JPH06113840A - ザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質及びその遺伝情報を有するｄｎａ、並びにザルコシンオキシダーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質
を遺伝子工学的手法によって純粋な形で安価に大量供給
しうる手段を提供する。 【構成】 アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６由
来のザルコシンオキシダーゼをコードし、かつ配列番号
１で表される塩基配列を有する遺伝子を含むＤＮＡを保
有する微生物を培養することにより、培地中にザルコシ
ンを添加することなく、ザルコシンオシダーゼが安価に
大量に生産される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床的に筋疾患、腎疾
患の診断の指標となっている体液中のクレアチン、クレ
アチニンの測定に用いられるザルコシンオキシダーゼ、
ザルコシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質の遺伝情報
を有するＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換えベクター、該
ベクターで形質転換された形質転換体及び該形質転換体
を使用するザルコシンオキシダーゼを製造する方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】ザルコシンオキシダーゼ（EC 1.5.3.1）
は、バチルス属（特開昭５４−５２７８９号公報）、コ
リネバクテリウム属（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８９，５９
９，（１９８１））、シリンドロカルボン属（特開昭５
６−９２７９０号公報）、シュードモナス属（特開昭６
０−４３３７９号公報）等の細菌が生産することが知ら
れている。とりわけ、アースロバクター・エスピーＴＥ
１８２６の生産するザルコシンオキシダーゼは、従来の
ザルコシンオキシダーゼよりも熱安定性に優れ、かつＫ
ｍ値の小さい実用的な酵素であることが既に知られてい
る（特開平０２−２６５４７８号公報）。しかしなが
ら、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６のザルコ
シンオキシダーゼ生産性は十分なものではなく、工業的
にザルコシンオキシダーゼを生産する際には問題があっ
た。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ザル
コシンオキシダーゼ活性を有する蛋白質のアミノ酸配列
を決定して、分子構造を明らかにするとともに、ザルコ
シンオキシダーゼ活性を有する蛋白質を遺伝子工学的手
法によって純粋な形で安価に大量供給しうる手段を提供
することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため、ザルコシンオキシダーゼ生産菌として
アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（微工研菌寄
第１０６３７号）を選び、該菌体より抽出した染色体Ｄ
ＮＡよりザルコシンオキシダーゼ遺伝子の単離に成功
し、そのＤＮＡの全構造を決定した。更に本ザルコシン
オキシダーゼを遺伝子工学的手法によって形質転換体に
高生産させることに成功し、高純度なザルコシンオキシ
ダーゼを安価に大量供給することを可能にした。

【０００５】すなわち本発明は、配列表の配列番号１に
記載されたアミノ酸配列を含有するザルコシンオキシダ
ーゼ活性を有する蛋白質、ザルコシンオキシダーゼ活性
を有する蛋白質の遺伝情報を含有するＤＮＡ断片、該Ｄ
ＮＡ断片を含有する組換えベクター、該組換えベクター
で形質転換された形質転換体及び該形質転換体を培地で
培養し、ザルコシンオキシダーゼを生成させ、該ザルコ
シンオキシダーゼを採取することを特徴とするザルコシ
ンオキシダーゼの製造法である。

【０００６】本発明の遺伝子の起源であるアースロバク
ター・エスピーＴＥ１８２６を培養する方法は、培地と
しては炭素源、窒素源、無機イオン更に必要に応じて硝
酸塩、リン酸塩等を含有するものである。炭素源として
は、澱粉あるいは澱粉加水分解物、糖密、ペプトン類等
が用いられる。窒素源としては、ポリペプトン、トリプ
トン、肉エキス、酵母エキス等が使用できる。該菌体を
培養を行うに当たり、誘導物質としてザルコシンまたは
クレアチンを培地に添加する必要がある。培養は好気的
条件下で培地のpH及び温度を適宜調節することが望まし
いが、必ずしもその必要はない。培養時間は培養物のザ
ルコシンオキシダーゼ活性が最高になるところまで行な
われる。

