WO2021149675A1 - ３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素及びその製造方法 - Google Patents

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hydroxybutyric acid
acid dehydrogenase
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dehydrogenase according
residual activity
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千夏 田邉
晋平 伊藤
裕 川南
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東洋紡株式会社
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    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase

Definitions

  • the present invention relates to 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase.
  • the present invention comprises a 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase derived from a microorganism of the genus Geobacillus, an expression vector having a DNA encoding the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase, and transformation with the expression vector.
  • the present invention relates to the transformed product, a method for producing the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase, a method for measuring a ketone body using the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase, and the like.
  • ketone bodies In the field of clinical examination, measurement of blood ketone bodies is used as a metabolic index that reflects the degree of deficiency of insulin action in diabetic patients.
  • the ketone body is a general term for acetoacetic acid, 3-hydroxybutyric acid and acetone, but most of the blood ketone bodies are occupied by acetoacetic acid and 3-hydroxybutyric acid.
  • ketone bodies are mainly produced in the liver as metabolites in the process of oxidizing fatty acids, but they are also an indicator of whether or not sugars are properly used as an energy source. Since 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase can be used for the quantification of ketone bodies, it is an industrially useful enzyme.
  • 3-Hydroxybutyric acid dehydrogenase (EC 1.1.1.130) reacts in the presence of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) to oxidize 3-hydroxybutyric acid to produce acetoacetic acid and reduced NAD.
  • NAD nicotinamide adenine dinucleotide
  • microbial-derived enzymes include Rhodobacter rubrum (Non-Patent Document 1), Pseudomonas remoignei (Non-Patent Document 2), and Rhodobacter meliotilia (Non-Patent Document 3).
  • Alcaligenes faecalis (Patent Document 1), Rhodobacter sphaeroides (Patent Document 2) and the like.
  • Patent Document 3 reports a method of adding an alkali metal halide as a stabilizer. In this method, the effect of improving the storage stability of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase is observed by using an alkali metal halide and a specific buffer solution. However, since the buffer solution suitable for the alkali metal halide is limited, there is a problem in practicality.
  • Patent Document 4 reports a variant of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase derived from Alkaline Genesis faecalis
  • Patent Document 5 reports a variant of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase derived from Rhodobacter spharoides.
  • the stability of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase is improved by introducing mutations at specific sites, but enzyme properties other than stability may change unexpectedly.
  • Japanese Unexamined Patent Publication No. 8-70856 Japanese Unexamined Patent Publication No. 11-318438 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-83660 International Publication No. 2017/109003 International Publication No. 2017/137491
  • the present invention was devised in view of the current state of the prior art as described above, and an object of the present invention is to dehydrogenase 3-hydroxybutyric acid, which has high stability and high affinity for 3-hydroxybutyric acid. It is an object of the present invention to establish an industrial production method of an enzyme and the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase, and to provide a blood ketone body measurement composition using the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase.
  • a typical aspect of the present invention is as follows.
  • Item 1 A 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase derived from a microorganism of the genus Geobacillus and having the following physicochemical properties (a) to (g).
  • Action Catalyzes the following reactions.
  • B Optimal temperature: 55 ° C. or higher
  • Thermal stability The range in which the residual activity rate after 30 minutes treatment is 90% or higher is 65 ° C. or lower
  • Optimal pH 6.0 to 9.0
  • E pH stability: The range in which the residual activity rate after treatment at 25 ° C. for 20 hours is 80% or more is 5.0 to 10.0.
  • Km value Km value for 3-hydroxybutyric acid is 0.6 mM or less Item 2.
  • B The 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase according to Item 1, wherein the optimum temperature is 65 ° C. or higher.
  • Item 3. The 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase according to Item 1 or 2, wherein the range showing a residual activity rate of 90% or more after treatment for 16 hours is 55 ° C. or less.
  • Thermal stability The range in which the residual activity rate after 30 minutes treatment is 90% or more is 65 ° C.
  • Item 8. Item 3. The 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase according to any one of Items 1 to 7, wherein the residual activity rate after treatment at 25 ° C. for 1 hour is 90% or more in the presence of a metal chloride having a concentration of 2 mM.
  • the metal chloride is any one selected from the group consisting of manganese chloride, calcium chloride, manganese chloride, cobalt chloride, nickel chloride, and iron (III) chloride.
  • Item 10 The 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase according to any one of Items 1 to 9, wherein the residual activity rate after treatment at 25 ° C. for 1 hour is 90% or more in the presence of a chelating agent having a concentration of 1 to 50 mM.
  • Item 11. Item 3. The 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase according to Item 10, wherein the chelating agent is any one selected from the group consisting of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), phenanthroline, and ⁇ , ⁇ '-dipyridyl.
  • Item 12. Item 3. The 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase according to any one of Items 1 to 11, wherein the residual activity rate after treatment at 25 ° C.
  • Item 13 Item 2. The 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase according to Item 12, wherein the residual activity rate after treatment at 25 ° C. for 1 hour is 80% or more.
  • Item 14 Item 2. The 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase according to Item 12, wherein the residual activity rate after treatment at 25 ° C. for 1 hour is 90% or more.
  • Surfactants are Triton X-100 (polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether), Tween20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate), Brij35 (polyoxyethylene lauryl ether), sodium cholate, and Span20 ( Item 3.
  • Item 16 The 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase according to any one of Items 1 to 15, wherein the microorganism of the genus Geobacillus is Geobacillus stearophyllus.
  • Item 2. The gene encoding 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase according to Item 21, which comprises a base sequence having 95% or more identity with SEQ ID NO: 2.
  • Item 23. The gene encoding the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase according to Item 21, which comprises the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • Item 24. A recombinant vector containing a gene encoding the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase according to any one of Items 21 to 23.
  • 3-Hydroxybutyric acid dehydration which comprises a step of culturing the transformant, producing 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase in the culture solution, and purifying the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase from the culture solution.
  • Method for producing elementary enzyme Item 27.
  • Item 8. A method for measuring a ketone body using the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase according to any one of Items 1 to 20.
  • Item 30. A ketone body measurement sensor using the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase according to any one of Items 1 to 20.
  • the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention has a high affinity for 3-hydroxybutyric acid, that is, the Km value for 3-hydroxybutyric acid is significantly low, so that the amount of 3-hydroxybutyric acid in the sample is smaller. It makes it possible to measure the concentration of.
  • the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention has excellent thermal stability, which enables efficient production of a sensor strip accompanied by heat treatment or the like. Due to these properties, the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention makes it possible to accurately measure 3-hydroxybutyric acid in any sample containing 3-hydroxybutyric acid (eg, blood).
  • 3-Hydroxybutyric acid dehydrogenase (EC 1.1.1.130) reversibly reacts to oxidize 3-hydroxybutyric acid in the presence of nicotinamide dinucleotide (NAD) to produce acetacetic acid and reduced NAD. It is an enzyme having physicochemical properties that catalyze to. In the present invention, this physicochemical property is referred to as 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase activity, and unless otherwise specified, "enzyme activity” or "activity” means 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase activity.
  • the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention is a recombinant enzyme produced by using a gene recombination technique.
  • the properties of the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase will be described below.
  • the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention catalyzes the following reactions.
  • the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention has a substrate specificity that acts specifically on a ketone body (3-hydroxybutyric acid).
  • 3-hydroxypropionic acid (3-Hydroxypropionate), lactic acid (Lactate), glyceric acid (Glycate), 2-hydroxybutyric acid (2-Hydroxybutyrate), L-apple acid (L-Mate), D, L-apple.
  • It is characterized by low reactivity with acids (D, L-Mate), 2-butanol (sec-Butyl alcohol), gluconic acid (Gluconicate), glycolic acid (Glycolate) and the like.
  • Gluconicate glycolic acid
  • Glycolate glycolic acid
  • coenzyme it has excellent specificity for NAD + and low reactivity for NADP +.
  • the optimum temperature of the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention is preferably 55 ° C. or higher, more preferably 60 ° C. or higher, still more preferably 65 ° C. or higher.
  • the thermal stability of the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention shall be evaluated by the residual activity rate after heat treatment for 30 minutes at pH 6.5, and when the residual activity rate is 90% or more, heat It shall have stability. More preferably, the residual activity rate is 95% or more.
  • the range showing such thermal stability is 50 ° C. or lower, preferably 55 ° C. or lower, more preferably 60 ° C. or lower, and particularly preferably 65 ° C. or lower.
  • the thermal stability of the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention can also be evaluated by the residual activity rate after heat treatment for 16 hours at pH 6.5.
  • the residual activity rate is 90% or more, it shall have thermal stability. More preferably, the residual activity rate is 95% or more.
  • the range showing such thermal stability is 45 ° C. or lower, preferably 50 ° C. or lower, and more preferably 55 ° C. or lower.
  • the optimum pH of the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention is in the range of pH 6.0 to 9.0. It is preferably in the range of pH 6.5 to 8.5, and more preferably in the range of pH 7.5 to 8.5.
  • the pH stability of the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention shall be evaluated by the residual activity rate after treatment at 25 ° C. for 20 hours, and when the residual activity rate is 80% or more, the pH stability Shall have.
  • the pH stability range is in the range of pH 5.0 to 10.0, preferably in the range of pH 5.2 to 9.4. Since the pH stability of the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention has such a wide range of pH indicating stability, a reagent composition for measuring ketone bodies and a sensor for measuring ketone bodies are prepared. It is very useful in that the type of buffer used in the case is less limited.
