JP3112146B2

JP3112146B2 - 耐熱性マレートデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質

Info

Publication number: JP3112146B2
Application number: JP06151045A
Authority: JP
Inventors: 敦曽我部; 誠嗣竹嶋; 和巳山本; 真一手嶋; 川村　　良久; 重典愛水
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1993-07-02
Filing date: 1994-07-01
Publication date: 2000-11-27
Anticipated expiration: 2015-11-27
Also published as: JPH0847389A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は臨床的に肝炎や心筋梗塞
の診断の指標となる血中のアスパラギン酸：２−オキソ
グルタル酸アミノトランスフェラーゼ（以下、ＧＯＴと
略称）の活性測定や、呼吸代謝系の酸−塩基不均衡の指
標となる血漿中炭酸ガス濃度の測定に用いられる新規な
耐熱性マレートデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質、
該蛋白質をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片、該
ＤＮＡ断片を有する組換えベクター、該ベクターで形質
転換された形質転換体及び該形質転換体を使用した耐熱
性マレートデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質を製造
する方法に関する。

【０００２】また本発明は上記新規な蛋白質を一成分と
して含有するＧＯＴ活性測定用試薬ならびに該試薬を使
用することを含むＧＯＴ活性測定法に関する。

【０００３】

【従来の技術】ＧＯＴはＧＰＴ（グルタミン酸・ピルビ
ン酸トランスアミナーゼ）とともに心筋、骨格筋、脳、
肝、腎などに多く存在し、これらの臓器の障害により血
清中の活性値が変動することが知られている。ＧＯＴの
活性測定法として下記の反応を利用した紫外部吸収法が
標準法として採用されている。

【０００４】

【化３】

【０００５】

【化４】

【０００６】つまりＧＯＴの活性値は、その触媒作用に
よりＬ−アスパラギン酸とα−ケトグルタル酸より生成
するオキザロ酢酸を、共役酵素として共存させたマレー
トデヒドロゲナーゼとＮＡＤＨによりリンゴ酸に変換
し、その際にＮＡＤＨがＮＡＤ ⁺へ変換する速度を３４
０ｎｍにおける吸光度減少速度より求めるものである。

【０００７】ＧＯＴ測定試薬は通常、二試薬系で構成さ
れ、通常、ＮＡＤＨ、マレートデヒドロゲナーゼ、必要
によりラクテートデヒドロゲナーゼおよびα−ケトグル
タル酸またはＬ−アスパラギン酸を含有する第一試薬お
よびα−ケトグルタル酸またはＬ−アスパラギン酸を含
む第二試薬からなっている。上記試薬を溶解後、液状で
保存する上で問題となるのは、マレートデヒドロゲナー
ゼの安定性である。ＮＡＤＨはｐＨ９〜１０において安
定であることが知られており、α−ケトグルタル酸、Ｌ
−アスパラギン酸については問題ない。更にラクテート
デヒドロゲナーゼについても安定な酵素が市販されてい
る。

【０００８】ところで、マレートデヒドロゲナーゼ（Ｅ
Ｃ１．１．１．３７）は動物、植物、微生物全般の生物
界に広く存在している。高等動物ではミトコンドリアと
細胞質にアイソザイムとして極在することが知られてい
た。また従来から臨床的試験、例えば上記血中のＧＯＴ
活性測定あるいは血漿中の二酸化炭酸の濃度測定に使用
されている。このような酵素として、豚心臓のミトコン
ドリア画分のマレートデヒドロゲナーゼが一般的に使用
されている。しかしながら、該マレートデヒドロゲナー
ゼは熱安定性に劣り、市販されるＧＯＴ活性測定用試薬
は溶液状態で長期間保存することができないから、満足
すべきものではなかった。

【０００９】一方、種々の微生物由来のマレートデヒド
ロゲナーゼが見い出されている。例えばコリネバクテリ
ウム、ブレビバクテリウム、アースロバクター、バチル
ス・ズブチリス、エシェリヒア・コリ、クロロフレック
ス・アウランチカ、ロドシュードモナス・カプスタータ
およびシュードモナス・テストステルニなどの中温菌が
マレートデヒドトゲナーゼを生産することが公知である
が、これらの酵素は耐熱性ではない。したがってこれら
の酵素のいずれも実際的な応用には熱安定性が充分では
なく、また生産性も劣る。

【００１０】また、サーマス・サーモフィラス (特開昭
55-99188号公報) 、サーマス・フラバス AT-62 (Biochi
mica et Biophysica Acta 613, 1-9, 1980) 、バチルス
・ステアロサーモフィラス UK 788 ( 特開昭56-148188
号公報) 、バチルス・ステアロサーモフィラス 2184
(J. Biol. Chem., vol.242, no.7, 1548-1559, 1967)な
どの耐熱性菌が熱安定性マレートデヒドロゲナーゼを生
産することも公知である。サーマス属sp. 由来のマレー
トデヒドロゲナーゼが唯一、熱安定性酵素として市販さ
れている。しかし、この酵素の至適温度は９０℃付近と
非常に高温であり、臨床検査で使用される反応温度（通
常、室温) の反応性は低く、この酵素を臨床検査に使用
するには不適当である。さらに該酵素は酵素が所有する
熱安定性から予想されるほど、ＧＯＴ活性測定用試薬と
して安定性に優れていない。

【００１１】バチルス・ステアロサーモフィラス UK 78
8 由来のマレートデヒドロゲナーゼの熱的性質は不明で
ある。しかし該菌株はマレートデヒドロゲナーゼととも
に、酢酸キナーゼなどの他の酵素も生産するから、精製
されたマレートデヒドロゲナーゼには他の酵素が混在す
る可能性を有するであろう。またバチルス・ステアロサ
ーモフィラス 2184 もまた耐熱性マレートデヒドロゲナ
ーゼを生産する。しかし該菌株の酵素に対して、22℃で
測定した最大比活性は、この温度での活性が低いことか
ら非常に低い。したがってこれらのバチルス属由来の酵
素はＧＯＴ活性測定用試薬として調製するには、生産性
が悪いか、あるいは長期保存後の安定性に劣るであろ
う。したがって室温における反応性および長期保存後の
安定性に優れる、特にＧＯＴ活性測定用試薬として安定
性に優れたマレートデヒドロゲナーゼが望まれていた。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明の第１の目的
は、ＧＯＴ活性測定用試薬として優れた安定性を示す、
耐熱性マレートデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質を
提供することにある。また本発明の第２の目的は、遺伝
子工学により純粋な形態で、多量に該蛋白質を供給する
ための方法とその原料を提供することにある。さらに本
発明の第３の目的は、本発明の耐熱性マレートデヒドロ
ゲナーゼ活性を有する蛋白質を一成分として含有するＧ
ＯＴ活性測定用試薬を提供することにある。また本発明
の第４の目的は本発明の耐熱性マレートデヒドロゲナー
ゼ活性を有する蛋白質を使用することを含む、ＧＯＴ活
性測定法を提供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため、耐熱性マレートデヒドロゲナーゼ活性
を有する蛋白質の生産菌としてバチルス・ステアロサー
モフィラスＡＴＣＣ１２０１６を選び、該菌体より抽出
した染色体ＤＮＡより耐熱性マレートデヒドロゲナーゼ
活性を有する蛋白質遺伝子の単離に成功し、そのＤＮＡ
の全構造を決定した。更に該耐熱性マレートデヒドロゲ
ナーゼ活性を有する蛋白質を遺伝子工学的手法によって
形質転換体により高生産させることに成功し、高純度な
耐熱性マレートデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質を
安価に大量供給することを可能にした。

【００１４】すなわち本発明は４０℃において１０日間
溶液状態で保存した後の残存活性が少なくとも６０％で
あることを特徴とする耐熱性マレートデヒドロゲナーゼ
活性を有する蛋白質である。

【００１５】また本発明は耐熱性マレートデヒドトゲナ
ーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片、該ＤＮＡ断片を有する組換えベクター、該
組換えベクターで形質転換された形質転換体および該形
質転換体を培地で培養し、耐熱性マレートデヒドロゲナ
ーゼ活性を有する蛋白質を生成させ、該蛋白質を採取す
ることを特徴とする耐熱性マレートデヒドロゲナーゼ活
性を有する蛋白質の製造法である。

