KR20010044879A

KR20010044879A - 슈도모나스 이어루지노사 유래의 신규 에스터라제, 그유전자 및 이를 이용한 광학활성 카르복실산의 제조방법

Info

Publication number: KR20010044879A
Application number: KR1019990047927A
Authority: KR
Inventors: 김철호; 이상기; 송기방; 이제혁; 보야파티고쿨
Original assignee: 복성해; 한국생명공학연구원
Priority date: 1999-11-01
Filing date: 1999-11-01
Publication date: 2001-06-05
Also published as: WO2001032847A1; WO2001032847A9; KR100330359B1

Abstract

본 발명은 토양으로부터 분리한 신규한 슈도모나스 이어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)와 이로부터 유래한 신규 에스터라제 및 이를 이용하여 광학활성 카르복실산을 제조하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 균주로부터 분리되며 카르복실산 에스터 라세미체로부터 화학식 1로 표시되는 광학활성 카르복실산을 제조할 수 있는 신규 에스터라제 및 그 유전자, 상기 에스터라제 유전자를 클로닝하여 얻어진 재조합 발현벡터 및 형질전환체와, 이를 이용한 광학활성 카르복실산의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 에스터라제를 사용하면 생리활성 의약품, 특히 고혈압 치료제인 캡토프릴 및 아날라프릴의 생산에 유용한 광학활성 카르복실산을 고수율의 간단한 방법으로 얻을 수 있다.

(상기 식에서 R₁, R₂및 n은 명세서 내에서 정의된 바와 같다.)

Description

슈도모나스 이어루지노사 유래의 신규 에스터라제, 그 유전자 및 이를 이용한 광학활성 카르복실산의 제조방법{Novel esterase derived from Pseudomonas aeruginosa, its gene and process for production of optically active carboxylic acids using them}

본 발명은 카르복실산 에스터 라세미체를 비대칭적으로 가수분해하여 하기 화학식 1의 광학활성 카르복실산 및 그의 거울상 이성질체 에스터를 선택적으로 생산하는 미생물인 슈도모나스 이어루지노사와 이로부터 유래한 신규 에스터라제 및 이를 이용한 광학활성 카르복실산의 제조방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로 본 발명은 슈도모나스 이어루지노사 유래의 신규 에스터라제; 상기 에스터라제 유전자; 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터; 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체; 상기 형질전환체를 배양하여 그 배양액으로부터 광학활성 카르복실산을 얻는 방법에 관한 것이다.

화학식 1

상기 식에서, R₁은 알킬, 아랄킬 또는 아릴이고, R₂는 알킬이며, n은 1 또는 2이다.

광학활성 카르복실산은 여러 가지 생리활성 의약품, 특히 고혈압 치료제인 캡토프릴(captopril)(Ondettii et al., Science 196, 441(1977)) 및 아날라프릴(analapril)(일본 특허공개공보, 소63-18599)의 생산에 유용한 원료물질로 사용된다. 1992년에 FDA가 발표한 광학입체이성체 의약품의 화학, 약리학, 독성학 및 임상학적 양상에 관한 규정[Policy Statement for the Development of New Stereoisomeric Drug]에 따르면 앞으로 신규 키랄 의약품을 개발하여 FDA의 허가를 취득하기 위해서는 광학입체적으로 단일 입체이성체(single enantiomer)이어야 한다고 권고하고 있다. 그러나, 의약품을 라세믹 형태로 생산할 경우에는 라세믹 형태 자체로 사용할 때뿐만 아니라 각각의 이성체를 따로 사용했을 경우에 대해서도 각각 동물과 사람에 대하여 안전하다는 것을 증명하도록 규정하고 있어 라세믹 형태의 의약품 또는 의약품 중간체의 생산을 간접적이지만 거의 원천적으로 규제하는 효과를 나타내고 있다. 이러한 이유는 대개의 경우 광학적 이성질체인 의약품의 생물학적 활성이 한 입체이성체에 의해 나타나며, 다른 하나는 오히려 부작용 또는 독성을 지니기 때문이다. 따라서 광학활성 의약품 생산에 유용한 키랄화합물들의 생산연구는 의약산업의 경쟁력 확보와 국민건강 증진 차원에서 필수 불가결한 연구과제로 대두되고 있다.

광학이성질체 중에서 ACE계 저해제(Angiotensin-Converting Enzyme inhibitor)인 에날라프릴, 캡토프릴은 시장규모가 전체의 약 30 %정도로 세계 의약품 시장에서 가장 중요한 위치를 차지하고 있어, 이들의 주요 중간체인 (R)-2-히드록시-4-페닐타노에이트와 (R)-β-아세틸머캅토이소부티레이트의 생물학적 생산기술 개발이 시급한 실정이다.

광학활성 의약품의 생산원가는 중간체의 생산단가 및 이의 특성에 좌우되기 때문에 광학활성 중간원료의 수입은 곧 완제품의 수입과도 비교될 수 있으며 이의 생산 기술 또한 부가가치가 높아 기술이전을 기피할 뿐만 아니라 경우에 따라서는 광학활성 중간체 자체의 수출도 기피하는 경우도 있어 이의 기술도입은 거의 난망한 상태이다. 따라서 가능한 최종 제품에 근접한 광학활성 중간체를 얻는 것이 최선의 방법이 될 수 있으며, 이와 같은 관점에서 유용 광학활성 중간체인 (R)-β-아세틸머캅토이소부티레이트의 생물학적 생산공정 개발은 주요 광학활성 의약품인 캡토프릴, 토코페롤, 라살로시드 A, 칼시마이신, 락탐계 항생제, (R)- 및 (S)-무스콘등의 생산에 유용한 전구체로 사용될 수 있다.

상기 광학활성 카르복실산은 화학식 2로 표시되는 카르복실산 에스터 라세미체(racemic carboxylic acid esters)로부터 에스터라제를 이용한 비대칭 가수분해법으로 생산할 수 있다.

상기 화학식에서 R₁, R₂및 n은 화학식 1에서 정의된 바와 같고, R₃는 알킬이다.

일반적으로 화학합성에 의해 광학활성 카르복실산을 생산하는 방법은 낮은 반응선택성과 복잡한 광학분할방법 및 심각한 환경오염 유발 등으로 인해 많은 난관에 부딪쳐 왔으며, 결정적으로 경제성을 저하시키는 요인이 되어 왔다. 따라서 이에 대한 대안으로서 최근에는 미생물이나 효소와 같은 생체촉매를 이용한 광학활성체 생산방법이 개발되고 있다.

미생물 중에서는 특이적으로 (R)- 또는 (S)-카르복실산 에스터(carboxylic acid esters)만을 선택적으로 가수분해하는 활성을 갖는 균주가 보고된 바 있다(일본 특허공개공보, 평1-222798). 그러나 상기 특허에서 미생물 자체에 의하여 생산된 에스터라제는 소량으로, 이를 이용하여 광학활성 카르복실산을 대량으로 생산하기에는 부적합하다. 따라서, 일차적으로 미생물에서 분리한 에스터라제 유전자를 클로닝하고, 이를 일반적인 유전자 재조합 기술을 이용하여 대장균에서 발현하기 위한 기술에 연구의 초점이 맞춰지고 있다.

