JP5531272B2 - 熱安定性を向上させた改変型グリセロールキナーゼ - Google Patents
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Description
ここで、適当な温度で一定期間保存する条件とは、例えば、「60℃、15分間保存」などの加速(苛酷)試験の条件が選択されるが、時間が許せば、臨床検査薬が実際に長期保存される温度として汎用される2℃〜10℃の冷蔵条件下で6ヶ月以上の保存を選択しても良い。
また、適当な緩衝液とは、グリセロールキナーゼが作用するpH範囲で十分な緩衝能力を持つようにその種類と濃度を選べば特に限定されないが、例えば、50mMトリス緩衝液(pH8.0)、または、50mMのPIPES−NaOH緩衝液(pH7.0)などが選択される。診断薬用途を想定して、緩衝液は、界面活性剤、塩類、キレート剤、防腐剤などをさらに含んでいてもよい。
保存におけるグリセロールキナーゼの濃度は、特に限定されないが、通常の診断試薬に使用される濃度を想定した0.2〜30U/mlが好ましく選択される。さらに好ましくは1〜10U/mlである。
まず、特開2004−121234号公報の教示に従って、セルロモナス・エスピーJCM2471株(理化学研究所 生物基盤研究部 微生物系統保存施設より購入可能)から染色体DNAを分離して、公知のグリセロールキナーゼの塩基配列を基に設計したPCR用プライマーを使用したPCRによりグリセロールキナーゼ遺伝子を増幅させ、配列表の配列番号1で示す塩基配列(配列番号2で示すアミノ酸配列をコードする遺伝子の配列)を得る。
この際のプラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コリー(Escherichia coli)を宿主微生物とする場合には、pBluescript、pUC18などが使用できる。宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリーDH5、エシェリヒア・コリーW3110、エシェリヒア・コリーC600などが利用できるが、宿主由来のグリセロールキナーゼの混入を避けるためには、特開2007−195453号公報で開示されているグリセロールキナーゼ欠損株のエシェリヒア・コリーKM1株などを用いることが好ましい。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えDNAの移入を行う方法などを採用することができる。代わりに、エレクトロポレーション法や市販のコンピテントセル(例えばコンピテントハイJM109;東洋紡績製)を用いても良い。
計算式:
活性値(U/ml)={(ΔODtest−ΔODblank)×3.55(ml)×希釈倍率}/{13.3×1/2×1.0(cm)×0.1(ml)}
3.55(ml):反応混液液量
13.3:キノン色素を上記測定条件下で測定した時のミリモル吸光係数
1/2:酵素反応で生成した過酸化水素の1分子から形成するキノン色素が1/2分子であることによる係数
1.0cm:セルの光路長
0.1(ml):酵素サンプル液量
特開2004−121234号公報に開示されている、セルロモナス・エスピーJCM2471株由来のグリセロールキナーゼをコードするDNA配列から推定されるアミノ酸配列と同じアミノ酸配列をコードするDNA配列であって、コドン使用が大腸菌での発現に最適となるように修正され、その5’末端側と3’側に、各々制限酵素NcoIとNotIの認識配列が付与されたDNAを人工的に合成した。この合成DNAをNcoIとNotIで切断して得たDNA断片と、プラスミドpSE380(インビトロゲン社製)をNcoIとNotIで切断したものとを、Ligation Highキットにて16℃,1時間反応させて連結して組換えプラスミドpCGK14を得、この組換えベクターで、エシェリヒア・コリーJM109株(E.coli JM109)のコンピテントセル(東洋紡績製)を形質転換し、100μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布し、37℃,終夜培養して形質転換体を取得した。
(a)上記グリセロールキナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドpCGK14と、配列表の配列番号3記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、QuickChangeTM Site−Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、そのプロトコールに従って変異処理操作を行い、更に塩基配列を決定して、配列番号2記載のアミノ酸配列の50番目のグルタミンがグルタミン酸に置換された改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミド(pCGK14M1)を取得した。
(b)また、pCGK14と、配列表の配列番号4記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、QuickChangeTM Site−Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、上記と同様の操作により、配列番号2記載のアミノ酸配列の137番目のグリシンと138番目のプロリンがそれぞれアラニンとセリンに置換された改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミド(pCGK14M2)を取得した。
(c)また、pCGK14と、配列表の配列番号5記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、QuickChangeTM Site−Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、上記と同様の操作により、配列番号2記載のアミノ酸配列の163番目のアスパラギンと164番目のスレオニンがそれぞれスレオニンとイソロイシンに置換された改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミド(pCGK14M3)を取得した。
(d)また、pCGK14と、配列表の配列番号6記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、QuickChangeTM Site−Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、上記と同様の操作により、配列番号2記載のアミノ酸配列の274番目のロイシンがメチオニンに置換された改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミド(pCGK14M4)を取得した。
