KR101596435B1 - 남극 유래 바실러스 푸밀러스 리파아제 - Google Patents

남극 유래 바실러스 푸밀러스 리파아제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 남극에 서식하는 미생물로부터 분리된 바실러스 푸밀러스 유래 신규 리파아제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저온상태와 높은 알칼리상태에서도 높은 활성을 가지고 있는 신규 리파아제에 관한 것이다.

Description

남극 유래 바실러스 푸밀러스 리파아제{Lipase of Bacillus pumilus from the Antarctic}
본 발명은 저온과 높은 알칼리 상태에서도 안정한 신규 리파아제에 관한 것으로 더욱 자세하게는 남극 유래 바실러스 푸밀러스 리파아제에 관한 것이다.
남극의 추운 환경에도 많은 유기체, 특히 박테리아, 효모(yeast), 단세포 미세조류(algae), 곰팡이 등이 대량 서식하고 있고(Gerday, C. et al ., Trend Biotechnol , 18:103-107, 2000; Karl et al ., Science , 286:2144-2147, 1999), 이러한 유기체들은 새로운 효소(enzyme)를 생산할 수 있는 잠재력을 가진 유용한 자원이다 (Joseph, B. et al., Biotechnol Adv , 26:457-470, 2008).
리파아제(triacylglycerol acylhydrolase EC 3.1.1.3)는 기름과 물의 경계층에서 트라이아실글라이세롤(triacylglycerol)의 에스테르결합에 대해 가수분해를 촉매하고, 수분이 함유되지 않은 유기용매에서 에스테르 교환반응을 통해서 에스테르 결합을 합성한다 (Reetz, M.T. et al ., Curr Opin Chem Biol , 6:145-150, 2002).
리파아제는 생체내의 각종 대사반응을 촉진시키는 세포내 효소촉매로서 널리 연구되어 왔으며, 산업용 효소로서 각종 생물전환 반응에서도 이용되고 있다. 이와 같이 산업적으로 중요시되는 이유는 제약산업에 널리 쓰이는 키랄(chiral) 소재에 에스테르(ester) 결합이 많이 포함되어 있기 때문이다. 비대칭 화학합성법으로 에스테르 화합물을 합성하는 경우, 최고 700 psi의 고압과 250℃ 이상의 고온에서 반응이 진행되기 때문에 에너지가 많이 소모되며 품질에 좋지 않은 영향을 미치는 여러 가지 부반응이 일어날 뿐만 아니라, 전환율 및 광학순도가 낮아 고순도의 키랄 화합물의 생산에 어려움이 있다. 반면에 리파아제를 이용한 생물전환 공정은 효소 고유의 위치특이성과 입체특이성 및 다양한 기질특이성을 지니고 있어서 고순도의 키랄 소재를 효율적으로 생산할 수 있다. 또한, 최근 효소를 이용한 이상계, 미수계, 비수계 및 역상계의 효소반응계가 개발됨에 따라 고부가가치의 키랄 소재의 제조에 에스터라제(esterase)/리파아제 효소촉매가 점차 널리 이용되고 있다 (민태익 편저, 산업과 미생물, 1998년 3월 21일 초판, 한림원).
리파아제는 자연에서 풍부하게 존재하기 때문에 다양한 식물, 동물, 미생물에서 주로 분리된다. 미생물에서 유래한 리파아제는 촉매활성이 다양하고, 기질특이성을 가지고 있어, 산업적으로 응용하기에 매력적이다 (Gupta, R. et al ., Appl Microbiol Biotechnol , 64:763-781, 2004; Jaeger, K.E. et al ., Annu Rev Microbiol , 53:315-351, 1999; Tanaka, D. et al ., Appl Biochem Biotechnol , 168:327-338, 2012).
특히, 저온에서 높은 지질분해활성을 보이는 저온에 적응된 리파아제는 유용한 생체촉매제이다. 이들은 제약산업, 식품산업, 추운 지방에 오염된 기름을 제거하기 위한 생물학적 환경정화 및 저온 세탁시의 세제 생산에 적용될 수 있다 (Josep, B. et al ., Biotechnol Adv , 26:457-470, 2008; Suzuki, T. et al ., J Biosci Bioeng , 92:144-148, 2001).
지금까지, 저온에 적응된 또는 저온에서 활성화되는 지질분해효소는 사이클로필릭 앤타크틱 박테리아 모락셀라 탈44(psychrophilic Antarctic bacteria Moraxella Tal 44)(Feller, G. et al ., Gene , 102:111-115, 1991)와 사이클로박터 임모빌리스 (Psychrobacter immobilis) B10 (Arpigny, J.L. et al ., Biochem Biophys Acta , 1171:331-333, 2003)에서 생산되고, 저온에서 활성화되는 에스터레이즈는 남극 박테리아 사이클로박터 sp. Ant300(Antarctic bacteria psychrobacter sp. Ant300)(Kulakova, L. et al ., Biochem Biophys Acta , 1696:59-65, 2004); 리파아제(PFL)는 슈도모나스 프라기(Pseudomonas fragi)(X14033)(Alquati, C. et al., Eur J Biochem , 269:3321-3328, 2002)에서 생산된다. 저온에 적응된 리파아제(KB-Lip)는 사이클로트로픽 슈도모나스 sp. KB700A(psychrotrophic Pseudomonas sp. strain KB700A) (Rashid, N. et al ., Appl Environ Microbiol , 325(67): 4064-4069, 2001)에 의해 생산되며, 리파아제P(LipP)는 알라스칸 68 사이클로트로픽 슈도모나스 sp. B11-1(Alaskan 68 psychrotrophic Pseudomonas sp. B11-1) (Choo, D. et al., Appl Environ Microbiol , 64:486-49, 1998)에 의해 생산되고, 저온에 적응된 리파아제는 남극 심해 사이클로트로픽 사이클로박터 sp. (Antarctic deep-sea psychrotrophic psychrobacter sp.)(Zhang, J. et al., J Microbiol Biotechnol , 17: 604-610, 2007)로부터 생산된다.
리파아제는 그 기원에 따라서 고유의 특수기능을 갖고 있기 때문에 리파아제를 생산하는 새로운 미생물을 분리하는 것은 다양한 산업적 이용 가능성이 있는 리파아제를 찾아내는 데 있어 매우 중요하다.
이에 본 발명자들은, 남극 유래 미생물로부터 새로운 리파아제를 분리하고자 예의 노력한 결과, 남극 미생물인 바실러스 푸밀러스 유래 리파아제가 저온과 고 알칼리 상태에서 높은 활성을 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 남극에 서식하는 미생물로부터 분리된 리파아제 및 상기 리파아제를 코딩하는 유전자를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 리파아제의 용도를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 3 또는 5의 아미노산 서열을 가지는 리파아제를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 리파아제를 코딩하는 유전자를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 숙주미생물에 도입되어 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 리파아제의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 리파아제를 함유하는 지질 또는 지방 분해용 조성물 및 상기 리파아제를 이용한 지질 또는 지방 분해방법을 제공한다.