【００１６】さらに本発明はＮＡＤＨ、Ｌ−アスパラギ
ン酸、α−ケトグルタル酸、必要によりラクテートデヒ
ドロゲナーゼおよび４０℃において１０日間溶液状態で
保存した後の残存活性が少なくとも６０％である耐熱性
マレートデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質を含有す
るグルタミン酸・オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（Ｇ
ＯＴ）活性測定用試薬である。

【００１７】また本発明は試料に、ＮＡＤＨ、Ｌ−アス
パラギン酸、α−ケトグルタル酸、必要によりラクテー
トデヒドロゲナーゼおよび４０℃において１０日間溶液
状態で保存した後の残存活性が少なくとも６０％である
耐熱性マレートデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質を
含有するグルタミン酸・オキザロ酢酸トランスアミナー
ゼ（ＧＯＴ）活性測定用試薬を反応させて、消費される
ＮＡＤＨを測定することを特徴とするＧＯＴ活性測定法
である。

【００１８】本発明の耐熱性マレートデヒドロゲナーゼ
活性を有する蛋白質（耐熱性MAD と略称する）は４０℃
において１０日間溶液状態で保存した後の残存活性が少
なくとも６０％、好ましくは７０％、さらに好ましくは
８０％、特に好ましくは９０％であることが必要であ
る。本発明で溶液状態とは、下記組成を有する溶液を意
味する。ラクテートデヒドロゲナーゼ（所望により使用）５００〜２０００Ｕ／ｌ耐熱性MAD ５００〜５０００Ｕ／ｌＬ−アスパラギン酸１５０〜２５０ｍｍｏｌ／ｌ α−ケトグルタル酸１０〜４０ｍｍｏｌ／ｌＮＡＤＨ０．１〜０．２５ｍｍｏｌ／ｌ緩衝物質（ｐＨ７．０〜８．０）０．０５〜０．１ｍｍｏｌ／ｌまた本発明でいう残存活性とは、上記溶液を特定温度下
で１０日間保存した後のマレートデヒドロゲナーゼの活
性を測定し、保存前のMAD 活性(100%)に対する保存後の
MAD の活性の割合(%) を残存活性という。

【００１９】マレートデヒドロゲナーゼの活性は以下の
方法により測定する。下記反応混液をキュベット（ｄ＝
１．０ｃｍ）に調整し、２５℃で約５分間予備加温す
る。２．８ｍｌ０．１ＭＫ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）０．１ｍｌ１５ｍＭオキザロ酢酸溶液（Ｋ−リン酸
緩衝液に溶解）０．１ｍｌ６．０ｍＭＮＡＤＨ水溶液この反応混液に前述の耐熱性MAD 含有溶液０．０５ｍｌ
を添加し、ゆるやかに混和後、その混合液の３４０ｎｍ
における吸光度変化を、２５℃の下、水をコントロール
として分光光度計を用いて３〜４分記録し、その初期直
線部分から１分間当たりの吸光度変化を求める（ΔＯＤ
ｔｅｓｔ）。盲検は耐熱性MAD 含有溶液の代わりにＫ−
リン酸緩衝液(pH7.5) を０．０５ｍｌ加え、上記同様の
操作を行って１分間当たりの吸光度変化を求める（ΔＯ
Ｄｂｌａｎｋ）。耐熱性MAD １Ｕ（単位）は上記条件下
で１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを酸化するに必要
な酵素量とする。

【００２０】本発明の耐熱性MAD は、少なくとも前述の
性質を有していれば、その起源は特に限定されない。好
ましくはバチルス・ステアロサーモフィラスATCC 12016
菌が生産する耐熱性MAD 、より好ましくはATCC12016 菌
が生産する耐熱性MAD よりも熱安定性に優れ、かつ比活
性の高いバチルス属細菌由来の耐熱性MAD をコードする
遺伝子を担持する形質転換体より生産される耐熱性MAD
である。

【００２１】耐熱性MAD をコードする遺伝子を担持する
形質転換体は、該遺伝子を発現し得、耐熱性MAD を生産
する能力を有するものであれば、特に限定されるもので
はない。好ましくは大腸菌あるいは枯草菌属に由来する
ものであり、より好ましくはE.coli W3110, E.coli C60
0, E.coli JM109, バチルス・ズブチリス MI113あるい
はバチルス・ズブチリス MT-2 などが挙げられる。

【００２２】形質転換体が担持する耐熱性MAD をコード
する遺伝子は、バチルス属細菌から常法により抽出単離
されたものであっても、また化学合成によるものでもよ
い。また耐熱性MAD をコードするものであれば、天然型
あるいは非天然型を問わず、例えばバチルス属細菌由来
の天然型ＤＮＡ配列の一部が突然変異によって変化した
ものであってもよい。好ましくは配列表・配列番号１に
記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝
子であり、より好ましくは配列表・配列番号２に記載の
塩基配列を有する遺伝子である。

【００２３】また、本発明の耐熱性MAD は、下記性質を
有することが好ましい。作用：以下の反応を可逆的に触媒する。

【００２４】

【化５】

【００２５】基質特異性：Ｌ−リンゴ酸を特異的に酸
化、またはオキザロ酢酸を特異的に還元する。至適温度：７０℃ 至適ｐＨ：ｐＨ８．０熱安定性：７０℃以下ｐＨ安定性：ｐＨ３．０〜９．０等電点：４．８分子量：１４０，０００（ゲル濾過）、３８，０００
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）Ｋｍ値：４．３×１０^-6 Ｍ（オキザロ酢酸）

【００２６】本発明の耐熱性MAD を取得する方法は特に
限定されない。例えばバチルス・ステアロサーモフィラ
スＡＴＣＣ１２０１６菌体または耐熱性MAD をコードす
る遺伝子を担持する形質転換体を常法に従い、培養し、
培養物から生産した耐熱性MAD を採取する方法、または
化学合成する方法のいずれも用いることができる。

【００２７】以下、一例としてバチルス・ステアロサー
モフィラスＡＴＣＣ１２０１６菌体から、本発明の耐熱
性MAD を取得する方法を挙げる。当該菌体を培養するの
に用いられる培地として、炭素源、窒素源、無機イオン
更に必要に応じて硝酸塩、リン酸塩などを含有する物が
挙げられる。炭素源としてはグルコース、フラクトース
のような単糖類からデキストリン、可溶性澱粉のような
高分子多糖類まで用いることができる。窒素源としては
ポリペプトン、トリプトン、肉エキス、酵母エキスなど
が利用できる。該菌体を培養するにあたり特に誘導物質
等の添加は必要なく、好気条件下にて、該菌株の最も良
好に生育する温度にて培養し、マレートデヒドロゲナー
ゼの生産量が最大になる時点まで行う。

【００２８】培養した菌体よりマレートデヒドロゲナー
ゼを精製するには、以下のような方法が用いられる。培
養液より遠心分離にて菌体を回収し、次いで菌体を破砕
することによりマレートデヒドロゲナーゼを抽出する。
菌体破砕方法としては、例えばリゾチームのような細胞
壁溶解酵素による処理や、超音波破砕、ガラスビーズ破
砕、フレンチプレス破砕のような物理的処理を用いるこ
とができる。このようにして得られた溶菌物をポリエチ
レンイミン処理により除核酸処理を行った後、硫安沈澱
分画によりマレートデヒドロゲナーゼ画分を回収する。
このようにして得られたマレートデヒドロゲナーゼ画分
はＧ−２５ゲル濾過により脱塩した後、ＤＥＡＥＳｅ
ｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂカラムクロマト（ファルマシ
アＬＫＢ）→ＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−
６Ｂカラムクロマト（ファルマシアＬＫＢ）→ＴＳＫゲ
ルＧ−３０００ＳＷゲル濾過（東洋曹達）→ＭｏｎｏＰ
ＨＲ５／５クロマトフォーカシング（ファルマシアＬ
ＫＢ）により高純度に精製することができる。この精製
標品は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ）で単一バンドになっている。尚、カラム
クロマトグラフィーの組み合わせは上記ステップに限定
する必要はないものの、電気泳動的に単一バンドにする
には数段階のカラムクロマトグラフィーの操作が必要で
ある。

