活性。
本發明之酵素並不限定於本說明書的實施例所具體記載之酵素及突變體，只要滿足特性(A)及(B)，則各種多肽係包含在本發明之酵素中。只要其水解活性及轉醣苷化活性中至少任一者在上述溫度條件下與由序列識別號1之胺基酸序列所構成之酵素相較之下顯示一定程度以上的活性即可，較佳為0.5%以上，更佳為1%以上，再佳為5%以上，再更佳為10%以上，最佳為30%以上。
<基因>
本發明更提供具有編碼上述本發明之酵素的 核酸序列之基因。
此等基因，亦可基於R.pusillus或R.miehei的基因資訊，從自然界(例如，嗜熱性真菌，較佳為假根毛黴屬的真菌，更佳為R.pusillus或R.miehei)進行選殖而作為本酵素之基因。又，可基於酵素之胺基酸序列，遵循周知的基因工程手法，而作成為重組基因。
編碼本發明之酵素的核酸序列，係編碼多肽的序列，該多肽包含與序列識別號1所記載之胺基酸序列具有75%以上的同一性及95%以上的相似性之胺基酸序列，且為與序列識別號7的胺基酸序列不同之胺基酸序列。作為此種核酸序列的例子，亦可為例如序列識別號8、10、12、14、16或18(包含終止密碼子)所記載之真菌本身保持之核酸序列。又，可將酵素之胺基酸序列作為基礎，利用例如GeneArt Strings DNA Fragments(Thermo Fisher Scientific公司製)，製作具有對在大腸桿菌中的表現經最適化之核酸序列的核酸。序列識別號9、11、13、15、17及19之核酸序列係分別將序列識別號1(Endo-Rp)、2(Endo-Rp2)、3(Endo-Rp3)、4(Endo-Rp4)、5(Endo-Rp5)及6(Endo-Rm)之胺基酸序列作為基礎所設計之核酸序列，其係在C端附加有His標籤(His×6)的酵素之經最適化成在大腸桿菌中的表現用之核酸序列。藉由將此種核酸序列作為參考，而可設計例如使如序列識別號23的胺基酸序列之經施以各種胺基酸改變之多肽在大腸桿菌中有效率地表現之核酸序列。
作為編碼本發明之酵素之核酸序列的具體 例，可舉出下述核酸，該核酸係與序列識別號8~17之核苷酸編號1~2088及序列識別號18~19之核苷酸編號1~2091(較佳為編碼Endo-Rp或其同系物之序列識別號8~17之核苷酸編號1~2088)之任一者所記載之核酸序列顯示80%以上，較佳為95%以上，更佳為95%，再佳為98%以上的同一性之核酸序列，且在各核酸序列中之570~585的區域中編碼Leu-Ala-Lys-Leu-Leu之核酸。
<酵素的製造‧精製>
本發明更提供包含編碼上述本發明之酵素之重組基因的質體或表現載體等之基因構築體、藉由該基因構築體所轉形之宿主細胞、本發明之酵素的製造方法等，該製造方法包含自該宿主細胞的培養物回收本發明之酵素的步驟。藉由導入編碼本發明之酵素的基因所轉形之宿主細胞(可適當選擇動物細胞、植物細胞、大腸桿菌、酵母等產生蛋白質所通常使用之細胞等)，可因應細胞的種類而導入適當的質體/表現載體，藉由該質體/表現載體而將對象細胞轉形，在適當的條件下培養該轉形細胞，自其培養物回收本發明之酵素。
對於作成用於轉形之基因構築體，可因應進行表現之細胞種類而選擇通常基因工程領域中已知之載體、質體，並遵循周知的手法進行構築。例如，在使其於大腸桿菌表現之際，可採用pET載體、pCold載體、pFLAG載體等，但不限定於此。
作為大腸桿菌，可列舉BL21(DE3)、Origami(DE3)等。
作為用於使本發明之酵素產生之大腸桿菌的培養條件，例如將已轉形之菌液接種至100mL燒瓶中的25mL TB培養基(50ug/mL康黴素)，在37℃下振盪培養一晚(160rpm，O/N)。可使用將此前培養液20mL植菌至2.5L之附有隔板的燒瓶中之1L TB培養基(50ug/mL康黴素，0.01%消泡劑204(antifoam 204)，2mM MgSO4)，在37℃下進行振盪培養(200rpm，2小時)，將培養箱(incubator)的溫度降低至16℃，進行3小時培養後，以最終濃度成為0.2mM之方式添加IPTG，並培養24小時等之方法，但不限定於此。作為培養基，除了TB培養基以外，還可使用LB培養基、M9培養基等一般的培養基。
本發明之酵素的回收，係利用該酵素的物性，適當組合通常的精製手法而進行，但為了簡便地進行回收，能以預先使His標籤或GST等標籤肽以連接於酵素之形態表現之方式，設計基因構築體，藉此進行利用該標籤肽之親和性的回收。標籤肽可在精製後去除，但在不影響酵素活性之情形下，亦可將連接著標籤肽之酵素直接使用於水解等反應。本發明之酵素中，包含具有連接有此種標籤肽之胺基酸序列的酵素，作為其具體例，係His標籤(His×6)結合於序列識別號1~6之胺基酸序列的C端之胺基酸序列。
本發明之酵素，其胺基酸序列的特性上，在大腸桿菌中之產生效率為良好。本發明之酵素，在使用上述培養條件之大腸桿菌中的產生中，顯示每1L培養基 2mg以上之表現效率，但較佳為每1L培養基4mg以上，更佳為8mg以上，再佳為12mg以上，再更佳為15mg以上。
[實施例]
以下，使用實施例具體地說明本發明。實施例所示者為本發明之實施形態的一例，本發明並不限定於此。
本說明書所記載之蛋白濃度，係使用超微量分光光度計NanoDrop1000(Thermo Fisher Scientific製)或NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific製)而定量。