본 발명에 따른 남극 바실러스 푸밀러스 유래 리파아제는 저온상태와 높은 알칼리상태에서도 높은 활성을 가지고 있어, 관련분야에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 리파아제 생산 박테리아의 스크링을 나타낸 것으로, (a)는 리파아제를 생산하는 박테리아의 스크리닝 결과를 나타낸 것이며, (b)는 리파아제 활성을 통한 박테리아(KOPRI No. 23867, 25005, 23047, 22952, 23908, 23745 및 22850)의 선별 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 KOPRI No. 22952, 23047, 25005, 23745, 23867 및 22850 리파아제의 계통발생 분석결과를 나타낸 것이다.
도 3의 (a)는 바실러스 푸밀러스(B. pumilus) 22952 균주의 성장곡선에 따른 세포외 리파아제 활성을 나타낸 것이고(close circles: 미생물 농도, open circles: 세포외 리파아제 활성), (b)는 리파아제 BPL1의 분자량을 나타낸 것이다 (M: 단백질 사이즈 마커, 1: BPL1, 2: SDS-PAGE).
도 4의 (a)와 (b)는 리파아제 BPL1, BPL2 및 BPL3의 최적 온도 및 pH를 나타낸 것이고, (c)와 (d)는 리파아제 BPL1, BPL2 및 BPL3의 온도 및 pH 안정성을 나타낸 것이다 (open squares: BPL1, open circles: BPL2, close triangles: BPL3).
도 5의 (a)는 아실 체인 길이(acyl chain lengths)에 따른 리파아제 BPL1, BPL2 및 BPL3의 기질 특이성을 나타낸 것이고, (b)는 천연 오일 기질(natural oil substrates)에 대한 리파아제 BPL1, BPL2 및 BPL3의 기질 특이성을 나타낸 것이다 (black bar: BPL1, gray bar: BPL2, white bar: BPL3).
도 6은 남극 유래 바실러스 푸밀러스 리파아제 유전자의 클로닝 및 발현 플라스미드의 구조를 나타낸 것이다.
도 7은 바실러스 서브틸리스 시스템에서 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3의 발현을 나타낸 것으로, (a)는 bpl1 함유 재조합 바실러스 세포를 TBN 아가 플레이트(agar plates)에 도말한 것을 나타낸 것이고, (b)는 bpl3 함유 재조합 바실러스 세포를 TBN 아가 플레이트(agar plates)에 도말한 것을 나타낸 것이며, (c)는 배양시간에 따른 재조합 Bacillus cells (bpl1)의 성장(black circle)과 세포 외 리파아제 활성(white circles)을 나타낸 것이고, (d)는 배양시간에 따른 재조합 Bacillus cells (bpl3)의 성장(black circle)과 세포 외 리파아제 활성(white circles)을 나타낸 것이며, (e)는 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3의 분자량을 나타낸 것이다 (lane1: bpl1 함유 재조합 바실러스 세포 배양 상등액, lane1: bpl3 함유 재조합 바실러스 세포 배양 상등액, line M: 단백질 사이즈 마커).
도 8은 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3의 N-터미널 아미노산 시퀀싱(N-terminal amino acid sequencing) 결과를 나타낸 것으로, 도 8a는 N-터미널 서열에 NH2-Ala-Glu-His-Asn-Pro-가 존재함을 나타낸 것이고, 도 8b는 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 9는 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3의 정제 결과를 나타낸 것으로, (a) 및 (b)는 재조합 리파아제 BPL1를 이온 교환 크래마토그래피(ion exchange chromatography) 및 젤 필터레이션 크래마토그래피(gel filtration chromatography)로 정제한 결과를 나타낸 것이고, (c) 및 (d)는 재조합 리파아제 BPL3를 이온 교환 크래마토그래피(ion exchange chromatography) 및 젤 필터레이션 크래마토그래피(gel filtration chromatography)로 정제한 결과를 나타낸 것이며, (e)는 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다 (lane 1 및 5; 단백질 사이즈 마커, lane 2: 암모니움 설페이트(ammonium sulfate)로 침전시킨 BPL1, lane 3: 이온 교환 크래마토그래피(ion exchange chromatography) 후 BPL1, lane 4: 젤 필터레이션 크래마토그래피(gel filtration chromatography) 후 BPL1, lane 6: 암모니움 설페이트(ammonium sulfate)로 침전시킨 BPL3, lane 7: 이온 교환 크래마토그래피(ion exchange chromatography) 후 BPL3, lane 4: 젤 필터레이션 크래마토그래피(gel filtration chromatography) 후 BPL3.
도 10은 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3에 대한 온도와 pH의 영향을 나타낸 것으로, (a)와 (b)는 재조합 리파아제 BPL1(a) 및 재조합 리파아제 BPL3(b)의 온도에 따른 활성을 나타낸 것이고, (c)와 (d)는 재조합 리파아제 BPL1(c) 및 재조합 리파아제 BPL3(d)의 pH에 따른 활성을 나타낸 것이다 (open circles: 최적의 활성, close circles: 안정성).
도 11은 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3의 기질 특이성을 나타낸 것으로, (a)는 다양한 p-나아트로페닐 에스터(p-nitrophenyl esters)에 대한 재조합 리파아제의 가수분해 활성을 나타낸 것이고, (b)는 다양한 트리글리세라이드(triglycerides)에 대한 재조합 리파아제의 가수분해 활성을 나타낸 것을 나타낸 것이다(white bar: BPL1, black bar: BPL3).
도 12는 유기용매에 대한 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3의 활성을 나타낸 것으로, (a)와 (b)는 다양한 유기용매에서 BPL1(a) 및 BPL3(b) 리파아제의 활성을 나타낸 것이고(open circles: 메탄올, close circles: 에탄올, open square: t-부탄올), (c)는 메탄올 농도에 따른 상용화된 리파아제의 활성을 나타낸 것이며(open circles: 리조푸스 오리제, close circles: 무코 자바니쿠스), (d)는 메탄올 농도에서 따른 재조합 리파아제의 활성을 나타낸 것이다(open circles: BPL1, close circles: BPL3).
본 발명에서는, 저온과 높은 알칼리 상태에서도 안정한 남극 유래 바실러스 푸밀러스 신규 리파아제를 분리하고, 상기 신규 리파아제가 세제 및 식품산업에 경제적 적용이 될 수 있는지에 대한 개발 가능성을 확인하고자 하였다.
본 발명에서는 남극의 토양에 서식하는 50개의 미생물을 채취하고 트리카프릴린 아가 플레이트(tricaprylin agar plate) 배지에서 콜로니 주변에 선명한 할로스(halos)가 나타나는 미생물종균을 선별한 후, 상기 24개의 선별된 종균들로부터 최종적으로 단백질 아미노산 서열 비교분석을 총 3개의 리파아제 유전자(KOPRI No.22952, 22850, 23867)를 선택하였다. 그 유전자들은 바실러스 푸밀러스 리파아제 1, 2 및 3 (BPL1, BPL2 및 BPL3)이라고 명명하였고, 서열분석 결과, 각각 서열번호 1, 서열번호 3 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 것으로 확인되었으며, 이들을 인코딩하는 유전자의 염기서열을 각각 서열번호 2, 4 및 6으로 표시된다.