(e)また、pCGK14と、配列表の配列番号7記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、QuickChangeTM Site−Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE製)を用いて、上記と同様の操作により、配列番号2記載のアミノ酸配列の386番目のスレオニンと388番目のフェニルアラニンがそれぞれイソロイシンとチロシンに置換された改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミド(pCGK14M5)を取得した。
pCGK14M1、pCGK14M2、pCGK14M3、pCGK14M4、pCGK14M5の各組換えプラスミドで、グリセロールキナーゼ欠損株であるエシェリヒア・コリーKM1株(特開平11−9279号公報参照)を、ジーン・パルサーを用いたエレクトロポレーション法により形質転換し、形質転換体をそれぞれ取得した。
比較例として、pCGK14によりエシェリヒア・コリーKM1株を形質転換し、実施例3の方法と同様にして形質転換体を培養し、培養液からグリセロールキナーゼを抽出して野生型グリセロールキナーゼを取得した。
実施例3で取得した改変型グリセロールキナーゼ(CGKM1、CGKM2、CGKM3、CGKM4、CGKM5)および比較例1で取得した野生型グリセロールキナーゼをそれぞれ、40℃〜70℃の範囲で各15分間熱処理した後の残存酵素活性率(%)を測定し、各温度処理による残存活性率のプロットから残存活性率が50%になる温度(Tm(℃))を算出した。その結果を以下の表1に示す。表1から判るように、実施例3で取得した改変型グリセロールキナーゼは、改変前の野生型グリセロールキナーゼと比べて熱安定性が向上していることが確認された。
(a)実施例2で取得した改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミドpCGK14M1と、配列表の配列番号6記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、実施例2と同様の操作により、配列番号2記載のアミノ酸配列の50番目のグルタミンと274番目のロイシンがそれぞれグルタミン酸とメチオニンに置換された改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミド(pCGK14M6)を取得した。
(b)また、pCGK14M1と、配列表の配列番号7記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、実施例2と同様の操作により、配列番号2記載のアミノ酸配列の50番目のグルタミン、386番目のスレオニンおよび388番目のフェニルアラニンがそれぞれグルタミン酸、イソロイシンおよびチロシンに置換された改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミド(pCGK14M7)を取得した。
(c)また、上記(b)で取得したpCGK14M7と、配列表の配列番号6記載の合成オリゴヌクレオチドおよびこれと相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いて、実施例2と同様の操作により、配列番号2記載のアミノ酸配列の50番目のグルタミン、274番目のロイシン、386番目のスレオニンおよび388番目のフェニルアラニンがそれぞれグルタミン酸、メチオニン、イソロイシンおよびチロシンに置換された改変型グリセロールキナーゼをコードする組換えプラスミド(pCGK14M8)を取得した。
pCGK14M6、pCGK14M7、pCGK14M8の各組換えプラスミドで、エシェリヒア・コリーKM1株(特開平11−9279号公報参照)を実施例3と同様の手順で形質転換して、形質転換体を取得し、実施例3と同様の手順で培養、抽出することにより、各改変型グリセロールキナーゼCGKM6、CGKM7、CGKM8の粗酵素標品を取得した。
実施例6で取得した改変型グリセロールキナーゼ(CGKM6、CGKM7、CGKM8)をそれぞれ、40℃〜70℃の範囲で各15分間熱処理した後の残存酵素活性率(%)を測定し、各温度処理による残存活性率のプロットから残存活性率が50%になる温度(Tm(℃))を算出した。その結果を、実施例3で取得した改変型グリセロールキナーゼCGKM1、CGKM4、CGKM5のTmおよび比較例1で取得した野生型グリセロールキナーゼのTmのデータと共に表2に示す。表2から判るように、実施例6で取得した改変型グリセロールキナーゼCGKM6、CGKM7、CGKM8は、改変前の野生型グリセロールキナーゼおよび実施例3で取得した改変型グリセロールキナーゼCGKM1、CGKM4、CGKM5と比べて熱安定性が向上していることが確認された。
配列番号2は、配列番号1の遺伝子によってコードされるグリセロールキナーゼのアミノ酸配列である。
配列番号3〜7は、実施例2または5で変異処理のために使用した合成オリゴヌクレオチドの配列である。
Claims (8)
- セルロモナス属の細菌由来の野生型グリセロールキナーゼより熱安定性を向上させた改変型グリセロールキナーゼであって、配列表の配列番号2で示すアミノ酸配列に、Q50E、(T386I+F388Y)、(Q50E+L274M)、(Q50E+T386I+F388Y)、および(Q50E+L274M+T386I+F388Y)からなる群から選択されるアミノ酸置換が導入されたアミノ酸配列を有することを特徴とする改変型グリセロールキナーゼ。
- 請求項1に記載の改変型グリセロールキナーゼをコードすることを特徴とする遺伝子。
- 請求項2に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換えベクター。
- 請求項3に記載の組換えベクターで形質転換されたことを特徴とする形質転換体。
- 請求項4に記載の形質転換体を培養することを特徴とする改変型グリセロールキナーゼの製造方法。
- グリセロールキナーゼを使用する中性脂肪アッセイキットであって、グリセロールキナーゼとして請求項1に記載の改変型グリセロールキナーゼを使用することを特徴とする中性脂肪アッセイキット。
- グリセロールキナーゼを使用する中性脂肪センサーであって、グリセロールキナーゼとして請求項1に記載の改変型グリセロールキナーゼを使用することを特徴とする中性脂肪センサー。
- グリセロールキナーゼを使用する中性脂肪測定方法であって、グリセロールキナーゼとして請求項1に記載の改変型グリセロールキナーゼを使用することを特徴とする中性脂肪測定方法。
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