  • the molecular weight of the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention is about 25 to 30 kDa, preferably about 27 to 29 kDa, and more preferably about 28 kDa when determined by SDS-PAGE.
  • the Km value of the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention with respect to 3-hydroxybutyric acid is 0.6 mM or less, more preferably 0.5 mM or less.
  • the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention is less affected by the inhibition of enzyme activity by various coexisting substances, there are few restrictions on the reaction conditions used for the measurement of ketone bodies, and it is versatile. It is advantageous in that. It is also advantageous from the viewpoint of storage stability.
  • coexisting substances that are not hindered as described above include various metal salts such as metal chlorides, and chemical substances such as preservatives, chelating agents, and surfactants.
  • these metal chlorides or other metal salts have a residual activity rate of 70% or more after treatment at 25 ° C. for 1 hour at a concentration of 2 mM. It is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more.
  • preservatives examples include monoiodoacetic acid (MIA), sodium azide, sodium fluoride and the like.
  • MIA monoiodoacetic acid
  • these preservatives have a residual activity rate of 70% or more after treatment at 25 ° C. for 1 hour at a concentration of 2 mM to 20 mM. It is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more.
  • chelating agent examples include EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), phenanthroline, ⁇ , ⁇ '-dipyridyl and the like.
  • these chelating agents have a residual activity rate of 70% or more after treatment at 25 ° C. for 1 hour at a concentration of 1 mM to 50 mM. It is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more.
  • examples of other chemical substances include borate, hydroxylamine, iodoacetate amide (IAA) and the like.
  • the surfactant examples include Triton X-100 (polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether), Tween20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate), Brij35 (polyoxyethylene lauryl ether), sodium cholate, and Span20. (Sorbitan monolaurate) and the like.
  • these surfactants have a concentration of 0.1% and a residual activity rate of 70% or more after treatment at 25 ° C. for 1 hour. It is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% or more.
  • the fact that it is not inhibited even in the presence of a surfactant is a very useful property in producing a reagent for measuring ketone bodies and a sensor for measuring ketone bodies.
  • 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase having the following physicochemical properties (a) to (g), which is derived from a microorganism of the genus Geobacillus, can be mentioned.
  • the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase having the above-mentioned physicochemical properties is an enzyme produced by a 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase-producing microorganism, for example, a microorganism of the genus Geobacillus.
  • Geobacillus stearothermophilus (Geobacillus stearophermophilus), Geobacillus Anatorikasu (Geobacillus anatolicus), Geobacillus Bogazici (Geobacillus bogazici), Geobacillus Thermo Glico fern mouse (Geobacillus galactosidasius), Geobacillus Genomosupu (Geobacillus genomosp.), Geobacillus Jurashikusu (Geobacillus jurassicus), Geobacillus Kaue (Geobacillus kaue), Geobacillus Mahdia (Geobacillus mahadia), Geobacillus proteoglycan Initiative stearothermophilus (Geobacillus proteiniphilus), Geobacillus Sabuteraneusu (Geobacillus subterraneus), Geobacillus ⁇ (Geobacillus thermodenitrificans), Geobacillus Coast
  • the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention can be isolated by extracting and purifying from a culture solution obtained by culturing these Geobacillus microorganisms, but from the viewpoint of production efficiency, genetic recombination It is preferably a recombinant enzyme using the technique.
  • the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention is a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or from an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 1. Also included are proteins that have 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase activity. Further, the identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, and more preferably 90. % Or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more.
  • the gene encoding the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention may be obtained directly from the genome of the genus Geobacillus, or may be artificially synthesized.
  • the gene includes, for example, a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 1.
  • DNA encoding a protein with 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase activity.
  • a DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be mentioned.
  • the degree of DNA deletion, substitution, or addition includes those that do not change the basic characteristics or are designed to improve the characteristics.
  • the identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 is preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, and more preferably 90. % Or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more.
  • the DNA consisting of the base sequence encoding the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase is Escherichia coli or the like in a state of being linked to the vector. It is transferred to the host microorganism of Escherichia coli and becomes a transformant producing 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase.
  • Escherichia collie JM109, Escherichia collie DH5, Escherichia collie W3110, Escherichia collie C600 and the like can be used.
  • a method for transferring the recombinant vector into the host microorganism for example, when the host microorganism is a microorganism belonging to Escherichia collie, a method of transferring the recombinant DNA in the presence of calcium ions can be adopted, and further, electro The poration method may be used. Further, commercially available competent cells (for example, Competent High JM109; manufactured by Toyobo Co., Ltd.) may be used.
  • the microorganism thus obtained as a transformant can stably produce a large amount of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase by culturing in a nutrient medium.
  • the culture form of the host microorganism, which is a transformant may be selected in consideration of the nutritional and physiological properties of the host. In most cases, the culture is performed in liquid culture, but industrially, aeration stirring culture is performed. Is advantageous.
  • a nutrient source for the medium used for culturing the transformant those usually used for culturing microorganisms are widely used.
  • the carbon source any carbon compound that can be assimilated may be used, and for example, glucose, sucrose, lactose, maltose, molasses, pyruvic acid and the like are used.
  • the nitrogen reduction any available nitrogen compound may be used, for example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrous monster, soybean meal alkaline decomposition product and the like are used.
  • salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, specific vitamins, etc. are used as needed.
  • the medium temperature can be changed on an appropriate day within the range in which the bacteria grow and produce 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase, but in the case of Escherichia collie, it is preferably about 20 to 42 ° C.
  • the culture temperature varies slightly depending on the conditions, but the culture may be terminated at an appropriate time after the time when the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase reaches the maximum yield, and is usually about 6 to 48 hours.
  • the pH of the medium can be appropriately changed within the range in which the bacteria grow and produce 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase, but the pH is particularly preferably about 6.0 to 9.0.
  • 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase is present in the culture solution according to a conventional method. In this case, it is used after separating the solution containing 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase and the microbial cells by filtration, centrifugation or the like. If 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase is present in the cells, the cells are collected from the obtained culture by a method such as filtration or centrifugation, and then the cells are collected by a mechanical method or an enzyme such as lysozyme.
  • a chelating agent such as EDTA and / or a surfactant is added to solubilize the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase, and the mixture is separated and collected as an aqueous solution.
  • the solution containing 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase thus obtained is subjected to, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting out treatment of ammonium sulfate, sodium sulfate, or the like, or a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, etc. It may be precipitated by a fractional precipitation method using acetone or the like. In addition, heating treatment and isoelectric point treatment are also effective purification means. Purified 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase can be obtained by gel filtration with an adsorbent or a gel filter, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like.
  • the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention is preferably an isolated or purified 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase. Further, the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention may exist in a state of being dissolved in the above-mentioned solution suitable for storage or in a state of being lyophilized (for example, in the form of powder).
  • isolated means a component other than the enzyme (for example, a contaminating protein derived from a host cell, another component, a culture solution, etc.). The state that is not included.
  • the isolated 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase has a contaminating protein content of less than about 20%, preferably less than about 10%, more preferably less than about 5% in terms of weight. Even more preferably, it is less than about 1%.
  • the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention may be present in a solution (eg, buffer) suitable for storage or measurement of enzyme activity.
  • nicotinamide adenine NAD
  • NADH reduced nicotinamide dinucleotide
  • ⁇ Measurement conditions Preheat 3 mL of the reaction reagent at 37 ° C. for 5 minutes. Add 0.1 mL of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase solution, mix gently, and then record the change in absorbance at 340 nm for 5 minutes with a spectrophotometer controlled at 37 ° C. using water as a control. That is, the change in absorbance ( ⁇ OD TEST ) per minute is measured (after the reaction rate becomes constant).
  • a solvent for dissolving 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase is added to the reagent mixture, and the change in absorbance ( ⁇ OD BLANK ) per minute is similarly measured.
  • 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase activity is determined according to the following formula.
  • 1 unit (U) in 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase activity is the amount of enzyme that produces 1 micromol of NADH per minute in the presence of 3-hydroxybutyric acid under the above-mentioned measurement conditions.
  • 3.1 is the liquid volume (mL) of the reaction reagent + enzyme solution
  • 6.22 is the mmol molecular extinction coefficient of NADH under the present activity measurement conditions (cm 2 / micromol)
  • 0.1 is the enzyme solution.
  • the liquid volume (mL) and 1.0 indicate the optical path length (cm) of the cell.
  • the enzyme activity is measured according to the above-mentioned measuring method.
  • the vector of the present invention is a vector in which a DNA encoding the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention is incorporated.
  • the "vector” is a nucleic acid molecule (carrier) capable of transporting a nucleic acid molecule inserted therein into a target such as a cell, and can replicate the DNA of the present invention in an appropriate host cell.
  • a target such as a cell
  • its type and structure are not particularly limited.
  • an appropriate vector is selected in consideration of the type of host cell.
  • the vector examples include a plasmid vector, a cosmid vector, a phage vector, a virus vector (for example, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a retrovirus vector, a herpesvirus vector) and the like.
  • a virus vector for example, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a retrovirus vector, a herpesvirus vector
  • M13 phage or a variant thereof, ⁇ phage or a variant thereof, pBR322 or a variant thereof can be used as a vector. It is not limited.
