JPH07203959A - 安定型コレステロール・エステラーゼおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 配列番号１に示すアミノ酸配列を有するコレ
ステロール・エステラーゼにおいて、第１６３番目のア
スパラギンおよび第２６４番目のロイシンの少なくとも
一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、第１７６番
のアミノ酸がヒスチジンまたはヒスチジン以外のアミノ
酸であることを特徴とする安定型コレステロール・エス
テラーゼ。 【効果】 コレステロール・エステラーゼ遺伝子に変異
を導入することにより、安定性の向上した安定型コレス
テロール・エステラーゼを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コレステロール・エス
テラーゼ遺伝子に変異を導入した安定性の向上したコレ
ステロール・エステラーゼおよびその生産方法に関す
る。該安定型コレステロール・エステラーゼは、臨床診
断、有機合成、洗剤用酵素として有用な酵素である。

【０００２】

【従来の技術】長鎖脂肪酸エステルの加水分解酵素は、
その多岐にわたる触媒作用から、工業的に重要な酵素で
ある。シュードモナス属細菌の一種であるシュードモナ
ス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)FERM
P-2611〔後にシュードモナス・アエルギノーザ(Pseudom
onas aeruginosa ATCC31156)と再同定、改名された〕が
その培養物中にコレステロール・エステラーゼを生産す
ることが開示されている（特開昭50-157588)。このシュ
ードモナス属細菌の生産するコレステロール・エステラ
ーゼは、コレステロールエステル以外にも多くのエステ
ルを加水分解でき、また逆に各種脂肪酸のエステルをも
生成できるという特徴を有しており、臨床診断、不斉加
水分解、不斉エステル合成、洗剤、油脂の改質等への利
用価値が高い。

【０００３】配列番号１に示されるアミノ酸配列を持つ
シュードモナスＰＳ−２１由来のリポプロテイン・リパ
ーゼは知られてる（特開平3-201989号公報）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】天然のコレステロール
・エステラーゼは、例えば熱、各種の有機溶媒、界面活
性剤、酸化剤または変性剤に対する安定性が弱く産業上
利用するのに難点がある。

【０００５】本発明により、熱、各種の有機溶媒、界面
活性剤、酸化剤または変性剤に対する安定性を高めた安
定型のコレステロール・エステラーゼが提供される。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、微生物
から得られる配列番号１のアミノ酸配列を有するコレス
テロール・エステラーゼまたはその１７６番目のヒスチ
ジンがグルタミンに変った配列番号４のアミノ酸配列を
有するコレステロール・エステラーゼをコードする遺伝
子に変異を導入し、該遺伝子を組み込んだ組換え体ＤＮ
Ａを作成し、該組換え体ＤＮＡを保持する微生物を培養
することにより、１６３番目または２６４番目のアミノ
酸が異なるアミノ酸配列を持つ安定性の向上したコレス
テロール・エステラーゼを得ることができる。

【０００７】本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列
を有するコレステロール・エステラーゼにおいて、第１
６３番目のアスパラギンおよび第２６４番目のロイシン
の少なくとも１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換さ
れ、第１７６番目のアミノ酸がヒスチジンまたはヒスチ
ジン以外のアミノ酸であることを特徴とする安定型コレ
ステロール・エステラーゼに関する。

【０００８】配列番号１に示すアミノ酸配列を有するコ
レステロール・エステラーゼにおいて、第１６３番目の
アスパラギンに置換するアミノ酸としてはどのようなア
ミノ酸でもよく、酸性アミノ酸、アスパラギン以外の中
性アミノ酸、塩基性アミノ酸があげられるが、アスパラ
ギン以外の中性アミノ酸が好ましい。

【０００９】中性アミノ酸としてはグリシン、アラニン
等の脂肪族アミノ酸、バリン、ロイシン、イソロイシン
等の脂肪族分岐アミノ酸、セリン、トレオニン等の脂肪
族ヒドロキシアミノ酸、アスパラギン、グルタミン等の
脂肪族アミドアミノ酸、システイン、シスチン、メチオ
ニン等の脂肪族含硫アミノ酸、フェニルアラニン、チロ
シン等の芳香族アミノ酸、トリプトファン、ヒスチジ
ン、プロリン等の複素環式アミノ酸があげられる。酸性
アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸等が
あげられ、塩基性アミノ酸としては、ヒスチジン、リジ
ン、アルギニン等があげられる。

【００１０】第１６３番目のアスパラギンに置換するア
スパラギン以外の中性アミノ酸としては、好ましくは脂
肪族ヒドロキシアミノ酸、とりわけ好ましくはセリンが
あげられる。

【００１１】配列番号１に示すアミノ酸配列において、
第２６４番目のロイシンに置換するアミノ酸としてはど
のようなアミノ酸でもよく、ロイシン以外の前記の中性
アミノ酸、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸があげられる
が、好ましくはロイシン以外の中性アミノ酸、特に好ま
しくは複素環式アミノ酸、とりわけ好ましくはプロリン
があげられる。

【００１２】配列番号１に示すアミノ酸配列において、
第１７６番目のヒスチジン以外のアミノ酸としてはどの
ようなアミノ酸でもよく、前記の中性アミノ酸、酸性ア
ミノ酸、塩基性アミノ酸があげられるが、好ましくは中
性アミノ酸、特に好ましくはグルタミン等があげられ
る。

【００１３】また本発明は、上記安定型コレステロール
・エステラーゼを暗号化しているシュードモナス・アエ
ルギノーザ由来の安定型コレステロール・エステラーゼ
構造遺伝子を採取し、該遺伝子を含む組換え体ＤＮＡを
作成し、該組換え体ＤＮＡを保持する微生物を培地に培
養し、培養物中に安定型コレステロール・エステラーゼ
を生成蓄積させ、該培養物から安定型コレステロール・
エステラーゼを採取することを特徴とする安定型コレス
テロール・エステラーゼの製造方法に関する。以下、本
発明を詳細に説明する。

