TWI427147B - 具耐熱性之小枯草桿菌木聚醣酶 - Google Patents

Description

具耐熱性之小枯草桿菌木聚醣酶 相關申請案

本申請案主張美國臨時申請案第61/391,260號的優先權(申請於2010年10月8日)，該內容在此處全部併入作為參考資料。

本發明係關於突變的木聚醣酶。

內切β-1,4-木聚醣酶(E.C.3.2.1.8)藉由隨機水解來解聚木聚醣骨幹。木聚醣是植物細胞壁中僅次於纖維素的第二種最常見的半纖維素。近來，木聚醣和木聚醣的各種應用一直備受關注，例如：動物飼料的添加物，麵包、食品和飲料的製造上，紙漿和紙類的處理，以及供生產生質酒精之生物量前處理步驟。

雖然來自嗜熱性生物的木聚醣酶已可獲得，但它們可能並不適合工業製程。因此，有需要具改善的酵素活性及耐熱性的突變木聚醣酶。

本發明至少部分係基於發現了多種具增進的酵素活性及耐熱性的突變類芽孢桿菌(Paenibacillus )木聚醣酶。因此，本發明係關於包括突變木聚醣酶、編碼它們的核酸，以及使用木聚醣酶的方法。

在一方面，此處所描述的是一種分離的多肽，其包含與木聚醣酶X-H2(XylX-H2)胺基酸序列，即SEQ ID NO：2，至少有90%相同度的胺基酸序列。此多肽含有在對應於SEQ ID NO：2的第44個殘基的位置之Ala，在對應於SEQ ID NO：3的第345及346個殘基的位置之兩個胺基酸的缺失，並且與 小枯草桿菌(Paenibacillus campinasensis )的野生型木聚醣酶相較下表現出較低的最適溫度和較高的比活性。在一些具體實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：2與至多50個，例如：1、10、15、20、25、30及45個的保守胺基酸置換。此多肽可包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列。

在另一方面，此處所描述的是一種分離的核酸分子，其具編碼包含與SEQ ID NO：2胺基酸序列有90%相同度的胺基酸序列之多肽之核酸序列，其中該多肽包含在對應SEQ ID NO：2的第44個殘基的位置上之Ala，在對應SEQ ID NO：3的第345及346個殘基的位置之兩個胺基酸的缺失，並且與小枯草桿菌的野生型木聚醣酶相較下表現出較低的最適溫度和較高的比活性。在某些案例中，該核酸分子的核酸序列為SEQ ID NO：1。

本發明尚包含一種含有此處所述之核酸分子的表現載體，以及具有此表現載體的宿主細胞。

在又另一方面，本發明關於一種包含突變木聚醣酶之胺基酸序列之分離的多肽，例如：木聚醣酶X-R(Xylx-R)木聚醣酶X-H1(Xylx-H1)、木聚醣酶X-L1(Xylx-L1)、及木聚醣酶X-L2(Xylx-L2)。

本發明亦包含一種降解木聚醣的方法，該方法包含提供此所述的木聚醣多肽，以及混合木聚醣和此多肽。

本發明一或多個具體實施例的細節闡述於如後附隨的圖式及說明。本發明之其它特徵，物件及其優點將於說明、圖式及申請專利範圍中清楚呈現。

此處所述者為五種突變木聚醣酶，其係由來自小枯草桿菌BL11之41-kDa木聚醣酶(Xylx)的活體外致變而來。具體而言，這些突變的其中一種Xylx-H2擁有pH適應性、耐熱性及高比活性。這些特徵使此木聚醣酶適於多種應用。

本發明包括分離的木聚醣多肽及其功能同等物。圖2表示五個突變木聚醣酶的胺基酸序列之比對，即XylX-R、XylX-H1、XylX-H2、XylX-L1及XylX-L2。XylX-H2的胺基酸序列(SEQ ID NO:2)表示於圖7。