  • the vector usually contains a promoter sequence necessary for the expression of the inserted nucleic acid, an enhancer sequence that promotes the expression, and the like.
  • Vectors containing selectable markers can also be used. When such a vector is used, the presence or absence (and its degree) of introduction of the vector can be confirmed by using a selectable marker.
  • Insertion of the DNA encoding the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention into a vector,, if necessary, insertion of a selectable marker gene, insertion of a promoter, etc., are performed by standard recombinant DNA techniques (eg, Molecular). It can be carried out using a method using restriction enzymes and DNA ligase, which can refer to Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York).
  • the present invention relates to a transformant in which a DNA encoding the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention is transformed into a host cell.
  • the means for introducing the DNA encoding the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention into the host is not particularly limited.
  • the host cell is not particularly limited as long as it can express the DNA encoding the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention to produce 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase, but specifically, Escherichia coli.
  • Prokaryotic cells such as bacillus
  • eukaryotic cells such as yeast, mold, insect cells, and mammalian cells can be used.
  • Escherichia coli Escherichia coli
  • Escherichia collie JM109 Escherichia collie DH5
  • Escherichia collie W3110 Escherichia collie C600 and the like
  • examples of the vector include pBR322, pUC19 and pBluescript.
  • the transformant of the present invention is preferably prepared by transfection or transformation using a vector.
  • the transformation may be transient or stable transformation.
  • Transfections and transformations include calcium phosphate co-precipitation, electroporation (Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161-7165 (1984)), lipofection (Felgner). , PL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417 (1984)), Microinjection (Graessmann, M. & Graessmann, A., Proc. Natl. Acad Sci.
  • the transformant of the present invention has the ability to produce the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention, it is possible to efficiently produce the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention using the transformant of the present invention. It becomes.
  • the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention is recovered from the cells, for example, after the cells are crushed by a pressure treatment, an ultrasonic treatment, a mechanical method, a method using an enzyme such as lysozyme, or the like.
  • a chelating agent such as EDTA and a surfactant can be added to solubilize the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase, and the enzyme can be obtained by separating and collecting it as an aqueous solution, separating and purifying it. can. After collecting the bacterial cells from the culture solution in advance by filtration, centrifugation or the like, the above series of steps (crushing, separation, purification of the bacterial cells) may be performed.
  • Purification is performed by, for example, concentration under reduced pressure, film concentration, salting out treatment of ammonium sulfate, sodium sulfate, etc., or precipitation treatment, heat treatment, isoelectric spot treatment, etc. by a fractional precipitation method using a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, etc. , Gel filtration with an adsorbent or a gel filter, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like can be appropriately combined.
  • a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone, etc.
  • Gel filtration with an adsorbent or a gel filter, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like can be appropriately combined.
  • the ketone measurement kit containing the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention contains the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention in an amount sufficient for at least one assay.
  • a typical ketone measurement kit includes a buffer solution, a chromogen, a nicotinamide adenine dinucleotide, and a ketone standard for preparing a calibration curve. Contains solution.
  • the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention can be provided in various forms, for example, as a lyophilized reagent or as a solution in a suitable storage solution.
  • 3-Hydroxybutyric acid (3-OHBA) is affected by D-3-hydroxybutyric acid dehydrogenase (3-HBDH) in the presence of the coenzyme thionicotinamide adenine dinucleotide oxidized form (Tio-NAD). It becomes acetoacetic acid (AcAc).
  • AcAc returns to 3-OHBA under the action of 3-HBDH in the presence of the coenzyme ⁇ -nicotinamide adenine dinucleotide reduced form ( ⁇ -NADH).
  • the enzyme reaction rate of 3-HBDH is proportional to the total amount of 3-OHBA and AcAc present before the reaction is started, and can be grasped by the rate of increase of the thionicotinic acid amide adenine dinucleotide reduced form (Thio-NADH). ..
  • 3-HBDH is allowed to act on the measurement target (3-HB or AcAc) in the presence of ⁇ -NAD or ⁇ -NADH
  • AcAc or 3-HB is produced. It can be obtained by measuring the amount of change in absorbance accompanying the formation of ⁇ -NADH or ⁇ -NAD at this time.
  • Ketone measurement sensor As the electrode of the ketone measurement sensor of the present invention, for example, a carbon electrode, a gold electrode, a platinum electrode, or the like can be used.
  • the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention is immobilized on this electrode.
  • the immobilization method include a method using a cross-linking reagent, a method of encapsulating in a polymer matrix, a method of coating with a dialysis membrane, a photocrosslinkable polymer, a conductive polymer, a redox polymer, etc., or hexaamine ruthenium or a method thereof. Together with an electron mediator typified by a derivative, it may be fixed in a polymer or adsorbed and fixed on an electrode, or these may be used in combination.
  • the ketone concentration can be measured as follows.
  • a buffer solution is placed in a constant temperature cell and maintained at a constant temperature.
  • As the mediator hexaamine ruthenium, potassium ferricyanide, phenazinemethsulfate and the like can be used.
  • As the working electrode an electrode on which the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention is immobilized is used, and a counter electrode (for example, a platinum electrode) and a reference electrode (for example, an Ag / AgCl electrode) are used.
  • a constant voltage is applied to the carbon electrode, and after the current becomes steady, a sample containing a ketone is added and the increase in the current is measured.
  • the ketone concentration in the sample can be calculated according to the calibration curve prepared with the standard concentration of ketone standard solution.
  • Example 1 Cloning SEQ ID NO: 1 of various 3-hydroxybutyric acid dehydrogenases shows the amino acid sequence of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase (hereinafter abbreviated as “HBDH-GS”) derived from Geobacillus stearothermophilus. Based on SEQ ID NO: 1, the artificially synthesized gene set forth in SEQ ID NO: 2 was prepared, which was optimized for the codon usage of the Escherichia coli K-12 strain.
  • HBDH-GS 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase
  • amino acid sequences of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase derived from Pseudomonas aeruginosa, Helicobacter mustellae, and Hydrogenophilus thermoluteolus are SEQ ID NO: 3 (hereinafter abbreviated as "HBDH-PA”), SEQ ID NO: 5 (hereinafter, “HBDH-PA”). HM ”), SEQ ID NO: 7 (hereinafter abbreviated as“ HBDH-HT ”).
  • SEQ ID NO: 3 amino acid sequences of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase derived from Pseudomonas aeruginosa, Helicobacter mustellae, and Hydrogenophilus thermoluteolus
  • HM amino acid sequences of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase derived from Pseudomonas aeruginosa, Helicobacter mustellae, and Hydrogenophilus thermoluteolus
  • HM amino acid sequences of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenas
  • restriction enzyme site NdeI is added to the N-terminal side of this primer, and the restriction enzyme site BamHI is added to the C-terminal side.
  • This DNA fragment was cleaved with restriction enzymes NdeI and BamHI, mixed with the vector plasmid pBluescriptII KSN + cleaved with the same enzyme, and the mixture was incubated with an equal amount of ligation reagent (Toyo Spinning Ligation High) to ligate. carried out.
  • Example 2 E. coli of various 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase genes. Expression and purification in colli Using the various plasmids constructed in Example 1, E. coli. A competent cell of coliJM109 strain (Competent High JM109 manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed according to the protocol attached to this product to obtain a transformant. The obtained colonies of each transformant were inoculated into 5 mL of LB liquid medium (containing 50 ⁇ g / mL ampicillin) sterilized in vitro, and then aerobically cultured by shaking at 30 ° C. for 16 hours. ..
  • LB liquid medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin
  • the obtained culture broth was used as a seed culture broth, inoculated into 100 mL of TB medium (including 1 mM IPTG, 50 ⁇ g / mL ampicillin) in a 500 ml Sakaguchi flask, and cultured at 37 ° C. for 22 hours at a shaking rate of 180 rpm. ..
  • the cells thus obtained were collected by centrifugation, suspended in a 25 mM phosphate buffer solution (pH 7.5), crushed using glass beads, and the obtained crude enzyme 3-hydroxybutyric acid dehydration was performed.
  • His-HBDH-GS and HBDH-PA were highly expressed
  • His-HBDH-HT was moderately expressed
  • His-HBDH-HM was not expressed at all.
  • HBDH-HM Three kinds of crushed solutions except HBDH-HM were applied to HisTrap HP 1 mL (manufactured by GE Healthcare Bioscience) equilibrated with 25 mM phosphate buffer solution (pH 7.5) containing 20 mM imidazole, and 25 mM phosphate containing 500 mM imidazole. By eluting with a buffer solution (pH 7.5), a high-purity 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase solution was obtained.
  • Example 3 Thermal stability evaluation of various 3-hydroxybutyric acid dehydrogenases His-HBDH-GS, His-HBDH-PA and His-HBDH-HT enzyme solutions obtained in Example 2 were added to 1 U / mL at 50 mM KPB (pH 6). After the preparation in 5.5), the mixture was heated at 50 ° C. for 15 minutes, the activity of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase was measured, and the thermal stability was evaluated by the residual activity. As a result, as shown in Table 2, His-HBDH-GS had a residual rate of 99.8%, His-HBDH-PA had a residual rate of 38.0%, and His-HBDH-HT had a residual rate of 27.7%.
  • Example 4 Cloning of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase derived from Geobacillus stearothermophilus Using the artificial synthetic gene shown in SEQ ID NO: 2 as a template and the primers shown in Table 3, the same method as in Example 1 was used.