【０００７】培養物より、ザルコシンオキシダーゼを精
製するには、以下の様な方法が用いられる。培養物を遠
心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させることによっ
てザルコシンオキシダーゼ含有溶菌物を調製する。溶菌
方法としては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼな
どの細胞壁溶解酵素による処理や超音波破砕，フレンチ
プレス処理等の物理的破砕法が好適である。この様にし
て得られた溶菌物を硫安沈澱分画し、脱塩した後、DEAE
セファロースCL-6B カラム（ファルマシアLKB ）等のイ
オン交換により分離を行う担体にかけて分画を行う。こ
のステップは省略してしまうことも可能である。また、
分画したサンプルは、疎水性クロマトグラフィーや高速
液体クロマトグラフィー等を用い、さらに高純度とする
事が可能である。この精製標品は、SDS ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で単一バンドになってい
る。尚、カラムクロマトグラフィーの組合せは上記ステ
ップに限らず、その組合せ、種類を変えることは可能で
ある。

【０００８】本発明のザルコシンオキシダーゼ活性を有
する蛋白質の遺伝情報を含有するＤＮＡ（以下、ザルコ
シンオキシダーゼ遺伝子ともいう）は、アースロバクタ
ー・エスピーＴＥ１８２６から抽出してもよく、また合
成することもできる。上記ＤＮＡ配列としては、例えば
配列表の配列番号１に記載されたアミノ配列をコードす
るＤＮＡ配列または配列表の配列番号２に記載された塩
基配列を有するＤＮＡを挙げることができる。なお、本
発明のＤＮＡは、遺伝子組換え技術により基本となるＤ
ＮＡの特定部位に、該ＤＮＡがコードするザルコシンオ
キシダーゼの基本的な特性を変化させる事なく、或いは
その特性を改善するように人為的に変異、例えば置換、
削除、挿入などを起こさせたものも含むものである。

【０００９】本発明のＤＮＡは、例えばアースロバクタ
ー・エスピーＴＥ１８２６のＤＮＡを分離・精製した
後、超音波、制限酵素などを用いて、ＤＮＡを切断した
ものとリニヤーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑また
は接着末端部においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉
環させて組換えベクターとする。こうして得られた組換
えベクターは複製可能な宿主微生物に移入した後、ベク
ターのマーカーとザルコシンオキシダーゼ活性とを指標
としてスクリーニングして該組換えベクターを保持する
微生物を得る。該微生物を培養し、該培養菌体から該組
換えＤＮＡベクターを分離・精製し、次いで該組換えベ
クターからザルコシンオキシダーゼ遺伝子を採取すれば
よい。

【００１０】以下にＤＮＡの採取方法をより詳細に説明
する。遺伝子の供与体である微生物に由来するＤＮＡは
次の如くにして採取される。すなわち、供与微生物であ
る上述した細菌を例えば液体培地で約１〜３日間通気撹
拌培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し、次い
でこれを溶菌させることによってザルコシンオキシダー
ゼ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌方
法としてはたとえばリゾチームやβ−グルカナーゼなど
の細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要により、プ
ロテアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムな
どの界面活性剤が併用され、更に細胞壁の物理的破砕法
である凍結融解やフレンチプレス処理を上述の溶菌法と
の組み合せで行ってもよい。

【００１１】この様にして得られた溶菌物からDNA を分
離・精製するには常法に従って例えばフェノール抽出に
よる除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ
処理、アルコール沈澱遠心分離などの方法を適宜組み合
わせることにより行なうことができる。微生物から分離
・精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処
理、制限酵素処理などを行なうことができるが、得られ
る微生物ＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易ならしめ
る為、制限酵素とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用す
る、例えばEco RI,Hind III,Bam HIなどのII型制限酵素
が適している。