본 발명에 따른 리파아제 유전자 BPL1(KOPRI No. 22952)은 바실러스 푸밀러스 DBRL-191과 98.1%의 높은 상동성을 가진다는 것을 확인하였고, 리파아제 유전자 BPL2(KOPRI No. 22850)는 바실러스 푸밀러스 B26과 93.5%의 상동성을 가지며, 리파아제 유전자 BPL3(KOPRI No. 23867)은 바실러스 푸밀러스 F3와 99.5% 상동성을 가지는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 본 발명은 서열번호 1, 3 또는 5의 아미노산 서열을 가지는 리파아제 및 상기 리파아제를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
본 발명에 따른 3종의 리파아제는 모두 온도 40℃와 PH 9.0에서 최고의 활성을 나타내었고, BPL1 및 BPL3의 분자량을 SDS-PAGE 젤에서 확인한 결과, 약23kDa과 19kDa이었다. BPL1의 경우, 15℃에서 60%, 10℃에서는 40%정도의 활성을 나타내는 것으로 확인되어, 저온에서도 높은 활성을 가진다는 것을 알 수 있었다. 한편, 본 발명에 따른 리파아제의 온도 안정성을 확인한 결과, BPL1과 BPL2의 경우, 30℃에서 70% 이상의 활성이 유지되었고, BPL3의 경우, 20℃ 이상에서는 그 활성이 급격히 감소하였다. BPL1, 2 및 3은 31℃ 이상에서 불안정성을 나타내어 내저온성(psychrotolerant) 효소로 확인되었다. 또한 pH에 따른 안정성을 조사한 결과, 알칼리 조건에서 효소활성이 안정하며, BPL1과 BPL3의 경우, pH 6~11에서 60%이상의 높은 활성이 유지되었고, BPL2의 경우, pH 6~10에서 75% 이상의 활성이 유지되었다.
본 발명에 따른, 리파아제 유전자 BPL1, BPL2 및 BPL3은 기존 효소와 아미노산 서열이 유사하지만, 남극지역에서 분리된 효소로서 10℃에서의 활성이 최대 활성의 70% 또는 80%를 나타내는 저온성 효소이며, 또한, 에스테르치환반응에 사용되는 각종 알코올에 대한 안정성이 매우 높아서 유기합성반응에서 효소촉매로 사용할 수 있어, 이러한 특성이 기존 바실러스 푸밀러스 DBRL-191, 바실러스 푸밀러스 B26, 바실러스 푸밀러스 F3 유래의 리파아제와 크게 차이가 있음을 확인하였다.
한편, 본 발명의 일 실시예에서는 남극 유래 바실러스 푸밀러스 리파아제 BPL1 및 BPL3가 바실러스 서브틸리스 시스템에서 성공적으로 생산되는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3은 모두 저온 적응 효소이며, 알칼리 내성을 가지고 있으며, 높은 농도의 유기용매 존재하에서도, 높은 안정성을 나타내었다.
다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 2, 4 또는 6의 염기서열을 가지는 리파아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터, 상기 리파아제 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 리파아제의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 상기 재조합 미생물은 통상의 방법에 따라 상기 유전자를 미생물의 염색체(chromosome)에 삽입시키거나, 상기 재조합 벡터를 숙주 미생물에 도입시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명에서 "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli XL -1 Blue ( Stratagene ), E. coli DH5 α, E. coli JM101, E. coli K12 , E. coli W3110 , E. coli X1776 , E. coli BL21 등을 포함한다. 그러나 FMB101 , NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera) 등이 또한 사용될 수 있다. 상기 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.
원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.
본 발명에서 리파아제 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 물리적인 방법으로서, microinjection(세포에 DNA를 직접 넣는 것), liposome, directed DNA uptake, receptor~mediated DNA transfer 또는 Ca++을 이용한 DNA 운반 방법 등이 있으며, 최근에는 바이러스(virus)를 이용한 유전자 운반 방법이 많이 사용되고 있다. 일례로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 이용하는 방법 등이 있으며, 특히, 레트로바이러스는 유전자 전달 효율이 높고 gross deletion이나 숙주 DNA와 재정렬(rearrangement : 숙주 DNA 중 자기 DNA와 유사한 부위를 바꾸는 것으로 숙주 DNA 기능의 변화를 초래함)에 의한 결합 없이 넓은 범위의 세포들에서 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당 업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다.
본 발명에서 "발현 조절 서열(expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα프로모터와 사이토메가로바이러스(cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다. 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터,상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어, Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 프로모터는 대장균에서 본 발명의 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.
당 업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능 하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.
상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 본 발명에 따른 단백질의 cDNA를 클로닝하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법) 등이 적용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주미생물은 아로박테리움(Agrobacterium) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 아세토박터(Acetobacter) 속, 아미노박터(Aminobacter) 속, 아그로모나스(Agromonas) 속, 아시드필리움(Acidphilium) 속, 불레로미세스(Bulleromyces) 속, 불레라(Bullera) 속, 브레분디모나스(Brevundimonas) 속, 크립토코쿠스(Cryptococcus) 속, 치오노세라(Chionosphaera) 속, 캔디다(Candida) 속, 세리노스테루스(Cerinosterus) 속, 에체리치아(Escherichia) 속, 엑시소피일라(Exisophiala) 속, 엑소바시디움(Exobasidium) 속, 펠로미세스(Fellomyces) 속, 필로바시디움(Filobasidium) 속, 게오트리춤(Geotrichum) 속, 그레피올라(Graphiola ) 속, 글루코노박터(Gluconobacter) 속, 콕코바엘라(Kockovaella) 속, 크르츠마노미세스(Curtzmanomyces) 속, 랄라리라(Lalaria) 속, 레우코스포이디움(Leucospoidium) 속, 레지오넬라(Legionella) 속, 슈도지마(Psedozyma) 속, 파라코크스(Paracoccus) 속, 페트로믹(Petromyc) 속, 로도토룰라(Rhodotorula) 속, 로도스포리디움(Rhodosporidium) 속, 리도모나스(Rhizomonas) 속, 리도비움(Rhodobium) 속, 리도플렌스(Rhodoplanes) 속, 리도슈도모나스(Rhodopseudomonas) 속, 리도박터(Rhodobacter) 속, 스포로볼로모미세스(Sporobolomyces) 속, 스프리도볼로스(Spridobolus) 속, 사이토엘라(Saitoella) 속, 스키죠사카로미세스(Schizosaccharomyces) 속, 스핑고모나스(Sphingomonas) 속, 스포로트리츔(Sporotrichum) 속, 심포디오미코프시스(Sympodiomycopsis) 속, 스테리그마토스포리디움(Sterigmatosporidium) 속, 타파리나(Tapharina) 속, 트레멜라(Tremella)속, 트리조스포롱(Trichosporon) 속, 틸레티아리아(Tilletiaria) 속, 틸레티아(Tilletia) 속, 톨리포스포리움(Tolyposporium) 속, 틸레티포시스(Tilletiposis) 속, 우스틸라고(Ustilago) 속, 우덴로미세스(Udenlomyce) 속, 챤쇼필로미세스(Xanthophilomyces) 속, 챤쇼박터(Xanthobacter) 속, 페실로미세스(Paecilomyces) 속, 아크레모니움(Acremonium) 속, 하이호모나스(Hyhomonus) 속, 리조비움(Rhizobium) 속 등을 예시할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명의 일 실시예에서는 다양한 아실 체인 길이(acyl chain length)를 가진 p-나아트로페닐 에스터(p-nitrophenyl esters)와 오일 타입에 대한 가수분해 능력을 테스트한 결과, 본 발명에 따른 3종의 리파아제는 p-나아트로페닐 에스터(p-nitrophenyl esters)(C8) 기질에서 높은 가수분해 능력을 보였고, BPL2와 BPL3는 BPL1에 비해 탄소수 10~18의 긴사슬 기질에 보다 넓은 기질특이성을 가지는 것으로 확인되었다.