  • the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase gene derived from Geobacillus stearothermophilus was amplified. Specifically, the forward primer is amplified to include the start codon 5'upstream of the gene encoding 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase, and the reverse primer contains the stop codon at the 3'end of 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase. Designed to do. Primers of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 were used for amplification of the gene encoding HBDH-GS.
  • Example 5 E. coli of the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase gene derived from Geobacillus stearothermophilus. Expression and purification in colli Using the plasmid constructed in Example 4 by the same method as in Example 2, E. coli. A competent cell of coliJM109 strain (Competent High JM109 manufactured by Toyobo Co., Ltd.) was transformed according to the protocol attached to this product to obtain a transformant. Each of the obtained transformants was inoculated into 7 L of TB liquid medium (containing 1 mM IPTG, 50 ⁇ g / mL ampicillin) using a 10 L-volume jar fermenter, and then cultured at 37 ° C. for 22 hours.
  • TB liquid medium containing 1 mM IPTG, 50 ⁇ g / mL ampicillin
  • the cells thus obtained are collected by centrifugation, suspended in a 50 mM phosphate buffer solution (pH 7.5), sent to a French press (manufactured by Niro Soavi) at a flow rate of 160 mL / min, and 700 to The mixture was crushed at 800 bar, subjected to nucleic acid removal treatment, and then centrifuged to obtain a supernatant.
  • a 50 mM phosphate buffer solution pH 7.5
  • a French press manufactured by Niro Soavi
  • Ammonium sulfate (manufactured by Sumitomo Chemical Co., Ltd.) was gradually added to this so as to be 0.6 saturated, and after stirring at room temperature for 30 minutes, the target protein was precipitated, and the precipitate collected by centrifugation was a 50 mM phosphate buffer solution. It was redissolved in (pH 7.5). Then, gel filtration by Sephadex G-25 column, anion exchange chromatography by DEAE-Sepharose column (both elution conditions extract peak fraction by applying a sodium chloride concentration gradient of 0 to 1 M) and hydrophobicity by Penyl-Sepharose column.
  • Example 6 Evaluation of Enzyme Properties The following enzyme properties of the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase derived from Geobacillus stearothermophilus obtained in Example 5 were confirmed.
  • Optimal temperature The optimum active temperature was examined using the HBDH-GS enzyme solution (0.1 U / mL) obtained in Example 5. 50 mM KPB (pH 6.5) was used as the buffer solution, and 3-hydroxy at 15 ° C, 20 ° C, 25 ° C, 30 ° C, 37 ° C, 40 ° C, 45 ° C, 50 ° C, 55 ° C, 60 ° C and 65 ° C. The butyric acid dehydrogenase activity was determined. The results are shown in FIG.
  • the HBDH-GS of the present invention showed the highest activity value at 65 ° C. From the above, it was shown that the optimum temperature of HBDH-GS is 65 ° C. or higher.
  • Temperature stability 6-2-1 Temperature stability (1) The temperature stability was examined using the HBDH-GS enzyme solution (50 U / mL) obtained in Example 5. After treating the HBDH-GS enzyme solution with 50 mM KPB (pH 6.5) at each temperature (4 ° C, 40 ° C, 45 ° C, 50 ° C, 55 ° C, 60 ° C, 65 ° C, 70 ° C) for 30 minutes. , 3-Hydroxybutyric acid dehydrogenase activity was measured, and the residual rate was measured as compared with the activity before treatment. The results are shown in FIG.
  • the HBDH-GS of the present invention had a residual rate of 90% at a temperature in the range of 4 ° C. to 65 ° C. From this, it was shown that HBDH-GS is stable below 65 ° C.
  • the optimum active pH of HBDH-GS of the present invention was the highest at pH 8.5 when the Tris-HCl buffer was used. Moreover, when the potassium phosphate buffer solution was used, the highest activity was shown in the pH range of 6.5 to 7.0. Furthermore, when MES-NaOH buffer was used, the highest activity was shown at pH 7.0. From these results, it is considered that the optimum active pH of this HBDH-GS is in the range of about 6.5 to 8.0.
  • the HBDH-GS of the present invention had a residual rate of 80% or more at a pH in the range of pH 5.2 to 9.4. From this, it was shown that HBDH-GS is stable in the pH range of 5.2 to 9.4.
  • the molecular weight of the purified enzyme was determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis using Nu-PAGE 4-12% Bis-Tris Gel (manufactured by Invitrogen) (Fig. 5).
  • the molecular weight of HBDH-GS was about 28 kDa.
  • Example 6-6 The activity of HBDH-GS purified in Example 5 was measured by changing the concentration of 3-hydroxybutyric acid, which is a substrate for measuring the Km value, and a graph of the substrate concentration and the reaction rate was prepared (FIG. 6). Based on this, a Lineweaver-burk plot was prepared, and the Km value of the enzyme with respect to 3-hydroxybutyric acid was calculated (FIG. 7). As a result, the Km value of HBDH-GS of the present invention with respect to 3-hydroxybutyric acid was calculated to be 0.6 mM.
  • the 3-hydroxybutyric acid dehydrogenase of the present invention can be applied to a diagnostic agent or sensor for measuring ketone bodies to measure ketone bodies as an index in the ketogenic diet (ketogenic diet) as well as in the fields of medicine and diagnosis. It is expected that it will be widely used in.

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Abstract

３－ヒドロキシ酪酸に対する高い親和性を有し、かつ高い熱安定性を有する３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、及びその製造方法を提供することを課題とする。　ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物に由来する、以下の（ａ）から（ｈ）の理化学的性質を有する、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。 （ａ）作用：下記の反応を触媒する。　３－ヒドロキシ酪酸　＋　ＮＡＤ　←→　アセト酢酸　＋　ＮＡＤＨ （ｂ）至適温度：５５℃以上 （ｃ）熱安定性：３０分処理後の残存活性率が９０％以上を示す範囲が６５℃以下 （ｄ）至適ｐＨ：６．０～９．０ （ｅ）ｐＨ安定性：２５℃で２０時間処理後の残存活性率が８０％以上を示す範囲が５．０～１０．０ （ｆ）分子量：約２８ｋＤａ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ） （ｇ）Ｋｍ値：３－ヒドロキシ酪酸に対するＫｍ値が０．６ｍＭ以下

Description

３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素及びその製造方法
　本発明は、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素に関する。詳しくは、本発明は、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物に由来する３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素、該３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードするＤＮＡを有する発現ベクター、及び、該発現ベクターで形質転換した形質転換体、該３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造方法、該３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を使用したケトン体測定方法などに関する。
　臨床検査分野において、血中ケトン体の測定は糖尿病患者の内、インスリン作用の不足の程度を反映する代謝指標として使用されている。ここでケトン体とは、アセト酢酸、３－ヒドロキシ酪酸（３－Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ　ａｃｉｄ）およびアセトンの総称であるが、血中ケトン体の殆どはアセト酢酸と３－ヒドロキシ酪酸で占められている。また、ケトン体は主として肝臓で脂肪酸の酸化過程で代謝物として生産されるが、糖質がエネルギー源として適切に利用されているか否かの指標にもなる。ケトン体の定量には、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いることができるので、産業上有用な酵素である。
　３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ１．１．１．３０）はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の存在下で、３－ヒドロキシ酪酸を酸化してアセト酢酸と還元型ＮＡＤを生じる反応を、可逆的に触媒する酵素として知られている。微生物由来の酵素としては、ロドスピリラム・ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｒｕｂｒｕｍ）（非特許文献１）やシュードモナス・レミオグネイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｌｅｍｏｉｇｎｅｉ）（非特許文献２）、リゾビウム・メリオティアルカ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）（非特許文献３）、アルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）（特許文献１）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）（特許文献２）等からも生産されることが知られている。
これまで臨床検査分野で工業的に利用されている微生物由来の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、不安定な酵素が殆どであるため、安定性の優れた３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が望まれていた。そこで、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の安定性を改善する方法が報告されている。特許文献３には、ハロゲン化アルカリ金属塩を安定化剤として添加する方法が報告されている。この方法ではハロゲン化アルカリ金属塩と特定の緩衝液を用いることで、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の保存安定性が向上する効果が認められる。しかしながら、ハロゲン化アルカリ金属塩に適した緩衝液が限定されるので実用性に課題があった。
他の方法として、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードする遺伝子に変異を導入し、酵素の安定性を向上させる方法が報告されている。特許文献４にはアルカリゲネシス・フェーカリス由来、特許文献５にはロドバクター・スフェロイデス由来３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の変異体が報告されている。この方法では、特定の部位に変異を導入することで、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の安定性は向上しているが、安定性以外の酵素特性が予期せずに変質する可能性があるので、実用化には至っていない。そこで、本質的特性を維持しつつ、より安定性の優れた３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が望まれていた。