木聚醣酶的功能或特徵可包括，例如：酵素活性、耐熱性、動能參數、溫度或展現最佳活性的溫度範圍(即最適溫度)、及pH或展現最佳活性的pH範圍。該技術領域具有通常知識者將能透過技術領域中已知及下述的方法來決定木聚醣酶的功能和特徵。

此處所使用之「分離的多肽」乙詞或「實質純化的多肽」乙詞係指實質上不含天然相連之分子之多肽，即天然相連之分子至多占含該多肽的製備物之乾重量的20%。純度可藉由任何適當的方法測量，例如，管柱層析法、聚丙烯醯胺膠體電泳法及高效液相層析法(HPLC)。

兩段胺基酸序列的辨識可由Karlin及Altschul之Proc,Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268,1990所描述的算法來決定，其係由Karlin及Altschul之Natl. Acad. Sci. USA 5873-5877,1993修正而來。此種算法被納入Altschul et al.,J. Mol. Biol. 215:403-410,1990的NBLAST及XBLAST程式中。BLAST核苷酸的搜尋係利用NBLAST程式、分數=100、字長=12，以取得與本發明的核酸分子具同源性的核苷酸序列。BLAST蛋白質的搜尋係利用XBLAST程式、分數=50，字長=3，以取得與基準多肽具同源性的胺基酸序列。為了並列比較具缺口的序列，使用Altschul等人於Nucleic Acids Res. 25:3389-3402,1997所描述的Gapped BLAST程式。使用BLAST及Gapped BLAST程式時，採用個別程式的初始參數(例如：XBLAST及NBLAST)。參見網址ncbi.nlm.nih.gov.。

此處所述之多肽的胺基酸序列可能不同但不影響這些多肽的木聚醣酶酵素活性。例如，其可包含一或多個保守胺基酸置換。「保守胺基酸置換」係指某個胺基酸殘基被另一個具有相似側鏈的胺基酸所取代。該技術領域中已定義具有相似側鏈的胺基酸殘基之家族。這些家族包括具有鹼性側鏈(例如，賴胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如，甘胺酸、天門冬胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如，丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、貝塔分支側鏈(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸)及芳香環側鏈(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)的胺基酸。因此，以一個在SEQ ID NO:2經預測為非必要性胺基酸的殘基為例，較佳係以相同側鏈家族中另一個胺基酸殘基來取代。或者，也可於SEQ ID NO:2的全部或部分序列隨機導入突變，比如使用飽和誘變的方式，而其所造成的突變可被用來篩選木聚醣酶的活性以辨識出如下段實例中仍保有活性之突變。

本發明的多肽可以合成或重組的方式獲得。為製備一種重組多肽，可以將編碼該多肽的核酸連接另一編碼融合配偶體的核酸，例如，麩胺基硫轉移酶(GST)、6x-His抗原決定位置標記(6x-His epitope tag)、或M13基因3蛋白質(M13 Gene 3 protein)。所得之融合核酸在合適的宿主細胞內所表現的融合蛋白質能以該技術領域中已知的方法予以分離。經分離的融合蛋白質可進一步加以處理，例如，藉由酵素切割以去除融合配偶體而得到本發明的重組多肽。

本發明亦包含編碼此處所述之突變木聚醣酶多肽的對應核酸序列。在一較佳的具體實施例中，該核酸包含SEQ ID NO: 1序列(其編碼SEQ ID NO: 2)。核酸係指DNA分子(例如，cDNA或基因體DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、或DNA或RNA的類似物。DNA或RNA的類似物可由核苷酸合成。核酸分子可以是單股或雙股，但雙股DNA較佳。「分離的核酸」為一核酸，其結構不同於任何天然發生的核酸或任何天然發生的基因體核酸之片段的結構。因此該名詞涵蓋，例如，(a)DNA，其具有天然發生之基因體DNA分子的部分之序列，但不被在其天然發生之生物體之基因體中的該分子之該部分兩端的編碼序列所包圍；(b)核酸，其嵌入載體或嵌入原核或真核生物之基因體DNA，其方式係使得所得分子不同於天然發生的載體或基因體DNA；(c)分離的分子，如cDNA、基因體片段、聚合鋂鏈鎖反應(PCR)產生的片段，或限制片段；以及(d)重組核酸序列，其為雜交基因之一部分，即編碼融合蛋白質的基因。上述之核酸可用來表現本發明的多肽。為了此目的，可以操作性地連結核酸到合適的調控序列以產生表現載體。

