KR101828080B1

KR101828080B1 - 싸이크로박터 유래의 저온활성 지질분해효소

Info

Publication number: KR101828080B1
Application number: KR1020160121713A
Authority: KR
Inventors: 임정한; 김일찬; 한세종; 윤의중; 구본훈; 문병헌; 신종서
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2016-09-22
Filing date: 2016-09-22
Publication date: 2018-02-09

Abstract

본 발명은 싸이크로박터 유래의 저온활성 지질분해효소에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 저온활성 지질분해효소를 발현하는 재조합 미생물을 제조하고 이를 이용하여 저온활성 지질분해효소를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 미생물을 이용한 싸이크로박터 유래 재조합 저온활성 지질분해효소는 저온에서 높은 활성을 나타내므로, 다양한 산업적 용도로 이용이 가능하다.

Description

싸이크로박터 유래의 저온활성 지질분해효소 {Cold-Active Lipase from Psychrobacter sp.}

본 발명은 싸이크로박터 유래의 저온활성 지질분해효소에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 저온활성 지질분해효소를 발현하는 재조합 미생물을 제조하고 이를 이용하여 저온활성 지질분해효소를 제조하는 방법에 관한 것이다.

지질분해효소 (리파아제)는 동식물, 곰팡이, 박테리아 등에서 지질에 특이적으로 작용해 가수분해를 유도하는 촉매 역할을 한다(Cardenas et al., Enzyme Microb. Technol . 28, 145-154, 2001; Salameh and Wiegel, Appl . Environ. Microbiol. 73, 7725-7731, 2007; Sarkar et al., Process Biochem . 47, 858-866, 2012). 이중 박테리아 유래 지질분해효소는 탁월한 안정성, 기질 특이성, 입체선택성 등을 보이기 때문에 세탁 세제, 세정제와 같은 산업용뿐 아니라 식품용, 의약품용, 축산용, 화장품용 등으로 다양한 활용 가능성을 갖는다(Jaeger et al., FEMS Microbiol. Rev. 15, 29-63, 1994; Jaeger et al., Annu . Rev. Microbiol . 53, 315-351, 1999).

저온환경에서 박테리아, 효모, 지의류, 곰팡이 등은 다양한 방법으로 저온에 적응하며 살아오고 있다(Gerday et al., Trends Biotechnol. 18, 103-107, 2000). 특히, 저온에 적응한 미생물들은 유용한 저온활성 효소들의 원천이기 때문에 산업적으로 중요한 자원으로 간주된다(Jaeger et al., Annu. Rev. Microbiol. 53, 315-351, 1999; Zhang et al., J. Microbiol. Biotechnol. 17, 604-610, 2007; Joseph et al., Biotechnol . Adv . 26, 457-470, 2008). 중온성 효소에 비해 저온활성 지질분해효소를 포함한 대부분의 저온활성 효소들은 일반적으로 매우 높은 촉매활성도와 열 불안정성의 특징을 나타낸다(Gerday et al., Trends Biotechnol . 18, 103-107, 2000b; Joseph et al., Biotechnol . Adv . 26, 457-470, 2008; Feller et al., Scientifica, 2013). 저온에서 기질들의 낮은 운동에너지에 기인하는 효소반응의 저하는 단백질 구조의 일부를 변화시킬 수 있는 유연한 구조를 유지함으로써 상쇄된다(Smalas et al., Biotechnol . Annu . Rev. 6, 1-57, 2000). 예로 활성부위에서의 높은 유연성은 낮은 활성화 에너지와 높은 특정 활성을 띠게 한다. 반면, 구조의 유연성 증가는 열에 대한 안정성을 떨어뜨리게 한다(Smalas et al., Biotechnol . Annu. Rev. 6, 1-57, 2000). 저온에서의 높은 활성도는 가열공정의 생략으로 인한 비용절감과 수율의 증대, 그리고 고온에서 잘 생기는 원치 않는 반응들을 최소화하는 이점이 있다. 또한, 열 불안정성은 연속처리공정에서 다음 단계로의 전환 시, 효소의 열에 의한 불활성화를 유도하여 빠르고 쉽게 공정을 진행시킬 수 있다. 더 나아가 구조분석을 통해 얻은 효소들의 저온적응 기작의 규명은 보다 더 낮은 온도에서의 활성도 유지나 증가, 높은 활성도를 유지하면서도 열안정성을 증가시킬 수 있는 효소들의 제조를 위한 단백질공학에 필요한 정보를 제공할 수 있다.

지금까지 다양한 저온환경에서 저온활성 지질분해효소를 생산하는 미생물들이 동정되었고, 그 미생물로부터 분리된 지질분해효소의 특성이 연구되었다(Gerday et al., Trends Biotechnol . 18, 103-107, 2000). 최근 북극해의 축치해 (Chuckchi Sea)로부터 저온지질분해효소 활성을 보이는 균주들이 분리되었으며, 그 중 싸이크로박터 (Psychrobacter sp. ArcL13)에서 가장 높은 효소활성이 확인되었다(Kim et al., Prep. Biochem . Biotechnol . 45, 348-364, 2015). 그러나, 직접 이 균주를 사용해 산업화에 필요한 효소를 경제적으로 대량생산하기는 어려운 문제점이 있으므로, 이 균주로부터 지질분해효소 유전자를 분리 동정하고 다른 발현 숙주에서 대량으로 생산하는 기술 개발이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 다양한 산업적 용도로 이용 가능한 싸이크로박터 유래 저온활성 지질분해효소를 제조하고자 예의 노력한 결과, 싸이크로박터 (Psychrobacter sp. ArcL13)로부터 지질분해효소 유전자를 분리 동정하고, 발현벡터를 제작하여 대장균에서 발현시켜 제조한 지질분해효소의 저온에서 높은 활성을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 싸이크로박터 유래의 저온활성 지질분해효소, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물을 이용하여 저온활성의 재조합 지질분해효소를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 저온활성의 재조합 지질분해효소를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 지질분해효소를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 지질분해효소를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 지질분해효소를 회수하는 단계를 포함하는 지질분해효소의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 저온활성의 재조합 지질분해효소를 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 미생물을 이용한 싸이크로박터 유래 재조합 저온활성 지질분해효소는 저온에서 높은 활성을 나타내므로, 세제 혹은 토양과 폐수 정화의 첨가제 등의 다양한 산업적 용도로 이용이 가능하다.