特開平８－７０８５６号公報 特開平１１－３１８４３８号公報 特開２０００－８３６６０号公報 国際公開第２０１７／１０９００３号 国際公開第２０１７／１３７４９１号
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９６２），２３７：６０３－６０７． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９６５），２４０：４０２３－４０２８． Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９９），８１（３）：８４９－８５７．
本発明は、上述のような従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、高い安定性を有し、加えて３－ヒドロキシ酪酸に対する親和性が高い、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素および該３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の工業的製造方法を確立すると共に、該３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いた血中ケトン体測定組成物を提供することにある。
　上記課題を解決するために、本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ゲオバチルス属の微生物由来の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が有用であることを見出し、本発明を完成するに至ったものである。代表的な本発明の態様は、以下の通りである。
項１．
ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物に由来する、以下の（ａ）から（ｇ）の理化学的性質を有する、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
（ａ）作用：下記の反応を触媒する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 （ｂ）至適温度：５５℃以上
（ｃ）熱安定性：３０分処理後の残存活性率が９０％以上を示す範囲が６５℃以下
（ｄ）至適ｐＨ：６．０～９．０
（ｅ）ｐＨ安定性：２５℃で２０時間処理後の残存活性率が８０％以上を示す範囲が５．０～１０．０
（ｆ）分子量：約２８ｋＤａ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）
（ｇ）Ｋｍ値：３－ヒドロキシ酪酸に対するＫｍ値が０．６ｍＭ以下
項２．
（ｂ）至適温度：６５℃以上である、項１に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項３．
（ｃ）熱安定性：１６時間処理後の残存活性率が９０％以上を示す範囲が５５℃以下である、項１または２に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項４．
（ｃ）熱安定性：３０分処理後の残存活性率が９０％以上を示す範囲が６５℃以下であり、かつ、１６時間処理後の残存活性率が９０％以上を示す範囲が５５℃以下である、項１～３のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項５．
（ｄ）至適ｐＨ：７．５～８．５である、項１～４のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項６．
（ｅ）ｐＨ安定性：２５℃で２０時間処理後の残存活性率が８０％以上を示す範囲が５．２～９．４である、項１～５のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項７．
３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が遺伝子組換え酵素である、項１～６のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項８．
２ｍＭ濃度の金属塩化物の存在下で、２５℃、１時間処理後の残存活性率が９０％以上である、項１～７のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項９．
金属塩化物が、塩化マンガン、塩化カルシウム、塩化マンガン、塩化コバルト、塩化ニッケル、及び、塩化鉄（III）よりなる群から選択されるいずれか１種である項８に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項１０．
１～５０ｍＭ濃度のキレート剤の存在下で、２５℃、１時間処理後の残存活性率が９０％以上である、項１～９のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項１１．
キレート剤が、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、フェナントロリン、α,α'-ジピリジルよりなる群から選択されるいずれか１種である項１０に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項１２．
０．１％濃度の界面活性剤存在下で、２５℃、１時間処理後の残存活性率が７０％以上である、項１～１１のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項１３．
２５℃、１時間処理後の残存活性率が８０％以上である、項１２に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項１４．
２５℃、１時間処理後の残存活性率が９０％以上である、項１２に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項１５．
界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（ポリエチレングリコールモノ-p-イソオクチルフェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、Ｂｒｉｊ３５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）、コール酸ナトリウム、及び、Ｓｐａｎ２０（ソルビタンモノラウラート）よりなる群から選択されるいずれか１種である、項１２～１４に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項１６．
ゲオバチルス属の微生物がゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｐｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である、項１～１５のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項１７．
配列番号１との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなる、項１～１６のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項１８．
配列番号１との同一性が９５％以上であるアミノ酸配列からなる、項１７に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項１９．
配列番号１において、１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、項１７に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項２０．配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる、項１７に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
項２１．
配列番号２と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる、項１～２０に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードする遺伝子。
項２２．
配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなる、項２１に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードする遺伝子。
項２３．
配列番号２に記載の塩基配列からなる、項２１に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードする遺伝子。
項２４．
項２１～２３のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
項２５．
項２４に記載の組換えベクターにより宿主細胞を形質転換した形質転換体。
項２６．
項２５に記載の形質転換体を培養し、培養液中に３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生成させ、該３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を培養液から精製する工程を含む、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法。
項２７．
項１～２０のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を含有するケトン体の測定用組成物。
項２８．
項１～２０のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いるケトン体の測定方法。
項２９．
項１～２０のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いるケトン体の測定キット。
項３０．
項１～２０のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いるケトン体の測定センサ。
　本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、３－ヒドロキシ酪酸との親和性が高い、即ち、３－ヒドロキシ酪酸に対するＫｍ値が有意に低いため、より少ない酵素量で試料中の３－ヒドロキシ酪酸の濃度を短時間で測定することを可能にする。加えて、本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、熱安定性に優れるため、熱処理等を伴う効率的なセンサストリップの製造を可能にする。これらの特性を備えるため、本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、３－ヒドロキシ酪酸を含むあらゆる試料（例えば、血液）における３－ヒドロキシ酪酸を正確に測定することを可能にする。
３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の活性に対する温度の影響を示す図である。 ３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のｐＨ安定性を測定した結果を示す図である。 ３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の活性に対するｐＨの影響を示す図である。 ３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の熱安定性を測定した結果を示す図である。 ３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の分子量を求めた結果を示す図である。 ３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の反応速度と基質濃度との関係を示す図である。 ３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素について、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－ｂｕｒｋ　ｐｌｏｔを作成した結果を示す図である。
３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（Ｅ．Ｃ１．１．１．３０）は、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）の存在下３－ヒドロキシ酪酸を酸化してアセト酢酸と還元型ＮＡＤを生じる反応を可逆的に触媒する理化学的性質を有する酵素である。本発明においては、この理化学的性質を３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性といい、特に断りが無い限り、「酵素活性」又は「活性」とは、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を意味する。
　本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、遺伝子組換え技術を用いて生産される組換え酵素である。以下に、該３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の有する性質について述べる。
　本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、下記の反応を触媒する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
　本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、ケトン体（３－ヒドロキシ酪酸）に対して特異的に作用する基質特異性を有している。特には、３－ヒドロキシプロピオン酸（３－Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、乳酸（Ｌａｃｔａｔｅ）、グリセリン酸（Ｇｌｙｃｅｒａｔｅ）、２－ヒドロキシ酪酸（２－Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）、Ｌ－リンゴ酸（Ｌ－Ｍａｌａｔｅ）、Ｄ，Ｌ－リンゴ酸（Ｄ，Ｌ－Ｍａｌａｔｅ）、２－ブタノール（ｓｅｃ－Ｂｕｔｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ）、グルコン酸（Ｇｌｕｃｏｎａｔｅ）、グリコール酸（Ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）などに対する反応性が低いことを特徴とする。また、補酵素としては、ＮＡＤ＋に対する特異性に優れ、ＮＡＤＰ＋に対する反応性は低い。
　本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の至適温度は、好ましくは５５℃以上、より好ましくは６０℃以上、さらに好ましくは６５℃以上である。
　本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の熱安定性は、ｐＨ６．５において、３０分の熱処理後の残存活性率により評価するものとし、残存活性率が９０％以上である場合には、熱安定性を有するものとする。より好ましくは、残存活性率が９５％以上である。このような熱安定性を示す範囲は５０℃以下であり、好ましくは５５℃以下、より好ましくは６０℃以下、特に好ましくは６５℃以下である。
　本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の熱安定性は、また、ｐＨ６．５において、１６時間の熱処理後の残存活性率により評価することもできる。残存活性率が９０％以上である場合には、熱安定性を有するものとする。より好ましくは、残存活性率が９５％以上である。１６時間の熱処理後に、このような熱安定性を示す範囲は４５℃以下であり、好ましくは５０℃以下、より好ましくは５５℃以下である。
　本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の至適ｐＨは、ｐＨ６．０～９．０の範囲内にある。好ましくはｐＨ６．５～８．５の範囲であり、より好ましくはｐＨ７．５～８．５の範囲である。
　本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のｐＨ安定性は、２５℃、２０時間の処理後の残存活性率により評価するものとし、残存活性率が８０％以上である場合には、ｐＨ安定性を有するものとする。ｐＨ安定性の範囲は、ｐＨ５．０～１０．０の範囲であり、好ましくはｐＨ５．２～９．４の範囲である。本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のｐＨ安定性は、このように安定性を示すｐＨの範囲が広いことから、ケトン体の測定のための試薬組成や、ケトン体測定用センサを作製する際に用いる緩衝液の種類が制限されることが少なくなる点で、非常に有用である。
　本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の分子量は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで求めた場合に、２５～３０ｋＤａ程度、好ましくは２７～２９ｋＤａ程度、より好ましくは２８ｋＤａ程度である。
　本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の３－ヒドロキシ酪酸に対するＫｍ値は、０．６ｍＭ以下、より好ましくは０．５ｍＭ以下である。
　本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、様々な共存物質による酵素活性阻害の影響を受けることが少ないことから、ケトン体の測定に用いられる反応条件に関して制約を受けることが少なく、汎用性の点で有利である。また、保存性の観点でも有利である。上記のような阻害を受けない共存物質としては、金属塩化物など様々な金属塩、防腐剤、キレート剤、界面活性剤などの化学物質が挙げられる。