載體係指一個可以運輸連結於其上之另一個核酸的核酸分子。載體能自我複製或插入宿主DNA。載體的實例包含質體、柯斯載體(cosmid)、或病毒載體。本發明之載體包含處於適合在宿主細胞中表現該核酸的狀態。較佳地，該載體包含一或多種操作性地連結到欲表現之核酸序列的調控序列。調控序列包含啟動子、增強子、和其它表現控制之元件(例如，多腺苷酸信息)。調控序列包含直接使核酸序列持續表現的序列，以及組織特異性調控及/或誘發的序列。表現載體的設計可以取決於諸如轉型細胞的選擇、欲取得之蛋白質的表現水平、及其類似者之因子。表現載體能被引入宿主細胞以產生本發明的多肽。

本發明的範圍尚包括一種含有上述核酸的宿主細胞。實例包含大腸桿菌(E. coli )細胞、昆蟲細胞(例如，使用桿狀病毒表現載體)、酵母菌細胞、植物細胞、或哺乳類細胞。參見，如，Goeddel,(1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA。為了製造本發明的多肽，可在能表現本發明之核酸編碼之多肽的培養液中培養宿主細胞，並從培養的細胞或細胞培養液中純化出該多肽。另一種情形，本發明的核酸可利用如T7啟動子調控序列和T7聚合酶在活體外轉錄和轉譯。

本發明亦包含此處所述之木聚醣酶突變多肽之組合物與其使用方法。該組合物可以被用於各種方法涉及木聚醣酶降解之方法。舉例而言，它們可以用於1)以酵素降解含木聚醣之農林廢棄物的生物量轉換，供生質酒精製作之前處理步驟；2)改善含木聚醣動物飼料及飼料成份之體內降解；3)來自植物纖維來源之紙漿之漂白前處理；4)作為烘培劑；及5)其它涉及木聚醣降解之工業製程。

以下特定之實例僅供作說明之用，而非以任何方式限制其餘的揭露內容。無須進一步的闡明，咸相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於此處之說明即可利用本發明至最廣的程度。所有在此處被引用的出版物皆以參考資料全份併入於本案中。

實例

小枯草桿菌(Paenibacillus campinasensis )BL-11品系先前在一個高溫及鹼性的環境下被鑑定並分離出來。參見，Ko et al.,Bioresource Technol. 98: 2727-2733,2007。來自小枯草桿菌BL-11編碼41-kDa之內切木聚醣酶(pre-XylX)的開放閱讀框架(ORF)係選殖並表現於大腸桿菌；編碼其內切葡聚糖酶的ORF也已鑑定出來。參見，Ko et al.,Bioresour Technol. 101: 7882-7888,2010。pre-XylX的胺基酸序列在資料庫裡和與其最接近的序列只有73%相同。參見，Ko et al.,Process Biochem. 45: 1638-1644,2010。

在本研究中，活體外誘變的操作係用來改善源自小枯草桿菌BL11、大小為41-kDa之木聚醣酶的酵素活性及耐熱性。非分泌型細胞內木聚醣酶XylX-R係由直接誘變所製造。四個突變係利用以xylX-R 作為模板的易錯PCR經過兩個階段的誘變而獲得。

(1)材料和方法

除非特別說明，所有使用的化學藥品皆由Sigma(St Louis,美國)而來，或所有分析等級的化學藥品皆由E. Merck (Darmstadt,德國)而來。細菌以慣常的方式培養於Luria-Bertani(LB)培養液。LB培養液含10 g/L胰化蛋白腖,5 g/L酵母菌萃取物，及5 g/L NaCl。載體pBCKS(+)和大腸桿菌NM522係來自Stratagene(La Jolla,美國)。載體pET15b、pET-25b及大腸桿菌HMS174(DE3)係來自Novagen(Madison,美國)。T-vector pOptima係來自Strong Biotech(台北)。PCR引子由Bio Basic,Inc.(Markham,Ontario,加拿大)合成。