【００２９】本発明のＤＮＡ断片は前述の性質を有する
耐熱性MAD 活性を有する蛋白質をコードする塩基配列を
有するものであれば特に限定されない。例えば配列表・
配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を含有するＤＮＡ断片、配列表・配列番号２に記載の塩
基配列を含有するＤＮＡ断片などが挙げられる。また前
述の性質を有する蛋白質をコードするものであれば、塩
基配列の一部が突然変異などにより変化（削除、置換、
付加、修飾など）したＤＮＡ断片であってもよい。本発
明のＤＮＡ断片は、バチルス属細菌、好適にはバチルス
・ステアロサーモフィラス、より好適にはバチルス・ス
テアローモフィラスＡＴＣＣ１２０１６菌体から常法に
より抽出、単離されたものでも、また常法により化学合
成されたものでもよい。

【００３０】例えばバチルス属細菌から、本発明のＤＮ
Ａを調製する方法としては、以下の方法が例示される。
まず、バチルス属細菌、好ましくはバチルス・ステアロ
サーモフィラスＡＴＣＣ１２０１６の染色体ＤＮＡを分
離・精製する。その後、超音波、制限酵素などを用いて
該ＤＮＡを切断し、得られたＤＮＡとリニヤーな発現用
ベクターとを両ＤＮＡの平滑末端または接着末端部にお
いてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環させて組換えベ
クターを作成する。こうして得られた組換えベクターを
複製可能な宿主微生物に移入して、遺伝子ライブラリー
を作成する。この遺伝子ライブラリーから、ベクターの
マーカーと耐熱性MAD 活性とを指標として耐熱性MAD を
コードするＤＮＡをもつ微生物（供与微生物）を得る。
次に得られた供与微生物を例えば液体培地で約１〜３日
間通気撹拌培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌
し、次いでこれを溶菌させることによって耐熱性MAD 遺
伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌方法と
しては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼなどの溶
菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼ
や他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの
界面活性剤が併用され、更に物理的破砕方法である凍結
融解やフレンチプレス処理を上述の溶菌方法と組み合わ
せても良い。

【００３１】次いで得られた溶菌物から常法に従って例
えばフェノール抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処
理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱遠心分離な
どの方法を適宜組み合わせることによりＤＮＡを単離、
精製する。得られたＤＮＡを例えば超音波処理、制限酵
素処理、好ましくII型制限酵素処理することにより、本
発明のＤＮＡ断片を調製する。

【００３２】本発明の組換えベクターは、前述の本発明
のＤＮＡ断片を含有するものであり、好ましくは大腸菌
内またはバチルス・ズブチリス内で自律増殖可能である
ことを特徴とするものである。本発明の組換えベクター
は、宿主細胞（例えば大腸菌、バチルス・ズブチリス）
に、耐熱性MAD をコードする遺伝子を発現させ、耐熱性
MAD を生産させる機能を与える発現ベクターであること
が好ましい。当該組換えベクターは、本発明のＤＮＡ断
片を発現用ベクターに組み込むことにより調製すること
ができる。用いられる発現用ベクターとしては、宿主微
生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミド
から遺伝子組換え用として構築された物が適している。
ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリーを宿主
微生物とする場合には、λｇｔ・１０，λｇｔ・１１な
どが使用できる。また、プラスミドとしては、例えばエ
シェリヒア・コリーを宿主微生物とする場合には、ｐＢ
Ｒ３２２，ｐＵＣ１９などが使用できる。バチルス・ズ
ブチリスを宿主微生物とする場合には、ｐＵＢ１１０，
ｐＣ１９４などが使用できる。更にエシェリヒア・コリ
ーおよびバチルス・ズブチリスなどのグラム陰性，陽性
にまたがる二種以上の宿主微生物で自立増殖可能なシャ
トルベクター、例えばｐＨＹ３００ＰＬＫなども利用す
ることができる。このような発現用ベクターを先に述べ
た耐熱性MAD 遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に
使用した制限酵素と同じ制限酵素で切断して、ベクター
断片を得ることが望ましい。本発明のＤＮＡ断片を当該
ベクター断片と結合させる方法は、公知のＤＮＡリガー
ゼを用いる方法で有れば良く、例えば本発明のＤＮＡ断
片の接着末端とベクター断片の接着末端とのアニーリン
グの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により、本発明の
ＤＮＡ断片とベクター断片との組換えベクターを作成す
る。必要ならば、アニーリングの後、宿主微生物に移入
して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し、組換えベクター
を作成することもできる。

【００３３】本発明の形質転換体は、前述の組換えベク
ターを担持するものであり、宿主微生物に常法により、
該組換えベクターを移入することにより調製することが
できる。宿主微生物としては、本発明の組換えベクター
が安定且つ自律的に増殖可能で、且つ外来性遺伝子の形
質発現できる物で有れば良く、例えばエシェリヒア・コ
リーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシ
ェリヒア・コリーＪＭ１０９、バチルス・ズブチリスＭ
Ｉ１１３、バチルス・ズブチリスＭＴ−２などが挙げら
れる。

【００３４】宿主微生物に組換えベクターを移入する方
法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリー
属に属する微生物の場合には、カルシウムイオン存在下
で組換えＤＮＡの移入を行い、またバチルス属に属する
微生物の場合には、コンピテントセル法[J.Mol.Biol.,5
6,209(1971)]またはプロトプラスト法[Mol.Gen.Genet,1
68,111(1979)] などを採用することができ、更にエレク
トロポレーション[Cell,48,813-825(1987)] を用いても
良い。こうして得られた形質転換体である微生物は、栄
養培地で培養されることにより、多量の耐熱性MAD を安
定に生産し得ることを見いだした。宿主微生物への目的
組換えベクター移入の有無についての選択は、目的とす
るＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーと耐熱
性MAD とを同時に発現する微生物を検索すれば良く、例
えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、且つ
耐熱性MAD を生成する微生物を選択すれば良い。なお、
本発明の耐熱性MAD 遺伝子を含有する形質転換体は、宿
主微生物由来のマレートデヒドロゲナーゼと区別するた
め、培養菌体を破砕した後、６５℃３０分間加熱処理
し、宿主由来のマレートデヒドロゲナーゼを完全に失活
させた後、マレートデヒドロゲナーゼ活性を測定するこ
とにより選択することができる。

【００３５】なお、一度、選択された本発明の耐熱性MA
D 遺伝子を担持する組換えベクターは、形質転換体から
取り出され、他の微生物に移入することも容易に実施で
きる。また本発明の耐熱性MAD 遺伝子を保持する組換え
ベクターから制限酵素などにより耐熱性MAD 遺伝子であ
るＤＮＡを切り出し、これを同様な方法により切断して
得られるベクター断片とを結合させて、宿主微生物に移
入する事も容易に実施できる。

【００３６】本発明の耐熱性MAD の製造法は、前述した
本発明の形質転換体を培養することによって実施され
る。用いられる培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考
慮して培養条件を選択すれば良く、通常多くの場合は液
体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有
利である。培地の炭素源としては、形質転換体の培養に
通常用いられる物が広く使用され得る。宿主微生物が資
化可能な炭素源であれば良く、例えばグルコース、シュ
ークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、
糖蜜、ピルビン酸などが使用できる。窒素源としては、
宿主微生物が利用可能な窒素化合物で有れば良く、例え
ばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解
物、大豆粕アルカリ抽出物のような有機窒素化合物や硫
安、塩安の様な無機窒素化合物が使用できる。その他、
リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウ
ム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定の
アミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用でき
る。