在本實施例中，作為酵素之內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶之水解活性量測中，反應液中的SGP及SG(10)之檢出係採用上述LC-MS分析條件A，並藉由上述計算公式而算出水解率、比活性。
<實施例1>源自R.pusillus之內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶的表現
將R.pusillus NBRC 9740、NBRC 9741、NBRC 9742及NBRC 9743株植菌至GSYFe斜面培養基(5%葡萄糖，2%大豆蛋白腖(Soytone)，1%酵母萃取液，0.05%FeSO4‧7H2O，1.5%瓊脂)，在40℃下培養5天。採取菌體，使用玻璃製均質機，在2mL之100mM磷酸鉀緩衝液(pH6.25)中進行破碎後，將經過濾器滅菌者作為粗酵素液。
在粗酵素液50μL中添加3mg之SGP(最終濃度21mM)，在50℃下進行培養。以LC-MS解析反應液 的結果，確認SGP消失及SG(10)生成(圖2)，故R.pusillus NBRC 9742被認為具有內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶。
又，使反應溫度變化並進行水解反應，針對各樣本，將最徹底進行反應之溫度中之活性設為100%，算出相對活性。將結果示於圖3。使用於比較對象之Endo-M(東京化成工業(股)製)係在45℃去活性，相對於此，可確認源自R.pusillus之粗酵素的最適溫度為55℃以上。
<實施例2>源自R.pusillus之內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶基因的選殖
藉由以下的方法，進行自R.pusillus NBRC 9742株選殖內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶基因以及由基因體公開序列提取相關序列。
(1)自微生物的基因選殖
首先，將R.pusillus NBRC 9742株植菌至GSYFe斜面培養基，在40℃下培養5天。採取菌體，與錐形金屬殼(metal cone)一起置入附有螺旋帽之2mL微量離心管，在-80℃下凍結。一邊以Multi-beads-shocker(安井器機械公司)將已凍結之樣本冷卻至4℃，一邊以2,000rpm、作動時間(on time)30秒鐘、停機時間(off time)30秒鐘而重複五次循環，將菌體進行破碎。自此樣本，使用NucleoSpin RNA Plant(MACHEREY-NAGEL公司)及Oligotex-dT30<Super>mRNA PurificaTion Kit(TAKARA BIO公司)而獲得mRNA溶液。
將所得之mRNA作為模板，使用引子1(序列 識別號22)與3’-Full RACE Core Set(TAKARA BIO公司)，將編碼內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶之基因進行增幅，並選殖至pUC19載體。此基因包含終止密碼子係由2091個鹼基(序列識別號8)所構成，並編碼由696個胺基酸殘基(序列識別號1)所構成之分子量78,874的蛋白質，將此蛋白質命名為Endo-Rp。
同樣地進行，亦自R.pusillus NBRC 9740、9741及9743株選殖為Endo-Rp的同系物之Endo-Rp2(序列識別號2之胺基酸序列)、Endo-Rp3(序列識別號3之胺基酸序列)及Endo-Rp4(序列識別號4之胺基酸序列)。自NBRC 9740僅檢出Endo-Rp2，但自NBRC 9741檢出Endo-Rp2及Endo-Rp3之二種類的序列，自NBRC 9743檢出Endo-Rp3及Endo-Rp4之二種類的序列。任一者與Endo-Rp之胺基酸序列的同一性皆為99%。
(2)與基因體公開序列的比較
比較Endo-Rp、Endo-Rp2、Endo-Rp3及Endo-Rp4之序列與在Genozymes Project的資料庫所公開之推定序列的結果，相當於序列識別號1之第193號的Lys之胺基酸，其在序列識別號7被取代成Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg，蛋白的長度不同(圖4)。自R.pusillus NBRC 9742株提取基因體DNA，將Endo-Rp基因的ORF全長序列進行PCR增幅並進行解析的結果，暗示在基因體公開株之推定序列中，內含子的預測位置不同，被認為因此而上述胺基酸序列發生差異。
又，使用Endo-Rp之胺基酸序列，對於NCBI 的資料庫進行BLAST檢索的結果，在近緣種(related species)之米氏假根毛黴CAU432株之基因體序列中檢索到對應的序列，故由此序列資訊而特定被認為係編碼內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶之核酸序列(序列識別號18)及胺基酸序列(序列識別號6)，將由此胺基酸序列所構成之蛋白質命名為Endo-Rm。與Endo-Rp之同源性為67%。