【００１２】ベクターとしては、宿主微生物で自律的に
増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組換え
用として構築されたものが適している。ファージとして
は、例えばエシェリヒア コリー(Escherichia coli)を
宿主微生物とする場合には、λgt・10,λgt・11などが使
用できる。また、プラスミドとしては、例えばエシェリ
ヒア・コリーを宿主微生物とする場合には、pBR322, pU
C18 などがバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)
を宿主微生物とする場合には、pUB110, pC194 などが使
用でき、更にエシェリヒア・コリー及びバチルス・ズブ
チリスなどのグラム陰陽性にまたがる二種以上の宿主微
生物で自律的に増殖可能なシャトルベクター、例えばpH
Y300PLK などを利用することもできる。この様なベクタ
ーを、先に述べたザルコシンオキシダーゼ遺伝子供与体
である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同じ制
限酵素で切断して、ベクター断片を得ることが望まし
い。微生物ＤＮＡ断片をベクター断片と結合させる方法
は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよく、
例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の接
着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの
使用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断片との組換え
ベクターを作成する。必要ならば、アニーリングの後、
宿主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガーゼを利用
し、組換えベクターを作成することもできる。

【００１３】宿主微生物としては、組換えベクターが安
定、且つ自律的に増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質
が発現できるものであればよく、例えば宿主微生物がエ
シェリヒア・コリー W3110、エシェリヒア・コリーC60
0、エシェリヒア・コリーJM109 、バチルス・ズブチリ
スMI113 、バチルス・ズブチリスMT-2などが利用でき
る。

【００１４】宿主微生物に組換えベクターを移入する方
法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属す
る微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換
えDNA の移入を行ない、またバチルス属に属する微生物
の場合には、コンピテントセル法またはプロトプラスト
法などを採用することができ、更にマイクロインジェク
ションを用いても良い。こうして得られた形質転換体で
ある微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量
のザルコシンオキシダーゼを安定して生産し得ることを
見出した。宿主微生物への目的組換えベクター移入の有
無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベク
ターの薬剤耐性マーカーとザルコシンオキシダーゼとを
同時に発現し得る微生物を検索すればよく、例えば薬剤
耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、且つザルコシ
ンオキシダーゼを生成する微生物を選択すればよい。好
ましくは、選択培地にザルコシンオキシダーゼの基質で
あるザルコシンと、パラロースアニリン及びソディウム
ハイドロジェンサルファイトを加え、ザルコシンオキシ
ダーゼの働きでザルコシンより生成されるホルムアルデ
ヒドとパラロースアニリンがシッフ塩基を形成すること
により生じる赤色コロニーを指標に、ザルコシンオキシ
ダーゼ遺伝子の入った組換えベクターをスクリーニング
する。

【００１５】上述の方法により得られたザルコシンオキ
シダーゼ遺伝子の塩基配列はサイエンス（Science),21
4,1205 〜1210(1981)に記載されているジデオキシ法で
解読し、またザルコシンオキシダーゼのアミノ酸配列は
塩基配列より推定した。このようにして、一度選択され
たザルコシンオキシダーゼ遺伝子を保有する組換えベク
ターは、形質転換微生物から取り出され、他の宿主微生
物に移入することも容易に実施できる。また、ザルコシ
ンオキシダーゼ遺伝子を保持する組換えベクターから制
限酵素などにより切断してザルコシンオキシダーゼであ
るＤＮＡを切り出し、これを同様な方法により切断して
得られるベクター断片とを結合させて、宿主微生物に移
入することも容易に実施できる。

【００１６】形質転換体である宿主微生物の培養形態は
宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば
よく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には
通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源とし
ては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され
得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよ
く、例えばグルコ−ス、シュークロース、ラクトース、
マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使
用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれ
ばよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼ
イン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用され
る。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウ
ム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの
塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応
じて使用される。本発明の形質転換体の培養には、従来
添加されていたザルコシンまたはクレアチニンを添加す
る必要がない。すなわちザルコシン遺伝子の本質は何ら
変わらないにも係わらず、形質転換体は誘導物質である
ザルコシンまたはクレアチンが培地に添加されていなく
てもザルコシンオキダーゼを生産するという顕著な効果
を生じる。