아울러, 리파아제 BPL1은 tributyrin에 대해 높은 활성을 가지며, 리파아제 BPL2와 BPL3는 tricaprylin에 대해 높은 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 리파아제를 함유하는 지질 또는 지방 분해용 조성물 및 상기 리파아제를 이용한 지질 또는 지방 분해방법에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업게에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 남극 유래의 미생물 종에서 리파아제 생산능력이 있는 종균의 확인 및 선별
남극에서 채취한 50개의 미생물 종균들 중에서 리파아제 생산 능력이 있는 종균들만 추출하기 위해 1% 트리카필린(TCN) 아가 플레이트(agar plate)를 이용했다. 50개의 종균 중에 콜로니(colony) 주위에 후광(Halos)이 보이는 24개의 종균 선별하여(도 1a), LB 배지 (1% tryptone, 0.5% yeast extract 및 1% NaCl)에 접종하여 20°C에 48시간 배양한 다음, 그 배양액을 pNPC(p-nitrophenyl carprylate)로 리파아제 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 1b에 나타난 바와 같이, 0.1 U/㎖ 이상의 리파아제 활성을 나타내는 7개의 종균을 선별하였다.
실시예 2: B. pumilus 리파아제 유전자의 클로닝
실시예 1에서 선별된 7개의 종균의 DNA를 분리하고, 하기 서열번호 7 및 8의 프라이머(primer)를 이용하여 하기 조건하에서 리파아제 유전자를 PCR을 통해 증폭하였다.
서열번호 7: BPUM1-F (5'-GAGTCGTATAAGATGAATAAGGGGGAATG-3')
서열번호 8: BPUM1-R (5'-TTAATTCGTATTTTGTCCTCCGCCGTTC-3')
PCR 반응물 (총 부피 50μl): 0.2μM의 프라이머, 1.5mM의 MgCl2, 0.2mM의 dNTPs, 0.1 %의 BSA (Boehringer Mannheim), 10ng의 주형 DNA, 및 2.5U의 Taq DNA polymerase (Promega)
PCR반응 조건: 95℃ 10분, [95℃, 1분 54℃, 1분 72℃, 2분]: 35회, 72℃, 10분
증폭된 유전자를 pGEM T벡터(Promega, USA)에 라이게이션(ligation)하여 E.coli XL1-Blue에 전기천공법으로 형질전환시켰다. 형질전환된 E. coli는 100㎍/㎖의 암피실린 항생제, 1mM의 IPTG, 50㎍/㎖의 X-gal 함유 LB 플레이트에서 선별하였으며, 형질전환된 플라스미드는 T7 및 SP6 프로모터 프라이머로 정제하고, 시퀀싱 하였다.
실시예 3: B. pumilus 리파아제 유전자의 시퀀싱 분석
실시예 2에서 시퀀싱한 결과를 이용하여, 수득한 DNA 염기서열의 동일성(identities)을 확인하기 위하여, NCBI의 BLAST 프로그램을 사용하였다. 염기서열은 DANSTAR 프로그램의 EditSeq application을 사용하여 아미노산 서열로 번역하였으며, 아미노산 서열은 DANSTAR 프로그램의 MegAlign의 ClustalW을 이용하여 다른 바실러스 푸밀러스 리파아제 서열과 정렬하였다. 단백질 다양성(protein divergence)은 사이토크롬 에스(cytochrome S)을 사용하여 아미노산 치환에 기초하여 계산하였다.
그 결과, KOPRI No. 22952, 23047, 23745 및 25005는 동일한 염기서열을 가지고 있으며, 표 1에 나타난 바와 같이, 선별된 종균들의 아미노산 서열 비교를 통해서 (1) 4개의 리파아제 유전자(KOPRI No. 22952(BPL1), 23047, 23745 및 25005)는 바실러스 푸밀러스 DBRL-191과 98.1%의 높은 상동성을 가진다는 것을 확인하였고, (2) 리파아제 KOPRI No. 22850(BPL2)은 바실러스 푸밀러스 B26과 93.5%의 상동성을 가지며, (3) 리파아제 KOPRI No. 23867(BPL3)는 바실러스 푸밀러스 F3와 99.5% 상동성을 가지는 것을 확인하였다.
6개의 남극 유래 바실러스 푸밀러스의 아미노산 서열의 상동성
Divergence 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1. 22952 B 100.0 100.0 100.0 98.1 93.5 93.0 92.1 92.6 1
2. 23047 0.0 B 100.0 100.0 98.1 93.5 93.0 92.1 92.6 2
3. 25005 0.0 0.0 B 100.0 98.1 93.5 93.0 92.1 92.6 3
4. 23745 0.0 0.0 0.0 B 98.1 93.5 93.0 92.1 92.6 4
5. Bacillus Pumilus DBRL191 1.9 1.9 1.9 1.9 B 94.0 93.5 92.6 93.0 5
6.23867 6.8 6.8 6.8 6.8 6.3 B 93.5 94.9 94.0 6
7. Bacillus Pumilus F3 7.3 7.3 7.3 7.3 6.8 0.5 B 94.4 93.5 7
8. Bacillus Pumilus B26 8.4 8.4 8.4 8.4 7.9 5.3 5.8 B 93.5 8
9. 22850 7.9 7.9 7.9 7.9 7.3 6.3 6.8 6.8 B 9
1 2456789 356789 46789 5789 689 79 8 9
또한, 리파아제의 계통발생 분석결과를 통해 리파아제 KOPRI No. 22952(BPL 1)는 B. pumilus DBRL 191 리파아제 연관성이 있으며, 리파아제 리파아제 KOPRI No. 22850(BPL2)는 대부분의 Bacillus 리파아제와 연관성이 있으며, 리파아제 KOPRI No. 23867(BPL3)는 B. pumilus F3 리파아제와 비교적 연관성이 있음을 확인하였다 (도 2).
여기서 남극 바실러스 푸밀러스 리파아제 22952, 22850 및 23867을 각각 BPL1, BPL2 및 BPL3로 명명하였다.
실시예 4: 리파아제의 발현 및 정제
실시예 3에서 선별된 BPL1, 2 및 3 중에서 BPL1을 발현시키기 위하여, 바실러스 푸밀러스 22952 균주를 LB배지, 20℃에서 54시간 배양하였다.
그 결과, 도 3(a)에서 나타난 바와 같이, BPL1 라파아제는 배양한지 36시간이 되어 배양액에 리파아제 분비가 시작되고, 성장곡선은 정체 상태로 접어들었고, 배양한지 54시간까지는 눈에 띄게 리파아제 분비가 증가됨을 확인할 수 있었다. 바실러스 푸밀러스 22850 및 23867 균주도 동일한 조건에서 배양하였다.