【００１４】配列番号１または配列番号４のアミノ酸配
列を有するコレステロール・エステラーゼをコードする
ＤＮＡは、シュードモナス・アエルギノーザATCC31156
、シュードモナス・アエルギノーサTE3285［アーカイ
ブス オブ バイオケミストリー アンド バイオフィ
ジクス（Arch.Biochem.Biophys.),296巻,505頁(199
3)］、シュードモナス・フルオレッセンス、ストレプト
マイセス・グリセウス、ストレプトマイセス・オーレオ
ファシエンス［アグリカルチュラル アンド バイオロ
ジカル ケミストリー（Agr.Biol.Chem.）,40 巻,1605
頁(1976)］等の微生物の染色体から下記のようにクロー
ニングして得ることができる。染色体DNA の単離は常
法、例えばマームー（Marmur）の方法〔ジャーナル オ
ブ モレキュラーバイオロジー（J. Mol. Biol.), 3 巻
, 208頁 (1961年) 〕, スミス（Smith）らの方法〔メ
ソズ イン エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y ），12巻, Part A, 545頁 (1967年) , アカデミック
プレス（Academic Press），ニューヨーク（New Yor
k）〕等により行うことができる。

【００１５】こうして単離された染色体DNA およびベク
ターDNA を制限酵素で切断した後、両者を混合し、DNA
リガーゼで処理することにより、染色体DNA のベクター
DNAへの組込みを行い、組換え体ＤＮＡを得る。ここで
用いられるベクターDNA としては、エシェリヒア・コリ
を宿主とすることが可能なプラスミドであればよく、pB
R322、pUC18 、pUC19 、pUC118、pUC119、pHSG298 、pH
SG299 、pHSG396 、pHSG397 、pHSG398 、pHSG399 、pT
V118N 、pTV119N 、pSTV28、pSTV29、 pTWV228、pTWV22
9 、pHY300PLK 、pBluescriptIISK(+)、pBluescriptIIS
K(-)、pBluescriptIIKS(+)、pBluescriptIIKS(-)等があ
げられる。とりわけpUC19 、pBluescriptIIKS(+)を用い
ることが好ましい。また制限酵素としては、例えばBamH
I, Sau3AI, BglII, EcoRI, PstI, HindIII等があげられ
る。

【００１６】ついで上記の方法で得られた組換え体DNA
を、例えばモレキュラー クローニング（Molecular C
loning）、コールド スプリング ハーバー ラボラト
リー（Cold Spring Harbor Laboratory)刊、 1982 年記
載の方法によってエシェリヒア・コリに導入することが
できる。導入された菌株からのコレステロール・エステ
ラーゼをコードする遺伝子を含有する組換え体DNA の選
択は、公知のハイブリダイゼーションによる方法、抗コ
レステロール・エステラーゼ抗体を用いる方法、ハロー
形成等によるコレステロール・エステラーゼ活性の発現
を検出する方法等のいずれの方法でも行うことができ
る。

【００１７】次に、安定型コレステロール・エステラー
ゼをコードするＤＮＡは、例えばラウング（Leung ）ら
の方法〔テクニック（ Technique）, 1 巻 , 11 頁(198
9 年)〕、キャドウェル（Cadwell ）とジョイス（Joyce
）の方法〔PCR メソズ アンド アプリケーションズ
（PCR Methods and Applications）, 2 巻 , 28 頁(199
2 年) 〕等を参考にして次の操作を行うことにより得る
ことができる。すなわち、前述の天然のコレステロール
・エステラーゼをコードするＤＮＡを鋳型として、忠実
度の低い条件下でPCR 反応を行い、増幅してくる変異を
含む遺伝子をベクターDNA へ組込み、得られる組換え体
DNA をエシェリヒア・コリに導入する。栄養(LB)培地上
で生じたコロニーをフィルターに転写し、溶菌した後、
それを元の酵素が完全に失活する条件で熱処理をする。
該フィルターを発色性基質パルミチン酸パラニトロフェ
ノールを含む寒天上に放置し、残存酵素活性により黄色
に発色するコロニーを選択する。該コロニーから耐熱性
の向上した安定型コレステロール・エステラーゼをコー
ドする遺伝子を単離し、その塩基配列を決定し、アミノ
酸配列を明らかにすることにより、安定型コレステロー
ル・エステラーゼのアミノ酸配列を同定することができ
る。

【００１８】得られた安定型コレステロール・エステラ
ーゼをコードする遺伝子を例えば、pUC19 、pUC119、pE
G400、pHSG396 、pHSG397 、pHSG398 、pBluescriptIIK
S(+)、pBluescriptIIKS(-)、pHY300PLK 、pIJ702好適に
はpUC19 やpEG400〔ジャーナル オブ バクテリオロジ
ー（ J. Bacteriol.）, 172 巻 , 2392 頁(1990 年 )〕
等の適当な発現ベクターに挿入し、得られた組換え体Ｄ
ＮＡを宿主微生物で発現させることができる。宿主微生
物としては、エシェリヒア属、シュードモナス属等のグ
ラム陰性細菌やバチルス属、ストレプトマイセス属等の
グラム陽性細菌等があげられるが、とりわけエシェリヒ
ア・コリやシュードモナス・アエルギノーサ等が好適で
ある。

【００１９】組換え体ＤＮＡをシュードモナス・アエル
ギノーザへ導入する方法としては接合法があげられる。
すなわち安定型コレステロール・エステラーゼをコード
する遺伝子を運ぶ組換え体ＤＮＡを持つエシェリヒア・
コリとヘルパープラスミドpRK2013 ［プロシーディング
オブ ナショナルアカデミー サイエンス ユーエス
エー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),76 巻,1648 頁(1979)］
を持つシュードモナス・アエルギノーザとを混合培養す
ることによって、シュードモナス・アエルギノーザに安
定型コレステロール・エステラーゼをコードする遺伝子
を運ぶ組換え体ＤＮＡを導入する。また、バチルス属の
宿主微生物へ導入する場合はモレキュラー ジェネラル
ジェネティックス(Mol.Gen.Genet.),168巻,111頁(197
9)記載のプロトプラスト法で行い、ストレプトマイセス
属の宿主微生物へ導入する場合はカレント トピックス
オブ マイクロバイオロジー アンド イムノロジー
(Curr.Topics Microbol.Immunol.),96巻,69 頁(1982)記
載のプロトプラスト法で行う。

【００２０】このようにして得られた組み換え体ＤＮＡ
を保持する微生物を、酵素生産に適した以下のような培
地の組成、培養方法、培養温度、培養時間等の諸条件下
で培養し、その培養上清あるいは菌体破砕液より耐熱性
の向上したコレステロール・エステラーゼを得ることが
できる。