本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素に対して阻害を受けない共存物質として、具体的に例示されるものとして、金属塩化物としては、例えば、塩化マンガン、塩化カルシウム、塩化マンガン、塩化コバルト、塩化ニッケル、塩化鉄（III）などが挙げられる。その他の金属塩としては、例えば、硫酸亜鉛などが挙げられる。本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素にあっては、これら金属塩化物またはその他の金属塩が２ｍＭの濃度で、２５℃、１時間処理後の残存活性率が７０％以上を示す。好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
防腐剤としては、例えば、モノヨード酢酸（ＭＩＡ；Ｍｏｎｏｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ）、アジ化ナトリウム、フッ化ナトリウムなどが挙げられる。本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素にあっては、これらの防腐剤が２ｍＭ～２０ｍＭの濃度で、２５℃、１時間処理後の残存活性率が７０％以上を示す。好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
キレート剤としては、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、フェナントロリン、α,α'-ジピリジルなどが挙げられる。本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素にあっては、これらキレート剤が１ｍＭ～５０ｍＭの濃度で、２５℃、１時間処理後の残存活性率が７０％以上を示す。好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。また、その他の化学物質として、ホウ酸塩、ヒドロキシルアミン、ヨードアセテートアミド（ＩＡＡ）等が挙げられる。
界面活性剤としては、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（ポリエチレングリコールモノ-p-イソオクチルフェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、Ｂｒｉｊ３５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）、コール酸ナトリウム、Ｓｐａｎ２０（ソルビタンモノラウラート）などが挙げられる。本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素にあっては、これら界面活性剤が０．１％の濃度で、２５℃、１時間処理後の残存活性率が７０％以上を示す。好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。特に、界面活性剤の共存下においても阻害を受けないことは、ケトン体測定用試薬やケトン体測定用センサを作製するうえで、非常に有用な特性である。
本発明の好ましい実施態様の一つとしては、ゲオバチルス属の微生物に由来する、以下（ａ）から（ｇ）の理化学的性質を有する３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が挙げられる。
（ａ）作用：下記の反応を触媒する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
（ｂ）至適温度：６５℃以上
（ｃ）熱安定性：６５℃以下
（ｄ）至適ｐＨ：８．５
（ｅ）ｐＨ安定性：５．２～９．４
（ｆ）分子量：約２８ｋＤａ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）
（ｇ）Ｋｍ値：３－ヒドロキシ酪酸に対するＫｍ値が０．６ｍＭ
上記の理化学的性質を有する３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素生産微生物、例えばゲオバチルス属の微生物が生産する酵素である。好ましくは、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｐｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ゲオバチルス・アナトリカス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎａｔｏｌｉｃｕｓ）、ゲオバチルス・ボアジチ（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｏｇａｚｉｃｉ）、ゲオバチルス・サーモグリコシダウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｉｕｓ）、ゲオバチルス・ゲノモスプ（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇｅｎｏｍｏｓｐ．）、ゲオバチルス・ジュラシクス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｊｕｒａｓｓｉｃｕｓ）、ゲオバチルス・カウエ（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋａｕｅ）、ゲオバチルス・マハディア（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｈａｄｉａ）、ゲオバチルス・プロテイニフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎｉｐｈｉｌｕｓ）、ゲオバチルス・サブテラネウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｓ）、ゲオバチルス・（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、ゲオバチルス・コーストフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｋａｕｓｔｏｐｈｉｌｕｓ）、ゲオバチルス・リトアニカス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｔｕａｎｉｃｕｓ）、ゲオバチルス・サーモカテニュロータス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｓ）、ゲオバチルス・サーモレオボランス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、ゲオバチルス・ブルカニ（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｖｕｌｃａｎｉ）、ゲオバチルス・サーモパラフィニボランス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐａｒａｆｆｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、ゲオバチルス・トロピカリス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、ゲオバチルス・ウラリカス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｕｒａｌｉｃｕｓ）、ゲオバチルス・ウゼネンシス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｕｚｅｎｅｎｓｉｓ）、ゲオバチルス・ユムタンジェネシス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｙｕｍｔｈａｎｇｅｎｓｉｓ）などが挙げられる。本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、これらのゲオバチルス属の微生物を培養して得られる培養液から抽出、精製することにより単離することもできるが、生産効率の観点から、遺伝子組換え技術を用いた組換え酵素であることが好ましい。
本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質で、または、配列番号１において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を有するタンパク質も含まれる。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列との同一性が、７０％以上であることが好ましく、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上である。本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードする遺伝子は、ゲオバチルス属のゲノムから直接取得しても良く、または人工的に合成することもできる。
該遺伝子としては、例えば配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、または配列番号１において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡがある。具体的には、配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。ＤＮＡの欠失、置換、付加の程度については、基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善するようにしたものを含む。また、配列番号２に記載の塩基配列との同一性が、７０％以上であることが好ましく、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上である。
本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を遺伝子組換え技術により生産する場合には、該３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードする塩基配列からなるＤＮＡは、ベクターと連結された状態にて大腸菌等の宿主微生物に移入され、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する形質転換体となる。この際の宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００などが利用できる。
宿主微生物に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えＤＮＡの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えば、コンピテントハイＪＭ１０９；東洋紡製）を用いても良い。
こうして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を安定して生産し得る。形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
形質転換体の培養に用いられる培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素減としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分怪物、大豆粕アルカリ分解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
培地温度は菌が発育し、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する範囲で適日変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０～４２℃程度である。培養温度は条件によって多少異なるが、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６～４８時間程度である。培地ｐＨは、菌が発育し、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する範囲で適宜変更しうるが、特に好ましくはｐＨ６．０～９．０程度である。
培養物中の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には、常法に従って３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が培養液中に存在する場合は、濾過、遠心分離などにより、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手法により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び／または界面活性剤を添加して３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を可溶化し、水溶液として分離採取する。
このようにして得られた３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに、硫酸アンモニム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿せしめればよい。また、加温処理や等電点処理も有効な精製手段である。吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーにより、精製された３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を得ることができる。
　本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、単離又は精製された３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素であることが好ましい。また、本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、上記保存に適した溶液中に溶解した状態又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）で存在してもよい。本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素に関して使用する場合の「単離された」とは、当該酵素以外の成分（例えば、宿主細胞に由来する夾雑タンパク質、他の成分、培養液等）を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、単離された３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。一方で、本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、保存又は酵素活性の測定に適した溶液（例えば、バッファー）中に存在してもよい。
３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性は、例えば、ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤ）を用い、還元型ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）の反応前後における生成量を、３４０ｎｍの波長における試料の吸光度の変化を指標に活性を測定することができる。より具体的には、下記の試薬及び測定条件を用いて活性を測定することができる。
３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性の測定方法
＜試薬＞
・１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．５（２５℃）
・１５８ｍＭ　３－ヒドロキシ酪酸溶液
・２７．９ｍＭ　ＮＡＤ＋溶液
上記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液２．３ｍＬ、３－ヒドロキシ酪酸溶液０．５ｍＬ、ＮＡＤ＋溶液０．２ｍＬを混合して反応試薬とする。
＜測定条件＞
　反応試薬３ｍＬを、３７℃で５分間予備加温する。３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素溶液０．１ｍＬを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照に、３７℃に制御された分光光度計で、３４０ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から（即ち、反応速度が一定になってから）１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検は、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素溶液の代わりに、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を溶解する溶媒を試薬混液に加えて、同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から、次の式に従って３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を求める。ここで、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性における１単位（Ｕ）とは、上記の測定条件の３－ヒドロキシ酪酸存在下で１分間に１マイクロモルのＮＡＤＨを生成する酵素量である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　上記式中、３．１は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、６．２２は本活性測定条件におけるＮＡＤＨのミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。本発明においては、別段の表示しない限り、酵素活性は上記の測定方法に従って測定される。