이러한 연구의 하나로, 카르복실산 에스터 라세미체로부터 (R)-에스터에만 특이적으로 작용하여 광학활성 (R)-카르복실산을 생산하는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens IFO3018) 유래의 에스터라제 유전자를 분리하고 그 염기서열 및 아미노산 서열을 밝혔으며, 이 유전자를 포함하는 형질전환 대장균에 의해 재조합 에스터라제를 생산하는 기술이 보고된 이래(일본 특허공개공보, 소64-67190), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida FERM BP-3846) 유래 에스터라제 유전자도 클로닝되어 염기서열 및 이로부터 추정되는 아미노산 서열이 밝혀졌고, 마찬가지로 형질전환 대장균에 의한 발현기술과 이를 통해 생산된 재조합 에스터라제의 물리적 특성이 보고된 바 있다(미국 특허 5308765,미국 특허5482847, Ozaki et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59, 1204(1992)).

이들 두 미생물에서 유래한 에스터라제의 염기서열 및 아미노산 서열은 서로 달랐는데 슈도모나스 플루오레센스 유래의 에스터라제는 218개의 아미노산으로 이루어져 있고, 슈도모나스 푸티다 유래의 에스터라제는 276개의 아미노산으로 구성된다. 상기 두 효소의 열에 대한 안정성은 슈도모나스 푸티다 유래 에스터라제의 경우 70℃로 슈도모나스 플루오레센스 유래 에스터라제의 50℃보다 높았다. 슈도모나스 푸티다 유래 에스터라제의 분자량은 약 30,000 달톤으로 등전점은 pH 3.90±0.1이었으며, 최적 pH는 7.0이고 pH 6.0-8.0에서 안정하였다.

본 발명자들은 광학활성 카르복실산을 생산하는 새로운 균주 및 이로부터 유래한 신규 에스터라제를 찾고자 연구한 결과, 토양으로부터 분리한 슈도모나스 이어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 70℃ 이상에서도 안정성을 보이며 (R)-카르복실산을 선택적으로 생산하는 약 35 kDa 크기의 신규 에스터라제와 이를 코딩하는 유전자를 분리함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 고온에서도 안정하고 카르복실산 에스터 라세미체에 특이적으로 작용하여 광학활성 카르복실산을 생산하는 새로운 에스터라제 효소 단백질과 이를 코딩하는 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 에스터라제를 생산하는 신규 균주를 제공하고 그 물리화학적 특성을 밝히는 것을 목적으로 한다.

아울러 본 발명은 상기 에스터라제 유전자를 클로닝한 재조합 발현벡터를 이용하여 대장균 균주를 형질전환시키고, 상기 형질전환된 균주를 배양하여 배양액으로부터 에스터라제 효소를 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

마지막으로 본 발명은 상기 에스터라제 효소를 사용하여 광학활성 카르복실산을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1 은 (R)-카르복실산을 생산하는 에스터라제를 코딩하는 유전자의 클로닝과정을 나타낸 모식도이고,

도 2 는 (R)-카르복실산을 생산하는 에스터라제를 코딩하는 유전자의 제한효소 지도와 위치분석결과를 나타낸 것이고,

B:BamH I, H:Nhe I, N:Nco I, R:Nru I, K: Kpn I, B1:BamH I/Sau3A

RAM: (R)-아세틸머캅토이소부티레이트

(pTBL7, pTBL71, pTBL72는 pBluescript(R)KSII+ 벡터에 삽입된 것이고, 그 외의 인서트(insert)는 pUC119 클로닝 벡터에 삽입된 것이며, '+'와 '-'는 RAM의 생산여부를 나타낸다.)

도 3a, 3b 은 (R)-카르복실산을 생산하는 에스터라제의 아미노산 배열의 상동성을 다른 에스터라제와 비교한 결과이고,

1 : 에스터라제 유전자 estA

2 : 트리아실글리세롤 리파아제(Moraxella sp.)

3, 4 : 트리아실글리세롤 리파아제(Psychrobacter immobilis)

5, 6 : 카르복실 에스터라제(Acinetobacter calcoaceticus)

도 4 는 재조합 에스터라제 발현벡터 pES22b의 구조를 나타낸 제한효소 지도이고,

Ap : 앰피실린(ampicillin) 내성 유전자

lac I: 베타 갈락토시다아제(β-galactosidase) 유전자

도 5 는 재조합 대장균 PES를 배양하여 pES22b로부터 발현된 에스터라제를 포함한 단백질들의 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸 것이고,

1 : 4시간, 2 : 2시간, 3 : 1시간, 4 : 0시간, M : 단백질 마커

도 6 은 표준물질인 (R)형 및 (S)형 아세틸머캅토이소부티레이트와 재조합 에스터라제에 의하여 생산된 아세틸머캅토이소부티레이트로부터 각각 합성된 다이아스테레오머의 가스크로마토그램이다.

(a) : 재조합 대장균 BL21 PES에 의해 생산된 아세틸머캅토이소부티레이트의 다이아스테레오머

(b) : 표준물질 (S)-아세틸머캅토이소부티레이트(ii)와 (R)-아세틸머캅토이소부티레이트(iii)

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 슈도모나스 속 균주에서 유래한 신규 에스터라제 효소 단백질을 제공한다. 상기 에스터라제 효소는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 35,000 달톤의 분자량을 갖고, 등전점(isoelectric point)은 pH 6.4이다.

상기 에스터라제는 슈도모나스 이어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 분리되며, 카르복실산 에스터 라세미체를 비대칭적으로 가수분해하여 광학활성 (R)- 또는 (S)-카르복실산 에스터를 선택적으로 생산하는 활성을 갖는다.

본 발명의 에스터라제의 아미노산 서열을 모락셀라 속(Moraxella sp.)과 사이크로박터 임모빌리스(Psychrobacter immobilis) 유래의 트리아실글리세롤 리파아제(triacylglycerol lipase)와 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) 유래의 카르복실 에스터라제의 아미노산 서열과 비교한 결과, 본 발명에서 분리한 에스터라제의 169번째 아미노산인 세린을 함유한 글리신-X-세린-X-글리신(G-X-S-X-G)의 공통서열(consensus sequence)이 공통적으로 존재하였다. 상기 세린 잔기는 에스터라제 등의 효소의 활성 중심 부위로 알려져 있으며, 본 발명의 에스터라제에는 상기 공통서열의 활성을 돕는 히스티딘-글리신(His-Gly)의 또다른 공통서열이 세린 잔기에서 약 70개 아미노산 앞에 위치하고 있어 전형적인 세린 에스터라제의 특징을 나타낸다.

또한 본 발명은 상기 에스터라제를 암호화하는 유전자를 제공한다. 상기 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지며 서열번호 3으로 기재되는 CDS(coding sequence)를 가진다. 전체 염기서열 중 G+C 비율은 67.41%이다. 본 발명자들은 상기 에스터라제의 유전자 염기서열을 미국 GenBank에 수탁번호 AF170828로 등록하였다.