【００３７】培養温度は宿主微生物が発育し、耐熱性MA
D を生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・
コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培
養時間は条件によって多少変動するが、耐熱性MAD が最
高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了
すれば良く、通常は２０〜４８時間程度である。培地ｐ
Ｈは宿主微生物が発育しマレートデヒドロゲナーゼを生
産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ
６．０〜９．０程度である。培養液より菌体を回収する
方法は、通常用いられる方法により行えば良く、例えば
遠心分離、濾過などによって回収することができる。培
養液中の耐熱性MADが菌体外に分泌される場合は、この
菌体分離液を用いれば良く、以下の菌体破砕後の方法に
準じて耐熱性MAD を分離精製できる。

【００３８】耐熱性MAD が菌体内に存在する場合前述し
たような酵素的または物理的な破砕方法により破砕抽出
することができる。このようにして得られた耐熱性MAD
含有溶液を耐熱性MAD が失活せず且つ宿主由来のマレー
トデヒドロゲナーゼが失活するような温度で加熱処理す
る事により、例えば６５℃３０分処理により宿主由来の
マレートデヒドロゲナーゼを除去する。次いで、親水性
ポリマー処理、例えばポリエチレンイミン処理により除
核酸を行い、硫安沈澱により耐熱性MAD 画分を回収す
る。次いで回収した耐熱性MAD 液を、耐熱性MAD が失活
しない条件での長時間の加熱処理、例えば６０℃１６時
間処理により宿主由来の夾雑蛋白質を変性させ不溶性蛋
白質として除去できる。不溶性蛋白質の除去方法として
は通常用いられる方法を用いることができ、例えば遠心
分離や濾過などにより除去することができる。

【００３９】この耐熱性MAD 液から通常用いられる方
法、例えば半透膜を用いた透析やＳｅｐｈａｄｅｘＧ
−２５（ファルマシアＬＫＢ）ゲル濾過等により脱塩を
行うことができる。この操作の後、耐熱性MAD 溶液を酸
溶液、例えば酢酸にてｐＨを４．０に調製し、イオン交
換クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィー、
好ましくはＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬー６Ｂ（ファ
ルマシアＬＫＢ）により分離精製し、精製耐熱性MAD 標
品を得ることができる。この精製耐熱性MAD 標品は、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドになっている。

【００４０】本発明の製造法により得られる耐熱性MAD
は、４０℃において１０日間溶液状態で保存した後の残
存活性が少なくとも６０％、好ましくは７０％、さらに
好ましくは８０％、特に好ましくは９０％であるという
性質を有する。また以下に示す性質を有することが好ま
しい。作用：以下の反応を可逆的に触媒する。

【００４１】

【化６】

【００４２】基質特異性：Ｌ−リンゴ酸を特異的に酸
化、またはオキザロ酢酸を特異的に還元する。至適温度：７０℃ 至適ｐＨ：ｐＨ８．０熱安定性：７０℃以下ｐＨ安定性：ｐＨ３．０〜９．０等電点：４．８分子量：１４０，０００（ゲル濾過）、３８，０００
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）Ｋｍ値：４．３×１０-6 Ｍ（オキザロ酢酸）

【００４３】該酵素はバチルス・ステアロサーモフィラ
スＡＴＣＣ１２０１６が産生する酵素と熱安定性及び比
活性の点において異なっている。すなわち、バチルス・
ステアロサーモフィラスＡＴＣＣ１２０１６が産生する
酵素は、熱安定性が６５℃以下、比活性１０３Ｕ／ｍｇ
−蛋白質であるのに対し、本発明の耐熱性NAD 活性を有
する蛋白質は、熱安定性が７０℃以下、比活性が２０３
Ｕ／ｍｇ−蛋白質である。

【００４４】本発明のＧＯＴ測定用試薬は、前述の本発
明の耐熱性MAD を用いることを特徴とし、長期保存性に
優れた試薬である。すなわち本発明のＧＯＴ活性測定用
試薬は、ＮＡＤＨ、α−ケトグルタル酸、Ｌ−アスパラ
ギン酸、本発明のマレートデヒドロゲナーゼおよび必要
によりラクテートデヒドロゲナーゼを含有する。ここで
ラクテートデヒドロゲナーゼは直接にＧＯＴ活性測定反
応に関与する試薬ではない。しかしＧＯＴ反応で生成す
るオキザロ酢酸をは不安定であり、自然分解的に脱炭酸
分解してビルビン酸を生成するため、正確なＮＡＤ⁺変
換速度（ＧＯＴ活性値）が求められないのである（特開
昭57-39799号公報、特開昭57-53298号公報、特開昭59-1
75898 号公報参照) 。したがって、オキザロ酢酸から自
然分解的に脱炭酸して得られたピルビン酸の影響を回避
するために、ラクテートデヒドロゲナーゼを添加するこ
と望ましい。また、体液中のピルビン酸の影響を回避す
るためにも試薬中へラクテートデヒドロゲナーゼを添加
することが望ましい。本発明に使用するラクテートデヒ
ドロゲナーゼは４０℃において１０日間溶液状態で保存
した後の残存活性が少なくとも６０％であるものであれ
ば、いかなる起源のものを用いても良い。例えばウシ心
臓、ブタ心臓などの動物臓器由来のものや乳酸菌由来の
ものが挙げられるが、特に好ましくは安定性等において
優れている乳酸菌由来のものがある。

【００４５】本発明のＧＯＴ測定用試薬は一液であって
も、二液であってもよい。二液としては、ＮＡＤＨ、本
発明の耐熱性MAD 、必要によりラクテートデヒドロゲナ
ーゼ、α−ケトグルタル酸、またはＬ−アスパラギン酸
を含有する第一試薬、およびα−ケトグルタル酸または
Ｌ−アスパラギン酸を含む第二試薬からなるものが挙げ
られる。

【００４６】本発明の試薬組成としては、下記組成が好
適に例示される。なお、第一試薬と第二試薬を混和した
後の組成をモル濃度または酵素活性値で示す。ラクテートデヒドロゲナーゼ５００〜２０００Ｕ／ｌ本発明の耐熱性MAD ５００〜５０００Ｕ／ｌＬ−アスパラギン酸１５０〜２５０ｍｍｏｌ／ｌ α−ケトグルタル酸１０〜４０ｍｍｏｌ／ｌＮＡＤＨ０．１〜０．２５ｍｍｏｌ／ｌ緩衝物質０．０５〜０．１ｍｏｌ／ｌ

【００４７】緩衝物質としてはトリス塩酸、ナトリウム
リン酸、カリウムリン酸およびＧＯＯＤの緩衝物質が望
ましい。本発明の試薬はｐＨ７．０〜８．０であること
が好ましい。

【００４８】本発明のＧＯＴ活性測定法は、前述の本発
明のＧＯＴ活性測定用試薬を用いて行うことを特徴とす
る。すなわち本発明のＧＯＴ活性測定法は試料、すなわ
ちＧＯＴ測定被験物と、本発明のＧＯＴ活性測定用試薬
とを反応させ、試薬中のＮＡＤＨがＮＡＤ⁺に変換する
速度を３４０ｎｍにおける吸光度の減縮により求める方
法である。

【００４９】一般に検体１リットル当たりのＧＯＴ活性
単位は次のように求める。

【００５０】

【化７】

【００５１】なお、ＧＯＴ１Ｕ（国際単位）は、３０℃
で１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを消費する酵素量
として定義される。

【００５２】

【発明の効果】本発明の酵素は４０℃において１０日間
溶液状態で保存した後の残存活性が少なくとも６０％で
ある新規な耐熱性MAD である。本発明により耐熱性MAD
遺伝子の塩基配列及びそのアミノ酸配列が明かとなり、
工業的に大量生産ができるようになった。また、本発明
の製法により、野生株(ATCC12016) により生産された耐
熱性MADより高純度であり、かつ熱安定性に優れた耐熱
性MAD を製造することが可能となった。さらに本発明で
は４０℃において１０日間溶液状態で保存した後の残存
活性が少なくとも６０％である耐熱性MAD を使用するこ
とにより、長期保存性に優れたＧＯＴ測定用試薬が得ら
れる。液状化試薬が広まりつつある現在、このように液
状で安定な試薬は、用時調製という手間が省けるなど非
常に有用である。