【００２１】本発明で使用する培地は、炭素源、窒素
源、無機物、その他の栄養素を程良く含有する培地なら
ば合成培地または天然培地のいずれも使用可能である。

【００２２】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、シュークロース、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜など
の種々の炭水化物、またはグリセロール、ソルビトー
ル、マンニトールなどの種々の糖アルコールを用いるこ
とができ、酢酸、乳酸、ピルビン酸、フマール酸、クエ
ン酸等の各種有機酸、メタノール、エタノール等の各種
アルコール類、エチレングリコール、プロピレングリコ
ール等の各種グリコール、n-ヘキサデカン、n-ペンタデ
カン、ｎ−ドデカンおよびそれらの混合物等の非芳香族
炭化水素や各種アミノ酸も使用可能であるが、とりわけ
グルコースが好ましい。

【００２３】窒素源としては、アンモニアあるいは塩化
アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無
機および有機アンモニウム塩、アミノ酸およびその他の
窒素化合物ならびにペプトン、酵母エキス、NZ- アミ
ン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水
分解物、フィシュミールあるいはその消化物、脱脂大豆
あるいはその消化物などの窒素性有機物質など種々のも
のが使用可能であるが、とりわけペプトン、酵母エキス
および肉エキスの混合物が好ましい。

【００２４】無機物としては、第一リン酸カリウム、第
二リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸マンガン、塩化カリウムおよび炭酸カルシウム
等を使用するが、とりわけ第一リン酸カリウム、塩化カ
リウムおよび硫酸マグネシウムの混合物が好ましい。

【００２５】本発明に使用する微生物が生育のため、あ
るいは安定型コレステロール・エステラーゼの生産のた
めに特定の栄養素を必要とする場合はその栄養素を適当
量培地に添加しなければならないが、この種の栄養素は
前記の窒素源として例示した窒素性有機物などに含まれ
て加えられる場合もある。

【００２６】例えば、コレステロールの各種エステルを
少量添加することによって、生産性を飛躍的に増大させ
ることができる。ここで使用するエステルとしてはステ
アリル、パルミチル、ラウリル、オレイル、リノレイル
等のエステルが挙げられるが、とりわけリノレイルエス
テルが好ましく用いられる。これらのエステルあるいは
これに類似のエステルを含有すると思われる天然物、例
えばコーンスティープリカー、ソイビーンミール、魚
粕、油粕等を該エステルの代わりに添加してもよい。

【００２７】培養は振とう培養あるいは通気撹拌培養な
どの好気的条件下での培養方法により行う。培養温度は
２０〜４０℃が適当である。培地のpHは３〜９の範囲で
行うことができるが、pH６〜８の中性域に保持すること
が望ましい。通常１〜３日間の培養で培養液中に安定型
コレステロール・エステラーゼが生成蓄積される。

【００２８】培養終了後、培養液からの安定型コレステ
ロール・エステラーゼの単離精製は、例えば次のように
して行う。培養液からろ過あるいは遠心分離によって菌
体を除いて培養ろ液を得る。このろ液に硫酸アンモニウ
ムを投入して90％濃度とし、撹拌して酵素を沈澱させ、
粗酵素を得る。この沈澱を10mMリン酸緩衝液(pH 7.3)に
対して透析して脱塩する。その後、等量の冷アセトンを
添加し、ろ過あるいは遠心分離によって沈澱を採取す
る。この操作によって、色素等を除去する。沈澱を10mM
リン酸緩衝液(pH 7 .3) に溶解した後、陰イオン交換樹
脂例えばDEAEセルロースを充填したカラムに通塔し、該
酵素を吸着させる。その後、10mMリン酸緩衝液(pH 7.3)
/1M NaCl溶液をカラム容量の２〜５倍量通塔し、余分な
タンパク質等を除去する。再び10mMリン酸緩衝液(pH 7.
3)を通塔してカラムを平衡化した後、10mMリン酸緩衝液
(pH 7.3)/0.1％トリトンＸ-100溶液及び 10mM リン酸緩
衝液(pH 7.3)/0.1％トリトンＸ-100/1M NaCl溶液による
グラジエント溶出を行う。溶出液中の活性画分を合わ
せ、限外ろ過膜による濃縮と10mMリン酸緩衝液(pH 7.3)
による希釈を繰り返し、脱塩、脱トリトンＸ-100を行っ
た後、凍結乾燥して精製標品を得る。菌体から安定型コ
レステロール・エステラーゼを単離精製するには、培養
液からろ過あるいは遠心分離によって菌体を採取し、得
られた菌体をセルミルを用いて破砕し、適当量の10mMリ
ン酸緩衝液(pH 7.3)に懸濁し、遠心分離して得られた上
澄み液について培養ろ液と同様にして行う。

【００２９】本発明において、コレステロール・エステ
ラーゼ活性の測定は、(1) コレステロール・エステルを
基質とするコレステロール・エステラーゼ反応により遊
離したコレステロールをコレステロール・オキシダーゼ
で酸化し、生成する過酸化水素をペルオキシダーゼで比
色定量する方法［ジャーナル オブ リピッドリサーチ
（J.Lipid Res.）,19 巻,913頁(1978)］、(2) 標識コレ
ステロールエステルを基質とし、遊離する脂肪酸の放射
能を測定する方法［ジャーナル オブ バイオロジカル
ケミストリー(J.Biol.Chem.),250巻,4505 頁(197
5)］、(3) パラニトロフェノールの脂肪酸エステルを基
質とし、生成するパラニトロフェノールを比色定量する
方法［ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリ
ー(J. Biol.Chem.), 266巻,18135頁(1991)］等を用いる
ことが可能であるが、以下に述べる実施例および試験例
においては次の二つの方法を用いて行った。（活性測定
方法１） 酵素を、10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.0 ）、
0.2%トリトンX-100 、0.17mMパルミチン酸パラニトロフ
ェノールを含む反応液中で37℃でインキュベートし、酵
素反応によって生成するパラニトロフェノールの量を40
0nm の吸光度を経時的に分光光度計で測定することによ
り行った。（活性測定方法2 ） 酵素を、基質としてリ
ノール酸コレステロールを最終濃度0.17mMになるように
添加した遊離型コレステロール測定用試薬（デタミナー
FC555 、協和メデックス社製）3ml 中に添加し、37℃で
インキュベートし、酵素反応によって遊離するコレステ
ロールに基づく555nm の吸光度を経時的に分光光度計で
測定することにより行った。酵素活性は、これらの条件
下で1 分間に1 μmolの基質を加水分解できる酵素量を1
単位と定義した。