本発明のベクターは、本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードするＤＮＡが組み込まれたベクターである。ここで「ベクター」とは、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子（キャリアー）であり、適当な宿主細胞内で本発明のＤＮＡを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター）等を挙げることができる。
　大腸菌を宿主とする場合には、例えば、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８など）をベクターとして使用することができるが、これらに限定される訳ではない。
　ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含むベクターを使用することもできる。かかるベクターを用いた場合には、選択マーカーを利用してベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードするＤＮＡのベクターへの挿入、必要に応じて、選択マーカー遺伝子の挿入、および、プロモーターの挿入等は、標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，１．８４，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照することができる、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた方法）を用いて行うことができる。
　本発明は、宿主細胞に本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードするＤＮＡが形質転換された形質転換体に関する。本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードするＤＮＡの宿主への導入手段は、特に制限されない。宿主細胞は、本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードするＤＮＡを発現して３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生産することが可能である限り、特に制限されないが、具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。宿主が大腸菌の場合、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＤＨ５、エシェリヒア・コリーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００などが用いられ、ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが例として挙げられる。
本発明の形質転換体は、好ましくはベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。形質転換は一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。トランスフェクション及びトランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポレーション（Ｐｏｔｔｅｒ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１，７１６１－７１６５（１９８４））、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，７４１３－７４１７（１９８４））、マイクロインジェクション（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，　Ｍ．＆Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７３，３６６－３７０（１９７６））、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６，５５７－５８０（１９８３））、酢酸リチウム法（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ，Ｒ．Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６，３３９－３４６（１９８９））、プロトプラスト－ポリエチレングリコール法（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，１４７０－１４７４（１９８４））等を利用して実施することができる。
本発明の形質転換体は、本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を産生する能力を有するため、それを用いて、効率的に本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を製造することが可能となる。
本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理、機械的手法、又はリゾチーム等の酵素を利用した手法等によって破砕した後、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加して３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を可溶化し、水溶液として分離採取し、分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。
精製は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿処理、加熱処理や等電点処理、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせて実施することができる。
　カラムクロマトグラフィーを用いる場合には、例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ－６Ｂ（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス製）、オクチルセファロースＣＬ－６Ｂ（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス製）等を用いることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
ケトン測定キット
本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を含むケトン測定キットは、本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的なケトン測定キットは、本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素に加えて、アッセイに必要な緩衝液、色原体、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、及び、キャリブレーションカーブ作製のためのケトン標準溶液を含む。本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、あるいは適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
３－ヒドロキシ酪酸（３－ＯＨＢＡ）は補酵素であるチオニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド酸化型（Ｔｈｉｏ－ＮＡＤ）の存在下でＤ－３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（３－ＨＢＤＨ）の作用を受けてアセト酢酸（ＡｃＡｃ）となる。また、ＡｃＡｃは補酵素であるβ－ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド還元型（β－ＮＡＤＨ）の存在下で３－ＨＢＤＨの作用を受けて３－ＯＨＢＡに戻る。　この３－ＨＢＤＨの酵素反応速度は、反応を開始する前に存在する３－ＯＨＢＡとＡｃＡｃの総量に比例し、チオニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド還元型（Ｔｈｉｏ－ＮＡＤＨ）の増加速度でとらえることができる。あるいは、測定対象（３－ＨＢあるいはＡｃＡｃ）にβ－ＮＡＤあるいはβ－ＮＡＤＨの存在下３－ＨＢＤＨを作用させると、ＡｃＡｃあるいは３－ＨＢが生成される。この時のβ－ＮＡＤＨあるいはβ－ＮＡＤの生成に伴う吸光度の変化量を測定することにより求めることができる。
ケトン測定センサ
本発明のケトン測定センサの電極としては、例えば、カーボン電極、金電極、白金電極などを用いることができる。この電極上に本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を固定化する。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがあり、あるいはヘキサアミンルテニウムあるいはその誘導体に代表される電子メディエーターとともに、ポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。
ケトン濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、ヘキサアミンルテニウム、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、ケトンを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のケトン標準溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のケトン濃度を計算することができる。
　以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、実施例により本発明が特に限定されるものではない。
実施例１　各種３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のクローニング
配列番号１に、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（以下、「ＨＢＤＨ－ＧＳ」と略す）のアミノ酸配列を示す。配列番号１に基づいて、大腸菌Ｋ－１２株のコドンユーゼージに最適化された、配列番号２に記載の人工合成遺伝子を作製した。同様に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｍｕｓｔｅｌａｅ由来、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｌｕｔｅｏｌｕｓ由来の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のアミノ酸配列を配列番号３（以下、「ＨＢＤＨ－ＰＡ」と略す）、配列番号５（以下、「ＨＢＤＨ－ＨＭ」と略す）、配列番号７（以下、「ＨＢＤＨ－ＨＴ」と略す）に示す。配列番号３、配列番号５、配列番号７に基づいて、配列番号４、配列番号６、配列番号８に記載の人工合成遺伝子をそれぞれ作製した。
これらの人工合成遺伝子を鋳型として、表１に記載のプライマーを用いて、各種３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子を増幅した（表１において、Ｆｗはフォワードプライマー、Ｒｖはリバースプライマーを表す）。具体的には、フォワードプライマーは、各種３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードする遺伝子の５’上流側に開始コドンを加え、開始コドンの後にヒスチジンタグが繋がるように設計した。リバースプライマーは、各種３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の３’末端の終始コドンを含む形で増幅するように設計した。Ｈｉｓ－ＨＢＤＨ－ＧＳをコードする遺伝子の増幅には、配列番号９、配列番号１０のプライマーを使用した。同様に、Ｈｉｓ－ＨＢＤＨ－ＰＡ、Ｈｉｓ－ＨＢＤＨ－ＨＭ、Ｈｉｓ－ＨＢＤＨ－ＨＴをコードする遺伝子の増幅には、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２、配列番号１３及び配列番号１４、配列番号１５及び配列番号１６のプライマー対を使用した。
なお、本プライマーのＮ末端側には制限酵素サイトＮｄｅＩが、Ｃ末端側には制限酵素サイトＢａｍＨＩが、それぞれ付加されている。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII　ＫＳＮ＋と混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ライゲーションハイ）を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにして、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子を大量に発現できるように設計された組換えプラスミドｐＢＳＫ－Ｈｉｓ－ＨＢＤＨ－ＧＳ、ｐＢＳＫ－Ｈｉｓ－ＨＢＤＨ－ＰＡ、ｐＢＳＫ－Ｈｉｓ－ＨＢＤＨ－ＨＭ、ｐＢＳＫ－Ｈｉｓ－ＨＢＤＨ－ＨＴを取得した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例２　各種３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現及び精製
実施例１で構築した各種のプラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製コンピテントハイＪＭ１０９）を当製品に添付のプロトコールに従って形質転換し、形質転換体を取得した。得られた各形質転換体のコロニーを、試験管内にて滅菌した５ｍＬのＬＢ液体培地（５０μｇ／ｍＬ　アンピシリンを含む）に植菌後、３０℃で１６時間振とうして好気的に培養した。
得られた培養液を種培養液とし、５００ｍｌの坂口フラスコに入った１００ｍＬのＴＢ培地（１ｍＭ　ＩＰＴＧ、５０μｇ／ｍＬ　アンピシリンを含む）に植菌し、振とう数１８０ｒｐｍで３７℃、２２時間培養した。このようにして得られた菌体を遠心分離で集菌し、２５ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）に懸濁し、ガラスビーズを用いて破砕し、得られた粗酵素の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を測定したところ、Ｈｉｓ－ＨＢＤＨ－ＧＳ、ＨＢＤＨ－ＰＡは高発現し、Ｈｉｓ－ＨＢＤＨ－ＨＴは中程度の発現量、Ｈｉｓ－ＨＢＤＨ－ＨＭはまったく発現が認められなかった。ＨＢＤＨ－ＨＭを除く３種の破砕液を、２０ｍＭ　イミダゾールを含む２５ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ　ＨＰ１ｍＬ（ＧＥヘルスケア　バイオサイエンス製）に供し、５００ｍＭ　イミダゾールを含む２５ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）で溶出することで、高い純度の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素溶液を得た。
実施例３　各種３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の熱安定性評価
実施例２で取得したＨｉｓ－ＨＢＤＨ－ＧＳ、Ｈｉｓ－ＨＢＤＨ－ＰＡ及びＨｉｓ－ＨＢＤＨ－ＨＴ酵素溶液を１Ｕ／ｍＬに５０ｍＭ　ＫＰＢ（ｐＨ６．５）で調製後、５０℃で１５分間加温処理し、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を測定し、残存活性により熱安定性を評価した。結果は表２に示した通り、Ｈｉｓ－ＨＢＤＨ－ＧＳは９９．８％、Ｈｉｓ－ＨＢＤＨ－ＰＡは３８．０％、Ｈｉｓ－ＨＢＤＨ－ＨＴは２７．７％の残存率であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例４　ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス由来３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素のクローニング
実施例１と同様の方法で、配列番号２に記載の人工合成遺伝子を鋳型として表３に記載のプライマーを用いて、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス由来３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子を増幅した。具体的には、フォワードプライマーは３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードする遺伝子の５’上流側に開始コドン、リバースプライマーは３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の３’末端の終始コドンを含む形で増幅するように設計した。ＨＢＤＨ－ＧＳをコードする遺伝子の増幅には、配列番号１７、配列番号１８のプライマーを使用した。
なお、本プライマーのＮ末端側には制限酵素サイトＮｄｅＩが、Ｃ末端側には制限酵素サイトＢａｍＨＩが、それぞれ付加されているので、このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII　ＫＳＮ＋と混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ライゲーションハイ）を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにして、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス由来３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子を大量に発現できるように設計された、組換えプラスミドｐＢＳＫ－ＨＢＤＨ－ＧＳを取得した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例５　ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス由来３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける発現及び精製