<實施例3>使用大腸桿菌之Endo-Rp的表現
對於實施例2所得之源自真菌的內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶基因，利用Thermo Fisher Scientific公司之GeneArt Strings DNA Fragments，設計已最適化成在大腸桿菌中之異種表現用的核酸序列(序列識別號15)，使用該序列，製作編碼在Endo-Rp的C端附加有6×His標籤之多肽的基因。將其選殖至pET24b(+)載體，對E.coli BL21(DE3)進行轉形。將轉形後之菌液接種至100mL燒瓶中之25mL TB培養基(50μg/mL康黴素)，在37℃下進行振盪培養一晚(160rpm，O/N)。將此前培養液20mL植菌至2.5L之附有隔板的燒瓶中之1L TB培養基(50μg/mL康黴素，0.01%消泡劑204，2mM MgSO4)，在37℃下進行振盪培養(200rpm，2小時)。將培養箱的溫度降低至16℃，培養3小時後，以最終濃度成為0.2mM之方式添加IPTG，再繼續培養24小時。
將已集菌之菌體懸浮於100mL之接合溶液(binding buffer)(50mM HEPES(pH8.0)，0.5M NaCl，20mM咪唑，5%甘油)，以Ni Sepharose 6 Fast Flow及HiLoad 16/60Superdex 200 pg管柱(GE HEALTHCARE公司)，精 製已進行超音波破碎與離心分離之上清液。產量(A280，吸光係數換算)為16.9mg/L培養液(broth)。
又，針對Endo-Rp同系物及Endo-Rm亦同樣地實施異種表現。作為Endo-Rp的同系物，除了實施例2所鑑定之酵素，亦針對將序列識別號7之第193號至第198號的Asn-Thr-Tyr-Tyr-Ile-Arg取代成其他同系物同樣的Lys殘基之序列(Endo-Rp5，序列識別號5)的表現進行探討。經最適化成大腸桿菌用之Endo-Rm基因的序列係基於序列識別號6之胺基酸序列，藉由GeneArt Strings DNA Fragments(Thermo Fisher Scientific公司)而取得(序列識別號20)。其他基因係遵循PrimeSTAR Mutagenesis Basal Kit(TAKARA BIO公司)的標準規程(protocol)，藉由在包含序列識別號15之鹼基序列的Endo-Rp之大腸桿菌表現用載體中導入突變而取得(Endo-Rp2：序列識別號16，Endo-Rp3：序列識別號17，Endo-Rp4：序列識別號18，Endo-Rp5：序列識別號19)。
表現誘導係藉由上述條件進行，僅本培養以500mL之附有隔板的燒瓶中之100mL TB培養基進行實施。將已集菌之菌體懸浮於6mL之接合溶液，以His GraviTrap管柱(GE HEALTHCARE公司)精製已進行超音波破碎與離心分離的上清液。
精製的結果，除了序列識別號7，以SDS-PAGE確認到表現蛋白的帶(band)。各蛋白的產量為Endo-Rp：2.067mg(20.67mg/L培養基)，Endo-Rp2：2.139mg(21.39mg/L培養基)，Endo-Rp3：2.765mg(27.65mg/L 培養基)，Endo-Rp4：2.301mg(23.01mg/L培養基)，Endo-Rp5：2.187mg(21.87mg/L培養基)，Endo-Rm：1.650mg(16.50mg/L培養基)。
<實施例4>Endo-Rp的對於複合型糖鏈之水解活性
針對實施例3所取得之酵素，藉由上述方法量測水解活性。此時，將Endo-M(東京化成工業(股)製)、EndoS及Endo-Om用於比較對象。
製備包含最終濃度200mM磷酸鉀緩衝液(pH 6.25)、69mM SGP及0.02μM之酵素的反應液(總容量100μL)，包含Endo-Rp及Endo-Om的反應液係在50℃下進行培養，包含Endo-M及Endo-S的反應液係在37℃下進行培養。取樣反應1小時、2小時、6小時、12小時、18小時及24小時的反應液，藉由上述分析條件A進行LC-MS分析。將反應產率的經時變化示於圖5。比活性係Endo-Rp：0.21μmol/min/μg，Endo-M：0.0071μmol/min/μg，Endo-S：0.0022μmol/min/μg，Endo-Om：0.060μmol/min/μg。Endo-Rp的比活性被確認為Endo-M的30倍，Endo-S的100倍，Endo-Om的4倍，相較於周知的酵素，對於SGP具有非常強的水解活性。
又，亦針對實施例3所表現‧精製之Endo-Rp同系物量測活性。製備包含最終濃度200mM之磷酸鉀緩衝液(pH6.25)、69mM SGP及0.2μM之酵素的反應液(總容量30μL)，在50℃下培養1小時。1小時後的水解率係Endo-Rp：87%，Endo-Rp2：91%，Endo-Rp3：84%， Endo-Rp4：79%，Endo-Rp5：94%，Endo-Rm：23%，且Endo-Rp2、Endo-Rp3、Endo-Rp4、Endo-Rp5被確認對於SGP具有與Endo-Rp幾乎同等的水解活性。
<實施例5>Endo-Rp的最適反應條件的探討
探討Endo-Rp的最適反應溫度及pH。