도 1의 (A)는 지질분해효소 발굴을 위해, 싸이크로박터 (Psychrobacter sp. ArcL13)의 게놈 DNA를 주형으로 하고 다양한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과로 화살표의 PCR 산물은 지질분해효소 유전자 단편이다 (lanes: 1, OXF1+ACR1; 2, OXF1+ACR2; 3, OXF1+ACR3; 4, OXF1+ACR4; 5, OXF2+ACR1; 6, OXF2+ACR2; 7, OXF2+ACR3; 8, OXF2+ACR4; 9, OXF3+ACR1; 10, OXF3+ACR2; 11, OXF3+ACR3; 12, OXF3+ACR4). (B)는 OXF1+ACR2 또는 OXF1+ACR4 프라이머로 PCR을 수행한 PCR 산물의 뉴클레오티드 서열이고, (C)는 상기 뉴클레오티드 서열로부터 번역된 아미노산 서열이며, (D)는 상기 아미노산 서열의 지질분해효소인 L13 (Psychrobacter sp. ArcL13의 지질분해효소)과 다른 싸이크로박터 속 유래 지질분해효소들과의 아미노산 서열 얼라인먼트 결과이다.
도 2의 (A)는 싸이크로박터 속 유래 지질분해효소의 N- 및 C- 말단 아미노산을 코딩할 수 있는 프라이머와 ArcL13-Lip의 내부 염기 서열을 기초로 한 프라이머들을 조합하여 싸이크로박터 (Psychrobacter sp. ArcL13)의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 결과로 화살표의 PCR 산물은 지질분해효소 유전자 단편이다 (lanes: 1, Psychro-1-F+L13-internal-R; 2, Psychro-2-F+L13-internal-R; 3, Psychro3-F+L13-internal-R). (B)는 Psychro-2-F+L13-internal-R 프라이머로 PCR을 수행한 PCR 산물의 뉴클레오티드 서열이다. (C)는 L13 internal-F+Psychro-R 프라이머와 싸이크로박터 (Psychrobacter sp. ArcL13)의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 결과로 화살표의 PCR 산물은 지질분해효소 유전자 단편이며, (D)는 L13 internal-F+Psychro-R 프라이머로 PCR을 수행한 상기 PCR 산물의 뉴클레오티드 서열이다.
도 3의 (A)는 싸이크로박터 (Psychrobacter sp. ArcL13) 유래 지질분해효소인 ArcL13-Lip의 유추된 전체 뉴클레오티드 서열이며, (B)는 싸이크로박터 (Psychrobacter sp. ArcL13)의 게놈 DNA를 주형으로 하여 전체 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과이다. (C)는 ArcL13-Lip의 유추된 아미노산 서열이며, 밑줄은 시그널 펩타이드로 추정되는 부분이다.
도 4는 ArcL13-Lip과 다른 지질분해효소들과의 아미노산 서열 얼라인먼트 결과로, (▼)은 catalytic triad 이며 (●)은 oxyanion hole을 나타낸 것이다 (L13, Psychrobacter sp. ArcL13; GAF53800.1, Psychrobacter sp. JCM 18900; ERL56372.1, Psychrobacter aquaticus CMS 56; GAF62973.1, Psychrobacter sp. JCM 18903; GAF59766.1, Psychrobacter sp. JCM 18902).
도 5의 (A)는 ArcL13-Lip를 BL21 (DE3)에 형질전환시킨 후, IPTG 유도에 의한 ArcL13-Lip 단백질 발현을 SDS-PAGE로 확인한 것이며, (B)는 ArcL13-Lip를 과발현시킨 세포의 상층액 및 침전물의 SDS-PAGE 분석 결과로 화살표는 ArcL13-Lip이다 (lanes: 1, 총 세포 용해물; 2, 상층액; 3, 침전물; M, 마커).
도 6의 (A)는 다양한 첨가제에 의한 ArcL13-Lip의 리폴딩 효율을 비교한 결과이며, (B)는 서로 다른 글루코스 농도에 대한 ArcL13-Lip의 리폴딩 효율을 비교한 결과이다 (*P < 0.05 vs 대조군).
도 7의 (A)는 ArcL13-Lip의 기질 특이성을 분석하기 위한 탄소 수가 서로 다른 p-니트로페닐에스테르에 대한 효소활성 결과이고, (B)는 서로 다른 pH 완충액에서의 ArcL13-Lip의 지질분해효소 활성 결과이며 (●, PBS (pH 6.0.7.5); ■, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5.9.0); ▲, 50 mM glycine-NaOH (pH 9.0.10.0)), (C)는 온도에 대한 ArcL13-Lip의 효소 활성 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는, 북극 축치해 (Chuckchi Sea)로부터 분리된 저온활성 지질분해효소 활성을 보이는 Psychrobacter sp.ArcL13 (KCTC 12498BP) 균주로부터 PCR을 이용한 유전자 프로스펙팅 (gene prospecting) 방법으로 새로운 지질분해효소 유전자인 ArcL13-Lip을 분리·동정하였다. ArcL13-Lip은 일부 싸이크로박터 속 박테리아 유래의 지질분해효소들과 염기서열의 유사성은 낮지만, 84~90%의 아미노산 서열 유사성을 보였으므로 ArcL13-Lip 유전자를 대장균에서 발현시켰다. 약 35 kDa 분자량의 봉입체 형태의 단백질을 수득하고, 글루코스에서 리폴딩 (refolding) 하였다. 이렇게 제조된 저온활성 지질분해효소는 다양한 탄소 수를 갖는 p-니트로페닐 에스터 (p-nitrophenyl ester)에 대한 효소활성 및 저온활성을 나타냈다.