【００１７】培養温度は菌が発育し、ザルコシンオキシ
ダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒ
ア・コリーの場合、好ましくは20〜42℃程度である。培
養時間は条件によって多少異なるが、ザルコシンオキシ
ダーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に
培養を終了すればよく、通常は6 〜48時間程度である。
培地pHは菌が発育しザルコシンオキシダーゼを生産する
範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはpH6.0 〜9.0
程度である。培養物中のザルコシンオキシダーゼを生産
する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することも
できるが、一般には常法に従ってザルコシンオキシダー
ゼが培養液中に存在する場合は濾過、遠心分離などによ
り、ザルコシンオキシダーゼ含有溶液と微生物菌体とを
分離した後に利用される。ザルコシンオキシダーゼが菌
体内に存在する場合には、得られた培養物を濾過または
遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌
体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破
壊し、また必要に応じてEDTA等のキレート剤及びまたは
界面活性剤を添加してザルコシンオキシダーゼを可溶化
し、水溶液として分離採取する。

【００１８】この様にして得られたザルコシンオキシダ
ーゼ含有溶液を例えば減圧濃縮，膜濃縮、更に硫酸アン
モニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水
性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトン
などによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。ま
た、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸
着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィ
ニティークロマトグラフィーにより、精製されたザルコ
シンオキシダーゼを得る事ができる。本発明のザルコシ
ンオキシダーゼは従来のアースロバクター・エスピーＴ
Ｅ１８２６が生産していたザルコシンオキダーゼに比較
して分子量が相違する新規な酵素である。また本発明の
ザルコシンオキシダーゼ遺伝子を使用するザルコシンオ
キダーゼの製造には、従来の製造法で必要としたザルコ
シンまたはクレアチンを添加する必要がないという優れ
た効果を呈する。

【００１９】本発明のザルコシンオキシダーゼ活性を有
する蛋白質は、以下に示す性質を有する。 作用：酸素の存在下、ザルコシンを酸化し、グリシン、
ホルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成する反応を触
媒する。 基質特異性：ザルコシンに特異的に作用する。 至適ｐＨ：７．０〜８．５ 至適温度：４０〜５０℃ ｐＨ安定性：ｐＨ６．５〜９．０（２５℃、２４時間） 熱安定性：５５℃以下（ｐＨ７．５、１０分間） 等電点：４．９±０．１ Ｋｍ：２．８×１０^-3Ｍ 該酵素はアースロバクター・エスピーＴＥ１８２６が産
生する酵素と、その分子量において異なっている。すな
わち、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６が産生
する酵素の分子量は約６５，０００である（特開平０２
−２６５４７８号公報）が、本発明のザルコシンオキシ
ダーゼ活性を有する蛋白質の分子量は約４３，０００で
ある。

【００２０】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例中、ザルコシンオキシダーゼの活性測定は以
下のようにして行なった。すなわち、48mMトリス緩衝液
(pH8.0) 、95mMザルコシン、0.47mM４−アミノアンチピ
リン、2.0mM フェノール、0.045％トリトンＸ−１０
０、4.5U/ml ペルオキシダーゼ中で酵素を３７℃，１０
分反応させ、500nm における吸光度を測定する。酵素活
性の１単位は、この条件下で１分間当たり１マイクロモ
ルの過酸化水素を生成する酵素量とした。

【００２１】実施例１ 染色体DNA の分離 アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６の染色体ＤＮ
Ａを次の方法で分離した。同菌株を100ml の２×ＹＴ培
地（１．６％ポリペプトン，１％酵母エキス，０．５％
塩化ナトリウム（ｐＨ７．２））で３７℃一晩振盪培養
後、遠心(8000rpm,10 分) により集菌した。15mMクエン
酸ナトリウム、0.15M 塩化ナトリウムを含んだ溶液で菌
体を洗浄した後、20％シュークロース、1mM EDTA、50mM
トリス塩酸(pH7.6) を含んだ溶液 5mlに懸濁させ、0.5m
l のリゾチーム溶液(100mg/ml)を加えて37℃，30分間保
温した。次いで11mlの１％ラウロイルサルコシン酸、0.
1MEDTA(pH9.6)を含む溶液を加えた。この懸濁液に臭化
エチジウム溶液を0.5%塩化セシウムを約１００％加え、
撹拌混合し、55.000rpm 、２０時間の超遠心でＤＮＡを
分取した。分取したＤＮＡは、 10mM トリス塩酸(pH8.
0) 、 1mM EDTA を含んだ溶液（ＴＥ）で透析し、精製
ＤＮＡ標品とした。エシェリヒア・コリーJM109 のコン
ピテントセルはHanahan の方法により作成し、ライブラ
リー作成の宿主として用いた。