【００３０】以下に本発明を実施例および試験例で説明
する。

【００３１】

【実施例】

実施例１−１ コレステロール・エステラーゼ遺伝子の
単離 (1) 染色体DNA の単離とベクターへの挿入 シュードモナス・アエルギノーザATCC31156 をLB培地
（グルコース1g/l、トリプトン10g/l 、酵母エキス5g/
l、塩化ナトリウム5g/l、pH7.2 ）300ml 中、28℃で16
時間振とう培養して得られた菌体を集菌洗浄後、コール
マン（Coleman)らの方法〔ジャーナル オブ バクテリ
オロジー(J. Bacteriol.), 153巻, 909 頁(1983 年 )〕
でフェノール処理し、染色体DNA 約2mg を得た。この染
色体DNA3μgをとり、制限酵素BamHI で完全に切断し
た。この分解産物をショ糖密度勾配遠心分離にかけ6-11
kbの大きさのDNA 断片を分取した。またベクターとして
使用するpBluescriptII KS(+)(Stratagene社製、USA)3
μg をBamHI で完全に切断した。両切断物をDNA ライゲ
ーションキット（宝酒造製）を用いて連結した。

【００３２】(2) コレステロールエステラーゼ遺伝子を
含むプラスミドの単離 エシェリヒア・コリXL1-Blue株をLB培地40mlにて対数増
殖中期（OD660=約0.4）まで生育させた後、0.1M塩化カ
ルシウム溶液で洗浄後、同溶液1ml に再懸濁させた。こ
の懸濁液に(1) で得たDNA 溶液を加え、0 ℃で30分間保
持した後、37℃で20分間加熱してDNA を細胞内に取り込
ませた。この懸濁液をLB培地5ml に接種し、2 時間振と
う培養した。菌体を集菌洗浄後、20μg /ml のアンピシ
リンを含むLB培地プレートにプレート当たり約100 コロ
ニーになるように塗布し、30℃で1 日培養し、合計約26
00のコロニーを得た。プレート上のコロニーをナイロン
膜（ハイボンドＮ、Amersham社製) 上に転写した。膜を
アルカリ-SDSで処理後、精製酵素のN 末端アミノ酸配列
に対応する合成DNA プローブ（5'-ACCTACACCCAGACCAAGT
ACCCGATCGTCCTGGCCCACGGCATGCTGGGCTTC-3'）〔配列番号
２〕を放射性³²P でラベルしたものとハイブリダイズす
るコロニーを選択した。ハイブリダイズしたコロニーか
らプラスミドDNA を調製し、その塩基配列をSequenase
Version 2.0（USB 社製、東洋紡績販売）を用いて解析
した結果、上記N 末端アミノ酸配列を含む全長311 のア
ミノ酸をコードするコレステロール・エステラーゼ遺伝
子(CHER1) を見いだすことができた〔配列番号３〕。ま
たそのすぐ下流には、明確な機能は不明であるが、活性
なコレステロール・エステラーゼの生産に必須な遺伝子
（CHER2)も存在していた。それ故、この目的とするプラ
スミドをpAK002と命名した。そのコレステロール・エス
テラーゼ（CHER1 ）を構成するアミノ酸配列〔配列番号
４〕は、配列番号１のアミノ酸配列とは１７６位がグル
タミンである点で異なる。

【００３３】(3) コレステロール・エステラーゼ発現用
および変異処理用プラスミドの構築 次に余分な配列を出来るだけ除くために、pAK002をNruI
で切断後、その切断部位にHindIII リンカー（宝酒造
製）を挿入しHindIII 部位に改変した。そしてHindIII
とSmaIで切断後、同じくHindIII とSmaIで切断したpUC1
9 およびpEG400にDNA ライゲーションキットを用いて連
結し、エシェリヒア・コリでの発現用プラスミドpAK024
およびシュードモナス・アルギノーザでの発現用プラス
ミドpAK047を得た。

【００３４】次に更に余分な配列を除きコレステロール
・エステラーゼ遺伝子部分のみを切り出すために、pAK0
47をHindIII で切断後Bal31 ヌクレアーゼでN 末端から
DNA鎖を約400bp 除去し、HindIII リンカー（宝酒造
製）を用いてHindIII 部位を創設し、さらにC 末端下流
に部位特異的変異キット（Mutan-K 、宝酒造製）を用い
てBamHI 部位を導入し、エシェリヒア・コリでの発現用
プラスミドpAK032を得た。次にコレステロール・エステ
ラーゼ遺伝子部分（CHER1 ）のみに変異を導入するため
に、プラスミドpAK032からHindIII とBamHI でコレステ
ロール・エステラーゼ遺伝子を含む約1kb の断片を切り
出しプラスミドpBluescript II SK(-)のHindIII とBamH
I 部位に導入し、変異処理用プラスミドpAK033を得た。
これら各種のプラスミドの制限酵素地図は、図1 にまと
めて示した。

【００３５】１−２，安定型コレステロール・エステラ
ーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡの造成 (1) ランダム変異法による熱安定性コレステロール・エ
ステラーゼ遺伝子を含む組換え体ＤＮＡの取得 コレステロール・エステラーゼ遺伝子を含むプラスミド
pAK033をScaIで切断したもの1 μg を鋳型として、リバ
ースプライマー１（5'-CAGGAAACAGCTATGACCATG-3' ）
〔配列番号５〕とKSプライマー２（5'-CTCGAGGTCGACGGT
ATCGA-3'）〔配列番号６〕を用いてCadwell とJoyce 方
法〔PCR Methods and Applications, 2 巻, 28 頁(1992
年) 〕を用いてコレステロール・エステラーゼ遺伝子
を増幅した。増幅されて変異を導入された約1kb の断片
をHindIII とBamHI で切断しゲル電気泳動で精製した
後、同じくHindIII とBamHI で切断したpAK032とDNA ラ
イゲーションキットを用いて結合させた後、そのDNA 溶
液を用いてエシェリヒア・コリXL1Blue を形質転換し、
LB培地上に塗布して20枚のプレート上に総計約2600個の
コロニーを得た。コロニーをナイロン膜に転写した後、
その膜を2mg/mlのリゾチームと0.2%のトリトンX-100 を
含む溶液中で室温で30分間処理した後、その膜を70℃の
オーブン中で45分間加熱処理した。この時、膜が乾燥し
ないように水を含ませた濾紙上で膜を処理した。処理し
た膜を酵素の基質である1mM のパルミチン酸パラニトロ
フェノールを含む0.8%アガロースよりなるプレート上に
乗せ室温で約30分間インキュベートし、酵素活性残存の
指標である黄色に発色するコロニーを2 株（TR6 とTR8
）得、その保持するプラスミドをそれぞれpTR6とpTR8
と命名した。