反應溫度的探討，係製備包含最終濃度200mM之磷酸鉀緩衝液(pH6.25)、69mM SGP及0.02μM之酵素的反應液(總容量：100μL)，在45、50、52、55、57、60及63℃的各溫度下培養18小時，算出水解率。將結果示於圖6。
反應pH的探討，係製備包含最終濃度200mM之乙酸鈉緩衝液或磷酸鉀緩衝液、69mM SGP及0.02μM之酵素的pH4.5、5.0、5.5、5.8、6.0、6.2、6.5、7.0及7.5的反應液(容量100μL)，在50℃下培養23小時，算出水解率。將結果示於圖7。
此探討的結果，Endo-Rp的最適反應溫度在55℃附近，最適反應pH在5.8附近。
<實施例6>Endo-Rp的轉醣苷化活性
Endo-Rp是否具有轉醣苷化活性係如以下般進行探討。
製備包含最終濃度1.6M之磷酸鉀緩衝液(pH6.25)、69mM SGP、690mM(GlcNAc-)Asn(渡邊化學工業(股)製)及0.1μM之酵素的反應液(總容量：30μL)，在50℃下培養4小時。
藉由下述條件將反應液進行LC-MS分析。
質譜儀裝置：四極液相層析質譜儀6130型(Agilent Technologies公司)
離子化：電噴灑離子化
模式：正
HPLC：1260 Infinity LC(Agilent Technologies公司)
管柱：Inertsil ODS-3 2μm 2.1×50mm(GL Sciences公司)
管柱溫度：40℃
移動相A：H2O+0.1% HCOOH
移動相B：乙腈+0.1% HCOOH
梯度(移動相B%)：0.8%(0分鐘)、2%(5分鐘)、2%(6分鐘)
流速：0.7mL/min
將結果示於圖8。在不添加受體之條件下，僅檢出為供體之SGP與為水解物之SG(10)的峰。在添加(GlcNAc-)Asn作為受體之條件下，除了SG(10)以外還觀測到為轉醣苷化反應生成物之(SG-)Asn的峰。由此結果確認Endo-Rp具有轉醣苷化活性。
<實施例7>Endo-Rp N172Q的製作
為了取得在維持Endo-Rp的糖鏈轉移活性的狀態下抑制糖鏈水解活性之酵素，製作將為活性中心之第172號的天冬醯胺酸(N)取代成麩醯胺酸(Q)之N172Q改變體。N172Q改變體係在編碼序列識別號9所示之Endo-Rp的鹼基序列中，將第514號至第516號的AAC取代成CAA，並利用實施例3所記載之方法進行製備。
轉醣苷化活性的評價係如以下般進行。製備包含最終濃度1.6M之磷酸鉀緩衝液(pH6.25)、69mM SGP、690mM(GlcNAc-)Asn及1.0μM之酵素的反應液(總容量：30μL)，在50℃下進行培養。取樣反應20分鐘、40分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時、20小時、24小時及48小時的反應液，以實施例6所記載之條件進行LC-MS分析。
將反應產率的經時變化示於圖9。在Endo-Rp WT(野生型(wild type))中，為轉醣苷化反應生成物之(SG-)Asn係迅速地被水解，相對於此，在N172Q改變體中，確認到水解受到抑制，產率佳地生成(SG-)Asn。
<實施例8>Endo-Rp的改變
為了取得糖鏈轉移活性較Endo-Rp N172Q改變體高的酵素，實施改變探討。基於Endo-A(PDB ID：3FHQ)及Endo-D(PBD ID：2W92)的結構，設計表1所示之各種突變體，量測其對於SGP之水解活性及轉醣苷化活性。
轉醣苷化活性的評價係如以下般進行。製備包含最終濃度1.6M之磷酸鉀緩衝液(pH6.25)、69mM SGP、690mM GlcNAc-AcA及1.0μM之酵素的反應液(總容量：30μL)，在50℃下進行培養。取樣反應1小時、2小時、4小時、8小時、24小時、48小時及96小時的反應液，以上述LC-MS分析條件B進行分析。
水解活性的評價係如以下般實施。製備包含最終濃度1.6M磷酸鉀緩衝液(pH6.25)、69mM SG-A、及 0.2μM之酵素的反應液(總容量20μL)，在50℃下進行培養。取樣反應1小時、2小時、4小時、8小時、24小時、48小時及72小時的反應液，以上述LC-MS分析條件B進行分析。
表1中，顯示將Endo-Rp的轉移及水解的比活性設定為100時之各改變體的比活性(水解及轉醣苷化)之相對值。在導入N172A、N172C、N172D、N172E、N172G、N172H、N172I、N172M、N172S、N172T、N172V、D176R、Y214F、S216V、L245S、N246D、T275I、F283S、L306I、F307Y、F307H、A310D、E314Q的突變之改變體中，確認到在維持轉移活性的狀態下水解活性受到抑制，且轉移活性比例(轉移活性/水解活性；在表中為轉移/水解比)提升。又，在導入W278F、W278Y的突變之改變體中，轉移活性與水解活性皆提升，另一方面轉移活性比例則降低。
ND：未檢出(Not detected)。
<110> 第一三共股份有限公司(DAIICHI SANKYO COMPANY LIMITED)
<120> 新穎內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶
<130> FP1734
<150> JP2016-234808
<151> 2016-12-02
<160> 23