実施例２と同様の方法により、実施例４で構築したプラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製コンピテントハイＪＭ１０９）を当製品に添付のプロトコールに従って形質転換し、形質転換体を取得した。得られた各形質転換体を、１０Ｌ容ジャーファーメンターを用いて、７ＬのＴＢ液体培地（１ｍＭ　ＩＰＴＧ、５０μｇ／ｍＬ　アンピシリンを含む）に植菌後、３７℃で２２時間培養した。このようにして得られた菌体を遠心分離で集菌し、５０ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）に懸濁し、フレンチプレス（Ｎｉｒｏ　Ｓｏａｖｉ製）に流速１６０ｍＬ／分で送液し、７００～８００ｂａｒで破砕し、除核酸処理後、遠心分離して上清を得た。
これに硫酸アンモニウム（住友化学株式会社製）を０．６飽和になるように徐々に添加し、室温で３０分間攪拌した後、目的タンパク質を沈殿させ、遠心分離で集めた沈殿を５０ｍＭ　リン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）に再溶解させた。そして、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５カラムによるゲルろ過、ＤＥＡＥ－セファロースカラムによる陰イオン交換クロマトグラフィー（溶出条件は共に、０～１Ｍの塩化ナトリウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）およびＰｈｅｎｙｌ－セファロースカラムによる疎水クロマトグラフィー（溶出条件は共に、２５％飽和から０％の硫酸アンモニウム濃度勾配をかけてピークフラクションを抽出）を実施し、さらにＧ－２５セファロースカラムによるゲルろ過で硫酸アンモニウムを除去し、ＨＢＤＨ－ＧＳ酵素溶液を取得した。
実施例６　酵素特性の評価
実施例５で得られた、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス由来３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の以下のような酵素特性について確認を行った。
６－１．至適温度
　実施例５で得られたＨＢＤＨ－ＧＳ酵素溶液（０．１Ｕ／ｍＬ）を用いて、至適活性温度を検討した。緩衝溶液には５０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ６．５）を用い、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃における３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を求めた。結果を図１に示す。
　その結果、本発明のＨＢＤＨ－ＧＳは、６５℃で最も高い活性値を示した。以上のことから、ＨＢＤＨ－ＧＳの至適温度は６５℃以上であることが示された。
６－２．　温度安定性
６－２－１．　温度安定性（１）
実施例５で得られたＨＢＤＨ－ＧＳ酵素溶液（５０Ｕ／ｍＬ）を用いて、温度安定性を検討した。５０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ６．５）を用いて、ＨＢＤＨ－ＧＳ酵素溶液を各温度（４℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃）で３０分間処理した後、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を測定し、処理前の活性と比較して残存率を測定した。結果を図２に示す。
　その結果、本発明のＨＢＤＨ－ＧＳは４℃～６５℃の範囲の温度で、残存率９０％を有していた。このことから、ＨＢＤＨ－ＧＳは６５℃以下で安定であることが示された。
６－２－２．　温度安定性（２）
　実施例５で得られたＨＢＤＨ－ＧＳ酵素溶液（５０Ｕ／ｍＬ）を用いて、さらに別の条件下での温度安定性を検討した。５０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ６．５）を用いて、ＨＢＤＨ－ＧＳ酵素溶液を各温度（４５℃、５０℃、５５℃）で１６時間処理した後、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性を測定し、処理前の活性と比較して残存率を測定した。結果を表４に示す。その結果、５５℃、１６時間の熱処理後においても、ほぼ失活することなく安定であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
６－３．　至適ｐＨ
　実施例４で得られたＨＢＤＨ－ＧＳ酵素溶液（０．５Ｕ／ｍＬ）を用いて、至適ｐＨを検討した。１００ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ５．５－８．０）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０－９．０）、１００ｍＭ 炭酸－重炭酸緩衝液（ｐＨ９．０－１０．０）を用い、それぞれのｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行い、相対活性を比較した。結果を図３に示す。
　その結果、本発明のＨＢＤＨ－ＧＳの至適活性ｐＨは、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を使用した場合のｐＨ８．５において、最も高い活性値を示した。また、リン酸カリウム緩衝液を使用した場合は、ｐＨ６．５～７．０の範囲で最も高い活性が示された。更に、ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液を用いた場合は、ｐＨ７．０で最も高い活性が示された。これらの結果から、このＨＢＤＨ－ＧＳの至適活性ｐＨは、約６．５～８．０の領域と考えられる。
６－４．　ｐＨ安定性
実施例４で得られたＨＢＤＨ－ＧＳ酵素溶液（５０Ｕ／ｍＬ）を用いて、ｐＨ安定性を調べた。１００ｍＭ　酢酸－カリウム緩衝液（ｐＨ４．４－ｐＨ６．３）、１００ｍＭ　ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．１－ｐＨ７．０）、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．５－ｐＨ８．４）、１００ｍＭ　炭酸－重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３－ｐＨ９．４）を用い、２５℃、２０時間、各緩衝液中で酵素を維持した後の３－ヒドロキシ酪酸を基質とした場合の活性を測定した。処理後の活性値と処理前の活性値を比較し、残存活性率を求めた。結果を図４に示す。
その結果、本発明のＨＢＤＨ－ＧＳはｐＨ５．２～９．４の範囲のｐＨで、残存率８０％以上を有していた。このことから、ＨＢＤＨ－ＧＳはｐＨ５．２～９．４の範囲で安定であることが示された。
６－５．　分子量
　Ｎｕ－ＰＡＧＥ　４－１２％　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ　Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いたＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気動により、精製酵素の分子量を求めた（図５）。
　図５に示す通り、ＨＢＤＨ－ＧＳの分子量は約２８ｋＤａであった。
６－６．　Ｋｍ値の測定
基質である３－ヒドロキシ酪酸の濃度を変化させて実施例５で精製したＨＢＤＨ－ＧＳの活性を測定し、基質濃度と反応速度のグラフを作製した（図６）。これに基づいてＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ－ｂｕｒｋ　ｐｌｏｔを作成し、当該酵素の３－ヒドロキシ酪酸に対するＫｍ値を算出した（図７）。その結果、本発明のＨＢＤＨ－ＧＳの３－ヒドロキシ酪酸に対するＫｍ値は、０．６ｍＭと算出された。
６－７．　化学物質の影響（１）
実施例５で精製したＨＢＤＨ－ＧＳに種々の化学物質を所定の濃度で添加し、２５℃、１時間後におけるＨＢＤ活性を測定し、相対活性（％）を比較した（表５）。その結果、本発明のＨＢＤＨ－ＧＳは、表５に示すような、金属塩化物などの様々な金属塩、防腐剤、キレート剤、界面活性剤等の多種類の化学物質の存在下にあっても、高い残存活性を示すことが判明した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　本発明の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素は、ケトン体測定用の診断薬やセンサに適用されることにより、医療、診断の分野はもとより、ケトジェニックダイエット（ケトンダイエット）における指標としてのケトン体測定においても広く用いられることが期待される。

Claims (30)

  1. ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の微生物に由来する、以下の（ａ）から（ｇ）の理化学的性質を有する、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
    （ａ）作用：下記の反応を触媒する。
    　３－ヒドロキシ酪酸　＋　ＮＡＤ　←→　アセト酢酸　＋　ＮＡＤＨ
    （ｂ）至適温度：５５℃以上
    （ｃ）熱安定性：３０分処理後の残存活性率が９０％以上を示す範囲が６５℃以下
    （ｄ）至適ｐＨ：６．０～９．０
    （ｅ）ｐＨ安定性：２５℃で２０時間処理後の残存活性率が８０％以上を示す範囲が５．０～１０．０
    （ｆ）分子量：約２８ｋＤａ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）
    （ｇ）Ｋｍ値：３－ヒドロキシ酪酸に対するＫｍ値が０．６ｍＭ以下
  2. （ｂ）至適温度：６５℃以上である、請求項１に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  3. （ｃ）熱安定性：１６時間処理後の残存活性率が９０％以上を示す範囲が５５℃以下である、請求項１または２に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  4. （ｃ）熱安定性：３０分処理後の残存活性率が９０％以上を示す範囲が６５℃以下であり、かつ、１６時間処理後の残存活性率が９０％以上を示す範囲が５５℃以下である、請求項１～３のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  5. （ｄ）至適ｐＨ：７．５～８．５である、請求項１～４のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  6. （ｅ）ｐＨ安定性：２５℃で２０時間処理後の残存活性率が８０％以上を示す範囲が５．２～９．４である、請求項１～５のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  7. ３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素が遺伝子組換え酵素である、請求項１～６のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  8. ２ｍＭ濃度の金属塩化物の存在下で、２５℃、１時間処理後の残存活性率が９０％以上である、請求項１～７のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  9. 金属塩化物が、塩化マンガン、塩化カルシウム、塩化マンガン、塩化コバルト、塩化ニッケル、及び、塩化鉄（III）よりなる群から選択されるいずれか１種である請求項８に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  10. １～５０ｍＭ濃度のキレート剤の存在下で、２５℃、１時間処理後の残存活性率が９０％以上である、請求項１～９のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  11. キレート剤が、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、フェナントロリン、α,α'-ジピリジルよりなる群から選択されるいずれか１種である請求項１０に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  12. ０．１％濃度の界面活性剤存在下で、２５℃、１時間処理後の残存活性率が７０％以上である、請求項１～１１のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  13. ２５℃、１時間処理後の残存活性率が８０％以上である、請求項１２に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  14. ２５℃、１時間処理後の残存活性率が９０％以上である、請求項１２に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  15. 界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００（ポリエチレングリコールモノ-p-イソオクチルフェニルエーテル）、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）、Ｂｒｉｊ３５（ポリオキシエチレンラウリルエーテル）、コール酸ナトリウム、及び、Ｓｐａｎ２０（ソルビタンモノラウラート）よりなる群から選択されるいずれか１種である、請求項１２～１４に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  16. ゲオバチルス属の微生物がゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｐｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｐｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）である、請求項１～１５のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  17. 配列番号１との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなる、請求項１～１６のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  18. 配列番号１との同一性が９５％以上であるアミノ酸配列からなる、請求項１７に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  19. 配列番号１において、１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、請求項１７に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  20. 配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる、請求項１７に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素。
  21. 配列番号２と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる、請求項１～２０に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードする遺伝子。
  22. 配列番号２と９５％以上の同一性を有する塩基配列からなる、請求項２１に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードする遺伝子。
  23. 配列番号２に記載の塩基配列からなる、請求項２１に記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードする遺伝子。
  24. 請求項２１～２３のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素をコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
  25. 請求項２４に記載の組換えベクターにより宿主細胞を形質転換した形質転換体。
  26. 請求項２５に記載の形質転換体を培養し、培養液中に３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を生成させ、該３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を培養液から精製する工程を含む、３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法。
  27. 請求項１～２０のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を含有するケトン体の測定用組成物。
  28. 請求項１～２０のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いるケトン体の測定方法。
  29. 請求項１～２０のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いるケトン体の測定キット。
  30. 請求項１～２０のいずれかに記載の３－ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を用いるケトン体の測定センサ。
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