상기 22952, 22850 및 23867 균주 배양액에 암모니움 설페이트(ammonium sulfate)를 20%~70%까지 불포화하여 단백질 응고물을 침전(10,000 g, 10 min) 시킨 다음, 단백질 침전물을 수득하고(10,000g, 10 min), 멸균된 물로 녹인다. 그리고 잔류해 있는 암모니움 설페이트를 제거하기 위해 Spectra/Por4 membrane (Spectrum labs, USA)를 이용하여 투석(dialysis)하여 리파아제 BPL1, BPL2 및 BPL3을 각각 정제하였다.
상기 정제된 리파아제 BPL1의 분자량을 SDS-PAGE와 Zymogram을 이용하여 측정한 결과, 도 3(b)에 나타난 바와 같이, BPL1(B. pumilus 22952)의 분자량은 약 23kDa이었다.
실시예 5: 온도 및 pH에 따른 리파아제의 활성 및 안정성
실시예 4에서 수득된 BPL1, BPL2 및 BPL3 리파아제들의 생화학적 특성을 확인하기 위하여, 10~70℃의 온도 범위와 pH 6.0~10.0의 범위에서 pNPC(p-nitrophenyl carprylate) 분석을 이용하여 최적의 온도와 pH를 측정하였다.
그 결과, 도 4(a) 및 (b)에 나타난 바와 같이, 상기 3종의 리파아제는 40℃와 pH 9.0에서 가장 높은 활성을 가지는 것으로 확인하였다. 리파아제 BPL1의 경우, 15℃에서 60%, 10℃에서는 40%정도의 활성도를 가졌다. 이 결과는 리파아제 BPL1이 저온적응 효소(cold-adapted enzyme)인 것을 의미한다. 즉, 저온에 특화된 효소라고 볼 수 있다.
리파아제 BPL1, BPL2 및 BPL3의 온도 및 pH 안정성을 확인하고자, 10~45℃ 및 pH 4~10의 범위에서 30분간의 인큐베이션(incubation)한 다음, 활성을 측정하였다. 그 결과, 도 4(c)에 나타난 바와 같이, 리파아제 BPL1 및 BPL2는 30℃에서 각각 그 활성이 80 및 70% 이상 유지되었다. 리파아제 BPL3은 20℃까지 안정하지만, 25℃ 이상이 되면 활성이 급격히 감소함을 확인하였다. 또한, 도 4(d)에 나타난 바와 같이, 리파아제 BPL1과 BPL3의 경우, pH 6~11에서 60% 이상의 높은 활성을 유지하였고, 반면, BPL2의 경우, pH 6~10에서 75% 이상의 높은 활성을 나타내었다.
이러한 본 발명에 따른 남극 유래 바실러스 푸밀러스의 리파아제들은 높은 알칼리 pH 범위에서 안정하기 때문에 세제의 첨가물로 유용할 것으로 기대된다.
실시예 6: 기질 특이성
실시예 4에서 수득된 리파아제의 기질 특이성 확인하기 위하여, 다양한 아실 체인 길이(acyl chain length)를 가진 p-나아트로페닐 에스터(p-nitrophenyl esters)와 오일 타입에 대한 가수분해 능력을 테스트하였다. 합성기질(pNP-acetate, pNP-butyrate, pNP-caprylate, pNP-caprate, pNP-laurate)에 대한 가수분해 속도는 분광 분석법으로 측정하였으며, 자연생성기질(tributyrin, tricaprylin, olive oil, soybean oil, sunflower oil, fish oil and castor oil)에 대한 리파아제의 가수분해 속도는 pH STAT 방식을 이용해서 측정하였다. 리파아제 용액 20㎕를 50mM Tris-Hcl(pH8.0), 0.1% 아라비아 고무, 0.2% 데옥시콜레이트(deoxycholate)가 함유된 반응완충용액 880㎕에 첨가한 다음, 이 혼합 용액을 30℃에서 3분 동안 정치(incubation) 시킨 후, 이소프로판올(isopropanol)에 용해되어 있는 8mM의 기질 100㎕을 추가하여, 30℃에 3분 동안 반응시킨 다음, 3M HCL 0.5㎖을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 2분 동안 12000g에서 원심분리기를 한 다음, 상층액 333㎕를 수득하여 2M NaOH 1㎖을 섞어주고 420nm 파장에서 OD값을 측정하였다.
그 결과, 도 5(a)에 나타난 바와 같이, 3가지 리파아제는 p-나아트로페닐 에스터(p-nitrophenyl esters)(C8) 기질에서 높은 가수분해 능력을 나타냈고, BPL2와 BPL3은 BPL1에 비해 탄소수 10~18의 긴사슬 기질에 보다 넓은 기질특이성을 가지는 것으로 확인되었다.
또한, 리파아제 BPL1은 tributyrin에 대해 높은 활성을 가지며, 리파아제 BPL2 및 BPL3은 tricaprylin에 대해 높은 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다 (도 5b).
대부분의 Bacillus sp. 리파아제가 쇼트 체인 지방산 에스터(short chain fatty acid esters)에 대한 기질특이성을 가진다고 알려져 있는 점을 고려할 때, 본 발명에 따른 남극 유래 바실러스 푸밀러스 리파아제는 쇼트 체인 지방산에스터 뿐만 아니라, 롱 체인 지방산(C8~C12)과 천연 트리글리세라이드(natural triglycerides)에 강한 가수분해 활성을 나타내므로, 넓은 활용 가능성이 기대된다.
실시예 7: B. pumilus 리파아제 유전자( pbl1 및 pbl3 ) 클로닝
실시예 1에서 선별된 PBL1과 PBL3 종균의 DNA를 분리하고, 하기 서열번호 9, 10 및 11의 프라이머(primer)를 이용하여 하기 조건하에서 리파아제 유전자를 PCR로 증폭하였다.
PCR 프라이머는 5’에 NdeI 제한 부위가 그리고 3’에 BamHI 제한 부위가 위치하도록 디자인하였다.
BPL1 정방향 프라이머 (서열번호 9: 5’-GAACATATGAAAGTGATTCTTTTTAAG-3')
BPL3 정방향 프라이머 (서열번호 10: 5’-GAACATATGAAAGTGATTCGTTTTAAG-3')
일반 역방향 프라이머 (서열번호 11: 5’-GCAGGATCCTTAATTCGTATTTTGTCCTCC-3’)
PCR 반응물 (총 부피 50μl): 0.2μM의 프라이머, 1.5mM의 MgCl2, 0.2mM의 dNTPs, 0.1 %의 BSA (Boehringer Mannheim), 10ng의 주형 DNA, 및 2.5U의 Taq DNA polymerase (Promega)
PCR반응 조건: 94℃ 5분,[95℃, 30초 47℃, 30초 72℃, 1분], 72℃, 7분
증폭된 유전자를 pGEM T벡터(Promega, USA)에 라이게이션(ligation)하여 E. coli XL1-Blue에 전기천공법으로 형질전환시켰다. 형질전환된 재조합 대장균은 100㎍/㎖의 암피실린 항생제, 1mM의 IPTG, 50㎍/㎖의 X-gal 함유 LB 플레이트에서 선별하였으며, 상기 재조합 대장균로부터 재조합 플라스미드 pTBPL1 및 pTBPL3을 각각 분리 정제하였다. pMA5 벡터(E. coli - Bacillus shuttle vector, zyprian, E. et al ., DNA , 219-225, 1986)를 리파아제 유전자 클로닝에 사용하였다. pMA5 벡터를 NdeI 및 BamHI 제한효소로 절단한 다음, 동일한 제한효소로 절단한 pTBPL1 및 pTBPL3를 각각 라이게이션하고, 라이게이션된 믹스쳐(Ligation mixtures)를 E. coli XL1-Blue에 전기천공법으로 형질전환시켜, 재조합 플라스미드 pMBPL1와 pMBPL3을 수득하였다 (도 6).