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 696
<212> PRT
<213> 小假根毛黴(Rhizomucor pusillus)
<400> 1
<210> 2
<211> 696
<212> PRT
<213> 小假根毛黴
<400> 2
<210> 3
<211> 696
<212> PRT
<213> 小假根毛黴
<400> 3
<210> 4
<211> 696
<212> PRT
<213> 小假根毛黴
<400> 4
<210> 5
<211> 696
<212> PRT
<213> 小假根毛黴
<400> 5
<210> 6
<211> 697
<212> PRT
<213> 米氏假根毛黴(Rhizomucor miehei)
<400> 6
<210> 7
<211> 701
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 此假定的胺基酸序列源自公開可用之 小假根毛黴菌株CBS 183.67的基因體DNA序列， 其被認為係內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶。
<400> 7
<210> 8
<211> 2091
<212> DNA
<213> 小假根毛黴
<400> 8
<210> 9
<211> 2109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於在大腸桿菌中表現Endo-Rp的最適化DNA序列
<400> 9
<210> 10
<211> 2091
<212> DNA
<213> 小假根毛黴
<400> 10
<210> 11
<211> 2109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於在大腸桿菌中表現Endo-Rp2的最適化DNA序列
<400> 11
<210> 12
<211> 2091
<212> DNA
<213> 小假根毛黴
<400> 12
<210> 13
<211> 2109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於在大腸桿菌中表現Endo-Rp3的最適化DNA序列
<400> 13
<210> 14
<211> 2091
<212> DNA
<213> 小假根毛黴
<400> 14
<210> 15
<211> 2109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於在大腸桿菌中表現Endo-Rp4的最適化DNA序列
<400> 15
<210> 16
<211> 2091
<212> DNA
<213> 小假根毛黴
<400> 16
<210> 17
<211> 2109
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於在大腸桿菌中表現Endo-Rp5的最適化DNA序列
<400> 17
<210> 18
<211> 2094
<212> DNA
<213> 米氏假根毛黴
<400> 18
<210> 19
<211> 2112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於在大腸桿菌中表現Endo-Rm的最適化DNA序列
<400> 19
<210> 20
<211> 2106
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 此假定的DNA序列源自公開可用之 小假根毛黴菌株CBS 183.67的基因體DNA序列， 其被認為編碼內-β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶。
<400> 20
<210> 21
<211> 2124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於在大腸桿菌中表現假定的SEQ ID NO：7的胺基酸序列的最適化DNA序列
<400> 21
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於選殖Endo-Rp基因的PCR引子
<400> 22
<210> 23
<211> 696
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Endo-Rp胺基酸序列中可能的突變， 已確認其在實施例中作用。
<220>
<221> 突變
<222> (128)..(128)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為Ala或Thr
<220>
<221> 突變
<222> (172)..(172)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為Asn、Asp、Gln、 Glu、Ala、Cys、His、Phe、Gly、Leu、Ile、Lys、Met、Pro、Ser、Thr 或Val。
<220>
<221> 突變