【００２２】実施例２ ザルコシンオキシダーゼをコー
ドする遺伝子を含有するＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を
有する組換えベクターの調製 実施例１で得たＤＮＡ 1μg を制限酵素 Sau3AI （東洋
紡製）で部分分解反応させ、2kbp以上の断片に分解した
後、Sal I(東洋紡製）で切断したpUC18 0.5 μg とM.G.
LoftusらのBACKFILLING 法（Biotechniques Vol12,N
o.2(1992)) に従い、T4- ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）1
ユニットで16℃、12時間反応させ、ＤＮＡを連結し
た。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリーJM109のコ
ンピテントセルを用いて形質転換した。使用したＤＮＡ
1μg 当たり約 1×10⁶ 個の形質転換体のコロニーが得
られた。得られたコロニーは50μg/mlアンピシリン、0.
5%ザルコシン、0.005%パラロースアニリン、及び0.025%
ソディウムハイドロジェンサルファイト入りＬ培地（1%
ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム）
で37℃, 18時間培養し、赤色コロニーを指標にザルコシ
ンオキシダーゼ遺伝子の入った組換えＤＮＡをスクリー
ニングした。その結果、約1.000 個のコロニーのうち１
株の割合で赤色を示すコロニーを得た。この中の１株が
保有するプラスミドには約8.7kbpの挿入ＤＮＡ断片が存
在しており、このプラスミドをpSAO1 とした。次いでpS
AO1 より挿入ＤＮＡ断片を種々の制限酵素により切断し
てpUC18 にサブクローニングし、約1.7kbpの挿入ＤＮＡ
断片を有するpSAOEP3 を得、エシェリヒア・コリーJM10
9 を形質転換した。pSAO1 及びpSAOEP3 を含むその派生
プラスミドの挿入ＤＮＡ制限酵図を図１に示した。

【００２３】実施例３ 塩基配列の決定 pSAOEP3 の約1.7kbpの挿入ＤＮＡ断片について種々の制
限酵素で切断してサブクローンを調製した。種々のサブ
クローンは常法に従い、SEQUENASE VERSION2.07-deaza-
dGTP kit （東洋紡製）を用いて、図２に示したストラ
テジーにて塩基配列の決定を行った。決定した塩基配列
及びアミノ酸配列を配列表に示した。アミノ酸配列から
求められる蛋白質の分子量は約４３，０００であり、ア
ースロバクター・エスピーＴＥ１８２６のザルコシンオ
キシダーゼの分子量（約６５，０００）とは異なる値を
示した。

【００２４】実施例４ エシェリヒア・コリー、バチル
ス・ズブチリス−シャトルベクターへのザルコシンオキ
シダーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片のサ
ブクローニング 図３に示したスキームにて、pSAOEP3 の約1.7kbpの挿入
ＤＮＡ断片を、エシェリヒア・コリー及びバチルス・ズ
ブチリスを形質転換可能なシャトルベクターpHY300PLK
（東洋紡製）にサブクローニングした。この組換えベク
ターをpHYSAO2と名付けた。

【００２５】実施例５ エシェリヒア・コリー形質転換
体及びバチルス・ズブチリス形質転換体の作成 pHYSAO2 でエシェリヒア・コリーJM109 のコンピテント
セルを形質転換し、形質転換体JM109(pHYSAO2)を得た。
また、同様にpHYSAO2 でSpizizenの方法(Molecular Clo
ning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))
により調製したバチルス・ズブチリスMT-2のコンピテン
トセルを形質転換し、形質転換体MT-2(pHYSAO2) を得
た。