따라서, 본 발명은 일관점에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 지질분해효소에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 지질분해효소는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 시그널 펩타이드를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 지질분해효소는 싸이크로박터 속 (Psychrobacter sp.) 유래인 것을 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

같은 계열의 유전자들 사이에서 전체 아미노산 서열의 유사성이 낮더라도, 기능이나 구조에 중요한 역할을 하는 도메인의 경우 유사한 아미노산 서열로 구성된다. 그러나, 이 도메인들의 아미노산 서열이 잘 보존되어 있다 하더라도, 이 아미노산들을 코딩하는 염기 서열은 서로 다를 수 있다. 따라서, 이 아미노산들을 모두 코딩할 수 있는 염기들로 구성된 디제너레이트 프라이머 (degenerate primer)들을 사용해 PCR을 수행하게 되면, 원하는 유전자를 찾을 수 있는 확률이 높아진다. 이와 같은 방법을 유전자 프로스펙팅 (gene prospecting)이라 하며, 다양한 유전자들을 발굴하는데 이용된다(Bell et al., Microbiology 148:2283-2291, 2002; Sunna and Bergquist, Extremophiles 7:63-70, 2003; Shandilya et al., Extremophiles 8:243-251, 2004; Finnegan et al., Arch. Microbiol . 183:140-147, 2005). 현재까지 Psychrobacter sp. ArcL13의 게놈서열은 밝혀져 있지 않기 때문에, 이 균주로부터 원하는 유전자를 발굴하기는 쉽지 않다. 그러나, 게놈서열을 모르더라도 유전자 프로스펙팅 방법을 사용할 경우, 좀더 경제적으로 원하는 유전자를 발굴하기 용이해진다. 따라서, 유전자 프로스펙팅 방법은 다양한 환경으로부터 스크리닝 과정을 통해 발굴된 유용한 활성을 갖는 다양한 균주로부터 게놈서열의 규명 없이도 원하는 유전자를 발굴이 가능하다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 시그널 펩타이드를 코딩하는 폴리펩티드의 염기서열 부분을 포함하지 않는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 벡터는 pET-28a(+)인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 BL21 (DE3)인 것이며, 가장 바람직하게는 KCTC 13078BP 균주인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 KCTC 13078BP 균주는 2016년 8월 23일에 기탁되었다.

본 발명에서, “벡터”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, “플라스미드” 및 “벡터”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환 되어야 한다. 형질전환은 Sambrook , et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현벡터가 사용될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다.

상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 “형질전환”은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

Basic Local alignment Search Tool을 사용해 ArcL13-Lip과 일부 싸이크로박터 속 박테리아 유래 지질분해효소들의 아미노산 서열 유사성이 확인되었지만, 이들 싸이크로박터 속 박테리아 유래 지질분해효소들에 대한 연구가 전무한 상황이다. 그러나, ArcL13-Lip은 지질분해효소 활성에 대한 스크리닝 과정을 통해 Psychrobacter sp. ArcL13을 분리하고 (Kim et al., Prep. Biochem . Biotechnol . 45:348-364, 2015), 분석한 결과 아미노산 서열에 전형적인 지질분해효소의 특징인 catalytic triad와 oxyanion hole을 구성하는 아미노산들을 갖고 었있다 (Jaeger et al., Annu. Rev. Microbiol. 53:315-351. 1999).

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 미생물을 배양하여 지질분해효소를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 지질분해효소를 회수하는 단계를 포함하는 지질분해효소의 제조방법에 관한 것이다.

대부분의 이종 단백질은 대장균에서 불활성 상태인 단백질 봉입체 형태로 발현된다. 단백질 봉입체 형태로 발현되는 것의 장점은 단백질을 과발현시킬 수 있고, 세포 파쇄 후 단백질 봉입체의 세척 과정만으로 고순도의 단백질을 얻을 수 있기 때문에 정제 과정이 복잡하지 않다는 것이다. 반면, 단백질 봉입체는 불활성 상태이기 때문에 활성 형으로 전환시키기 위해서는 많은 시간과 노력이 필요하다. In vivo에서 단백질 폴딩 (folding) 과정에는 샤페론 (chaperone)이 관여하여, 폴딩 중간체 (folding intermediate)들의 응집 (aggregation)을 방지함으로써 단백질 폴딩을 촉진한다 (Hartl et al., Nature 475:324-332, 2011). In vitro에서는 단백질 폴딩 효율성을 높이기 위해 폴딩 중간체 (folding intermediate)들의 응집 (aggregation)을 방지하는 다양한 첨가제들 (예; 아르기닌, 계면활성제, 글리세롤, 수크로스, 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜)이 사용된다 (Vallejo and Rinas, Microb . Cell Fact. 3:11, 2004). 특히, 글루코스는 in vitro에서 단백질 안정화에 기여한다. 예로, 글루코스는 높은 온도에서 native 상태를 유지할 수 있도록 효소들을 안정화시키는 역할을 하며 (Hottiger et al., Eur . J. Biochem . 219:187-193, 1994), 변성된 로다네제 (rhodanese)의 응집 (aggregation)을 억제한다는 보고도 있다 (Singer and Lindquist, Mol . Cell 1:639-648, 1998). 글루코스, 락토스, 수크로스 등과 같은 당들은 물과 단백질 사이의 접촉 면적을 최소화해 단백질의 고유한 구조와 변성된 구조 사이의 평형 상태를 고유한 구조 쪽으로 유리하게 함으로써, 단백질의 고유한 구조를 안정화시키는 역할을 한다(Lee and Timasheff, J. Biol . Chem . 256:7193-7201, 1981; Arakawa and Timasheff, Biochemistry 21:6536.6544, 1982). 따라서, 글루코스에 의한 ArcL13-Lip의 리폴딩 효율의 증가는 글루코스가 리폴딩 과정에서 응집 (aggregation) 방지를 통해 리폴딩 효율을 증가시키는 것으로 설명할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법에 의해 제조된 저온활성의 재조합 지질분해효소에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 지질분해효소는 탄소수 C8~C10의 기질, pH 8.0-8.5 및 20℃ 내지 50℃의 온도에서 최고 활성을 나타내는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