또한 본 발명은 상기 에스터라제를 생산하는 슈도모나스 속 균주 슈도모나스 이어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)를 제공한다. 구체적으로 국내 각지 및 인도에서 채취한 토양시료로부터 (R,S)-아세틸머캅토이소부틸산 메틸에스터((R,S)-acetylmercaptoisobutylic acid methyl ester)와 pH 지시약을 포함하는 일차선발 배지에서 균주를 배양하여 배양액의 색깔 변화를 통해 카르복실산 생물전환 균주를 선발하였다. 일차선발된 균주는 가스 크로마토그래피(gas chromatography, GC)로 분석하여 최종적으로 (R)-카르복실산 생산능력이 우수한 균주를 선발하였다.

위와 같이 분리된 광학활성 카르복실산 생산 균주의 지방산과 퀴논(quinone) 조성 및 함량을 측정하여 동정한 결과, C_18:1, C_16:0이 지방산의 주요성분으로 존재하였으며, 수산화 지방산으로는 3-OH C_10:0, 3-OH C_12:0이 특징적으로 존재하였다. 또한 미생물의 화학분류학상 중요한 성분인 퀴논의 경우 유비퀴논-9(ubiquinone-9)를 함유하고 있었다. 이상의 결과를 종합할 때, 본 발명의 균주는 슈도모나스 속으로 동정되었고, 종(species) 결정을 위해 16S 리보소말 RNA(16S ribosomal RNA)서열을 조사한 결과 99.9%의 상동성으로서 슈도모나스 이어루지노사로 동정되었다. 상기 균주는 본 발명자들에 의해 생명공학연구소 유전자은행에 1999년 8월 4일자로 기탁되었다(수탁번호 : KCTC 8953P).

한편, 상기에서 얻어진 에스테라제를 대량으로 생산하기 위하여 재조합 에스터라제 발현벡터를 제조하였다. 우선, 에스터라제의 정제를 쉽게 하기 위하여 서열번호 4 및 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 두 개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 상기 올리고뉴클레오티드를 각각 estA 유전자 N-말단 프라이머와 C-말단 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응을 수행함으로써 estA 유전자의 C-말단에 6개의 히스티딘(histidine)을 코딩하도록 설계된 DNA 절편을 증폭하였다. 추출된 상기 DNA 절편을 PCR 클로닝 벡터(PCR cloning vector)인 pT7blue 벡터의 제한효소 EcoR I 의 블런트 절단(blunt cleavage) 부위에 삽입하여 pT7ES 벡터를 제조한 다음, 상기 pT7ES와 pET22b를 Nco I로 부분 절단하여 연결함으로써 재조합 에스터라제 발현벡터 pES22b를 제조하였다(도 1 참조). 상기와 같이 제조된 발현벡터 pES22b의 제한효소 지도가 도 4 에 나타나 있다. 상기 pES22b를 대장균 BL21에 형질전환시켜 재조합 대장균 균주 BL21 PES를 얻었으며, 상기 균주를 생명공학연구소 유전자은행에 1999년 8월 4일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCTC8952P).

상기 재조합 대장균 균주를 배양하여 균체를 회수한 다음 파쇄하여 그 상등액으로부터 재조합 에스터라제를 분리하였다. 상기 재조합 에스터라제의 활성을 조사하기 위하여 (R,S)-아세틸머캅토이소부틸산 메틸에스터를 기질로 가수분해 시키고, 화학적으로 합성한 다이아스테레오머의 GC 분석과 비교하여 본 발명의 에스터라제에 의해 생산된 아세틸머캅토이소부티레이트의 광학활성을 조사하였다. 그 결과 본 발명의 재조합 에스터라제에 의해 생산된 광학활성 카르복실산은 (R)형임을 알 수 있었다. 일반적으로 화학적 방법에 의해 (R,S)-아세틸머캅토이소부틸산 메틸에스터로부터 (R)-아세틸머캅토이소부티레이트를 생산하는 경우에는 (S)형이 혼합된 라세미체의 형태로 생산되는 반면, 본 발명의 에스터라제를 이용하는 경우 (R)형만의 광학활성을 갖는 카르복실산이 쉽게 분리되므로 이를 이용하여 각종 의약품의 제조에 사용되는 광학활성 카르복실산을 제조할 수 있다.

한편, 본 발명의 재조합 대장균에 의해 생산된 재조합 에스터라제의 열안정성을 조사하기 위하여 배양된 균체를 파쇄하고 원심분리하여 에스터라제가 함유된 상등액을 각각 온도를 달리하여 유지한 후, 30℃에서 활성을 조사하였다. 그 결과 본 발명의 재조합 에스터라제의 활성은 70℃에서도 거의 변하지 않았으며, 이로부터 본 발명의 에스터라제가 70℃ 이상의 높은 온도에 대해서도 열안정성을 가짐을 알 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

〈실시예 1〉 비대칭 가수분해 활성을 갖는 에스터라제 생산균주의 분리

국내 및 인도 토양에서 채취한 토양을 시료로 균주를 선발하였다. 먼저 1g의 토양 시료를 9 ml의 증류수에 현탁하고, 이 용액을 10배, 100배, 1000배로 희석하였다. 상기 토양 현탁액을 영양배지(박토 쇠고기 추출물 3g/l, 펩톤 5g/l, 한천 15g/l)에 200㎕씩 도말하여 30℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 여기서 성장한 균주를 순수분리하고, 이 중에서 일차선발 액체배지를 사용하여 광학활성 카르복실산 생산균주를 분리하였다. 일차선발 액체배지의 조성은 (R,S)-아세틸머캅토이소부티르산 메틸에스터((R,S)-acetylmercaptoisobutyric acid methyl ester) 1 v/v%, pH 지시약인 브로모크레졸 퍼플(bromocresol purple) 0.1 w/v%, 0.05M 인산칼륨 완충용액(potassium phosphate buffer, pH 7.0)으로 하였다.

순수분리한 균주를 1 ml의 일차선발 배지에 접종하고 3시간 동안 30℃ 배양기에서 배양한 후, 배양액의 색깔 변화를 조사하였다. 브로모크레졸 퍼플은 pH 6.8에서는 남보라색, pH 3.2에서는 노란색을 띠므로, 상기 카르복실산 에스터로부터 광학활성 카르복실산을 생산하는 균주의 경우 배양액의 pH가 낮아져 노란색을 띠게 된다. 따라서 배양액의 색이 노란색으로 변한 균주만을 일차적으로 카르복실산 생물전환 균주로 선발하였다. 일차 선발된 시료는 가스 크로마토그래피(gas chromatography, HEWLEET PACKARD 5890)로 분석하여 최종 (R)-카르복실산 생산능이 우수한 균주를 선발하였다.