<222> (176)..(176)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為Asp或Arg。
<220>
<221> 突變
<222> (214)..(214)
<223> 此位置可為各種具有大側鏈的胺基酸， 較佳為Tyr或Phe。
<220>
<221> 突變
<222> (216)..(216)
<223> 此位置可為各種具有小側鏈的胺基酸， 較佳為Ser、Ala或Val。
<220>
<221> 突變
<222> (245)..(245)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為Leu或Ser。
<220>
<221> 突變
<222> (246)..(246)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為Asn或Asp。
<220>
<221> 突變
<222> (275)..(275)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為丁hr或Ile。
<220>
<221> 突變
<222> (278)..(278)
<223> 此位置可為各種具有疏水性側鏈的胺基酸， 較佳為Phe、Tyr、Ala、Leu或Ile。
<220>
<221> 突變
<222> (283)..(283)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為Phe或Ser。
<220>
<221> 突變
<222> (306)..(306)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為Leu或Ile。
<220>
<221> 突變
<222> (307)..(307)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為Phe、Tyr或 His。
<220>
<221> 突變
<222> (310)..(310)
<223> 此位置可為各種具有極性或荷電側鏈的胺基酸， 較佳為Asp、Glu、
<220>
<221> 突變
<222> (314)..(314)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為Glu或Gln。
<220>
<221> 突變
<222> (333)..(333)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為Asp或Gly。
<220>
<221> 突變
<222> (434)..(434)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為Ile或Leu。
<220>
<221> 突變
<222> (460)..(460)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為Val或Ala。
<220>
<221> 突變
<222> (527)..(527)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為Ile或Val。
<220>
<221> 突變
<222> (569)..(569)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為Lys或Thr
<220>
<221> 突變
<222> (610)..(610)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為Phe或Ser。
<220>
<221> 突變
<222> (626)..(626)
<223> 此位置可為各種胺基酸，較佳為His或Arg。
<400> 23

Claims (19)

  1. 一種多肽，其具有以下(A)及(B)之特性：(A)包含與序列識別號1所記載之胺基酸序列具有75%以上的同一性(identity)及95%以上的相似性(similarity)之胺基酸序列，且為與序列識別號7的胺基酸序列不同之胺基酸序列；(B)對於複合糖鏈之水解活性及/或轉醣苷化(transglycosylation)活性係在45~60℃之任一溫度下顯示最大活性值的40%以上。
  2. 如請求項1之多肽，其具有以下(A)及(B)之特性：(A)包含與序列識別號1所記載之胺基酸序列具有75%以上的同一性及95%以上的相似性之胺基酸序列，且相當於序列識別號1之胺基酸編號191~195的胺基酸序列之胺基酸序列為Leu-Ala-Lys-Leu-Leu(LAKLL)；(B)對於複合糖鏈之水解活性係在45~60℃之任一溫度下顯示最大活性值的40%以上。
  3. 如請求項1之多肽，其在50℃下之對於複合糖鏈之水解活性係顯示最大活性值的60%以上。
  4. 如請求項1至3中任一項之多肽，其除了(A)及(B)之特性，更具有(C)在使用大腸桿菌之基因重組表現中，顯示10mg/L培養基以上。
  5. 如請求項1至4中任一項之多肽，其在序列識別號1之胺基酸序列中，胺基酸編號54~341的區域中之序列同一性(sequence identity)為85%以上。