ArcL13-Lip과 아미노산 서열이 유사한 싸이크로박터 속 박테리아 유래 지질분해효소들은 지질분해효소로서의 가능성만 제시되었을 뿐 실제 지질분해효소로서의 기능과 특성을 규명한 것은 ArcL13-Lip이 처음이다.

알려진 대부분의 저온활성 지질분해효소는 싸이크로박터 속 박테리아를 포함한 호냉성 (psychrophlilic)과 내냉성 (psychrotolerant) 미생물에서 분리되었다 (Zhang et al., J. Mol . Catal . B Enzym . 56:78-84, 2009; Chen et al., World J. Microbiol. Biotechnol . 27:431-441, 2011). 대부분의 저온활성 지질분해효소는 EDTA에 의해 활성을 잃지만(Kulakova et al., Biochim . Biophys . Acta . 1696:59-65, 2004; Chen et al., World J. Microbiol . Biotechnol . 27:431-441, 2011; Novototskaya-Vlasova et al., Biochemistry ( Mosc ) 78:385-394, 2013a), ArcL13-Lip 활성은 EDTA 영향을 거의 받지 않는다. 이것은 ArcL13-Lip의 활성에는 금속이온이 필요 없지만, 대부분의 저온활성 지질분해효소의 활성을 위해서는 금속이온이 필수적임을 의미한다.

저온활성 지질분해효소는 세제 혹은 토양과 폐수 정화 등에 첨가제로 다양하게 사용될 수 있기 때문에 특히 주목을 받고 있다. 본 연구를 통해 이루어진 ArcL13-Lip의 물리； 화학적 특성 규명, 발현 균주, 최적의 리폴딩 방법을 바탕으로 ArcL13-Lip의 산업적 응용을 위해서는 우선 대량생산 기술개발이 요구되며, 이를 통해 다양한 분야로의 적용이 가능하다.

[ 실시예 ]

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: ArcL13 -Lip 유전자 동정 및 분리

1-1: Gene prospecting 방법을 이용한 ArcL13 -Lip 유전자의 동정

북극 축치해 (Chuckchi Sea)로부터 분리된 저온활성 지질분해효소활성을 보이는 Psychrobacter sp.ArcL13 (KCTC 12498BP)는 한국극지연구소로부터 제공 받았다. Psychrobacter sp. ArcL13을 Marine broth (BD Biosciences) 배지를 사용하여 25℃에서 48시간 배양한 후, 원심분리하여 세포 펠렛을 회수하였다. 그 다음 Genomic DNA extraction kit (Intron Biotechnology)를 이용하여 세포 펠렛으로부터 게놈 DNA를 분리하여, PCR 주형으로 사용하였다.

Psychrobacter sp. ArcL13의 게놈 서열은 알려져 있지 않기 때문에, 이 균주로부터 지질분해효소 유전자를 분리 동정하기 위해 PCR을 이용한 유전자 프로스펙팅 (gene prospecting) 방법을 활용하였다 (Bell et al., Microbiology 148, 2283-2291, 2002). 대부분의 박테리아 유래 지질분해효소들은 oxyanion hole 부위와 active site 부위에서 염기 서열이 서로 다름에도 불구하고 아미노산 서열들이 비교적 잘 보존되어 있기 때문에, 이 보존된 아미노산 서열들을 코딩하는 디제너레이트 프라이머 (degenerate primer)들을 이용하였다 (표 1).

디제너레이트 프라이머 (degenerate primer)

Primer	Region	Sequence	서열번호
OXF1	Lipase-oxyanion hole	CCYGTKGTSYTNGTNACATGG	4
OXF2	Lipase-oxyanion hole	CCRATMRTWYTNGTNCAYGG	5
OXF3	Lipase-oxyanion hole	CCKYTWGTKYTNATHCAYGG	6
ACR1	Lipase-active site	AGGCCNCCCAKNGARTGNSC	7
ACR2	Lipase-active site	AGRCCNCCCAKRCTRTGNSC	8
ACR3	Lipase-active site	AGGCCRCCNTGNGATRGNSC	9
ACR4	Lipase-active site	AGGCCNCCNTGRCTRTGNSC	10

(R:A,G Y:C,T W:A,C S:C,G K:G,T N:A,C,G,T H:A,T,C)

Oxyanion hole로부터 active site 사이의 염기 서열 (약 200-250 염기쌍)을 찾기 위해 다양하게 조합시킨 프라이머 쌍들(OXF1 + ACR1, OXF1 + ACR2, OXF1 + ACR3, OXF1 + ACR4, OXF2 + ACR1, OXF2 + ACR2, OXF2 + ACR3, OXF2 + ACR4, OXF3 + ACR1, OXF3 + ACR2, OXF3 + ACR3, OXF3 + ACR4)과 Psychrobacter sp. ArcL13 균주로부터 분리한 게놈 DNA를 사용하여 PCR을 수행하였다.