이상과 같이 일차 선발된 21개의 균주 중 (R)-카르복실산의 생산능이 가장 우수한 균주를 선발하기 위해 포도당 배지(포도당 2.66%, 황산암모늄 0.5%, 효모추출액 0.066%, 옥수수 침지액 2.0%, pH 6.8-7.0)를 사용하여 액체배양을 실시하였다. 24시간 동안 30℃에서 150rpm으로 교반하며 배양한 후, 3000rpm으로 30분간 원심분리하여 얻어진 균체를 생물전환 실험에 사용하였다. 상기 일차선발된 21 균주 중 최종적으로 가장 높은 (R)-카르복실산 생산수율을 보이는 균주 No. 1001을 우수 균주로 선발하였다.

〈실시예 2〉 분리된 균주의 동정

실시예 1에서 선발된 (R)-카르복실산 생물전환 균주 No. 1001의 동정은 지방산과 퀴논(quinone)의 조성 및 함량을 측정하여 기존의 데이터베이스와 비교함으로써 이루어졌으며, 결정 및 분석은 윤 등(Yoon et al., Int.J.Syst.Bacteriol., 47, 933, 1997)의 방법을 사용하였다.

지방산 분석결과, C_18:1, C_16:0이 지방산의 주요성분으로 존재하였으며, 수산화 지방산으로는 3-OH C_10:0, 3-OH C_12:0이 특징적으로 존재하였다. 또한 미생물의 화학분류학상 중요한 성분인 퀴논의 경우 유비퀴논-9(ubiquinone-9)를 함유하고 있었다. 이상의 결과를 종합할 때, 본 발명의 균주는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)으로 동정되었다. 한편 종(species) 결정을 위해 16S 리보소말 DNA(16S ribosomal DNA)서열을 조사하였으며, 그로부터 얻어진 본 발명의 균주의 16S rDNA의 염기서열은 서열번호 6으로 기재된다. 또한 상기 서열을 슈도모나스 속 균주 및 프로테오박테리아의 γ-서브클래스(subclass)의 16S rDNA 서열과 비교한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

그 결과, 본 발명의 균주는 99.9%의 상동성으로서 슈도모나스 이어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)로 동정되었으며, 상기 균주는 본 발명자들에 의해 생명공학연구소 유전자은행에 1999년 8월 4일자로 기탁되었다(수탁번호 : KCTC 8953P).

〈실시예 3〉 슈도모나스 이어루지노사로부터 염색체 DNA의 분리

실시예 2에서 동정된 슈도모나스 이어루지노사로부터 광학활성 (R)-카르복실산 메틸에스터에 특이적으로 작용하는 에스터라제를 암호화하는 염색체를 분리하기 위하여 Bio 101사의 게놈 DNA 분리 키트(G NOME^TMDNA isolation kit)를 사용하였다. 먼저 5 ml의 LB배지(박토 트립톤 10%, 박토-이스트 추출물 5%, 염화나트륨 10%, pH 7.0)에 분리한 슈도모나스 이어루지노사를 접종하여 24시간 동안 30℃로 배양하였다. 세포를 충분히 성장시킨 후, 5분간 원심분리하여 세포를 수확하고, 얻어진 세포 펠렛을 세포 현탁 용액[cell suspension solution, 10mM Tris-Cl(pH 8.0), 0.1M EDTA(pH 8.0)]에 용해하여 1.85 ml의 세포현탁액을 제조하였다. 상기 세포현탁액에 50 ㎕의 RNase 용액과 100 ㎕의 세포 분해/변성 용액(cell lysis/denaturation solution, 0.5% SDS)을 넣어 잘 혼합한 후, 55℃에서 15분간 배양하였다. 그 후 시료속의 단백질을 제거하기 위하여 프로테아제 25 ㎕를 혼합하여 55℃에서 1시간 동안 반응시키고, 500 ㎕의 투석용 완충용액을 넣어 1.5 ml 튜브에 시료를 나눈 다음 4℃에서 10분간 냉각시켰다. 그 후 12,000rpm으로 10분간 원심분리하여 펠렛을 침전시키고, 상등액을 15 ml 튜브에 옮겼다. 여기에 2 ml의 TE 완충용액(Tris-EDTA, pH 7.5)과 100% 에탄올 8 ml을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 이후 12,000rpm으로 15분간 원심분리하여 상등액을 버린 다음, DNA를 공기중에서 건조시키고, 건조된 DNA에 TE 완충액을 가하여 용해시켰다. 이 DNA를 제한효소 Sau3A로 부분절단하고 1% 아가로스 겔 (agarose gel)을 사용하여 전기영동한 후, 이 DNA 단편을 겔로부터 용출하여 부분 절단된 슈도모나스 이어루지노사의 게놈 DNA 라이브러리를 얻었다.

〈실시예 4〉 재조합 플라스미드의 제조

실시예 3과 같이 슈도모나스 이어루지노사로부터 크로모좀 DNA(chromosome DNA)를 추출한 후, 제한효소 Sau3A1으로 부분 절단하였다. 이를 미리 제한효소 BamH I으로 절단된 클로닝 벡터 pBluescript KSII+(Stratagene사, 미국)에 삽입하여 대장균 DH5α(Stratagene사, 미국)에 도입하였다. 상기 형질전환체 중에서 에스터라제를 코딩하는 유전자를 함유한 균주를 선발하기 위하여 다음과 같은 선발실험을 수행하였다.

우선, 형질전환체를 리파아제의 효소활성 측정 기질인 트리부티린(tributyrin)이 함유된 한천배지(트리부티린 10g/l, 한천 15g/l, 트립톤 10g/l, 효모 추출물 5g/l, 염화나트륨 10g/l)에 도말하여 배양하고, 트리부티린이 분해되어 콜로니 주변에 투명한 환이 생기는 균주를 1차로 선별하였다. 이들을 다시 에스터라제 기질로 사용되는 (R,S)-아세틸머캅토이소부티르산 메틸에스터 1 v/v%가 함유된 한천배지((R,S)-아세틸머캅토이소부티르산 메틸에스터 1 v/v%, 한천 15g/l, 트립톤 10g/l, 효모 추출물 5g/l, 염화나트륨 10g/l)에 접종하여, 콜로니 주변의 색이 노란색으로 변색되는 균주만을 2차로 선별하였다. 최종적으로 실제 본 에스터라제 반응 기질인 (R,S)-아세틸머캅토이소부틸산 메틸에스터를 사용하여 (R)-아세틸머캅토이소부티레이트를 생산하는 균주를 선발하였다. 생산된 (R)-아세틸머캅토이소부티레이트의 분석에는 가스 크로마토그래피(HEWLETT PACKARD 5890)와 고성능 액체 크로마토그래피[HPLC, 키렉스 컬럼(chirex(R) NGLY ＆ DNB, 페노메넥스사, 미국), 20mM 암모늄 아세테이트(Ammonium acetate)/메탄올, 영린社, 한국]를 사용하였다.

상기와 같은 과정을 통해 (R)-아세틸머캅토이소부티레이트 생산활성을 가진 4.5 kb 크기의 플라스미드인 pTBL7을 포함하고 있는 형질전환체를 분리하였다.