  6. 如請求項1至5中任一項之多肽，其維持D276、V223、W225、Y247及W248的胺基酸中之至少一個(較佳為至少維持D276)。
  7. 如請求項1至3中任一項之多肽，其係包含序列識別號1之胺基酸序列之多肽、或包含下述胺基酸序列之多肽：在序列識別號1之胺基酸序列中具有選自包含A128T、D333G、I434L、V460A、I527V、K569T、F610S及H626R之群組中的至少一個突變之胺基酸序列。
  8. 如請求項1之多肽，其包含序列識別號1~6之任一胺基酸序列。
  9. 如請求項1至6中任一項之多肽，其具有滿足特性(A)之胺基酸序列，且具有至少一個序列識別號23所示之突變。
  10. 如請求項9之多肽，其在選自N172、D176、Y214、S216、L245、N246、T275、L306、F307及A310之至少一個胺基酸具有突變，且具有經增強之糖鏈轉移活性。
  11. 如請求項7之多肽，其具有選自以下之群組的至少一個突變：N172被取代成Gln、Asp、Gly、Ala、Phe、Cys、His、Ile、Ser、Thr、Val或Met之突變；D176被取代成Arg之突變；Y214被取代成Phe之突變；S216被取代成Val之突變；L245被取代成Ser之突變；N246被取代成Asp之突變；T275被取代成Ile之突變；F283被取代成Ser之突變；L306被取代成Ile之突變；F307 被取代成Tyr之突變；A310被取代成Asp之突變；及E314被取代成Gln之突變。
  12. 如請求項9至11中任一項之多肽，其具有W278被取代成Phe或Tyr之突變。
  13. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至12中任一項之多肽。
  14. 如請求項13之多核苷酸，其具有序列識別號8~17之核苷酸編號1~2088的核苷酸序列及序列識別號18~19之核苷酸編號1~2091的核苷酸序列之任一核苷酸序列。
  15. 一種表現用質體，其包含如請求項13或14之多核苷酸。
  16. 一種宿主細胞，其係經如請求項15之質體所轉形而成。
  17. 如請求項16之宿主細胞，其係經包含多核苷酸之質體所轉形而成之大腸桿菌，該多核苷酸包含序列識別號9、11、13、15或17之核苷酸編號1~2088的核苷酸序列或序列識別號19之核苷酸編號1~2091的核苷酸序列。
  18. 一種如請求項1至12中任一項之多肽的製造方法，其包含將如請求項16或17之宿主細胞進行培養並自所得之培養物回收如請求項1至12中任一項之多肽的步驟。
  19. 一種試劑，其含有如請求項1至12中任一項之多肽。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102468395B1 (ko) 2019-07-22 2022-11-16 주식회사 엘지에너지솔루션 이차전지 분리막 접힘 방지를 위한 분리막 실링 장치 및 실링 방법

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0805866B1 (en) * 1994-12-21 2008-10-29 Chr. Hansen A/S Microbially derived rennin having enhanced milk clotting activity and method of producing same
JP4160652B2 (ja) * 1998-05-22 2008-10-01 キリンファーマ株式会社 エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ遺伝子
CA2502356A1 (en) 2002-10-15 2004-04-29 Synta Pharmaceuticals Corp. Aromatic bicyclic heterocyles to modulate 1l - 12 production
TW200510394A (en) 2003-05-29 2005-03-16 Synta Pharmaceuticals Corp Heterocyclic compounds for preventing and treating disorders associated with excessive bone loss
GB2431156A (en) 2005-10-11 2007-04-18 Piramed Ltd 1-cyclyl-3-substituted- -benzenes and -azines as inhibitors of phosphatidylinositol 3-kinase
US20080233127A1 (en) 2007-03-21 2008-09-25 Wyeth Imidazolopyrimidine analogs and their use as pi3 kinase and mtor inhibitors
WO2009034386A1 (en) 2007-09-13 2009-03-19 Astrazeneca Ab Derivatives of adenine and 8-aza-adenine and uses thereof-796