실시예 8: 재조합 바실러스 서브스틸리스에서 재조합 리파아제의 발현 및 정제
실시예 7에서 수득된 pMBPL1와 pMBPL3을 B. substilis DB104(Kawamura et al ., J. Bacteriol ., 160(1):442,1984)에 각각 도입하여 형질전환시켰다. 재조합 플라스미드(각 1μg)을 B. subtilis 세포와 혼합한 다음, 0.7 kV로 싱글 펄스(single pulse)로 전기천공법에 의해 형질전환시킨 다음, 1ml LB 배지에 37℃에 1시간 배양하였다. 형질전환된 B. substilis 세포를 카나마이신(10μg/ml kanamycin)이 첨가된 LB 아가-플레이트(agar plate)에 도말하여 37℃에서 배양하였다.
생성된 콜로니(Colonies)를 1% 트리부트린(1% tributyri)과 10 μ/ml 카나마이신(10 μ/ml kanamycin)이 첨가된 LB 아가-플레이트(agar plate)에 도말하여 pMBPL1와 pMBPL3를 함유하는 재조합 바실러스 서브틸리스를 수득하였다 (도 7 a, b).
pMBPL1및 pMBPL3을 각각 함유하는 재조합 바실러스 서브틸리스를 LB 배지, 30℃에서 24시간 배양하였다. 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3 생성 재조합 미생물의 성장곡선에 따른 효소분비량을 확인한 결과, 도 7의 (c) 및 (d)에 나타난 바와 같이, 각 재조합 Bacillus 균주는 배양한지 8시간이 되어 배양액에 리파아제 분비가 시작되었고, 리파아제의 활성은 세포성장에 따라 증가하였으며, 배양한 지 24시간에 각각 3 U/ml 및 5 U/ml까지 증가되었다.
상기 배양 상층액에 암모니움 설페이트(ammonium sulfate)를 첨가하여 침전시킨 후, 펠렛(pellet)을 멸균된 물에 녹여 PD G10 디솔팅 컬럼 크래마토그래피(desalting column chromatography)를 이용하여, 잔류 암모니움 설페이트를 제거한 후, 브레드포드 단백질 분석법으로 단백질의 농도를 확인하였다. 암모니움 설페이트(ammonium sulfate) 침전 펠렛(30~70% 프렉션)을 실시예 4와 같은 방법으로 정제하여 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3을 수득하였다. 수득된 재조합 리파아제의 순도는 12% gel SDS-PAGE를 이용하여 확인하였다.
상기 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3의 분자량을 실시예 4와 같은 방법으로 측정한 결과, 각각 약 23kDa 및 약 19kDa이었다 (도 7e).
상기 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3를 N-터미널 아미노산 시퀀싱(N-terminal amino acid sequencing)하였다. 그 결과, 도 8a 및 도 8b에 나타난 바와 같이, N-터미널 서열에 NH2-Ala-Glu-His-Asn-Pro-가 존재하고, 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3가 181개 아미노산 잔기를 가지고 있으며, 그 분자량을 계산하면 각각 19,254 Da 및 19,208 Da임을 확인하였다. 또한, 계산된 분자량과 SDS-PAGE로 확인한 분자량은 재조합 리파아제의 BPL3은 유사하였으며, 재조합 리파아제의 BPL1은 약간의 차이가 있었다.
한편, 암모니움 설페이트(ammonium sulfate)로 침전시킨 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3를 포타슘 포스페이트 버퍼(potassium phosphate buffer, 20 mM, pH 7.0)에 투석한 다음, 양이온 교환 칼럼(cation exchange column, HiTrap SP 217 FF)에 로딩하여 정제하였다. 그 결과, 도 9의 (a) 및 (b)에 나타난 바와 같이, 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3의 등전점(isoelectric points, pI values)은 각각 9.35 및 9.62이었고, pH 7.0에서 각각 4.7 및 6.7의 양전하를 가졌으며, KCl 직선증가경사도(KCl linear increasing gradient)에서 용출시켰다. 양이온 컬럼으로부터 얻은 활성 프렉션(active fraction)은 젤 투과 컬럼(gel permeation column, Superose 12)에 로딩하여 재조합 리파아제의 특징을 확인하는데 사용하였다 (도 9 c, d).
재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3은 이온 교환 크래마토그래피(ion exchange chromatography) 및 젤 필터레이션 크래마토그래피(gel filtration chromatography)로 정제하였다(도 9 e).
pNPC(p-nitrophenyl caprylate)를 기질로 사용하였을 경우, 재조합 리파아제 BPL1의 정제 수득율은 18.2%이었고, 최종 비활성은 328U/mg이었으며, 재조합 리파아제 BPL3의 정제 수득율은 23.3%이었고, 최종 비활성은 310U/mg이었다 (표 2 및 3).
재조합 리파아제 BPL1의 정제
Total protein
(mg)		 Total acticity
(U)		 Specific activity (U/mg) Yield
(%)		 Purification
(Fold)
(NH4)2SO4 7.14 605 84.7 100 1.00
SPFF 1.43 340 238 56.2 2.81
Superose 0.335 110 328 18.2 3.87
재조합 리파아제 BPL3의 정제
Total protein
(mg)		 Total acticity
(U)		 Specific activity (U/mg) Yield
(%)		 Purification
(Fold)
(NH4)2SO4 12.4 1030 83.1 100 1.00
SPFF 2.57 797 310 77.3 3.73
Superose 0.775 240 310 23.3 3.73
실시예 9: 재조합 리파아제의 온도 및 pH 에 따른 활성 및 안정성
실시예 8에서 수득된 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3의 생화학적 특성을 확인하기 위하여, 다양한 온도(10~40℃)에서 30분간의 전-인큐베이션(pre-incubation)한 다음, 10~60℃의 온도 범위와 pH 5.0~12.0의 범위에서 pNPC(p-nitrophenyl carprylate) 분석을 이용하여 최적 온도와 pH를 측정하였다.
그 결과, 도 10(a) 및 (b)에 나타난 바와 같이, 상기 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3는 35℃에서 가장 높은 활성을 나타냈다. 또한, 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3의 온도 안정성을 확인한 결과, 재조합 리파아제 BPL1의 경우, 25℃에서 안정하였고, 30℃ 이상에서는 점차 감소했으며, 재조합 리파아제 BPL3의 경우, 30℃까지 안정하였고, 30℃ 이상에서는 점차 감소하였다.
아울러, 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3의 pH 안정성을 측정한 결과, 도 10(c) 및 (d)에 나타난 바와 같이, 재조합 리파아제 BPL1은 pH 8.5에서, 재조합 리파아제 BPL3은 pH 8.0에서 최고의 활성을 나타냈다. 또한, 재조합 리파아제 BPL1은 pH 6.5~11에서 70%이상의 활성을 나타냈으며, 재조합 리파아제 BPL3은 pH 6.5~11.5에서 60%이상의 활성을 나타내었다.