【００３６】どのような変異によって熱安定性がもたら
されたかを明らかにするために、pTR6とpTR8より単鎖DN
A を調製し、Sequenase Version 2.0 を用いて塩基配列
を決定した。その結果、pTR6の場合は配列番号３の塩基
配列において、869 番目のＴがＣに置換されることによ
って、配列番号４のアミノ酸配列における264 番目のロ
イシンのコドンであるCTG が、プロリンのコドンである
CCG に〔配列番号７参照〕、pTR8の場合は、配列番号３
における566 番目のＡがＧに置換されることによって、
配列番号４における163 番目のアスパラギンのコドンで
あるAAC がセリンのコドンであるAGC に〔配列番号８参
照〕置換されていることが判明した。これらの結果か
ら、163 番目と264 番目の位置のアミノ酸配列が熱安定
性に重要な役割を果たすことが明らかとなった。

【００３７】(2) 変異の組み合わせによる熱安定性コレ
ステロール・エステラーゼ遺伝子を含む組換え体DNA の
取得 そこで両変異部位を合わせ持つ変異酵素を作製するため
に、pTR6からPstIとBamHI で切断して生成する約150bp
の断片とpTR8からHindIII とPstIで切断して生成する約
850bp をアガロースゲル電気泳動にて取得し、それらを
HindIII とBamHI で切断したpAK032と混ぜ合わせDNA ラ
イゲーションキットで結合させた後、大腸菌XL1Blue を
形質転換し、配列番号３の塩基配列において566 番目と
869 番目の位置の両変異部位を同時に合わせ持つpTR10
〔配列番号９〕を得た。該塩基配列で示されるコレステ
ロールエステラーゼは、配列番号４のアミノ酸配列にお
いて、163 番目にセリンを264 番目にプロリンを持つ。

【００３８】実施例２ 安定型コレステロール・エステラーゼのエシェリヒア・
コリおよびシュードモナス・アエルギノーザにおける生
産 エシェリヒア・コリXL1Blue/pTR6を50μg/mlのアンピシ
リンを含むLB培地80ml中で、37℃で約３時間振とう培養
した。そしてイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（IPTG）を最終濃度1mM になるように添加し、更
に3 時間振とう培養を続けた。この培養液から遠心分離
(12,000rpm、15分）にて菌体を集めた後、40mlの10mMト
リス塩酸緩衝液（pH7.5)でその菌体を洗浄した。この菌
体を同緩衝液4ml に懸濁した後、氷中で超音波処理（20
Hz、5 分）により菌体を破砕し、遠心分離（12,000rpm
、15分）で上清を採取し、酵素抽出液を得た。エシェ
リヒア・コリXL1Blue/pTR8およびXL1Blue/pTR10 につい
ても同様の操作を行い、それぞれ酵素抽出液を得た。

【００３９】シュードモナス・アエルギノーザで発現さ
せる場合、pTR6、pTR8、pTR10 より安定型コレステロー
ル・エステラーゼ遺伝子をHindIII とBamHI で切り出
し、pAK047のHindIII とBamHI 部位に挿入することによ
り安定型コレステロール・エステラーゼ発現用プラスミ
ドpTR6P（ＦＥＲＭ ＢＰ−４５１５） 、pTR8P（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４５１４） 、pTR10P（ＦＥＲＭ ＢＰ−
４５１３）を得、それをシュードモナス・アエルギノー
ザPAO1161 に導入することにより酵素生産菌株を得た。

【００４０】このようにして得たシュードモナス・アエ
ルギノーザPAO1161/pTR6P を700 μg/mlのストレプトマ
イシンを含むLB培地80ml中で、30℃で約20時間振とう培
養した。この培養液から遠心分離（12,000rpm 、15分）
で培養上清を採取し、酵素溶液を得た。シュードモナス
・アエルギノーザPAO1161/pTR8P およびPAO1161/pTR10P
についても同様の操作を行い、それぞれ酵素溶液を得る
ことができた。それぞれの場合の安定型コレステロール
・エステラーゼの生産性を第１表にまとめて示す。

【００４１】

【表１】

【００４２】試験例 安定型コレステロール・エステラーゼの安定性の比較。 安定型または天然のコレステロール・エステラーゼの熱
安定性、界面活性剤安定性、酸化剤安定性、有機溶媒安
定性、アルカリ安定性を次のように比較した。

【００４３】(1) 熱安定性 シュードモナス・アエルギノーザおよびその組換え株が
生産する天然型コレステロール・エステラーゼおよび安
定型コレステロール・エステラーゼの熱安定性について
測定し、結果を比較した。酵素活性の測定は、各酵素を
トリス−塩酸緩衝液(pH7.0) 中で種々の温度で30分間加
熱処理後の残存活性を前記の方法2 により測定すること
により行った。測定により得られた残存活性を第２表に
示す。

【００４４】

【表２】

【００４５】第２表によれば、安定型コレステロール・
エステラーゼは３種類とも、天然型コレステロール・エ
ステラーゼよりも熱安定性が増加していた。

【００４６】(2) 界面活性剤安定性 シュードモナス・アエルギノーザおよびその組換え株が
生産する天然型コレステロール・エステラーゼおよび安
定型コレステロール・エステラーゼの、各種濃度のドデ
シル硫酸ナトリウム(SDS) 存在下での活性を上記の酵素
活性測定方法1 により測定し、比較した。測定より得ら
れた相対活性を第３表に示す。

【００４７】

【表３】

【００４８】第３表によれば、安定型コレステロール・
エステラーゼは3 種類とも、天然型コレステロール・エ
ステラーゼよりもSDS 存在下で高い活性を保持し、界面
活性剤存在下での酵素の安定性が増加していた。

【００４９】(3) 酸化剤安定性 シュードモナス・アエルギノーザおよびその組換え株が
生産する天然型コレステロール・エステラーゼおよび安
定型コレステロール・エステラーゼの酸化剤に対する安
定性について測定し、比較した。測定は、各酵素を最終
濃度0.5Mの過酸化水素溶液中で、37℃で適当な時間処理
したのち、100 単位のカタラーゼで過酸化水素を分解し
たのち、残存活性を方法1 により測定することにより行
った。測定により得られた残存活性を第４表に示す。