EP2209785A1 (en) 2007-10-05 2010-07-28 S*BIO Pte Ltd 2-morpholinylpurines as inhibitors of pi3k
MX2010003668A (es) 2007-10-05 2010-07-02 S Bio Pte Ltd Derivados de purina sustituidas con primidina.
ES2537624T3 (es) 2007-10-26 2015-06-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Derivados purina útiles como inhibidores de la quinasa PI3
WO2009100406A2 (en) 2008-02-07 2009-08-13 Synta Pharmaceuticals Corp. Topical formulations for the treatment of psoriasis
JP2011521968A (ja) 2008-05-30 2011-07-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド プリンｐｉ３ｋ阻害剤化合物および使用方法
US8513221B2 (en) 2008-07-07 2013-08-20 Xcovery Holding, LLC PI3K isoform selective inhibitors
TWI378933B (en) 2008-10-14 2012-12-11 Daiichi Sankyo Co Ltd Morpholinopurine derivatives
WO2010114494A1 (en) 2009-04-03 2010-10-07 S*Bio Pte Ltd 8-substituted-2-morpholino purines for use as pi3k and/or mtor inhibitors in the treatment of proliferative disorders
CA2772371A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Bicyclic indole-pyrimidine pi3k inhibitor compounds selective for p110 delta, and methods of use
CN102459272B (zh) 2009-05-27 2014-08-06 健泰科生物技术公司 对P110δ具有选择性的为PI3K抑制剂的二环嘧啶化合物和使用方法
MX2012005463A (es) 2009-11-12 2012-09-12 Hoffmann La Roche Compuestos de purina n/9 sustituida, composiciones y metodos de uso.
JP5619429B2 (ja) 2010-01-28 2014-11-05 株式会社ジャパンディスプレイ 画像表示装置の駆動方法及び画像表示装置組立体の駆動方法
CN103003279B (zh) 2010-07-14 2015-09-23 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 对PI3K P110δ具有选择性的嘌呤化合物及其使用方法
TWI617560B (zh) 2010-09-14 2018-03-11 伊塞利克斯公司 PI3Kδ 抑制劑以及其應用和生產方法
CN105859735B (zh) 2010-12-16 2018-03-09 霍夫曼-拉罗奇有限公司 三环pi3k抑制剂化合物和使用方法
JP5963777B2 (ja) 2011-01-31 2016-08-03 ノバルティス アーゲー 新規ヘテロ環誘導体
CN103476767B (zh) 2011-02-09 2015-06-10 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 作为pi3激酶抑制剂的杂环化合物
WO2013051608A1 (ja) 2011-10-03 2013-04-11 独立行政法人産業技術総合研究所 複合型糖鎖加水分解酵素
CN105121456A (zh) 2013-02-05 2015-12-02 科.汉森有限公司 经由去糖基化步骤对蛋白质的改良纯化
WO2016136984A1 (ja) 2015-02-26 2016-09-01 東京化成工業株式会社 エンドｍ変異体、及びｎ結合型糖鎖含有化合物又はｎ結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法
US11001819B2 (en) 2015-07-16 2021-05-11 Daiichi Sankyo Company, Limited Endos mutant enzyme

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