【００２６】実施例６ 形質転換体の培養とザルコシン
オキシダーゼの生成 前記の２×ＹＴ培地50mlを500ml フラスコに分注し、12
1 ℃，15分間オートクレーブを行い放冷後、別途無菌濾
過した抗生物質を添加（JM109(pHYSAO2)に対しては50mg
/ml アンピシリン（ナカライテスク製）、MT-2(pHYSAO
2) に対しては25mg/ml テトラサイクリン（ナカライテ
スク製）をそれぞれ０．１％）した。この培地に上記と
同一組成の培地で予め37℃で18時間振盪培養したJM109
(pHYSAO2)、MT-2(pHYSAO2) の培養液 1mlをそれぞれ接
種し、37℃で通気撹拌培養した。培養経過を図４および
図５に示した。培養開始より８時間後で、JM109(pHYSAO
2)は約1.1U/mlのザルコシンオキシダーゼ活性を示し、M
T-2(pHYSAO2) は約0.74U/mlのザルコシンオキシダーゼ
活性を示した。同条件下でのアースロバクター・エスピ
ーＴＥ１８２６のザルコシンオキシダーゼ活性は0.05U/
ml以下であり、本ザルコシンオキシダーゼ遺伝子がエシ
ェリヒア・コリー及びバチルス・ズブチリス内におい
て、効率的に発現することが明らかとなった。JM109(pH
YSA02)およびアースロバクター・エスピーＴＥ１８２６
培養物より、常法（特開平 2-265478 号公報に記載) に
従い、ザルコシンオキシダーゼを精製し、性質の比較を
行ったところ、下記性質を確認した。 作用：酸素の存在下ザルコシンを酸化し、グリシン、ホ
ルムアルデヒドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒
する。 基質特異性：ザルコシンに特異的に作用する。 至適ｐＨ：７．０〜８．５ 至適温度：４０〜５０℃ ｐＨ安定性：ｐＨ６．５〜９．０（２５℃、２４時間） 熱安定性：５５℃以下（ｐＨ７．５、１０分間） 等電点：４．９±０．１ Ｋｍ：２．８×１０^-3Ｍ

【００２７】

【発明の効果】本発明によってザルコシンオキシダーゼ
遺伝子の塩基配列及びザルコシンオキシダーゼのアミノ
酸配列が明らかになり、また遺伝子工学的手法によりザ
ルコシンオキシダーゼを容易に高純度で大量生産する事
が出来る。また本発明のザルコシンオキシダーゼの製法
は培地にザルコシンまたはクレアチンを添加することな
く、該酵素を生産できるという優れた効果を奏する。さ
らに本発明のザルコシンオキシダーゼ遺伝子と種々の蛋
白質工学的手法とを用いる事により、より高活性な、或
いはより安定性の高い新規ザルコシンオキシダーゼを作
ることも可能でなる。

【００２８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３８９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物名：アースロバクター・エスピー(Arthrobacter S
P.) 株名：ＴＥ１８２６ 配列の特徴 他の情報: ザルコシンオキダーゼ活性を有する蛋白質 配列 Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser 1 5 10 15 Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr 20 25 30 Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His 35 40 45 Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr 50 55 60 Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys 65 70 75 80 Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly 85 90 95 Pro Lys Gly Glu Ala Pro Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys 100 105 110 Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys 115 120 125 Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu 130 135 140 Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg 145 150 155 160 Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val 165 170 175 Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr 180 185 190 Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn 195 200 205 Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr 210 215 220 Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn 225 230 235 240 Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr 245 250 255 Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His 260 265 270 Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly 275 280 285 Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr 290 295 300 Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr 305 310 315 320 Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe 325 330 335 Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe 340 345 350 Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys 355 360 365 Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys 370 375 380 Gln Lys Glu Thr Ile 385