【００５３】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例１〜６において、耐熱性マレートデヒドロゲ
ナーゼの活性測定は以下のようにして行った。すなわ
ち、９７ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、
０．４９ｍＭオキザロ酢酸、０．２ｍＭＮＡＤＨ中で
酵素を２５℃３〜４分間反応させ、３４０ｎｍにおける
吸光度を測定する。酵素活性の１単位は、この条件下で
１分間あたり１マイクロモルのＮＡＤＨを酸化する酵素
量とした。

【００５４】実施例１バチルス・ステアロサーモフィ
ラスＡＴＣＣ１２０１６株からの耐熱性MAD の精製耐熱性MAD 生産菌、バチルス・ステアロサーモフィラス
ＡＴＣＣ１２０１６を１０ｌジャーファーメンターで培
養した。培地組成は１％酢酸ナトリウムを含んだＬＢ
（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎ
ａＣｌ、ｐＨ７．４）培地であり、５０℃，２６時間通
気撹拌培養した。この時の生産性は約１．２Ｕ／ｍｌで
あった。得られた培養液５．２ｌより遠心分離により約
３０ｇの菌体を分離した。この菌体を５０ｍＭリン酸カ
リウム緩衝液、ｐＨ７．５に懸濁し、リゾチウム処理に
より破砕して約２ｌの菌体破砕液を得た。この時のマレ
ートデヒドロゲナーゼ活性は約３．１Ｕ／ｍｌであっ
た。菌体破砕液をポリエチレンイミン処理による除核酸
し、次いで硫安沈澱によりマレートデヒドロゲナーゼ画
分を回収し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．
５にて再懸濁を行った。この時の比活性は０．１６Ｕ／
ｍｇ−蛋白質であった。

【００５５】硫安沈澱再懸濁液はＳｅｐｈａｄｅｘＧ
−２５（ファルマシアＬＫＢ）で脱塩を行った。脱塩液
は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で緩衝
化したＤＥＡＥＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ（ファ
ルマシアＬＫＢ）カラムクロマトグラフィーに供し、
０．１５Ｍ〜０．３５ＭＮａＣｌグラジェントにて溶出
した。次いで０．１５飽和度の硫安を含んだ５０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５にて緩衝化したＰｈｅ
ｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ（ファルマシア
ＬＫＢ）カラムクロマトグラフィーに供し、０．１５〜
０．０飽和度硫安にて洗浄し、０〜５０％エチレングリ
コールにて溶出した。次いでこの酵素液を０．２ＭＮａ
Ｃｌを含んだ５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．
５にて緩衝化したＴＳＫｇｅｌＧ−３０００ＳＷ（徳山
曹達）ゲル濾過に供した。更にこの酵素液をＭｏｎｏＰ
ＨＲ５／５クロマトフォーカシング（ファルマシアＬ
ＫＢ）に供しｐＨ６．０〜４．５のｐＨ勾配により溶出
した。本方法により得られたマレートデヒドロゲナーゼ
標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的に均一なバンドを示し、こ
の時の比活性は１０８．０Ｕ／ｍｇ−蛋白質であった。
表１にこれまでの精製のまとめを示す。また表２に上記
方法により得られた耐熱性MAD の理化学的性質を示す。

【００５６】

【表１】

【００５７】

【表２】

【００５８】実施例２染色体ＤＮＡの分離バチルス・ステアロサーモフィラスＡＴＣＣ１２０１６
の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。同菌株を１５０
ｍｌの普通ブイヨン培地で６０℃一晩振盪培養後、遠心
分離（８０００ｒｐｍ，１０分間）により集菌した。１
０％シュークロース、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．
０）、５０ｍＭＥＤＴＡを含んだ溶液５ｍｌに懸濁さ
せ、１ｍｌのリゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え
て３７℃、１５分間保温し、次いで１ｍｌの１０％ＳＤ
Ｓ溶液を加えた。この溶液に等量のクロロホルム・フェ
ノール溶液（１：１）を加え、撹拌混合し、１０，００
０ｒｐｍ，３分間の遠心で水層と溶媒層にわけ、水層を
分取した。この水層に２倍量のエタノールを静かに重層
し、ガラス棒でゆっくり撹拌しながらＤＮＡをガラス棒
に巻きつかせて分離した。これを１ｍＭＥＤＴＡを含ん
だ１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０溶液（以下ＴＥと略
記）で溶解した。これを等量のクロロホルム・フェノー
ル溶液で処理後遠心分離により水層を分取し、２倍量の
エタノールを加えて、上記の方法で、もう一度ＤＮＡを
分離し、２ｍｌのＴＥで溶解した。エシェリヒア・コリ
ーＪＭ１０９のコンピテントセルはＨａｎａｈａｎの方
法により作成し、ライブラリー作成の宿主とした。

【００５９】実施例３耐熱性MAD をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片及
び該ＤＮＡ断片を有する組換えベクターの調製実施例２で得たＤＮＡ１μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ
（東洋紡製）で部分分解反応させ、２ｋｂｐ以上の断片
に分解した後、ＳａｌＩ（東洋紡製）で切断したｐＵＣ
１９０．５μｇとＭ．Ｇ．ＬｏｆｔｕｓらのＢＡＣＫ
ＦＩＬＬＩＮＧ法（ＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓＶｏ
ｌ．１２，Ｎｏ．２（１９９２））に従いＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（東洋紡製）１ユニットで１６℃、１２時間反応
させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒ
ア・コリーＪＭ１０９のコンピテントセルを用いて形質
転換した。使用したＤＮＡ１μｇ当たり約１×１０⁶個
の形質転換体のコロニーが得られた。次いで、得られた
コロニーは５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含んだＬＢ培
地５ｍｌ（１％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、
０．５％塩化ナトリウム）で３７℃１８時間培養し、遠
心分離（１２，０００ｒｐｍ、３分間）により菌体を回
収し、耐熱性マレートデヒドロゲナーゼ活性を有する形
質転換体をスクリーニングした。すなわち、回収した菌
体を１ｍｌの０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．
５）に懸濁後、ガラスビーズにより菌体を破砕した。菌
体破砕後、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，５分間）に
より菌体残渣を除去し粗酵素液とし、本粗酵素液を６５
℃３０分間加熱処理後マレートデヒドロゲナーゼ活性を
測定した。その結果、約１０，０００個のコロニーをス
クリーニングした結果、１株耐熱性MAD を生産する株を
見いだした。この株が保有するプラスミドには約１．９
ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片が存在しており、このプラスミ
ドをｐＭＤＨ１とした。このｐＭＤＨ１の挿入ＤＮＡ制
限酵素地図を図１に示した。

【００６０】実施例４塩基配列の決定ｐＭＤＨ１の約１．９ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片について
種々の制限酵素で切断してサブクローンを調製した。種
々のサブクローンは常法に従い、Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ
ｅｓｃｅｎｔＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇｋｉｔ
（東洋紡製）を用いて塩基配列を決定した。決定した塩
基配列及びアミノ酸配列を配列表に示した。アミノ酸配
列から求められる蛋白質の分子量は約３５，５００であ
り、バシラス・ステアロサーモフィラスＡＴＣＣ１２０
１６のマレートデヒドロゲナーゼの分子量（約３８，０
００）とほぼ一致した。

【００６１】実施例５エシェリヒア・コリー形質転換
体の作成ｐＭＤＨ１でエシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコンピ
テントセルを形質転換し、形質転換体ＪＭ１０９（ｐＭ
ＤＨ１）を得た。