【００５０】

【表４】

【００５１】第４表によれば、安定型コレステロール・
エステラーゼは３種類とも天然型コレステロール・エス
テラーゼよりも高い酸化剤安定性を示した。 (4) 有機溶媒安定性 エシェリヒア・コリおよびその組換え株が生産する天然
型コレステロール・エステラーゼおよび安定型コレステ
ロール・エステラーゼの、各種濃度のアセトニトリル存
在下での活性を上記の酵素活性測定方法1 により測定
し、比較した。測定より得られた相対活性を第５表に示
す。

【００５２】

【表５】

【００５３】第５表によれば、安定型コレステロール・
エステラーゼは３種類とも、天然型コレステロール・エ
ステラーゼよりもアセトニトリル存在下で高い活性を保
持し、有機溶媒存在下での安定性が増加していた。 (5) アルカリ安定性 シュードモナス・アエルギノーザおよびその組換え株が
生産するコレステロール・エステラーゼおよび安定型コ
レステロール・エステラーゼのアルカリ条件下における
安定性及び活性を測定し、比較した。測定は、各酵素を
各種pHの緩衝液中で、37℃、 10 分間処理した後、基質
であるリノール酸コレステロールを0.17mMになるように
添加し、10分間反応させた。100 ℃で10分間加熱するこ
とによって、酵素を失活させ、1N塩酸でpH7.0 にした
後、酵素反応によって生成した遊離型コレステロールを
方法２に基づいて測定した。測定によって得られた結果
を第６表に示す。

【００５４】

【表６】

【００５５】第６表によれば、ＴＲ６、ＴＲ１０の安定
型コレステロール・エステラーゼが天然型コレステロー
ル・エステラーゼよりもアルカリ条件下で高い活性を示
した。尚、pH7.0 およびpH8.0 の場合は 50mM リン酸ナ
トリウム緩衝液を、pH9.0 、pH10.0およびpH11.0の場合
は、50mMほう酸/ 炭酸ナトリウム緩衝液を、pH12.0およ
びpH13.0の場合は、50mMリン酸二ナトリウム/NaOH 緩衝
液を用いた。

【００５６】

【発明の効果】本発明により、高熱条件下、界面活性
剤、酸化剤、有機溶媒存在下、アルカリ条件下などの種
々の苛酷な条件下での安定性の向上した安定型コレステ
ロール・エステラーゼおよびその製造法が提供される。

【００５７】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：311 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-26..-1 特徴を決定した方法：S 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..285 特徴を決定した方法：S

【００５８】 配列： MetLysLysLysSerLeu-21 LeuProLeuGlyLeuAlaIleGlyLeuAla SerLeuAlaAlaSerProLeuIleGlnAla -1 SerThrTyrThrGlnThrLysTyrProIle ValLeuAlaHisGlyMetLeuGlyPheAsp 20 AsnIleLeuGlyValAspTyrTrpPheGly IleProSerAlaLeuArgArgAspGlyAla 40 GlnValTyrValThrGluValSerGlnLeu AspThrSerGluValArgGlyGluGlnLeu 60 LeuGlnGlnValGluGluIleValAlaLeu SerGlyGlnProLysValAsnLeuIleGly 80 HisSerHisGlyGlyProThrIleArgTyr ValAlaAlaValArgProAspLeuIleAla 100 SerAlaThrSerValGlyAlaProHisLys GlySerAspThrAlaAspPheLeuArgGln 120 IleProProGlySerAlaGlyGluAlaIle LeuSerGlyLeuValAsnSerLeuGlyAla 140 LeuIleSerPheLeuSerSerGlySerThr GlyThrGlnAsnSerLeuGlySerLeuGlu 160 SerLeuAsnSerGluGlyAlaAlaArgPhe AsnAlaLysTyrProHisGlyValProThr 180 SerAlaCysGlyGluGlyAlaTyrLysVal AsnGlyValSerTyrTyrSerTrpSerGly 200 SerSerProLeuThrAsnPheLeuAspPro SerAspAlaPheLeuGlyAlaSerSerLeu 220 ThrPheLysAsnGlyThrAlaAsnAspGly LeuValGlyThrCysSerSerHisLeuGly 240 MetValIleArgAspAsnTyrArgMetAsn HisLeuAspGluValAsnGlnValPheGly 260 LeuThrSerLeuPheGluThrSerProVal SerValTyrArgGlnHisAlaAsnArgLeu 280 LysAsnAlaSerLeu

【００５９】配列番号：2 配列の長さ：54 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： ACCTACACCC AGACCAAGTA CCCGATCGTC CTGGCCCACG GCATGCTGGG CTTC

【００６０】配列番号：3 配列の長さ：936 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..78 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：79..933 特徴を決定した方法：E

【００６１】 配列： ATGAAGAAGA AGTCTCTGCT CCCCCTCGGC CTGGCCATCG GCCTCGCCTC 50 TCTCGCTGCC AGCCCTCTGA TCCAGGCCAG CACCTACACC CAGACCAAAT 100 ACCCCATCGT GCTGGCCCAC GGCATGCTCG GCTTCGACAA CATCCTCGGG 150 GTCGACTACT GGTTCGGCAT TCCCAGCGCC TTGCGCCGTG ACGGTGCCCA 200 GGTCTACGTC ACCGAAGTCA GCCAGTTGGA CACCTCGGAA GTCCGCGGCG 250 AGCAGTTGCT GCAACAGGTG GAGGAAATCG TCGCCCTCAG CGGCCAGCCC 300 AAGGTCAACC TGATCGGCCA CAGCCACGGC GGGCCGACCA TCCGCTACGT 350 CGCCGCCGTA CGTCCCGACC TGATCGCTTC CGCCACCAGC GTCGGCGCCC 400 CGCACAAGGG TTCGGACACC GCCGACTTCC TGCGCCAGAT CCCACCGGGT 450 TCGGCCGGCG AGGCAATCCT CTCCGGGCTG GTCAACAGCC TCGGCGCGCT 500 GATCAGCTTC CTTTCCAGCG GCAGCACCGG TACGCAGAAT TCACTGGGCT 550 CGCTGGAGTC GCTGAACAGC GAGGGGGCCG CGCGCTTCAA CGCCAAGTAC 600 CCGCAGGGCG TCCCCACCTC GGCCTGCGGC GAGGGCGCCT ACAAGGTCAA 650 CGGCGTGAGC TATTACTCCT GGAGCGGTTC CTCGCCGCTG ACCAACTTCC 700 TCGATCCGAG CGACGCCTTC CTCGGCGCCT CGTCGCTGAC CTTCAAGAAC 750 GGCACCGCCA ACGACGGCCT GGTCGGCACC TGCAGTTCGC ACCTGGGCAT 800 GGTGATCCGC GACAACTACC GGATGAACCA CCTGGACGAG GTGAACCAGG 850 TCTTCGGCCT CACCAGCCTG TTCGAGACCA GCCCGGTCAG CGTCTACCGC 900 CAGCACGCCA ACCGCCTGAA GAACGCCAGC CTGTAG