【００２９】配列番号：２ 配列の長さ：１６７０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 起源： 生物名：アースロバクター・エスピー(Arthrobacter s
p.) 株名：ＴＥ１８２６ 配列の特徴 特徴を表す記号：−３５ｓｉｇｎａｌ 存在位置：１１４．．１１９ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：−１０ｓｉｇｎａｌ 存在位置：２３７．．２４２ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２９８．．１４６４ 特徴を決定した方法：Ｐ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：３０１．．１４６４ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の情報：ザルコシンオキダーゼ活性を有する蛋白質を
コードする遺伝子。 配列 CTGCAGTTCT TCCTCCAGCT TTTGAATCCT CACGGTAACA TAAGATTGAA CATAATTTAA 60 ACTTTTGGCC GCCTTTGAAA CGCTGCCATA TTCAACTACC TTTTGAAAAA TCTGCAAATC 120 TTTAATTTCC AAGTATAATC ACTCCCAAAA CGTTCTTTTA CTACTAGCAC TAGAATATTT 180 CTAAAAGTGA TAGCTGCTAT CACTTTTAAG CATTTTACAT GATGGCCAAT AGGCCGTATG 240 ATGTAAATAG ATAATTAAGA AAATTCAAAT TACCTGTTTG AAAAAGGAGA GGAAACA 297 ATG AGT ATT AAA AAA GAT TAT GAT GTA ATT GTG GTT GGC GCT GGT TCC 345 Met Ser Ile Lys Lys Asp Tyr Asp Val Ile Val Val Gly Ala Gly Ser 1 5 10 15 ATG GGA ATG GCA GCT GGG TAC TAT CTG TCT AAA CAA GGT GTT AAA ACA 393 Met Gly Met Ala Ala Gly Tyr Tyr Leu Ser Lys Gln Gly Val Lys Thr 20 25 30 CTA TTG GTA GAT TCA TTT CAT CCT CCC CAT ACA AAT GGC AGC CAT CAT 441 Leu Leu Val Asp Ser Phe His Pro Pro His Thr Asn Gly Ser His His 35 40 45 GGC GAT ACA CGG ATC ATT CGT CAC GCA TAT GGC GAA GGA AGA GAG TAT 489 Gly Asp Thr Arg Ile Ile Arg His Ala Tyr Gly Glu Gly Arg Glu Tyr 50 55 60 GTA CCG TTT GCC TTG AGA GCA CAA GAG TTA TGG TAT GAA TTA GAA AAG 537 Val Pro Phe Ala Leu Arg Ala Gln Glu Leu Trp Tyr Glu Leu Glu Lys 65 70 75 80 GAG ACT CAT CAT AAA ATA TTT ACA AAA ACA GGT GTA CTC GTT TTT GGT 585 Glu Thr His His Lys Ile Phe Thr Lys Thr Gly Val Leu Val Phe Gly 85 90 95 CCT AAA GGA GAA GCT CCT TTC GTT GCC GAA ACA ATG GAA GCC GCA AAG 633 Pro Lys Gly Glu Ala Pro Phe Val Ala Glu Thr Met Glu Ala Ala Lys 100 105 110 GAA CAT TCA TTA GAT GTT GAT TTA CTA GAA GGA AGT GAA ATA AAT AAG 681 Glu His Ser Leu Asp Val Asp Leu Leu Glu Gly Ser Glu Ile Asn Lys 115 120 125 CGT TGG CCA GGT GTA ACG GTT CCT GAG AAT TAT AAT GCT ATT TTT GAA 729 Arg Trp Pro Gly Val Thr Val Pro Glu Asn Tyr Asn Ala Ile Phe Glu 130 135 140 AAA AAT TCT GGT GTC TTA TTT AGT GAA AAT TGT ATT CGC GCT TAC CGT 777 Lys Asn Ser Gly Val Leu Phe Ser Glu Asn Cys Ile Arg Ala Tyr Arg 145 150 155 160 GAA TTG GCG GAA GCA AAT GGT GCG AAA GTT CTA ACG TAC ACA CCC GTT 825 Glu Leu Ala Glu Ala Asn Gly Ala Lys Val Leu Thr Tyr Thr Pro Val 165 170 175 GAA GAT TTC GAG ATT GCC GAG GAC TTC GTC AAA ATC CAA ACC GCC TAT 873 Glu Asp Phe Glu Ile Ala Glu Asp Phe Val Lys Ile Gln Thr Ala Tyr 180 185 190 GGC TCC TTT ACA GCC AGT AAA TTA ATT GTT AGC ATG GGC GCT TGG AAT 921 Gly Ser Phe Thr Ala