그 결과, OXF1 + ACR2 (lane 2), OXF1 + ACR4 (lane 4), OXF2 + ACR3 (lane 7), OXF3 + ACR3 (lane 11) 프라이머 쌍에서 200-250 염기쌍의 PCR 산물들이 확인되었다 (도 1A). 이들 각 PCR 산물들의 염기 서열을 분석한 결과, OXF1 + ACR2과 OXF1 + ACR4 프라이머 쌍으로부터 얻은 PCR 산물에서 189개의 동일한 염기 서열이 확인되었으나 (도 1B), OXF2 + ACR3와 OXF3 + ACR3 프라이머 쌍을 통해 얻은 PCR 산물들에서는 염기 서열이 읽히지 않아, Basic Local alignment Search Tool (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 사용해 이 염기 서열과 유사한 서열을 갖는 유전자들을 찾고자 하였지만 유사성이 있는 유전자가 확인되지 않았다.

이에, 도 1B에서 확인된 염기 서열을 DNA 번역 프로그램 (http://web.expasy.org/translate/)을 사용해 아미노산 서열로 번역시킨 후 (도 1C), 다시 Basic Local alignment Search Tool을 사용해 유사한 아미노산 서열을 갖는 단백질들을 찾은 결과 일부 싸이크로박터 속 박테리아 유래 지질분해효소들과 유사성을 보였다 (도 1C의 밑줄 부분 및 도 1D).

1-2: ArcL13 -Lip 전체 유전자의 분리

[표 1]의 싸이크로박터 속 박테리아 유래 지질분해효소들의 N-말단과 C-말단 부위의 아미노산들을 코딩할 수 있는 디제너레이트 프라이머 (degenerate primer)들과 실시예 1-1에서 확인된 ArcL13-Lip 염기 서열 (도 1B의 밑줄 부분)을 기초로 고안한 프라이머들 (표 2)을 다양하게 조합하여 Psychrobacter sp. ArcL13 균주로부터 분리한 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행한 후 분석하였다.

Primer	Region	Sequence	서열번호
L13-imternal-F	ArcL13-Lip internal	GAGCAGCTGCTACAACAG	11
L13-imternal-R	ArcL13-Lip internal	CTGTTGTAGCAGCTGCTC	12
Psychro-1-F	Psychrobacter piscatorii α/β?? hydrolase N-terminal	ATGACGCTAAAATCTTCCTCT	13
Psychro-2-F	psychrobacter aquaticus CMA56 lipase precursor N-terminal	ATGACGCTTTCTTTGTACAT	14
Psychro-3-F	psychrobacter sp. JCM 18900 lipase precursor N-terminal	ATGACKCTAAARWCYTYYYT	15
Psychro-R	Psychrobacter C-terminal	TTAWAGGTTRGCGTTTTTMA	16

(R:A,G Y:C,T W:A,C K:G,T N:A,C)

그 결과, Psychro-2-F+L13-internal-R와 L13 internal-F+Psychro-R 프라이머 쌍으로부터 약 300 염기쌍 (도 2A)과 약 700 염기쌍 (도 2C)의 PCR 산물들이 각각 확인되었다. 이 PCR 산물들의 염기 서열 분석을 수행한 후 (도 2B 및 도 2D), 염기 서열을 Basic Local alignment Search Tool을 사용해 분석한 결과 유사성은 낮지만 Psychrobacter sp. JCM 18903 지질분해효소의 염기 서열과 비교되는 결과를 얻었다. 이 결과들을 바탕으로 N-말단 부위를 코딩하는 337개의 염기 서열 (도 2B)과 C-말단부위를 코딩하는 669개의 염기 서열 (도 2D)를 확인할 수 있었다.

이 두 염기 서열들을 결합함으로써 1,074개의 전체 ArcL13-Lip 유전자 염기 서열을 얻을 수 있었다(도 3A). 그 다음, ArcL13-Lip 유전자에 대한 5’- 말단과 3’- 말단 프라이머 쌍, 게놈 DNA를 사용하여 PCR를 수행한 결과 약 1 kb의 PCR 산물을 확인할 수 있었고 (도 3B), PCR 산물의 염기 서열 분석 결과는 이미 확인된 ArcL13-Lip 유전자 전체 염기 서열 (서열번호 2)과 일치하였다. DNA 번역 프로그램을 사용하여 ArcL13-Lip 유전자의 염기 서열을 번역한 결과, ArcL13-Lip 단백질은 358개의 아미노산 (서열번호 1 및 서열번호 3)으로 구성됨을 알 수 있었다 (도 3C).

실시예 2: ArcL13 -Lip의 아미노산 서열 분석

실시예 1에의 ArcL13-Lip 단백질의 전체 아미노산 서열을 Basic Local alignment Search Tool을 사용해 유사한 아미노산 서열을 갖는 단백질들을 확인하였다.

그 결과, ArcL13-Lip은 일부 싸이크로박터 속 박테리아 유래의 지질분해효소들과 84-90%의 유사성을 보였다(도 4). 이러한 다른 지질분해효소들과의 유사성을 기초로, ArcL13-Lip의 catalytic triad는 144번째 세린 (Ser144), 302번째 아스파테이트 (Asp302), 324번째 glt티딘 (His324)로 구성되며, oxyanion hole은 73번째 메티오닌 (Met73)과 145번째 글루타민 (Gln145)로 형성될 것으로 추론하였다(도 4). SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)를 이용하여 시그널 펩타이드 유무를 분석한 결과, ArcL13-Lip은 39개의 아미노산으로 구성된 시그널 펩타이드 (서열번호 3)를 갖고 있음이 확인되었다 (도 3C의 밑줄 부분).