〈실시예 5〉 재조합 플라스미드의 분리, 분석 및 서브클로닝(subcloning)

에스터라제를 암호화하는 유전자의 개략적인 클로닝 과정을 도 1 에 나타내었다. 형질전환된 대장균에서 DNA의 추출은 일반적인 비등(boiling) 방법(Sambrook et al., Molecular cloning, 1989)과 플라스미드 미디 키트(퀴아젠 사, 미국)를 사용한 추출방법을 사용하였으며, 분석은 제한효소(KpnI, BamHI, NheI, NruI, NcoI, ScaI 등)로 절단한 후 0.8-1% 아가로스 겔을 사용하여 전기영동으로 행하였다.

삽입된 유전자의 제한효소 지도와 효소 위치 분석결과를 도 2 에 나타내었다. 도 2 에서 pTBL7, pTBL71, pTBL72는 pBluescript(R)SKII+ 벡터에 삽입한 것이고, 그 외의 인서트(insert)들은 pUC119 클로닝 벡터(Stratagene사, 미국)에 삽입한 것이다.

4.5 kb의 pTBL7을 제한효소인 Kpn I로 절단하여 각 DNA 단편의 (R)-아세틸머캅토이소부티레이트의 생산활성을 조사한 결과, 2.6 kb의 pTBL72에서 (R)-아세틸머캅토이소부티레이트 생산활성이 나타나 목적하는 에스터라제가 존재하는 것이 확인되었다.

계속하여 pTBL72를 제한효소 BamHI, NheI, NruI로 절단하여 서브클로닝한 결과, NheI와 NruI로 절단된 pTBL76이 (R)-아세틸머캅토이소부티레이트의 생산능을 가진 것으로 확인되어, pTBL76에 포함된 DNA 인서트가 (R)-아세틸머캅토이소부티레이트의 생산능을 가진 최소부위인 것으로 확인되었다. 또한 (R)-아세틸머캅토이소부티레이트의 생산능을 가진 에스터라제를 코딩하는 DNA의 크기가 약 1.1-kb 이내인 것으로 밝혀졌다.

〈실시예 6〉 클로닝된 에스터라제 유전자의 염기서열 및 이로부터 추정되는 아미노산 서열

pTBL72의 핵산염기서열을 분석하기 위하여 단계적으로 약 300-400 bp 정도로 크기를 줄인 DNA 래더(ladder)를 제조하고 염기서열 분석을 행하여, 약 2455 bp의 염기서열을 얻었다. 염기서열 분석은 자동 염기서열분석기(ABI PRISM 377 autosequencer, Perkin-Elmer, 미국)를 사용하여 행하였다.

2455 bp의 염기서열 중 전사해독틀(open reading frame, ORF)을 조사한 결과 1개의 ORF가 존재하는 것으로 확인되었으며, BLAST 서치를 통하여 상동성(homology)를 조사한 결과 이 ORF가 에스터라제, 리파아제와 높은 상동성을 갖는 것으로 나타났다. 이를 estA로 명명하고 상기 염기서열을 미국 GenBank에 수탁번호 AF170828로 등록하였다.

상기에서 분리한 광학활성 (R)-카르복실산을 생산하는 에스터라제 유전자는 서열번호 1의 288번째 염기부터 1236번째 염기까지의 서열로 이루어지는 948개의 염기서열로 구성되며, 이 유전자가 암호화하는 에스터라제는 316개의 아미노산으로 구성되는 효소로서, 상기 유전자의 전체 염기서열 중 구아닌/시토신 비율(G+C ratio)은 67.41%, 분자량은 약 35 kDa이고, 등전점은 pH 6.4로 조사되었다. 상기 에스터라제는 기존에 보고된 슈도모나스 플루오레센스 또는 슈도모나스 푸티다 유래의 에스터라제보다 크기가 좀 더 크며, 이들 효소와는 아미노산 서열이 다른 새로운 효소로 판명되었다.

또한 도 3a, 3b 에 나타낸 바와 같이 모락셀라 속(Moraxella sp.)과 사이크로박터 임모빌리스(Psychrobacter immobilis) 유래의 트리아실글리세롤 리파아제(triacylglycerol lipase)와 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) 유래의 카르복실 에스터라제와 아미노산 서열의 상동성을 비교한 결과, 본 발명에서 새로이 분리한 에스터라제의 169번째 아미노산인 세린(serine)을 함유한 글리신-X-세린-X-글리신(G-X-S-X-G)의 공통 서열(consensus sequence)이 모두 존재하였다. 상기 세린 잔기는 에스터라제 등의 효소 활성 중심부위로 알려져 있다. 도 3a 및 도 3b에서 실선의 박스내의 아미노산 서열은 공지의 세린 에스터라제와 상동성을 가지는 아미노산 배열(-HG-와 -GXSXG-)을 나타내는 것이고, 회색 및 진회색의 부분은 그외의 아미노산 배열 중 상동이 높은 부분을 나타내는 것으로 상동성이 높은 부분일수록 검은색의 음영으로 나타내었다.

또한 상기 세린을 포함하는 공통 서열의 세린 잔기로부터 약 70개 아미노산 앞에 상기 서열의 활성을 돕는 히스티딘-글리신(His-Gly)의 또다른 공통 서열이 위치하여 전형적인 세린 에스터라제의 특성을 나타내므로, 본 발명의 에스터라제는 세린 에스터라제의 일종임을 알 수 있다.

〈실시예 7〉 재조합 에스터라제를 고발현하는 형질전환 대장균 균주의 개발

estA 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조하기 위해 pET22b(Novagen사, 미국)의 제한효소 NcoI와 BamHI 부위에 서열번호 1로 기재되는 estA 유전자를 삽입하여 발현벡터 pES22b를 제조하였다.

먼저 발현된 에스터라제의 정제를 쉽게 하기 위하여 플라스미드 pTBL74를 주형으로 하는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)을 수행하였다. estA 유전자 N-말단 프라이머와 C-말단 프라이머로는 각각 NcoI의 제한효소 절단 부위를 가지며 서열번호 4로 기재되는 올리고뉴클레오티드와 BamHI의 제한효소 절단 부위를 가지며 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. C-말단 프라이머의 경우 6개의 히스티딘이 첨가될 수 있도록 히스티딘을 코딩하는 염기서열을 함유하도록 설계하였다. PCR은 94℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분으로 구성되는 사이클을 30회 반복하여 실시하였다.

상기와 같은 반응으로 estA 유전자의 C-말단에 6개의 히스티딘(His)이 연결되도록 설계된 DNA 단편을 대량으로 증폭한 후, 이를 퀴아젠 겔 용출 키트(Quiagen사, 미국)로 추출하였다. 상기 DNA 단편을 pET22b 벡터(Novagen사, 미국)의 NcoI과 BamHI의 제한효소 부위에 삽입하였으며, 그 제한효소 지도를 도 4 에 나타내었다. 상기 재조합 플라스미드 pES22b를 대장균 BL21(Invitrogen사, 미국) 컴피턴트 세포와 혼합한 후 얼음에 30분간 방치하고 42℃에서 30초간 열충격을 가함으로써 형질전환된 균주를 제조하였다. 상기 형질전환체를 BL21 PES라 명명하고 1999년 8월 4일자로 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 8952P).