三步驟之活體外誘導之操作：(1)藉由直接誘變建構僅含成熟XylX(缺乏信號肽)的新開放式閱讀框架，(2)利用易錯PCR製造xylX 的隨機突變庫，及(3)進一步的直接誘變以消除分離而出的突變中不需要的部分。

第一階段和第二階段的PCR所使用的模板DNA係帶有xylX 的pBCKS(+)。參見，Ko et al.,Bioresour Technol. 101: 7882-7888,2010。由第二階段所製造的突變DNA被用來作為第三階段誘變的模板。第三階段的誘變與表現系統之建構協同作業。前兩個階段所使用的引子對包含X3shH-F(5’-AGCAAGCTTGGCAACAACGATCAC -3’；與XylX之N端配對的核苷酸序列以底線標示)及X3shX-R(5’-GCCTCTAGATCACCGGATCTCCA -3’；與XylX之C端配對的核苷酸序列以底線標示)。

直接誘變係利用傳統PCR的流程。xylX 突變庫的建立係使用Clontech(Palo Alto)的多樣化PCR隨機誘變套組並參照其使用手冊之指示，以易錯PCR製造隨機突變。PCR產物在以QIAquick純化套組(Qiagen，希爾登，德國)純化後被選殖到質體pOptima裡。轉型株則養在LA(Luria-Bertani洋菜膠)母本培養皿供進一步突變篩選。

篩選及分離XylX的突變係依照先前描述的流程並稍加修正而進行。參見，Ko et al.,Bioresour Technol. 101: 7882-7888,2010。NM522轉型株係於含盤尼西林(100 μg/ml)的LA母本培養皿中從密度為每個9公分的培養皿上有約50到100個菌落中挑選而出。在37℃培養隔夜後，以每個母本培養皿在含燕麥木聚醣(0.2%，w/v)、盤尼西林(100 μg/ml)、D-環絲胺酸(100 μg/ml)及IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，1 mM)的LA培養皿製造出二次複型。複型在37℃培養4小時並於65℃加熱30分鐘。複型上的菌落係使用氣霧劑噴灑0.1% Triton X-100而溶解。經過2小時在65℃進行酵素反應後，以剛果紅染該複型。參見如，Wood et al.,Methods Enzymol. 160: 59-74,1988。選擇表現出比較多清晰帶的菌落並檢查以確認該突變木聚醣酶的活性及序列。

編碼XylX突變的核苷酸序列以FS DNA聚合酶螢光染劑終結子的反應來決定。定序產物以Applied Biosystems 377擴展自動化定序儀偵測(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)。核苷酸序列和由其推衍出的胺基酸序列利用EMBL計算服務(網址為ebi.ac.uk/Tools/sequence.html)的序列分析工具來分析。相關序列係利用BLASTP 2.0及FASTA程式搜尋資料庫而取得，即(SwissPort,PIR,PRF,and GenBank)。四個xylX 突變的核酸序列，即xylX-R 、xylX-H1 、xylX-L1 及xylX-L2 在GenBank分別以登入號HM630610,FJ168524,FJ168525 and HM630609所儲存。

突變基因所編碼的胺基酸序列以各種軟體分析。預測的信號肽和切點係利用N N(neural networks)及HMM(hidden Markov models)的方法分析。保守區域係利用InterProScan(EMBL EBI)及PSI-CD(NCBI)來搜尋。最後，推衍出的突變胺基酸序列以ClustalW(EMBL-EBI)與XylX及pre-XylX序列進行多重比對。NCBI的保守區域搜尋服務(The Conserved Domain Search Service)被用來分析功能性酵素區域。以SWISS-MODEL Workspace來模擬木聚醣酶的結構。