실시예 3: ArcL13 -Lip 유전자 클로닝 및 대장균에서의 발현

3-1: ArcL13 -Lip 유전자 클로닝

시그널 펩타이드 부위를 제외한 ArcL13-Lip 전체 유전자 (서열번호 3) (도 3)를 클로닝하기 위해, 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 17 및 18의 프라이머 쌍을 사용해 PCR을 수행하였다. i-pfu DNA 폴리머레이즈 (Intron Biotechnology)를 사용하여 사이클 당 95℃에서 30초, 61℃에서 1분, 72℃에서 1분 총 25 사이클의 반응 조건으로 수행하였다.

서열번호 17 (Forward): 5'-GTACATATGGCAGGGCAGTACTATAAT-3'

(밑줄부분; NdeI site)

서열번호 18 (Reverse): 5’-ATACTCGAGTTAAAGGTTAGCGTTTTTAAG-3’

(밑줄부분; XhoI site와 stop codon)

그 다음, PCR 산물을 NdeI/XhoI 제한효소 (New England Biolabs)로 37℃에서 2시간 처리하고 Gel Extraction kit (Intron Biotechnology)로 정제한 후, 미리 같은 효소들로 처리한 pET-28a (+) 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하여 발현벡터를 제작하였다. 제작한 발현벡터 안의 ArcL13-Lip 전체 염기 서열은 양방향에서 읽어 검증하였다 (Cosmogenetech).

3-2: ArcL13 -Lip의 대장균에서의 발현

실시예 3-2의 ArcL13-Lip 발현벡터로 BL21 (DE3) 세포를 형질전환시킨 후, LB 배지에서 A600 nm = 0.6까지 배양하였다. ArcL13-Lip 발현 유도를 위해 0.2 mM IPTG를 처리하고 4시간 더 배양한 후, 발현 정도를 확인하기 위해 배양액을 SDS-PAGE로 분석하였다.

그 결과, 발현을 IPTG로 유도시한 세포에서만 약35kDa의 분자량을 갖는 ArcL13-Lip이 과발현됨을 확인하였다(도 5A).

그 다음, 발현된 ArcL13-Lip이 단백질 봉입체 형태로 발현되는지 확인하기 위해 과발현시킨 세포들을 초음파로 파쇄한 후 원심분리하여, 상층액과 침전물을 각각 SDS-PAGE로 분석하였다.

분석 결과, ArcL13-Lip의 발현은 오직 침전물에서만 관찰되었으며, 이것은 ArcL13-Lip 유전자를 대장균에서 발현시킬 경우 단백질 봉입체 형태로 발현됨을 의미 한다(도 5B).

실시예 4: ArcL13 -Lip의 리폴딩

4-1: 단백질 봉입체의 분리

대장균에서 발현시킨 단백질 봉입체 형태의 ArcL13-Lip은 불활성 상태이기 때문에, 활성형으로 전환시키기 위해서는 단백질 봉입체의 언폴딩과 리폴딩 과정이 필수적이다. 따라서, 대장균으로부터 고순도의 단백질 봉입체를 분리하기 위해, 파쇄한 세포들을 비이온 계면활성제가 포함된 완충용액으로 수차례 세척하는 과정이 필요하다.

단백질 봉입체 분리를 위해 대장균 배양액을 20분 동안 5,000 rpm으로 원심분리한 후, 상층액은 제거하고 대장균 펠렛만을 취하였다. 초음파로 파쇄한 대장균을 30분 동안 5,000 rpm에서 원심분리를 수행한 후 상층액은 제거하였고, 세포 잔여물 등을 제거하기 위해 침전물을 1% Triton X-100로 현탁한 후 원심분리를 수행하고, 침전물만 회수하였다. 이 과정을 1회 더 반복하였으며, 마지막으로 증류수로 침전물을 현탁한 후 원심분리하여, 잔존해 있는 Triton X-100를 제거하였다.

4-2: 리폴딩

단백질 봉입체의 언폴딩 (unfolding) 조건 확립을 위해 다양한 urea 농도와 pH 조건하에서 언폴딩 실험을 수행하였다. 단백질 봉입체를 pH 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10 및 11의 20 mM Tris-HCl, 2M, 4M, 6M 및 8M 우레아, 10 mM β-머캅토에탄올 용액에 첨가한 후 상온에서 1시간 교반시켰으며, 언폴딩 상태는 A595 nm에서 흡광도 측정을 통해 혼탁 정도로 확인하였다.

그 결과, 8M urea, 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), 10 mM β-머캅토에탄올 용액에서 단백질 봉입체의 언폴딩 효율이 가장 높았다.

리폴딩 (refolding)을 위한 최적의 조건을 확립하기 위한 리폴딩 용액으로 0.5M 아르기닌 (arginine), 0.1% Tween 80, 5% 글리세롤, 5% 프로필렌 글리콜 (propylene glycol), 0.5M 글루코스, 1 mg/ml PEG 6000 등과 10mM 시스테인 (cysteine)/1mM 시스틴 (cystine)을 첨가한 20mM Tris-HCl (pH 8.0)를 사용하였다. 리폴딩을 위해 10배 부피의 리폴딩 용액을 언폴딩 시킨 시료와 바로 섞은 후 4℃에서 3일간 반응시켰다. 3일 후 각 반응액에서 ArcL13-Lip의 리폴딩 정도를 확인하기 위해 기질로 p-니트로페닐 카프릴산 (p-nitrophenyl caprylate)을 사용하여 효소 반응을 시킨 후, A405 nm에서 흡광도 증가 정도를 측정하여 지질분해효소 활성을 확인하였다.