【００６２】実施例６耐熱性MAD の製造前記のＬＢ培地６ｌを１０ｌジャーファーメンターに分
注し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷
後別途無菌濾過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカ
ライテスク製）及び２００ｍＭＩＰＴＧ（日本精化
製）をそれぞれ６ｍｌ添加した。この培地に上記と同一
の組成の培地で予め３７℃で１８時間振盪培養したエシ
ェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＭＤＨ１）の培養液６
０ｍｌを接種し、３７℃で１９時間通気撹拌培養した。
培養終了後の耐熱性MAD 活性は７．７Ｕ／ｍｌであっ
た。培養液６ｌを遠心分離にて集菌し、２８０ｍｌの５
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５に懸濁し、常
法によりダイノミル破砕機（ＷＡＢ社製、スイス）で破
砕した後８，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して耐熱
性MAD 粗酵素液を得た。このようにして得た粗酵素液を
６５℃、３０分間加熱処理をし宿主由来のマレートデヒ
ドロゲナーゼを失活せしめた後、ポリエチレンイミンを
用いて除核酸処理を実施した。次いで硫安沈澱により耐
熱性MAD 画分を回収し、上記緩衝液にて１６ｍｌに再懸
濁した。この再懸濁液を６０℃１６時間の加熱処理を行
った。加温処理後、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５で脱塩
を行った。脱塩された酵素液は、酢酸によりｐＨを４．
０に調製し、ＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ
（ファルマシアＬＫＢ）に供して精製マレートデヒドロ
ゲナーゼ標品を得た。ＣＭＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−
６Ｂクロマトグラフィー後の耐熱性マレートデヒドロゲ
ナーゼ標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドであり、
活性回収率は４９％であった。表３に形質転換体からの
精製のまとめを示す。また、表４に上記方法によって得
られた耐熱性MAD の理化学的性質を示す。

【００６３】

【表３】

【００６４】

【表４】

【００６５】表１と表３を比較すれば、本発明の耐熱性
MAD の製造方法では野生株であるバチルス・ステアロサ
ーモフィラスＡＴＣＣ１２０１６から精製した酵素に比
べより高純度の酵素を大量に調製できることが判る。ま
た表２と表４を比較すれば、本発明によって得られる耐
熱性MAD は野生株であるバシラス・ステアロサーモフィ
ラスＡＴＣＣ１２０１６株由来のマレートデヒドロゲナ
ーゼに比べより熱安定性に優れた酵素であることが判
る。

【００６６】実施例７エシェリヒア・コリーＪＭ１０
９（ｐＭＤＨ１）由来の耐熱性MAD を用いたＧＯＴ測定
用試薬の調製ＧＯＴ活性測定用試薬として下記の溶液を作製した。ラクテートデヒドロゲナーゼ５００Ｕ／ｌ耐熱性MAD １０００Ｕ／ｌＬ−アスパラギン酸２００ｍｍｏｌ／ｌ α−ケトグルタル酸１０ｍｍｏｌ／ｌＮＡＤＨ０．１６ｍｍｏｌ／ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）８０ｍｍｏｌ／ｌ

【００６７】耐熱性MAD はエシェリヒア・コリーＪＭ１
０９（ｐＭＤＨ１）より実施例６の方法により調製し
た。上記試薬を４０℃で保存して、１、２、４、７、１
０、１４、２１、３２日目に残存マレートデヒドロゲナ
ーゼ活性を測定した。結果は図２の○で示す通りであっ
て、１日間保存で９９％、２日間保存で９７％、４日間
保存で９５％、７日間保存で９４％、１０日間保存で９
２％、１４日間保存で９１％、２１日間保存で８１％、
３２日間保存で７４％の残存活性を有していた。

【００６８】実施例８ＩＦＣＣ法に準ずる市販のＧＯ
Ｔ測定用試薬との相関関係実施例６記載の耐熱性ＭＡＤを用い、ＩＦＣＣ法に準ず
る下記組成のＧＯＴ測定用試薬を調製した。トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）８０ｍＭＬ−アスパラギン酸２４０ｍＭ α−ケトグルタル酸１２ｍＭＮＡＤＨ０．１８ｍＭ耐熱性ＭＡＤ６００Ｕ／ｌラクテートデヒドロゲナーゼ９００Ｕ／ｌ上記組成のＧＯＴ測定用試薬とＩＦＣＣ法に準ずる市販
のＧＯＴ測定用試薬（ベーリンガー・マンハイム社製）
との相関関係を見た。結果は図３に示す通りであって、
良好な相関関係が得られた。

【００６９】比較例１バチルス・ステアロサーモフィ
ラスＡＴＣＣ１２０１６由来のマレートデヒドロゲナー
ゼを用いたＧＯＴ測定用試薬の調製ＧＯＴ測定用試薬として実施例１の組成の溶液を調製し
た。但しマレートデヒドロゲナーゼとしてバチルス・ス
テアロサーモフィラスＡＴＣＣ１２０１６より実施例１
の方法により調製した酵素を用いた。上記試薬を４０℃
で保存して、１、２、４、７、１０、１４、２１、３２
日目に残存マレートデヒドロゲナーゼ活性を測定した。
結果は図２の●で示す通りであって、１日間保存で９９
％、２日間保存で９７％、４日間保存で９３％、７日間
保存で９０％、１０日間保存で８０％、１４日間保存で
７２％、２１日間保存で６３％、３２日間保存で４５％
の残存活性を有していた。

【００７０】比較例２豚心臓由来のマレートデヒドロ
ゲナーゼを用いたＧＯＴ測定用試薬の調製ＧＯＴ測定用試薬として実施例１の組成の溶液を調製し
た。但しマレートデヒドロゲナーゼとして市販の豚心臓
由来の酵素を用いた。上記試薬を４０℃で保存して、１、２、４、７、１０、
１４、２１、３２日目に残存マレートデヒドロゲナーゼ
活性を測定した。結果は図２の▲で示す通りであって、
１日間保存で１７％、２日間保存で２％、４日間保存で
１％、７日間保存で１％、１０日間保存で０％、１４日
間保存で０％、２１日間保存で０％、３２日間保存で０
％の残存活性を有していた。

【００７１】比較例３サーマス属由来のマレートデヒ
ドロゲナーゼを用いたＧＯＴ測定用試薬の調製ＧＯＴ測定用試薬として実施例１の組成の溶液を作製し
た。但しマレートデヒドロゲナーゼとして市販のサーマ
ス由来の酵素を用いた。上記試薬を４０℃で保存して、
１、２、４、７、１０、１４、２１、３２日目に残存マ
レートデヒドロゲナーゼ活性を測定した。結果は図２の
□で示す通りであって、１日間保存で９９％、２日間保
存で９７％、４日間保存で９２％、７日間保存で８７
％、１０日間保存で７５％、１４日間保存で６６％、２
１日間保存で４５％、３２日間保存で３１％の残存活性
を有していた。上記のようにバチルス属細菌由来の遺伝
子を導入された組換え体により生産されるマレートデヒ
ドロゲナーゼのＧＯＴ測定用試薬中での安定性が示され
た。

【００７２】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３２９配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質起源生物名：バシラス・ステアロサーモフィラス株名：ＡＴＣＣ１２０１６配列の特徴他の情報：マレートデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白
質配列 Met Ala Met Lys Arg Lys Lys Ile Ser Val Ile Gly Ala Gly Phe Thr 1 5 10 15 Gly Ala Thr Thr Ala Phe Leu Leu Ala Gln Lys Glu Leu Gly Asp Val 20 25 30 Val Leu Val Asp Ile Pro Gln Leu Glu Asn Pro Thr Lys Gly Lys Ala 35 40 45 Leu Asp Met Leu Glu Ala Ser Pro Val Leu Gly Phe Asp Ala Asn Ile 50 55 60 Ile Gly Thr Ser Asp Tyr Ala Asp Thr Ala Asp Ser Asp Ile Val Val 65 70 75 80 Ile Thr Ala Gly Ile Ala Arg Lys Pro Gly Met Ser Arg Asp Asp Leu 85 90 95 Val Thr Thr Asn Gln Lys Ile Met Lys Gln Val Thr Lys Glu Val Val 100 105 110 Lys Tyr Ser Pro Asn Cys Tyr Ile Ile Val Leu Thr Asn Pro Val Asp 115 120 125 Ala Met Thr Tyr Thr Val Phe Lys Glu Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg 130 135 140 Val Ile Gly Gln Ser Gly Val Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Thr Phe 145 150 155 160 Val Ala Glu Glu Leu Asn Ile Ser Val Lys Asp Val Thr Gly Phe Val 165 170 175 Leu Gly Gly His Gly Asp Asp Met Var Pro Leu Val Arg Tyr Ser Tyr 180 185 190 Ala Gly Gly Ile Pro Leu Glu Lys Leu Ile Pro Lys Asp Arg Leu Asp 195 200 205 Ala Ile Val Glu Arg Thr Arg Lys Gly Gly Gly Glu Ile Val Asn Leu 210 215 220 Leu Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Pro Ala Ala Ser Leu Val Glu 225 230 235 240 Met Val Glu Ala Ile Leu Lys Asp Gln Arg Arg Ile Leu Pro Ala Ile 245 250 255 Ala Tyr Leu Glu Gly Glu Tyr Gly Tyr Glu Gly Ile Tyr Leu Gly Val 260 265 270 Pro Thr Ile Leu Gly Gly Asn Gly Ile Glu Lys Val Ile Glu Leu Glu 275 280 285 Leu Thr Glu Glu Glu Lys Ala Arg Ser Pro Asn Pro Ser Asn Pro Leu 290 295 300 Lys Met Ser Cys Ala Cys Trp Asn Ser Gly Glu Ala Lys Ile Arg Ala 305 310 315 320 Leu Pro Gly Phe Leu Ser His Ser Gln 325 329