使用Novagen(Madison)pET表現系統以在大腸桿菌表現基因。利用PCR增幅所選的pOptima菌落中含突變序列的DNA片段。利用Nde I和Xho I切割增幅的產物、將其選殖入pET15b及pET25b，並以此轉型大腸桿菌HMS174(DE3)。

表現及純化XylX的突變係依照先前描述的流程進行。參見，Ko et al.,Bioresour Technol. 101: 7882-7888,2010。

標準木聚醣酶試驗係使用二硝基水楊酸(DNSA)方法，並以D-木糖作為基準。參見如，Knig et al.,Anal. Bioanal. Chem. 37: 80-87,2002。易言之，含30 μl的酵素樣本和300 μl、1.5%的燕麥木聚醣的反應混合物在pH 7、60℃的指定溫度下放置。該反應以加入150 μl的DNSA(終止溶液)終止。接著將該反應混合物離心並將上清液煮沸。煮沸的樣本接著以OD₅₃₀ 測量。酵素活性(IUs)依上述的方法計算。使用的緩衝液為100 mM磷酸緩衝液。溫度對於反應的影響係於將反應混合物放置在範圍為40到80℃的溫度下實驗。所有的試驗都進行三重複。

反應進行在最適條件下，即pH 7和60℃，使用5到40 mg/mL的燕麥木聚醣溶液。所建構的木聚醣酶活性對受質濃度的雙倒數Lineweaver-Burk圖形係利用線性回歸來估算XylX-H2-25b及XylX-L2的動能參數。k _cat 值的估算係利用Sigma圖形軟體ver. 10.0(SPSS,Chicago)之非線性回歸來加入雙曲線Michaelis-Menton方程式。

(2) XylX突變的基本骨幹：XylX-R

為了確保所有易錯PCR所引發的突變出現在成熟的酵素裡，即XylX，而不出現在pre-XylX的信號肽，該僅含XylX編碼序列的ORF係由直接誘變建構而成。依此所得到木聚醣酶被命名為XylX-R。XylX、pre-XylX及XylX-RN端序列的比較表示於圖1。pre-XylX信號肽(39個胺基酸的長度)已經在結構上以一段8個胺基酸的人造肽，即MTMITPSL，所證實。XylX-R是一個非分泌型細胞間酵素。在選殖株的培養環境中沒有發現酵素活性。

XylX-R及XylX酵素活性的粗略估算係以粗萃取物在57.5℃到70℃中進行。其結果統整在其下之表1。未發現酵素活性的差異。融合寡肽到XylX的N端對於酵素活性沒有任何重大的影響。

(3)具增進特性的突變

易錯PCR所製造突變庫經篩選後，獲得兩株具增進活性的突變。其中一個突變為錯異(即T44A)突變，即XylX-H1。另一個為單一核苷酸所造成的缺失突變，即XylX-L1。

刪除XylX(或Xyl-R)的C端會造成酵素活性的增加，其下為更詳細的描述。XylX-H2係由刪除XylX-H1 C端的兩個胺基酸而來。XylX-L2也包含一個C端的缺失。

XylX-R、XylX-H1、XylX-H2、XylH-L1及XylH-L2的胺基酸序列之比較表示於圖2。XylX的功能性區域圖和突變圖表示於圖3。

(4)反應最適條件及酵素活性

為了評估突變的表現，his標記之酵素以Ni-NTA親和層析法來純化。於不同pH和溫度下決定純化的酵素活性。其結果統整於如下之表2。在55oC及pH 7下，XylX-R、XylX-H1、XylX-H2及XylH-L1的活性最高。另一方面，XylX-L2的反應最適條件為50℃及pH 8。突變的最適溫度低野生型酵素約5-10℃。XylX-L1和XylX-L2較嗜鹼性。表現出最高的木聚醣酶活性者為選殖入pET 25b之xylX-H2 所表現的重組木聚醣酶，於圖2標示為XylX-H2-25b。突變的最適活性高於大部分先前研究過的木聚醣酶。參見：Beg et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 56: 326-338,2001；及S-Pereira et al.,Mol. Biotechnol. 24(3): 257-81,2003。於C端加入6×His標記使得XylX-H2-25b的酵素活性高於以6×His標記於N端的XylX-H2將近三倍。