그 결과, 글루코스에 의해서만 ArcL13-Lip의 리폴딩 수율이 크게 증가하였다(도 6A). 글루코스 농도에 따른 ArcL13-Lip의 리폴딩 수율을 확인하기 위해 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1M 글루코스를 포함하는 완충용액에 ArcL13-Lip을 리폴딩 시킨 후, 효소활성을 측정한 결과, 0.4M에서 리폴딩 효율이 정점을 나타내었고, 더 이상의 농도에서는 리폴딩 효율이 증가하지 않았다(도 6B).

실시예 5: 재조합 ArcL13 -Lip의 물리 화학적 특성

ArcL13-Lip 지질분해효소의 다양한 분야에서 적용을 위해, ArcL13-Lip의 기질 특이성, pH 및 온도 의존성, 금속이온들과 효소 저해제들에 의한 영향 등을 조사하였다.

5-1: 기질 특이성

기질 특이성은 탄소 수가 서로 다른 p-니트로페닐 에스터 (p-nitrophenyl ester)에 대한 효소활성을 측정하여 확인하였으며, 최종농도 0.1 mM의 다양한 p-니트로페닐 에스터 (pNP-butyrate (C4), pNP-caprylate (C8), pNP-decanoate (C10), pNP-dodecanoate (C12), pNP-palmitate (C16))와 10㎕ ArcL13-Lip 효소를 1ml의 50mM Tris-HCl (pH 8.0)에 첨가하여, 25℃에서 2분간 반응시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다.

그 결과, ArcL13-Lip은 p-니트로페닐 카프릴산 (p-nitrophenyl caprylate) (C8), 그 다음으로 p-니트로페닐 데카논산 (p-nitrophenyl decanoate) (C10)에 대해 최고의 활성을 나타내었다(도 7A). 반면, 탄소 수가 더 적거나 더 많은 기질에 대해서는 C4 60%, C12 50%, C16 45%로 상대적으로 낮은 활성을 보였다.

5-2: pH 및 온도에 따른 효소활성

ArcL13-Lip 지질분해효소 활성의 pH 의존성을 확인하기 위해, pH 6.0-10.0 범위에서 p-니트로페닐 카프릴산에 대한 효소활성을 2분간 측정하였다. 완충용액은 PBS (pH 6.0-7.5), 50 mM Tris-HCl (pH 7.5-9.0), 50mM glycine-NaOH (pH 9.0-10.0)을 사용하였다.

그 결과, ArcL13-Lip은 pH 8.0-8.5에서 최고의 활성을 보였다(도 7B).

그 다음, ArcL13-Lip 활성의 온도 의존성을 확인하기 위해, 5-70℃ 범위에서 p-니트로페닐 카프릴산에 대한 효소활성을 2분간 측정하였다.

그 결과, ArcL13-Lip은 40℃에서 최고의 활성을 나타내었고, 10℃와 20℃에서 각각 최고 활성 대비 약 40%와 73%의 효소활성을 나타내었다(도 7C). 이와 같이 저온에서의 높은 효소활성은 전형적인 저온활성 효소의 특징을 보여주는 것이다 (Joseph et al., Biotechnol. Adv. 26, 457-470, 2008).

5-3: 금속이온 및 효소 저해제에 의한 효소활성

다양한 금속이온들과 효소 저해제들이 효소활성에 미치는 영향을 조사하기 위해, Ca² ⁺, Mg² ⁺, Mn² ⁺, Cu² ⁺, Co² ⁺, Ni² ⁺, Zn² ⁺의 금속이온과 PMSF, EDTA의효소 저해제의 첨가물이 각 1 mM 포함된 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)에 10㎕의 ArcL13-Lip 시료를 넣고 상온에서 10분간 반응시킨 후 기질로 p-니트로페닐 카프릴산를 사용해 효소활성을 측정하였다.

그 결과, 다양한 금속이온 및 효소 저해제에 의한 ArcL13-Lip 효소활성을 측정한 결과, CoCl₂, NiCl₂, EDTA 등에 의해 미약하게 억제되었지만, CuCl₂와 ZnSO₄에 의해서는 약 50% 억제되었고, CaCl₂, MgCl₂, MnCl₂ 및 PMSF는 ArcL13-Lip의 효소활성에 영향을 주지 않았다 (표 3).