【００７３】配列番号：２配列の長さ：１９１２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源：生物名：バシラス・ステアロサーモフィラス株名：ＡＴＣＣ１２０１６配列 AATCAACTAC GCGATTGAAC ACGGCCGCAA GTCGGTGACG CTCGTTCATA AAGGAAACAT 60 TATGAAATTC ACCGAAGGCG CGTTTAAAAA CTGGGGTTAT GAATTGGCGG AGGAAGAATT 120 CGCCGACAAA GTGTTCACGT GGGCGCAATA CGACCGAATC GTTGAAACGG AAGGCAAGGA 180 AGCGGCGAAC AAAGCGCTTG CTGATGCGGA ACGGTCCGGC AAAATCATTA TCAAAGATGT 240 CATCGCCGAC ATCTTCCTGC AACAAATTTT GACGCGTCGC GCGAATTTGA CGTCATCGCG 300 ACGATGAACT TAAACGGCGA CTACATTTCC GACGCGCTGG CCGCTCAAGT CGGCGGCATC 360 GGCATCGCGC CGGGGGCCAA CATCAACTAC GAAACCGGCC ACGCGATTTT CGAAGCGACG 420 CACGGCACGG CTGCCGAATA CGCAGGCTTG ACAAAGTCAC CGTCGTCCGT CATTCTCTCG 480 GCGTCATGAT GTTTGAGCAT CTTGGTTGGA ACGAAGCAGC GAAATTGATC ATCAAAGCGA 540 TGGAGAAAAC CATCGCCGCG AAAATCGTCA CGTATGACTT CGCCCGCCTG ATGGAAGGGG 600 CGACGGAAGT GAAATGCTCC GAATTTGCTG ATGCGCTCAT CCGCAATATG GACTAACCTT 660 TGAAGGAAAG GGATGGCAAA CG 682 ATG GCG ATG AAA CGG AAA AAA ATC TCG GTG ATC GGC GCC GGA TTC ACG 730 Met Ala Met Lys Arg Lys Lys Ile Ser Val Ile Gly Ala Gly Phe Thr 1 5 10 15 GGG GCG ACG ACG GCG TTC CTT TTG GCG CAA AAA GAG CTC GGC GAC GTC 778 Gly Ala Thr Thr Ala Phe Leu Leu Ala Gln Lys Glu Leu Gly Asp Val 20 25 30 GTG TTG GTC GAT ATT CCG CAG CTT GAG AAC CCA ACG AAA GGG AAG GCG 826 Val Leu Val Asp Ile Pro Gln Leu Glu Asn Pro Thr Lys Gly Lys Ala 35 40 45 CTC GAT ATG CTC GAG GCA AGC CCG GTG CTC GGC TTT GAC GCG AAT ATC 874 Leu Asp Met Leu Glu Ala Ser Pro Val Leu Gly Phe Asp Ala Asn Ile 50 55 60 ATC GGC ACA TCG GAT TAC GCT GAC ACA GCC GAT TCC GAC ATC GTC GTC 922 Ile Gly Thr Ser Asp Tyr Ala Asp Thr Ala Asp Ser Asp Ile Val Val 65 70 75 80 ATC ACA GCA GGC ATC GCC CGC AAG CCG GGC ATG AGC CGC GAC GAT TTG 970 Ile Thr Ala Gly Ile Ala Arg Lys Pro Gly Met Ser Arg Asp Asp Leu 85 90 95 GTG ACG ACG AAC CAA AAA ATT ATG AAG CAA GTG ACG AAG GAA GTC GTC 1018 Val Thr Thr Asn Gln Lys Ile Met Lys Gln Val Thr Lys Glu Val Val 100 105 110 AAA TAC TCG CCG AAC TGC TAC ATC ATC GTC TTG ACG AAC CCG GTC GAT 1066 Lys Tyr Ser Pro Asn Cys Tyr Ile Ile Val Leu Thr Asn Pro Val Asp 115 120 125 GCG ATG ACG TAT ACG GTC TTT AAG GAA TCC GGA TTC CCG AAA AAC CGC 1114 Ala Met Thr Tyr Thr Val Phe Lys Glu Ser Gly Phe Pro Lys Asn Arg 130 135 140 GTC ATC GGC CAG TCG GGC GTC TTG GAT ACG GCG CGC TTC CGC ACG TTC 1162 Val Ile Gly Gln Ser Gly Val Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Thr Phe 145 150 155 160 GTC GCC GAG GAG CTG AAC ATT TCG GTA AAA GAT GTC ACT GGG TTT GTT 1210 Val Ala Glu Glu Leu Asn Ile Ser Val Lys Asp Val Thr Gly Phe Val 165 170 175 TTA GGC GGC CAT GGC GAT GAC ATG GTG CCG CTC GTC CGC TAC TCG TAC 1258 Leu Gly Gly His Gly Asp Asp Met Var Pro Leu Val Arg Tyr Ser Tyr 180 185 190 GCC GGC GGC ATT CCG CTC GAA AAA CTC ATT CCG AAA GAT CGT TTG GAC 1306 Ala Gly Gly Ile Pro Leu Glu Lys Leu Ile Pro Lys Asp Arg Leu Asp 195 200 205 GCC ATC GTT GAG CGG ACG CGC AAA GGC GGC GGT GAA ATC GTC AAC CTG 1354 Ala Ile Val Glu Arg Thr Arg Lys Gly Gly Gly Glu Ile Val Asn Leu 210 215 220 CTC GGC AAC GGC AGC GCC TAC TAC GCA CCG GCC GCC TCG CTT GTC GAA 1402 Leu Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Pro Ala Ala Ser Leu Val Glu 225 230 235 240 ATG GTC GAA GCG ATT TTG AAA GAC CAG CGC CGC ATT TTG CCG GCG ATC 1450 Met Val Glu Ala Ile Leu Lys Asp Gln Arg Arg Ile Leu Pro Ala Ile 245 250 255 GCC TAC CTT GAA GGC GAA TAC GGC TAT GAA GGC ATT TAT TTG GGC GTG 1498 Ala Tyr Leu Glu Gly Glu Tyr Gly Tyr Glu Gly Ile Tyr Leu Gly Val 260 265 270 CCG ACG ATC CTC GGC GGC AAC GGC ATC GAG AAA GTG ATC GAG CTC GAG 1546 Pro Thr Ile Leu Gly Gly Asn Gly Ile Glu Lys Val Ile Glu Leu Glu 275 280 285 CTG ACC GAA GAG GAA AAA GCG CGC TCG CCA AAT CCG TCG AAT CCG TTA 1594 Leu Thr Glu Glu Glu Lys Ala Arg Ser Pro Asn Pro Ser Asn Pro Leu 290 295 300 AAA ATG TCA TGC GCA TGC TGG AAT AGC GGC GAG GCA AAA ATT CGG GCA 1642 Lys Met Ser Cys Ala Cys Trp Asn Ser Gly Glu Ala Lys Ile Arg Ala 305 310 315 320 TTG CCC GGA TTT TTG TCC CAC AGT CAA 1669 Leu Pro Gly Phe Leu Ser His Ser Gln 325 329 TGAAAGCGCT TTCTAGACAA CGAAGGGGTG GGA ATGTT GAAAAAACGA AAGCTCGGGA 1729 GACGGATCGG GGAAATTCAA GCGGGGGAAA AGCTCGTGTT CCAAGCCGCC ATCGAAGACA 1789 AAGACTTGCT TCTTTATCTT GGGCTGACGG ATGATGCCAA TCCGCTCTAT ATCCAGCATG 1849 ATTATGCTTC ACAGACGCCG TTTGGAAAAC CGGTCGTGCC GCCGGTCATG TTGACGGGGA 1909 TGA 1912