〈실시예 8〉 재조합 대장균에서의 에스터라제 발현양상

실시예 7에서 제조한 재조합 대장균에서의 estA 유전자의 발현양상을 조사하기 위하여 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 아래와 같이 수행하였다. 우선, 10%의 폴리아크릴라마이드겔(Biorad사, 미국)을 전기영동장치에 설치하고 전기영동장치에 이동완충액(트리스 글리신 완충용액)을 채워 전기영동을 준비하였다. 먼저 estA가 함유된 pTBL72를 함유하는 대장균 BL21 PES를 LB 배지를 사용하여 37℃에서 배양하고 접종후 각각 1시간, 2시간 및 4시간 후 배양액을 취하여 3000rpm으로 30분간 원심분리하였다. 원심분리하여 균체를 회수한 후, 0.2배 부피의 균체 파쇄용 완충용액(50mM 인산나트륨 완충용액, pH 7.8, 300mM 염화나트륨, Quiagen사, 미국)을 가하여 5배 농축 현탁액을 만들었다. 초음파 파쇄기를 이용하여 균체를 파쇄한 후, 원심분리하고 에스터라제가 함유된 상등액 50 ㎕를 취하여 샘플 완충액 50 ㎕과 혼합하고 95℃에서 5분간 전처리한 후 10,000rpm에서 3-4분간 원심분리하였다. 원심분리한 상등액을 분자량 표준품과 함께 웰에 20 ㎕씩 로딩하고 120V의 전압으로 전기영동하였다. 염색선이 겔의 맨 아래까지 전개되면 전기영동을 멈추고 겔을 꺼낸 후 쿠마시 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색하였다. 대조군으로는 estA 유전자를 삽입하지 않은 대장균의 단백질을 사용하였으며, 그 결과를 도 5 에 나타내었다.

그 결과 대조군에서는 본 에스터라제의 아미노산 배열로부터 추론된 분자량인 36,400 달톤 부위의 밴드가 거의 나타나지 않았고, 에스터라제의 발현 1시간, 2시간, 3시간, 4시간 후 시료속의 단백질 분자량 양상은 약 35,000 달톤 부위에서 진한 밴드를 보여 에스터라제가 효과적으로 생산되었음을 알 수 있었다. 또한 그 분자량이 아미노산 배열로부터 추론된 분자량과 상당히 근접하여 이 단백질 밴드가 에스터라제임을 확인할 수 있었다.

〈실시예 9〉 재조합 에스터라제의 활성 조사

화학적으로 (R,S)-아세틸머캅토이소부틸산 메틸에스터로부터 (R)-아세틸머캅토이소부티레이트를 생산하려면 (S)형이 혼합된 라세미체로 생산된다. 따라서 실시예 7의 재조합 대장균에 의해 생산된 에스터라제가 (R)형과 (S)형이 혼합된 라세미체가 아니라 (R)형 또는 (S)형만의 순수한 광학활성을 갖는 카르복실산을 생산하는지 확인하기 위하여 가스 크로마토그래피를 통해 생산된 물질의 광학활성을 조사하였다. 표준물질로서 화학적으로 (R)형과 (S)형의 아세틸머탑토이소부티레이트 다이에스테레오머를 합성하고, 그의 GC 피크와 실시예 7의 재조합 대장균에 의해 생산된 아세틸머캅토이소부티레이트의 다이에스테레오머의 피크를 비교하여 도 6 에 나타내었다. 그 결과 도 6 에서 알 수 있듯이 재조합 에스터라제에 의해 생산된 아세틸머캅토이소부티레이트는 (R)형임을 알 수 있다.

〈실시예 10〉 재조합 에스터라제의 열안정성

실시예 7에서 제조한 재조합 대장균 BL21 PES에 의하여 생산된 슈도모나스 이어루지노사 유래 에스터라제의 열안정성을 아래와 같이 조사하였다. 먼저 estA가 함유된 pTBL72를 함유하는 대장균 BL21 PES를 LB 배지를 사용하여 37℃에서 24시간 동안 배양하고 원심분리하여 균체를 회수한 후, 0.2배 부피의 균체 파쇄용 완충용액(50mM 인산나트륨 완충용액, pH 7.8, 300mM 염화나트륨, Quiagen사, 미국)을 가하여 5배 농축 현탁액을 만들었다. 초음파 파쇄기를 이용하여 균체를 파쇄한 후, 원심분리하고 에스터라제가 함유된 상등액을 이용하여 열안정성을 조사하였다. 즉, 30℃, 40℃, 50℃, 60℃, 70℃에서 1시간 동안 유지시킨 후, 30℃에서 에스터라제의 활성을 조사하였다. 에스터라제 활성은 생산된 (R)-아세틸머캅토이소부티레이트의 양을 가스 크로마토그래피로 측정하여, 건조 세포 중량(dry cell weight, DCW) 1 mg당 활성으로 표시하였으며, 그 결과를 하기 표 2 에 나타내었다.

형질전환체에서 생산된 에스터라제의 열안정성

온도(℃)	활성(U/mg DCW)
30	404.09
40	426.36
50	438.63
60	429.09
70	420.91

상기 표 2 에서 알 수 있듯이, 본 발명의 재조합 에스터라제는 온도변화에 따른 활성변화가 거의 없었으며, 70℃의 고온에서도 거의 활성이 감소하지 않아 열안정성이 매우 우수한 것으로 나타났다.

본 발명의 슈도모나스 이어루지노사 유래의 신규 에스터라제는 카르복실산 에스터 라세미체로부터 광학활성 카르복실산을 생산하는 능력이 뛰어나며 70℃ 이상의 고온에서도 열에 대한 안정성을 나타내므로, 여러 가지 생리활성 의약품 특히 고혈압 치료제인 켑토프릴 및 아날라프릴 등의 생산에 유용하게 사용될 수 있고, 기존의 화학합성에 의한 광학활성 카르복실산의 생산에 비해 반응선택성이 높을 뿐 아니라, 공정이 간단하며, 환경오염물질의 배출이 적은 등의 장점이 있다.