【００６２】配列番号：４ 配列の長さ：311 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：-26..-1 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..285 特徴を決定した方法：E

【００６３】 配列： MetLysLysLysSerLeu-2１ LeuProLeuGlyLeuAlaIleGlyLeuAla SerLeuAlaAlaSerProLeuIleGlnAla -1 SerThrTyrThrGlnThrLysTyrProIle ValLeuAlaHisGlyMetLeuGlyPheAsp 20 AsnIleLeuGlyValAspTyrTrpPheGly IleProSerAlaLeuArgArgAspGlyAla 40 GlnValTyrValThrGluValSerGlnLeu AspThrSerGluValArgGlyGluGlnLeu 60 LeuGlnGlnValGluGluIleValAlaLeu SerGlyGlnProLysValAsnLeuIleGly 80 HisSerHisGlyGlyProThrIleArgTyr ValAlaAlaValArgProAspLeuIleAla 100 SerAlaThrSerValGlyAlaProHisLys GlySerAspThrAlaAspPheLeuArgGln 120 IleProProGlySerAlaGlyGluAlaIle LeuSerGlyLeuValAsnSerLeuGlyAla 140 LeuIleSerPheLeuSerSerGlySerThr GlyThrGlnAsnSerLeuGlySerLeuGlu 160 SerLeuAsnSerGluGlyAlaAlaArgPhe AsnAlaLysTyrProGlnGlyValProThr 180 SerAlaCysGlyGluGlyAlaTyrLysVal AsnGlyValSerTyrTyrSerTrpSerGly 200 SerSerProLeuThrAsnPheLeuAspPro SerAspAlaPheLeuGlyAlaSerSerLeu 220 ThrPheLysAsnGlyThrAlaAsnAspGly LeuValGlyThrCysSerSerHisLeuGly 240 MetValIleArgAspAsnTyrArgMetAsn HisLeuAspGluValAsnGlnValPheGly 260 LeuThrSerLeuPheGluThrSerProVal SerValTyrArgGlnHisAlaAsnArgLeu 280 LysAsnAlaSerLeu

【００６４】配列番号：5 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマー 配列： CAGGAAACAG CTATGACCAT G

【００６５】配列番号：6 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマー 配列： CTCGAGGTCG ACGGTATCGA

【００６６】配列番号：7 配列の長さ：936 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..78 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：79..933 特徴を決定した方法：E

【００６７】 配列： ATGAAGAAGA AGTCTCTGCT CCCCCTCGGC CTGGCCATCG GCCTCGCCTC 50 TCTCGCTGCC AGCCCTCTGA TCCAGGCCAG CACCTACACC CAGACCAAAT 100 ACCCCATCGT GCTGGCCCAC GGCATGCTCG GCTTCGACAA CATCCTCGGG 150 GTCGACTACT GGTTCGGCAT TCCCAGCGCC TTGCGCCGTG ACGGTGCCCA 200 GGTCTACGTC ACCGAAGTCA GCCAGTTGGA CACCTCGGAA GTCCGCGGCG 250 AGCAGTTGCT GCAACAGGTG GAGGAAATCG TCGCCCTCAG CGGCCAGCCC 300 AAGGTCAACC TGATCGGCCA CAGCCACGGC GGGCCGACCA TCCGCTACGT 350 CGCCGCCGTA CGTCCCGACC TGATCGCTTC CGCCACCAGC GTCGGCGCCC 400 CGCACAAGGG TTCGGACACC GCCGACTTCC TGCGCCAGAT CCCACCGGGT 450 TCGGCCGGCG AGGCAATCCT CTCCGGGCTG GTCAACAGCC TCGGCGCGCT 500 GATCAGCTTC CTTTCCAGCG GCAGCACCGG TACGCAGAAT TCACTGGGCT 550 CGCTGGAGTC GCTGAACAGC GAGGGGGCCG CGCGCTTCAA CGCCAAGTAC 600 CCGCAGGGCG TCCCCACCTC GGCCTGCGGC GAGGGCGCCT ACAAGGTCAA 650 CGGCGTGAGC TATTACTCCT GGAGCGGTTC CTCGCCGCTG ACCAACTTCC 700 TCGATCCGAG CGACGCCTTC CTCGGCGCCT CGTCGCTGAC CTTCAAGAAC 750 GGCACCGCCA ACGACGGCCT GGTCGGCACC TGCAGTTCGC ACCTGGGCAT 800 GGTGATCCGC GACAACTACC GGATGAACCA CCTGGACGAG GTGAACCAGG 850 TCTTCGGCCT CACCAGCCCG TTCGAGACCA GCCCGGTCAG CGTCTACCGC 900 CAGCACGCCA ACCGCCTGAA GAACGCCAGC CTGTAG

【００６８】配列番号：8 配列の長さ：936 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..78 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：79..933 特徴を決定した方法：E