所有突變最適溫度的下降可能是N端改變所致，XylX-L1及XylX-L2的嗜鹼性之轉變可能是C端序列缺失所致。與XylX-R比較，XylX-H1表現出約10%活性的增加，而XylX-L1則增加50%。值得注意的是，XylX-L2及XylX-H2比XylX-R及XylX表現出兩倍或更多的活性。XylX-H1之10%活性增加可歸因於T44A突變。須注意的是，在相同位置(T44M)的另一個突變造成酵素活性重大的喪失(資料未顯示)。此研究的突變酵素功能良好，其於45-65℃及pH範圍為5-9之間，高於60%的殘餘活性能持續4個多小時(資料未顯示)。

上述突變的蛋白質結構係以SWISS-MODEL Workspace模擬。XylX、XylX-R、XylX-H1及XylX-H2的構造幾乎相同。XylX-L1及XylX-L2不同於其它僅因其肽序列的缺失。XylX-R及XylX-L2的構造表示於圖4。

(5)溫度對XylX-H2-25b及XylX-L2穩定度的影響

研究溫度對XylX-H2-25b及XylX-L2穩定度的影響係於40℃到80℃及pH 7下進行。見圖5。於pH 7及40℃到60℃下，該兩個突變木聚醣酶的活性在8小時內皆維持初始值的80%以上。於70℃及80℃下，該兩個突變木聚醣酶的殘餘活性即使經8小時後仍能有約初始值的10%。

以繪製殘餘活性對時間的自然對數圖及其後的線性回歸來估計從40℃到60℃的半生期。該兩個突變從40℃到60℃的半生期，列於其下表3，長於大部分先前研究的細菌木聚醣酶。參見，Techapun et al.,Process Biochem. 38: 1327-1340,2003。兩個突變在60℃的半生期皆超過24小時。即是在70℃及80℃，XylX-H2-25b之內插半生期分別為96及36分鐘。兩個突變在70℃及80℃的內插半生期長於來自嗜熱桿菌(Geobacillus stearothermophilus )突變的值。參見：Zhang et al.,Bioresource Technol. 101: 9272-9278,2010。優良的耐熱性使兩個突變皆成為引人注意的生質轉換之候選者，諸如，需長反應時間的同時糖化及發酵以及其它在較高溫下進行的工業應用。

(6)XylX-H2及XylX-L2的動能參數

決定木聚糖濃度對於XylX-H2-25b、XylX-L2及pre-XylX釋放還原糖類的反應速率。見圖6。由圖6得到如下表4所列突變木聚醣酶在60℃、pH 7的動能參數。最高之V _max 、K _m 及k _cat 值顯示XylX-H2-25b在各方面的優越性。XylX-L2表現了不同的樣態：雖然其還原糖釋放速率在所有木聚糖濃度下皆高於pre-XylX，但XylX-L2突變的K _m 值是其中最大的，為19.23±3.62(mg/mL)。

其它實施方式

本說明書揭露的所有特徵可以組合於任何組合中。本說明書揭露的每一項特徵可以被另一項具相同、相當、或類似目的的特徵所取代。因此除別有說明，每項揭露的特徵都僅作為具相當或類似特徵之同屬系列的實例。

該技術領域具有通常知識者可由上述輕易地確認本發明的重要特徵並可在不會偏離其精神和範圍下，對本發明作不同的改變和修正使其適用於各種用途和條件。因此，申請專利範圍亦包括其它實施方式。

圖1為一個揭示pre-XylX、XylX和XylX-R N端序列的圖式。這裡所列出的胺基酸序列為該蛋白質N端的領導殘基。黑色陰影標示的序列為pre-XylX的信號肽。XylX-R N端利用誘變產生之多餘的殘基則以灰色陰影標示。