그러므로 본 발명에 따른 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3은 넓은 pH 범위에서 안정적이고 특히, 높은 알칼리에서 안정하다는 것을 확인하였다.
실시예 10: 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3 의 기질 특이성
실시예 8에서 수득된 재조합 리파아제의 기질 특이성 확인하기 위하여, 다양한 아실 체인 길이(acyl chain length)를 가진 p-나아트로페닐 에스터(p-nitrophenyl esters)와 오일 타입에 대한 가수분해 능력을 테스트 하였다. 합성기질(pNP-acetate, pNP-butyrate, pNP-caprylate, pNP-caprate, pNP-laurate)에 대한 가수분해 속도는 분광 분석법으로 측정하였으며, 자연생성기질(tributyrin, tricaprylin, olive oil, soybean oil, sunflower oil, fish oil and castor oil)에 대한 리파아제의 가수분해 속도는 pH STAT 방식을 이용해서 측정하다. 리파아제 용액 20㎕를 50mM Tris-Hcl(pH8.0), 0.1% 아라비아 고무, 0.2% 데옥시콜레이트(deoxycholate)가 포함된 반응완충용액 880㎕에 첨가한 다음, 이 혼합 용액을 30℃에서 3분 동안 배양시킨 후, 이소프로판올(isopropanol)에 용해되어 있는 8mM의 기질 100㎕을 추가하여, 30℃에서 3분 동안 배양시켜 기질 반응을 개시하였다. 3M HCL 0.5㎖을 첨가하여 그 반응을 종결시켰다. 반응액을 12000g에서 2분 동안 원심분리기를 한 다음, 상층액 333㎕를 수득하여 2M NaOH 1㎖을 섞어주고 420nm에서 OD값을 측정하였다.
그 결과, 도 11(a)에 나타난 바와 같이, 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3은 p-나아트로페닐 에스터(p-nitrophenyl esters)(C8) 기질에서 높은 가수분해 능력을 나타냈고, 탄소수 6~10의 긴사슬 기질에 보다 넓은 기질특이성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 두 재조합 리파아제는 tricaprylin(TCN)에 대해 높은 활성을 나타냈으며, 다양한 종류의 오일에 대해서도 기질특이성을 가지는 것을 확인할 수 있었다 (도 11b).
실시예 11: 유기용매에 대한 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3 의 활성
실시예 8에서 수득된 재조합 리파아제를 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol) 및 t-부탄올(t-butanol)와 같은 유기 알콜에 다양한 농도(0%~63%)로 30분간 인큐베이션하여 그 활성을 분광 분석법으로 측정하였다. 아울러 메탄올 농노에 따른 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3의 안정성을 상업화된 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae)와 무코 자바니쿠스(Mucor javanicus) 유래 리파아제와 다양한 메탄올 농도(0~90%)에서 비교하였다.
그 결과, 도 12(a) 및 도 11(b)에 나타난 바와 같이, 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3은 고농도의 유기용매에서 높은 안정성을 나타냈다.
아울러, 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3의 메탄올 용매에 대한 안정성을 상업화된 리파아제와 비교한 결과, 도 12(c) 및 (d)에 나타난 바와 같이, 상업화된 리조푸스 오리제(Rhizopus oryzae)와 무코 자바니쿠스(Mucor javanicus) 유래 리파아제에 비해 재조합 리파아제 BPL1 및 BPL3은 고농도의 메탄올 용매에 대해서 안정성이 탁월하다는 50%의 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Polar Research Institute <120> Lipase of Bacillus pumilus from the Antarctic <130> P12-B296 <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 215 <212> PRT <213> BPL1-P <400> 1 Met Lys Val Ile Leu Phe Lys Lys Arg Ser Leu Gln Ile Leu Val Ala 1 5 10 15 Leu Ala Leu Val Ile Gly Ser Met Ala Phe Ile Gln Pro Lys Glu Val 20 25 30 Lys Ala Ala Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Ile Gly Gly 35 40 45 Ala Ser Tyr Asn Phe Ala Ser Ile Lys Ser Tyr Leu Val Thr Gln Gly 50 55 60 Trp Asp Arg Asn Gln Leu Tyr Ala Ile Asp Phe Ile Asp Lys Thr Gly 65 70 75 80 Asn Asn Arg Asn Asn Gly Pro Arg Leu Ser Arg Phe Val Gln Asp Val 85 90 95 Leu Asp Lys Thr Gly Ala Lys Lys Val Asp Ile Val Gly His Ser Met 100 105 110 Gly Gly Ala Asn Thr Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asp 115 120 125 Lys Ile Glu Asn Val Val Thr Ile Gly Gly Ala Asn Gly Leu Val Ser 130 135 140 Ser Arg Ala Leu Pro Gly Thr Asp Pro Asn Gln Lys Ile Leu Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Val Tyr Ser Ser Ala Asp Leu Ile Val Val Asn Ser Leu Ser Arg 165 170 175 Leu Ile Gly Ala Arg Asn Val Leu Ile His Gly Val Gly His Ile Gly 180 185 190 Leu Leu Thr Ser Ser Gln Val Lys Gly Tyr Ile Lys Glu Gly Leu Asn 195 200 205 Gly Gly Gly Gln Asn Thr Asn 210 215 <210> 2 <211> 648 <212> DNA <213> BPL1-D <400> 2 atgaaagtga ttctttttaa gaaaaggagt ttgcaaattc tcgttgcgct tgcattggtg 60 attggttcaa tggcttttat ccagccgaaa gaggtgaagg cggctgagca taatccggtt 120 gtgatggtgc atggcattgg cggtgcctct tataactttg cttcaattaa aagttacttg 180 gtcacacaag gctgggatcg aaaccaatta tatgctatcg atttcataga caaaacaggt 240 aataaccgca acaatggtcc acgtctatcc agatttgtcc aagatgtgtt agacaaaacg 300 ggtgccaaaa aagtagatat tgtaggtcat agtatgggcg gggcgaacac gttatactat 360 attaagaatc ttgatggcgg agataaaatt gaaaacgttg tcacgattgg tggagcaaac 420 ggactcgttt caagcagagc attaccaggc acagatccaa atcaaaaaat tctttacaca 480 tccgtctaca gctcagccga tctcattgtc gtcaacagcc tctctcgttt aattggtgca 540 agaaacgtcc tgatccatgg tgttggccat atcggtctat taacctcaag ccaagtgaaa 600 ggctatatta aagaagggct gaacggcgga ggacaaaata cgaattaa 648 <210> 3 <211> 215 <212> PRT <213> BPL2-P <400> 3 Met Lys Val Ile Leu Phe Lys Lys Arg Ser Leu Gln Ile Leu Val Ala 1 5 10 15 Phe Ala Leu Val Val Gly Ser Met Ala Phe Ile Gln Pro Lys Glu Val 20 25 30 Lys Ala Ala Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Met Gly Gly 35 40 45 Ala Ser Tyr Asn Phe Ala Ala Ile Lys Arg Tyr Leu Val Ser Gln Gly 50 55 60 Trp Asp Arg Asn Gln Leu Tyr Ala Ile Asp Phe Ile Asp Lys Thr Gly 65 70 75 80 Asn Asn Leu Asn Asn Gly Pro Arg Leu Ser Arg Tyr Val Lys Asp Val 85 90 95 Leu Ala Lys Thr Gly Ala Lys Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser Met 100 105 110 Gly Gly Ala Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asp 115 120 125 Lys Ile Glu