Ser Lys Leu Ile Val Ser Met Gly Ala Trp Asn 195 200 205 AGC AAA CTG CTA TCA AAA TTA AAT ATT GAA ATC CCA TTG CAG CCA TAC 969 Ser Lys Leu Leu Ser Lys Leu Asn Ile Glu Ile Pro Leu Gln Pro Tyr 210 215 220 CGT CAA GTT GTC GGA TTC TTC GAA TGT GAT GAA AAA AAA TAT AGC AAT 1017 Arg Gln Val Val Gly Phe Phe Glu Cys Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Asn 225 230 235 240 ACA CAT GGT TAT CCG GCG TTC ATG GTC GAA GTC CCA ACT GGC ATC TAT 1065 Thr His Gly Tyr Pro Ala Phe Met Val Glu Val Pro Thr Gly Ile Tyr 245 250 255 TAC GGA TTT CCA AGC TTC GGC GGC TGC GGC TTG AAA ATA GGC TAT CAT 1113 Tyr Gly Phe Pro Ser Phe Gly Gly Cys Gly Leu Lys Ile Gly Tyr His 260 265 270 ACG TAT GGT CAA AAA ATC GAT CCA GAT ACG ATT AAT CGT GAA TTT GGT 1161 Thr Tyr Gly Gln Lys Ile Asp Pro Asp Thr Ile Asn Arg Glu Phe Gly 275 280 285 ATT TAC CCG GAG GAT GAA GGG AAT ATT CGC AAA TTC CTG GAA ACA TAT 1209 Ile Tyr Pro Glu Asp Glu Gly Asn Ile Arg Lys Phe Leu Glu Thr Tyr 290 295 300 ATG CCG GGA GCA ACC GGC GAA TTA AAA AGT GGG GCA GTT TGC ATG TAC 1257 Met Pro Gly Ala Thr Gly Glu Leu Lys Ser Gly Ala Val Cys Met Tyr ACA AAA ACA CCT GAT GAG CAT TTC GTG ATT GAT TTA CAT CCT CAA TTC 1305 Thr Lys Thr Pro Asp Glu His Phe Val Ile Asp Leu His Pro Gln Phe 325 330 335 TCG AAT GTC GCG ATT GCA GCC GGA TTC TCC GGA CAT GGG TTT AAA TTC 1353 Ser Asn Val Ala Ile Ala Ala Gly Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Phe 340 345 350 TCA AGC GTA GTT GGT GAA ACA TTA AGT CAA TTA GCT GTA ACC GGT AAA 1401 Ser Ser Val Val Gly Glu Thr Leu Ser Gln Leu Ala Val Thr Gly Lys 355 360 365 ACA GAA CAC GAT ATT TCC ATC TTT TCA ATC AAT CGC CCT GCT TTA AAA 1449 Thr Glu His Asp Ile Ser Ile Phe Ser Ile Asn Arg Pro Ala Leu Lys 370 375 380 CAA AAA GAA ACG ATT TAAAAACGCA AGCAAGCCGT ACATAAATTT CGATAGATAT 1504 Gln Lys Glu Thr Ile 385 TATGTACGGC TTACTTTATT TACAACTTAA AAATCTGCAT ATCAATCCTG TCCCTCTACT 1564 GATTGAAGCA CAAACTGTAC TTGAACGGCT TTTTTATTAA CTTGTAACGA TAACAGGAAC 1624 GCTAAAATAA GAAGACCGCT GCATAAGAAT AGTACGGGAG GAATTC 1670

【図面の簡単な説明】

【図１】pSAO1 及びその派生プラスミドの挿入ＤＮＡの
制限酵素地図を示す。

【図２】pSAOEP3 の約1.7kbpの挿入ＤＮＡ断片の塩基配
列決定に対するストラテジーを示す。

【図３】pHYSAO2 作成の手順を示す。

【図４】E.coli JM109(pHYSAO2) の培養経過を示す。

【図５】E.coli MT-2(pHYSAO2) の培養経過を示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載されたアミノ
   酸配列を含有するザルコシンオキシダーゼ活性を有する
   蛋白質。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号２に記載された塩基配
   列を含有するＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 請求項２に記載されたＤＮＡ断片を含有
   する組換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項３に記載された組換えベクターで
   形質転換された形質転換体。
5. 【請求項５】 請求項４に記載された形質転換体を培地
   で培養し、ザルコシンオキシダーゼを生成させ、該ザル
   コシンオキシダーゼを採取することを特徴とするザルコ
   シンオキシダーゼの製造法。