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

한국생명공학연구원

KCTC13078BP

20160823

<110> Korea Polar Research Institute (KOPRI) <120> Cold-Active Lipase from Psychrobacter sp. <130> P16-B185 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 319 <212> PRT <213> Psychrobacter sp. <400> 1 Ala Gly Gln Tyr Tyr Asn Cys Ala Asn Ala Asn Gly Cys Thr Leu Val 1 5 10 15 Asp Ser Lys Tyr Phe Thr Ser Asn Tyr Thr Lys Thr Gln Tyr Pro Val 20 25 30 Val Met Ala His Gly Leu Phe Gly Phe Thr Lys Leu Phe Gly Val Ile 35 40 45 Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Pro Asp Glu Leu Met Lys Gly Gly Ser Glu 50 55 60 Val Tyr Thr Thr Lys Thr Ser Ala Val Asn Asn Ser Glu Val Arg Gly 65 70 75 80 Glu Gln Leu Leu Gln Gln Val Lys Thr Ile Thr Ala Ile Ser Gly Asp 85 90 95 Pro Lys Val Asn Leu Phe Gly His Ser Gln Gly Gly Ile Asp Ile Arg 100 105 110 Tyr Val Ala Gly Val Ala Pro Lys Tyr Val Ala Ser Val Thr Ala Val 115 120 125 Ser Ser Pro Glu Gln Gly Ser Lys Thr Ala Asp Phe Val Lys Asn Val 130 135 140 Leu Glu Pro Asn Asn Asp Thr Gly Glu Pro Ser Asn Val Thr Thr Gln 145 150 155 160 Leu Val Ser Gly Val Phe Asn Leu Ile Gly Gly Phe Thr Asp Val Gly 165 170 175 Ser Gly Ile Ser Phe Lys Glu Ile Gln Glu Gln Asp Gly Trp Gln Ala 180 185 190 Leu Met Ala Leu Ser Thr Asp Gly Ala Ala Lys Phe Asn Ala Lys Phe 195 200 205 Pro Ala Ala Met Pro Thr Ser Tyr Cys Gly Gln Pro Thr Ser Thr Ala 210 215 220 Ala Asn Gly Ile Lys Tyr Tyr Ser Phe Ser Gly Val Gly Gln Val Thr 225 230 235 240 Ser Val Leu Asp Pro Ser Asp Tyr Leu Leu Ala Ala Thr Ser Val Pro 245 250 255 Phe Leu Phe Asp Ala Asn Asp Gly Leu Val Ser Ala Cys Ser Ser Arg 260 265 270 Leu Gly Tyr Val Ile Arg Asp Asn Tyr Leu Met Asn His Leu Asp Ser 275 280 285 Ala Asp Gln Val Leu Gly Leu Thr Ala Trp Gly Glu Ser Glu Pro Lys 290 295 300 Ser Ile Tyr Arg Thr Gln Val Asn Arg Leu Lys Asn Ala Asn Leu 305 310 315 <210> 2 <211> 1077 <212> DNA <213> Psychrobacter sp. <400> 2 atgacgcttt ctttgtacat tcgcgccgcg ctcacgccaa gagcattttt accaatactg 60 ggttctatca gtacttgcgt tttattaatg accatgcaaa ccacctcagc gcaagcggca 120 gggcagtact ataattgtgc caacgccaat ggctgcacgc tagtcgacag caaatatttt 180 acctctaatt ataccaaaac tcagtatcca gtggtcatgg cgcatggact tttcggcttt 240 accaaattat ttggcgtcat tgattatttt aatgggattc ctgatgagtt gatgaaaggt 300 ggctcagagg tttataccac gaaaacatca gcggttaata atagcgaagt gcgcggcgag 360 cagctgctac aacaggtaaa aaccatcact gccatctcag gcgatcctaa agtcaatttg 420 tttgggcaca gtcaaggcgg tatcgatatt cgttatgtcg ctggtgtcgc gccaaaatat 480 gtcgcatcag tcaccgccgt atcaagccca gagcaaggct caaaaacagc cgattttgtc 540 aaaaacgtcc ttgaaccaaa caatgacaca ggtgagccat caaacgttac gacacagctg 600 gtatcagggg tgtttaattt gattggcggc tttacagatg tgggatcagg catcagtttt 660 aaagagatac aagagcaaga tggctggcaa gcactcatgg cgctatcaac cgatggtgcg 720 gccaaattca atgccaaatt cccagcagcc atgccaacaa gttactgtgg tcagccgacc 780 agtactgctg ccaatggtat caaatattat tcatttagtg gcgttgggca agtcacaagc 840 gtccttgacc ctagtgatta tctgcttgca gcaacaagcg taccgttttt atttgatgcc 900 aatgatggtc tggtctctgc ctgctcaagc cgacttgggt atgtgattcg tgacaactac 960 ctcatgaacc atttggattc agcagaccaa gtactaggtc tgaccgcttg gggcgagtct 1020 gagccaaaat ctatctatcg tactcaggtc aatcgtctta aaaacgctaa cctttaa 1077 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Psychrobacter sp. <400> 3 Met Thr Leu Ser Leu Tyr Ile Arg Ala Ala Leu Thr Pro Arg Ala Phe 1 5 10 15 Leu Pro Ile Leu Gly Ser Ile Ser Thr Cys Val Leu Leu Met Thr Met 20 25 30 Gln Thr Thr Ser Ala Gln Ala 35 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXF1 <400> 4 ccygtkgtsy tngtnacatg g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXF2 <400> 5 ccratmrtwy tngtncaygg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OXF3 <400> 6 cckytwgtky tnathcaygg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACR1 <400> 7 aggccnccca kngartgnsc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACR2 <400> 8 agrccnccca krctrtgnsc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACR3 <400> 9 aggccrccnt gngatrgnsc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACR4 <400> 10 aggccnccnt grctrtgnsc 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L13-imternal-F <400> 11 gagcagctgc tacaacag 18 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L13-imternal-R <400> 12 ctgttgtagc agctgctc 18 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Psychro-1-F <400> 13 atgacgctaa aatcttcctc t 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Psychro-2-F <400> 14 atgacgcttt ctttgtacat 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Psychro-3-F <400> 15 atgackctaa arwcytyyyt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Psychro-R <400> 16 ttawaggttr gcgtttttma 20 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P1 <400> 17 gtacatatgg cagggcagta ctataat 27 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> P2 <400> 18 atactcgagt taaaggttag cgtttttaag 30

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 지질분해효소.
제1항에 있어서, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 시그널 펩타이드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 지질분해효소.
제1항에 있어서, 싸이크로박터 속 (Psychrobacter sp.) 유래인 것을 특징으로 하는 지질분해효소.
제1항의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자.
제4항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
제4항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
제4항의 유전자 또는 제6항의 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물.
제7항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제7항의 재조합 미생물을 배양하여 지질분해효소를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 지질분해효소를 회수하는 단계를 포함하는 지질분해효소의 제조방법.
제9항의 방법에 의해 제조된 저온활성의 재조합 지질분해효소.
제10항에 있어서, 탄소수 C8~C10의 기질에 대해 최고 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 지질분해효소.
제10항에 있어서, pH 8.0-8.5에서 최고 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 지질분해효소.
제10항에 있어서, 20℃ 내지 50℃에서 최고 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 재조합 지질분해효소.