圖2為XylX-R和其它突變木聚醣酶胺基酸序列的比對圖。此處為XylX-R胺基酸序列。陰影標示的殘基表示相較於XylX-R的序列有改變的位置。

圖3為野生型木聚醣酶的功能區域代表圖，即XylX及多種突變木聚醣酶。家族11糖基水解酶以一個富含脯胺酸的連接子與家族6的碳水化合物結合組件連接。XylX-L1及XylX-L2沒有具功能的碳水化合物結合區域。上方的尺規表示胺基酸殘基的數字。

圖4為利用SWISS-MODEL所模擬之XylX-R(上圖)及XylX-L2(下圖)的結構圖。其上已標示出殘基蘇胺酸44、麩胺酸103及麩胺酸192的位置。

圖5為表示在pH7時XylX-H2-25b(上圖)及XylX-L2(下圖)之耐熱性的圖示。

圖6為表示Pre-xylX、XylX-L2及XylX-H2-25b之反應速率的圖示。

圖7列出XylX-H2核酸序列(SEQ ID NO:1)及胺基酸序列(SEQ ID NO:2)。

圖8列出選殖於pET25b的XylX-H2之核酸及胺基酸序列(XylX-H2之C端帶有一個6×His的標記)。

圖9列出選殖於pET15b的XylX-H2之核酸及胺基酸序列(XylX-H2之N端帶有一個6×His的標記)。

<110> 中央研究院

<120> 具耐熱性之小枯草桿菌木聚醣酶

<140> 100136818

<141> 2011-10-11

<150> 61/391,260

<151> 2010-10-08

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1032

<212> DNA

<213> 小枯草桿菌

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<212> PRT

<213> 小枯草桿菌

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<213> 小枯草桿菌

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<213> 小枯草桿菌

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> Synthetic polypeptide

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<212> PRT

<213> 人工序列

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<223> Synthetic polypeptide

<400> 8

<210> 9

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Synthetic polypeptide

<400> 9

<210> 10

<211> 1107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Synthetic polynucleotide

<400> 10

<210> 11

<211> 368

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Synthetic polypeptide

<400> 11

<210> 12

<211> 1155

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Synthetic polynucleotide

<400> 12

<210> 13

<211> 384

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Synthetic polypeptide

<400> 13

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 14

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Synthetic oligonucleotide

<400> 15

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Synthetic peptide

<400> 16

Claims (11)

1. 一種分離的多肽，其包含與SEQ ID NO：2的胺基酸序列至少有90%相同度之胺基酸序列，其中該多肽包含在對應於SEQ ID NO：2第44個殘基的位置之Ala，以及在對應於SEQ ID NO：3第345及346個殘基的位置之兩個胺基酸的缺失，且其中該多肽相較於來自小枯草桿菌(Paenibacillus campinasensi )之野生型木聚醣酶表現出較低的最適溫度及較高比活性。
2. 如申請專利範圍第1項之多肽，其中該多肽包含與SEQ ID NO：2的胺基酸序列至少有95%相同度之胺基酸序列。
3. 如申請專利範圍第1項之多肽，其中該多肽包含SEQ ID NO：2的胺基酸序列。
4. 如申請專利範圍第1項之多肽，其中該多肽進一步包含His標記。
5. 如申請專利範圍第3項之多肽，其中該多肽進一步包含His標記於C端。
6. 一種分離的核酸分子，其包含編碼申請專利範圍第1項之多肽之核酸序列。
7. 如申請專利範圍第11項之核酸分子，其中核酸序列包括SEQ ID NO：1。
8. 一種包含申請專利範圍第11項之核酸的表現載體。
9. 一種包含申請專利範圍第13項之表現載體的宿主細胞。
10. 一種降解木聚醣之方法，該方法包含提供申請專利範圍第1項之多肽，以及混合木聚醣和該多肽。
11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該多肽包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列。