〈110〉 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology

〈120〉 Novel esterase derived from Pseudomonas aeruginosa, its gene and

process for production of optically active carboxylic acids using

them

〈130〉 9p-09-03

〈160〉 6

〈170〉 KOPATIN 1.5

〈210〉 1

〈211〉 1400

〈212〉 DNA

〈213〉 Pseudomonas aeruginosa

〈220〉

〈221〉 CDS

〈222〉 (288)..(1235)

〈400〉 1

gttcgcggca ccctcggcga catcctgccc aaggtcgccg ccaggaattt ccgccgcacc 60

gcgctgatcc tggtcggcga ggtgctggcc gccgaaggct tcgccgactc ttcgctgtac 120

cgcgccgagc atcgacatct ctatcgaccc ggcgaatgaa ccgccgtcct taggttcggc 180

gccgaccacc ggcagcacgc ctagactcgt cacaaggctt gcgacagcgg gccggcacgg 240

ctagcgttca gcgctggccc cttttttcct gaagccttcg gacaccc atg aaa cga 296

Met Lys Arg

1

ttc ctc ctc ggt ctg gtt ctg ctg ctg gcg gtc gcc gcc ggc gtc ctc 344

Phe Leu Leu Gly Leu Val Leu Leu Leu Ala Val Ala Ala Gly Val Leu

5 10 15

tac ttc gtc ccg gct acc ctc ctc gcc agc gta cgc acc gtc gag cgc 392

Tyr Phe Val Pro Ala Thr Leu Leu Ala Ser Val Arg Thr Val Glu Arg

20 25 30 35

ggc ctc gcc ggt ctc agc gag cac agc gtg cag gtc gac aac ctg gag 440

Gly Leu Ala Gly Leu Ser Glu His Ser Val Gln Val Asp Asn Leu Glu

40 45 50

atc gcc tac ctg gaa ggc ggc tcg gaa aag aac ccg acc ctg ttg ctg 488

Ile Ala Tyr Leu Glu Gly Gly Ser Glu Lys Asn Pro Thr Leu Leu Leu

55 60 65

atc cac ggc ttc ggc gcc gac aag gac aac tgg ctg cgc ttc gcc cgg 536

Ile His Gly Phe Gly Ala Asp Lys Asp Asn Trp Leu Arg Phe Ala Arg

70 75 80

ccg ctg acc gag cgc tac cat gtg gtc gcc ctc gac ctg ccc ggc ttc 584

Pro Leu Thr Glu Arg Tyr His Val Val Ala Leu Asp Leu Pro Gly Phe

85 90 95

ggc gac agc agc aag ccg caa cag gcc agc tac gac gtc ggc acc cag 632

Gly Asp Ser Ser Lys Pro Gln Gln Ala Ser Tyr Asp Val Gly Thr Gln

100 105 110 115

gcc gag cga gtc gcc aat ttc gcc gcc gcc atc ggc gtg cgc cgc ctg 680

Ala Glu Arg Val Ala Asn Phe Ala Ala Ala Ile Gly Val Arg Arg Leu

120 125 130

cac ctg gcc ggc aac tcc atg ggc ggg cac atc gcc gcg ctc tac gcg 728

His Leu Ala Gly Asn Ser Met Gly Gly His Ile Ala Ala Leu Tyr Ala

135 140 145

gcg cgc cat ccg gaa cag gtg cta tcg ctg gcg ctg atc gac aac gcc 776

Ala Arg His Pro Glu Gln Val Leu Ser Leu Ala Leu Ile Asp Asn Ala

150 155 160

ggg gta atg ccg gcg cgc aag agc gaa ctg ttc gag gac ctg gag cgc 824

Gly Val Met Pro Ala Arg Lys Ser Glu Leu Phe Glu Asp Leu Glu Arg

165 170 175

ggc gag aat ccc ctg gtg gtg cgc cag ccg gaa gac ttc cag aag ctg 872

Gly Glu Asn Pro Leu Val Val Arg Gln Pro Glu Asp Phe Gln Lys Leu

180 185 190 195

ctc gac ttc gtg ttc gtc cag caa ccg ccg ctg ccg gcg ccg ctc aag 920

Leu Asp Phe Val Phe Val Gln Gln Pro Pro Leu Pro Ala Pro Leu Lys

200 205 210

cgc tac ctc ggc gaa cgc gcg gta gcc gcg tcg gcg ttc aac gcg cag 968

Arg Tyr Leu Gly Glu Arg Ala Val Ala Ala Ser Ala Phe Asn Ala Gln

215 220 225

ata ttc gaa caa ctg cgc cag cgc tac atc ccg ctg gag ccg gaa ctg 1016

Ile Phe Glu Gln Leu Arg Gln Arg Tyr Ile Pro Leu Glu Pro Glu Leu

230 235 240

ccg aag atc gag gca ccg acc ctg ctg cta tgg ggc gac cgc gac cgc 1064

Pro Lys Ile Glu Ala Pro Thr Leu Leu Leu Trp Gly Asp Arg Asp Arg

245 250 255

gtg ctg gac gtc tcc agc atc gag gtg atg cgt ccg ctg ctg aag cgg 1112

Val Leu Asp Val Ser Ser Ile Glu Val Met Arg Pro Leu Leu Lys Arg

260 265 270 275

ccc agc gtg gtg atc atg gaa aac tgc gga cac gtg ccg atg gtc gaa 1160

Pro Ser Val Val Ile Met Glu Asn Cys Gly His Val Pro Met Val Glu

280 285 290

cgc ccg gag gaa acc gcg cag cac tac cag gcc ttc ctc gac ggt gta 1208

Arg Pro Glu Glu Thr Ala Gln His Tyr Gln Ala Phe Leu Asp Gly Val

295 300 305

cgg aac gcc cag gtg gcc ggt cgc tga aaacg cgaaccggcg cctgggcgcc 1260

Arg Asn Ala Gln Val Ala Gly Arg ***

310 315

ggttcggggg agcgggagcc gtcgcgagga cggctcggat acaggcctca ggcctggatc 1320

aggttggcga tctgcacgtc cgggttgacg tcctgctcgt agtcgacccc agcgacctcg 1380

aaaccgaaca ggttgaggaa 1400

〈210〉 2

〈211〉 315

〈212〉 PRT

〈213〉 Pseudomonas aeruginosa

〈400〉 2

Met Lys Arg Phe Leu Leu Gly Leu Val Leu Leu Leu Ala Val Ala Ala

1 5 10 15

Gly Val Leu Tyr Phe Val Pro Ala Thr Leu Leu Ala Ser Val Arg Thr

20 25 30

Val Glu Arg Gly Leu Ala Gly Leu Ser Glu His Ser Val Gln Val Asp

35 40 45

Asn Leu Glu Ile Ala Tyr Leu Glu Gly Gly Ser Glu Lys Asn Pro Thr

50 55 60

Leu Leu Leu Ile His Gly Phe Gly Ala Asp Lys Asp Asn Trp Leu Arg

65 70 75 80

Phe Ala Arg Pro Leu Thr Glu Arg Tyr His Val Val Ala Leu Asp Leu

85 90 95

Pro Gly Phe Gly Asp Ser Ser Lys Pro Gln Gln Ala Ser Tyr Asp Val

100 105 110

Gly Thr Gln Ala Glu Arg Val Ala Asn Phe Ala Ala Ala Ile Gly Val

115 120 125

Arg Arg Leu His Leu Ala Gly Asn Ser Met Gly Gly His Ile Ala Ala

130 135 140

Leu Tyr Ala Ala Arg His Pro Glu Gln Val Leu Ser Leu Ala Leu Ile

145 150 155 160

Asp Asn Ala Gly Val Met Pro Ala Arg Lys Ser Glu Leu Phe Glu Asp

165 170 175

Leu Glu Arg Gly Glu Asn Pro Leu Val Val Arg Gln Pro Glu Asp Phe

180 185 190