【００６９】 配列： ATGAAGAAGA AGTCTCTGCT CCCCCTCGGC CTGGCCATCG GCCTCGCCTC 50 TCTCGCTGCC AGCCCTCTGA TCCAGGCCAG CACCTACACC CAGACCAAAT 100 ACCCCATCGT GCTGGCCCAC GGCATGCTCG GCTTCGACAA CATCCTCGGG 150 GTCGACTACT GGTTCGGCAT TCCCAGCGCC TTGCGCCGTG ACGGTGCCCA 200 GGTCTACGTC ACCGAAGTCA GCCAGTTGGA CACCTCGGAA GTCCGCGGCG 250 AGCAGTTGCT GCAACAGGTG GAGGAAATCG TCGCCCTCAG CGGCCAGCCC 300 AAGGTCAACC TGATCGGCCA CAGCCACGGC GGGCCGACCA TCCGCTACGT 350 CGCCGCCGTA CGTCCCGACC TGATCGCTTC CGCCACCAGC GTCGGCGCCC 400 CGCACAAGGG TTCGGACACC GCCGACTTCC TGCGCCAGAT CCCACCGGGT 450 TCGGCCGGCG AGGCAATCCT CTCCGGGCTG GTCAACAGCC TCGGCGCGCT 500 GATCAGCTTC CTTTCCAGCG GCAGCACCGG TACGCAGAAT TCACTGGGCT 550 CGCTGGAGTC GCTGAGCAGC GAGGGGGCCG CGCGCTTCAA CGCCAAGTAC 600 CCGCAGGGCG TCCCCACCTC GGCCTGCGGC GAGGGCGCCT ACAAGGTCAA 650 CGGCGTGAGC TATTACTCCT GGAGCGGTTC CTCGCCGCTG ACCAACTTCC 700 TCGATCCGAG CGACGCCTTC CTCGGCGCCT CGTCGCTGAC CTTCAAGAAC 750 GGCACCGCCA ACGACGGCCT GGTCGGCACC TGCAGTTCGC ACCTGGGCAT 800 GGTGATCCGC GACAACTACC GGATGAACCA CCTGGACGAG GTGAACCAGG 850 TCTTCGGCCT CACCAGCCTG TTCGAGACCA GCCCGGTCAG CGTCTACCGC 900 CAGCACGCCA ACCGCCTGAA GAACGCCAGC CTGTAG

【００７０】配列番号：9 配列の長さ：936 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴： 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：1..78 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：79..933 特徴を決定した方法：E

【００７１】 配列： ATGAAGAAGA AGTCTCTGCT CCCCCTCGGC CTGGCCATCG GCCTCGCCTC 50 TCTCGCTGCC AGCCCTCTGA TCCAGGCCAG CACCTACACC CAGACCAAAT 100 ACCCCATCGT GCTGGCCCAC GGCATGCTCG GCTTCGACAA CATCCTCGGG 150 GTCGACTACT GGTTCGGCAT TCCCAGCGCC TTGCGCCGTG ACGGTGCCCA 200 GGTCTACGTC ACCGAAGTCA GCCAGTTGGA CACCTCGGAA GTCCGCGGCG 250 AGCAGTTGCT GCAACAGGTG GAGGAAATCG TCGCCCTCAG CGGCCAGCCC 300 AAGGTCAACC TGATCGGCCA CAGCCACGGC GGGCCGACCA TCCGCTACGT 350 CGCCGCCGTA CGTCCCGACC TGATCGCTTC CGCCACCAGC GTCGGCGCCC 400 CGCACAAGGG TTCGGACACC GCCGACTTCC TGCGCCAGAT CCCACCGGGT 450 TCGGCCGGCG AGGCAATCCT CTCCGGGCTG GTCAACAGCC TCGGCGCGCT 500 GATCAGCTTC CTTTCCAGCG GCAGCACCGG TACGCAGAAT TCACTGGGCT 550 CGCTGGAGTC GCTGAGCAGC GAGGGGGCCG CGCGCTTCAA CGCCAAGTAC 600 CCGCAGGGCG TCCCCACCTC GGCCTGCGGC GAGGGCGCCT ACAAGGTCAA 650 CGGCGTGAGC TATTACTCCT GGAGCGGTTC CTCGCCGCTG ACCAACTTCC 700 TCGATCCGAG CGACGCCTTC CTCGGCGCCT CGTCGCTGAC CTTCAAGAAC 750 GGCACCGCCA ACGACGGCCT GGTCGGCACC TGCAGTTCGC ACCTGGGCAT 800 GGTGATCCGC GACAACTACC GGATGAACCA CCTGGACGAG GTGAACCAGG 850 TCTTCGGCCT CACCAGCCCG TTCGAGACCA GCCCGGTCAG CGTCTACCGC 900 CAGCACGCCA ACCGCCTGAA GAACGCCAGC CTGTAG

【図面の簡単な説明】

【図１】シュードモナス・アルギノーザの染色体ＤＮＡ
断片

【符号の説明】

１：コレステロール・エステラーゼ遺伝子断片（CHER
1） ２：コレステロール・エステラーゼ修飾遺伝子断片(CHE
R2) ―：ベクタープラスミドＤＮＡ ａ：制限酵素部位（元々存在しているもの） ｂ：制限酵素部位（人工的に付加されたもの）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示すアミノ酸配列を有する
   コレステロール・エステラーゼにおいて、第１６３番目
   のアスパラギンおよび第２６４番目のロイシンの少なく
   とも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換され、第１７
   ６番目のアミノ酸がヒスチジンまたはヒスチジン以外の
   アミノ酸であることを特徴とする安定型コレステロール
   ・エステラーゼ。
2. 【請求項２】 第１６３番目のアスパラギンがアスパラ
   ギン以外の中性アミノ酸に、第２６４番目のロイシンが
   ロイシン以外の中性アミノ酸に置換されている請求項１
   記載の安定型コレステロール・エステラーゼ。
3. 【請求項３】 第１６３番目のアスパラギンがアスパラ
   ギン以外の中性アミノ酸に、第２６４番目のロイシンが
   ロイシン以外の中性アミノ酸に置換され、第１７６番目
   のアミノ酸がグルタミンである請求項１記載の安定型コ
   レステロール・エステラーゼ。
4. 【請求項４】 アスパラギン以外の中性アミノ酸が脂肪
   族ヒドロキシアミノ酸であり、ロイシン以外の中性アミ
   ノ酸が複素環式アミノ酸である請求項３記載の安定型コ
   レステロール・エステラーゼ。
5. 【請求項５】 脂肪族ヒドロキシアミノ酸がセリンであ
   り、複素環式アミノ酸がプロリンである請求項４記載の
   安定型コレステロール・エステラーゼ。
6. 【請求項６】 請求項１記載の安定型コレステロール・
   エステラーゼを暗号化しているシュードモナス・アエル
   ギノーザ由来の安定型コレステロール・エステラーゼ構
   造遺伝子。
7. 【請求項７】 請求項６記載の安定型コレステロール・
   エステラーゼ構造遺伝子を含む組換え体ＤＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項７記載の組換え体ＤＮＡを保持す
   る微生物を培地に培養し、培養物中に安定型コレステロ
   ール・エステラーゼを生成蓄積させ、該培養物から安定
   型コレステロール・エステラーゼを採取することを特徴
   とする安定型コレステロール・エステラーゼの製造方
   法。