Asn Val Val Thr Leu Gly Gly Ala Asn Gly Leu Val Ser 130 135 140 Leu Arg Ala Leu Pro Gly Thr Asp Pro Asn Gln Lys Ile Leu Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Val Tyr Ser Ser Ala Asp Leu Ile Val Val Asn Ser Leu Ser Arg 165 170 175 Leu Ile Gly Ala Arg Asn Val Leu Ile His Gly Val Gly His Ile Gly 180 185 190 Leu Leu Ala Ser Ser Gln Val Asn Gly Tyr Ile Lys Glu Gly Leu Asn 195 200 205 Gly Gly Gly Gln Asn Thr Asn 210 215 <210> 4 <211> 648 <212> DNA <213> BPL2-D <400> 4 atgaaagtga ttctttttaa gaaaaggagt ttgcaaattc tcgttgcgtt tgcattagtg 60 gtcggatcaa tggcttttat ccagcctaaa gaggtcaagg cggctgagca taatccggtc 120 gtgatggtac atggaatggg cggtgcctct tataactttg cggcgatcaa aagatacttg 180 gtgtcgcaag gctgggatcg aaaccaatta tatgcaattg atttcataga caaaacaggc 240 aataacctca ataatggacc gcgtctatct agatatgtca aagatgtgct agctaaaacg 300 ggtgccaaaa aagtagatat tgtggcgcat agtatgggcg gagccaacac gttatacttt 360 attaagaacc tagacggcgg agataaaatt gaaaatgtcg tcacactagg tggagcgaac 420 ggactcgttt cactcagagc attaccaggc accgatccaa atcaaaaaat tctttacaca 480 tctgtctata gctcagccga cctcatcgtc gtcaacagtc tctcccgctt aataggcgca 540 aggaacgtcc ttatccacgg cgtcggacat atcggtctat tagcctcaag ccaagtcaat 600 ggctatatta aagaagggct gaacggcgga ggacaaaata cgaattaa 648 <210> 5 <211> 215 <212> PRT <213> BPL3-P <400> 5 Met Lys Val Ile Arg Phe Lys Lys Arg Ser Leu Gln Ile Leu Val Val 1 5 10 15 Leu Ala Leu Val Met Gly Ser Met Ala Phe Ile Gln Pro Lys Glu Ile 20 25 30 Arg Ala Ala Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Met Gly Gly 35 40 45 Ala Ser Tyr Asn Phe Ala Ser Ile Lys Ser Tyr Leu Val Ser Gln Gly 50 55 60 Trp Asp Arg Asn Gln Leu Phe Ala Ile Asp Phe Ile Asp Lys Thr Gly 65 70 75 80 Asn Asn Arg Asn Asn Gly Pro Arg Leu Ser Arg Phe Val Lys Asp Val 85 90 95 Leu Ala Lys Thr Gly Ala Lys Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser Met 100 105 110 Gly Gly Ala Asn Thr Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asp 115 120 125 Lys Ile Glu Asn Val Val Thr Leu Gly Gly Ala Asn Gly Leu Val Ser 130 135 140 Leu Arg Ala Leu Pro Gly Thr Asp Pro Asn Gln Lys Ile Leu Tyr Thr 145 150 155 160 Ser Val Tyr Ser Ser Ala Asp Leu Ile Val Val Asn Ser Leu Ser Arg 165 170 175 Leu Ile Gly Ala Arg Asn Val Leu Ile His Gly Val Gly His Ile Gly 180 185 190 Leu Leu Ala Ser Ser Gln Val Lys Gly Tyr Ile Lys Glu Gly Leu Asn 195 200 205 Gly Gly Gly Gln Asn Thr Asn 210 215 <210> 6 <211> 648 <212> DNA <213> BPL3-D <400> 6 atgaaagtga ttcgttttaa gaaaaggagt ttgcaaattc ttgttgtgct tgcattggtg 60 atgggttcaa tggccttcat ccagccaaaa gagatcagag cggctgagca taatccggtt 120 gtgatggtac atggcatggg cggtgcgtct tataactttg cttcgattaa aagttacttg 180 gtatcacaag gatgggatcg aaaccaatta tttgctatcg atttcataga caaaacaggt 240 aataaccgca acaatggtcc gcgtctatcc agattcgtca aagatgtgct agccaaaaca 300 ggtgccaaaa aagttgatat tgtggctcat agtatgggcg gagcgaacac gttatactat 360 attaagaatc tagacggcgg cgataaaata gaaaacgtcg ttacacttgg tggagcgaac 420 ggactcgttt cactcagagc attaccaggc accgatccaa atcaaaaaat cctttacacc 480 tctgtctata gctcagccga tcttatcgtc gtcaacagcc tctcgcgttt aattggcgca 540 agaaacgtcc tcattcacgg cgttggtcac atcggtctat tagcttcaag ccaagtcaaa 600 ggctatatca aagaaggact gaacggcgga ggacaaaata cgaattaa 648 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPUM1-F <400> 7 gagtcgtata agatgaataa gggggaatg 29 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPUM1-R <400> 8 ttaattcgta ttttgtcctc cgccgttc 28 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPL1 -F <400> 9 gaacatatga aagtgattct ttttaag 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPL3 -F <400> 10 gaacatatga aagtgattcg ttttaag 27 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BPL1/3 -R <400> 11 gcaggatcct taattcgtat tttgtcctcc 30

Claims (13)

  1. 서열번호 1, 3 또는 5의 아미노산 서열로 표시되는 리파아제.
  2. 제1항에 있어서, 바실러스 푸밀러스 유래인 것을 특징으로 하는 리파아제.
  3. 제1항에 있어서, 온도 40℃와 pH 9.0에서 최고의 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 리파아제.
  4. 제1항에 있어서, 30℃ 또는 pH 6~11에서 40% 이상의 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 리파아제.
  5. 제1항에 있어서, C8~C12인 기질에 대해 특이성을 가지는 것을 특징으로 하는 리파아제.
  6. 제1항의 아미노산 서열을 코딩하는 리파아제 유전자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2, 4 또는 6의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
  8. 제6항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
  9. 제6항의 유전자 또는 제8항의 재조합 벡터가 숙주 미생물에 도입되어 있는 재조합 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 숙주 미생물은 대장균 또는 바실러스 속 미생물인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
  11. 제9항의 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 서열번호 1, 3 또는 5의 아미노산 서열로 표시되는 리파아제의 제조방법.
  12. 제1항의 리파아제를 함유하는 지질 또는 지방 분해용 조성물.
  13. 제1항의 리파아제를 이용하는 것을 특징으로 하는 지질 또는 지방의 분해방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR100236540B1 (ko) 1990-04-14 2000-01-15 레클로우크스 라우에르 알카리성 바실러스-리파제, 이를 코-딩하는 dna 서열 및 리파제를 생산하는 바실러스 균주

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