Gln Lys Leu Leu Asp Phe Val Phe Val Gln Gln Pro Pro Leu Pro Ala

195 200 205

Pro Leu Lys Arg Tyr Leu Gly Glu Arg Ala Val Ala Ala Ser Ala Phe

210 215 220

Asn Ala Gln Ile Phe Glu Gln Leu Arg Gln Arg Tyr Ile Pro Leu Glu

225 230 235 240

Pro Glu Leu Pro Lys Ile Glu Ala Pro Thr Leu Leu Leu Trp Gly Asp

245 250 255

Arg Asp Arg Val Leu Asp Val Ser Ser Ile Glu Val Met Arg Pro Leu

260 265 270

Leu Lys Arg Pro Ser Val Val Ile Met Glu Asn Cys Gly His Val Pro

275 280 285

Met Val Glu Arg Pro Glu Glu Thr Ala Gln His Tyr Gln Ala Phe Leu

290 295 300

Asp Gly Val Arg Asn Ala Gln Val Ala Gly Arg ***

305 310 315

〈210〉 3

〈211〉 948

〈212〉 DNA

〈213〉 Pseudomonas aeruginosa

〈400〉 3

atgaaacgat tcctcctcgg tctggttctg ctgctggcgg tcgccgccgg cgtcctctac 60

ttcgtcccgg ctaccctcct cgccagcgta cgcaccgtcg agcgcggcct cgccggtctc 120

agcgagcaca gcgtgcaggt cgacaacctg gagatcgcct acctggaagg cggctcggaa 180

aagaacccga ccctgttgct gatccacggc ttcggcgccg acaaggacaa ctggctgcgc 240

ttcgcccggc cgctgaccga gcgctaccat gtggtcgccc tcgacctgcc cggcttcggc 300

gacagcagca agccgcaaca ggccagctac gacgtcggca cccaggccga gcgagtcgcc 360

aatttcgccg ccgccatcgg cgtgcgccgc ctgcacctgg ccggcaactc catgggcggg 420

cacatcgccg cgctctacgc ggcgcgccat ccggaacagg tgctatcgct ggcgctgatc 480

gacaacgccg gggtaatgcc ggcgcgcaag agcgaactgt tcgaggacct ggagcgcggc 540

gagaatcccc tggtggtgcg ccagccggaa gacttccaga agctgctcga cttcgtgttc 600

gtccagcaac cgccgctgcc ggcgccgctc aagcgctacc tcggcgaacg cgcggtagcc 660

gcgtcggcgt tcaacgcgca gatattcgaa caactgcgcc agcgctacat cccgctggag 720

ccggaactgc cgaagatcga ggcaccgacc ctgctgctat ggggcgaccg cgaccgcgtg 780

ctggacgtct ccagcatcga ggtgatgcgt ccgctgctga agcggcccag cgtggtgatc 840

atggaaaact gcggacacgt gccgatggtc gaacgcccgg aggaaaccgc gcagcactac 900

caggccttcc tcgacggtgt acggaacgcc caggtggccg gtcgctga 948

〈210〉 4

〈211〉 26

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 N-terminal primer

〈400〉 4

gccatgggat tcctcctcgg tctggt 26

〈210〉 5

〈211〉 45

〈212〉 DNA

〈213〉 Artificial Sequence

〈220〉

〈223〉 C-terminal primer

〈400〉 5

cggatcctga atggtgatgg tgatggtggc gaccggccac ctggg 45

〈210〉 6

〈211〉 1491

〈212〉 DNA

〈213〉 Pseudomonas aeruginosa

〈400〉 6

attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc ggatgaaggg agcttgctcc 60

tggattcagc ggcggacggg tgagtaatgc ctaggaatct gcctggtagt gggggataac 120

gtccggaaac gggcgctaat accgcatacg tcctgaggga gaaagtgggg gatcttcgga 180

cctcacgcta tcagatgagc ctaggtcgga ttagctagtt ggtggggtaa aggcctacca 240

aggcgacgat ccgtaactgg tctgagagga tgatcagtca cactggaact gagacacggt 300

ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca atgggcgaaa gcctgatcca 360

gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg gattgtaaag cactttaagt tgggaggaag 420

ggcagtaagt taataccttg ctgttttgac gttaccaaca gaataagcac cggctaactt 480

cgtgccagca gccgcggtaa tacgaagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa 540

agcgcgcgta ggtggttcag caagttggat gtgaaatccc cgggctcaac ctgggaactg 600

catccaaaac tactgagcta gagtacggta gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg 660

aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt ggcgaaggcg accacctgga ctgatactga 720

cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780

aaacgatgtc gactagccgt tgggatcctt gagatcttag tggcgcagct aacgcgataa 840

gtcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg 900

cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta cctggccttg 960

acatgctgag aactttccag agatggattg gtgccttcgg gaactcagac acaggtgctg 1020

catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc 1080

cttgtcctta gttaccagca cctcgggtgg gcactctaag gagactgccg gtgacaaacc 1140

ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta cggccagggc tacacacgtg 1200

ctacaatggt cggtacaaag ggttgccaag ccgcgaggtg gagctaatcc cataaaaccg 1260

atcgtagtcc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg 1320

tgaatcagaa tgtcacggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380

tgggagtggg ttgctccaga agtagctagt ctaaccgcaa gggggacggt taccacggag 1440

tgattcatga ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta ggggaacctg c 1491

Claims

서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 카르복실산 에스터 라세미체를 비대칭적으로 가수분해하여 광학활성 카르복실산 및 그의 거울상 이성질체 에스터를 선택적으로 생산하는 에스터라제.
제 1항에 있어서, 하기 화학식 1의 광학활성 카르복실산을 생산하는 것을 특징으로 하는 에스터라제.

화학식 1

상기 식에서, R₁은 알킬, 아랄킬 또는 아릴이고, R₂는 알킬이며, n은 1 또는 2이다.
제 1항에 있어서, 광학활성 카르복실산은 (R)형인 것을 특징으로 하는 에스터라제.
서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지며, 제 1항의 에스터라제를 코딩하는 에스터라제 유전자.
서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 포함하며, 제 1항의 에스터라제를 코딩하는 에스터라제 유전자.
제 5항의 에스터라제 유전자를 포함하는 발현벡터.
제 6항에 있어서, 도 4로 기재되는 제한효소 지도로 표시되는 발현벡터 pES22b.
제 5항의 발현벡터로 형질전환된 형질전환체.
제 8항에 있어서, 형질전환체 BL21 PES(KCTC 8952P).
제 1항의 에스터라제를 이용하여 카르복실산 에스터 라세미체로부터 광학활성 카르복실산을 제조하는 방법.
제 1항의 에스터라제를 생산하는 슈도모나스 이어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)(KCTC 8953P).