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の酵素の生産に使用したプラスミドｐＭ
ＤＨ１の挿入ＤＮＡ制限酵素地図を示す。

【図２】本発明の試薬および比較例１〜３の試薬を４０
℃で保存したときのマレートデヒロドゲナーゼの残存活
性を示す。

【図３】本発明の耐熱性ＭＡＤを用いたＩＦＣＣ法に準
ずる組成のＧＯＴ測定用試薬とＩＦＣＣ法に準ずる市販
のＧＯＴ測定用試薬との相関関係を示す。

【符号の説明】

図２中、○は本発明の酵素、●はバチルス・ステアロサ
ーモフィルスＡＴＣＣ１２０１６由来の酵素、▲はブタ
心臓由来の酵素、□はサーマス属菌由来の酵素

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07） (72)発明者川村良久福井県敦賀市東洋町10番24号東洋紡績株式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者愛水重典福井県敦賀市東洋町10番24号東洋紡績株式会社敦賀バイオ研究所内審査官斎藤真由美 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12N 1/00 - 1/38 C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/00 - 1/70 G01N 33/50 - 33/98 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（ＧＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表・配列番号１に記載されたアミノ
酸配列を含有することを特徴とする耐熱性マレートデヒ
ドロゲナーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項２】配列表・配列番号２に記載される塩基配
列を含有する遺伝子を導入された組換え体により生産さ
れたものであることを特徴とする耐熱性マレートデヒド
ロゲナーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項３】配列表・配列番号２に記載される塩基配
列が、部分的削除、置換および／または付加による変異
によって得られた遺伝子を担持する組み換え体により生
産されたものであることを特徴する耐熱性マレートデヒ
ドロゲナーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項４】下記の特性を有することを特徴とする耐
熱性マレートデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質。作用：以下の反応を可逆的に触媒する。【化１】基質特異性：Ｌ−リンゴ酸を特異的に酸化するか、また
はオキザロ酢酸を特異的に還元する。至適温度：７０℃ 至適ｐＨ：ｐＨ８．０熱安定性：７０℃以下ｐＨ安定性：ｐＨ３．０〜９．０等電点：４．８分子量：１４０，０００（ゲル濾過）、３８，０００
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）Ｋｍ値：４．３×１０^-6Ｍ（オキザロ酢酸）
【請求項５】４０℃において１０日間溶液状態で保存
した後の残存活性が少なくとも６０％であることを特徴
とする請求項１〜４のいずれかに記載の耐熱性マレート
デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項６】４０℃において１０日間溶液状態で保存
した後の残存活性が少なくとも７０％であることを特徴
とする請求項１〜４のいずれかに記載の耐熱性マレート
デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項７】４０℃において１０日間溶液状態で保存
した後の残存活性が少なくとも８０％であることを特徴
とする請求項１〜４のいずれかに記載の耐熱性マレート
デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項８】４０℃において１０日間溶液状態で保存
した後の残存活性が少なくとも９０％であることを特徴
とする請求項１〜４のいずれかに記載の耐熱性マレート
デヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項９】バチルス属細菌由来の耐熱性マレートデ
ヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子
を担持する組換え体により生産された蛋白質であること
を特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の耐熱性マ
レートデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項１０】バチルス・ステアロサーモフィラス由
来の耐熱性マレートデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白
質をコードする遺伝子を担持する組換え体により生産さ
れた蛋白質であることを特徴とする請求項１〜４のいず
れかに記載の耐熱性マレートデヒドロゲナーゼ活性を有
する蛋白質。
【請求項１１】バチルス・ステアロサーモフィラスＡ
ＴＣＣ１２０１６由来の耐熱性マレートデヒドロゲナー
ゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を担持する組
換え体により生産された蛋白質であることを特徴とする
請求項１〜４のいずれかに記載の耐熱性マレートデヒド
ロゲナーゼ活性を有する蛋白質。
【請求項１２】配列表・配列番号１に記載されるアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列を含有することを特徴と
するＤＮＡ断片。
【請求項１３】配列表・配列番号２に記載される塩基
配列を含有することを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項１４】請求項１２または１３に記載のＤＮＡ
断片の塩基配列が、部分的削除、置換および／または付
加による変異によって得られた、耐熱性マレートデヒド
ロゲナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ断
片。
【請求項１５】請求項１２、１３または１４に記載さ
れたＤＮＡ断片を含有する組換えベクター。
【請求項１６】大腸菌内またはバチルス・ズブチリス
内で自律的増殖可能であることを特徴とする請求項１５
記載の組換えベクター。
【請求項１７】請求項１５または１６に記載された組
換えベクターにより形質転換された形質転換体。
【請求項１８】宿主細胞が、大腸菌またはバチルス・
ズブチリスであることを特徴とする請求項１７記載の形
質転換体。
【請求項１９】請求項１７または１８に記載された形
質転換体を培地で培養し、耐熱性マレートデヒドロゲナ
ーゼ活性を有する蛋白質を生成させ、該蛋白質を採取す
ることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の
耐熱性マレートデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質の
製造法。
【請求項２０】ＮＡＤＨ、Ｌ−アスパラギン酸、α−
ケトグルタル酸および請求項１〜１１に記載の耐熱性マ
レートデヒドロゲナーゼ活性を有する蛋白質を含有する
グルタミン酸・オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯ
Ｔ）活性測定用試薬。
【請求項２１】ＮＡＤＨ、Ｌ−アスパラギン酸、α−
ケトグルタル酸、ラクテートデヒドロゲナーゼおよび請
求項１〜１１に記載の耐熱性マレートデヒドロゲナーゼ
活性を有する蛋白質を含有するグルタミン酸・オキザロ
酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）活性測定用試薬。
【請求項２２】マレートデヒドロゲナーゼが下記の特
性を有することを特徴とする請求項２０または２１に記
載のＧＯＴ活性測定用試薬。作用：以下の反応を可逆的に触媒する。【化２】基質特異性：Ｌ−リンゴ酸を特異的に酸化するか、また
はオキザロ酢酸を特異的に還元する。至適温度：７０℃ 熱安定性：ｐＨ８．０ｐＨ安定性：ｐＨ３．０〜９．０等電点：４．８分子量：１４９，０００（ゲル濾過）、３８，０００
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）Ｋｍ値：４．３×１０^-6Ｍ（オキザロ酢酸）
【請求項２３】下記組成を有するＧＯＴ活性測定用試
薬。ラクテートデヒドロゲナーゼ５００〜２０００Ｕ／ｌ請求項１〜１１記載のマレートデヒドロゲナーゼ５００〜５０００Ｕ／ｌＬ−アスパラギン酸１５０〜２５０ｍｍｏｌ／ｌ α−ケトグルタル酸１０〜４０ｍｍｏｌ／ｌＮＡＤＨ０．１〜０．２５ｍｍｏｌ／ｌ緩衝物質（ｐＨ７．０〜８．０）０．０５〜０．１ｍ
ｍｏｌ／ｌ
【請求項２４】試料に請求項２０〜２３に記載のＧＯ
Ｔ活性測定用試薬を反応させて、消費されるＮＡＤＨを
測定することを特徴とするＧＯＴ活性測定法。